Summary
GABAergici progenitori degli interneuroni corticali disperdono, sviluppare e sinapticamente integrarsi in una corteccia di accoglienza dopo il trapianto. Queste cellule possono essere facilmente trasdotte prima del trapianto per gli studi in vivo di precursori GABAergici geneticamente modificati. Qui, vi mostriamo le tecniche di etichettatura virale per indirizzare specifici sottogruppi di interneuroni utilizzando linee Cre esistenti e giornalisti Cre-dipendenti.
Abstract
GABAergici interneuroni corticali, derivati dalla mediale embrionale e eminenze gangliari caudale (MGE e EGC), sono funzionalmente e morfologicamente diversificato. Incursioni sono stati fatti nella comprensione dei ruoli di distinti sottogruppi di interneuroni corticali, tuttavia, ci sono ancora molti meccanismi da elaborati che possono contribuire allo sviluppo e la maturazione dei diversi tipi di cellule GABAergici. Inoltre, la segnalazione GABAergici alterata può contribuire a fenotipi di autismo, la schizofrenia e l'epilessia. Specifiche linee Cre driver hanno cominciato a spartire le funzioni di sottogruppi interneuroni unici. Nonostante i progressi nella modelli murini, è spesso difficile da studiare in modo efficiente GABAergici progenitori degli interneuroni corticale con approcci molecolari in vivo. Una tecnica importante usata per studiare la cellula di programmazione autonoma di queste cellule è il trapianto di cellule MGE in corteccia di accoglienza. Queste cellule trapiantate migrano ampiamente, differenziarsi, unND funzionale integrazione. Inoltre, le cellule possono essere efficacemente MGE trasdotte con lentivirus immediatamente prima del trapianto, consentendo una moltitudine di approcci molecolari. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo di trasdurre efficientemente cellule MGE prima del trapianto per l'analisi in vivo, utilizzando disponibili linee Cre-driver e vettori di espressione Cre-dipendenti. Questo approccio è vantaggioso perché unisce manipolazione genetica preciso con la capacità di queste cellule di disperdersi dopo il trapianto, permettendo una maggiore risoluzione specifico tipo cellulare in vivo.
Introduction
GABAergici interneuroni corticali costituiscono ~ 20-30% dei neuroni nella neocorteccia dei mammiferi, mentre il resto corrisponde a eccitatori, principali neuroni glutamatergici. Interneuroni sono molto diverse nelle proprietà elettrofisiologiche, assoni e dendriti morfologia e sinaptica mira 1, e gli squilibri in eccitatoria tono / inibitorio Si ipotizza che alla base di alcuni fenotipi di disturbi neuropsichiatrici / neurologici, tra cui l'autismo, la schizofrenia e l'epilessia 2. L'obiettivo generale del protocollo qui descritto è quello di fornire un mezzo per modificare in modo efficiente geneticamente GABAergici progenitori degli interneuroni corticali prima del trapianto in vivo per le analisi.
Interneuroni GABAergici corticale nascono in eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 3,4, così come la zona preottica 5. Progenitori degli interneuroni corticali sottoposti seguita a lunga distanza di migrazione tangenzialedalla migrazione radiale per raggiungere i loro obiettivi finali. All'arrivo a destinazione, questi interneuroni corticali devono integrarsi correttamente nella rete neuronale esistente, e ogni sottogruppo interneurone unica contribuirà alla circuiteria corticale in modi specifici. Quattro sottogruppi principali possono essere distinti da marcatori molecolari: somatostatina MGE-derivato (SST) + e parvalbumina (PV) + sottogruppi, e CGE-derivati peptide intestinale vasoattivo (VIP) + e Reelin +; SST - sottogruppi 6. Diversi sottogruppi interneuroni corticali sono nati più di momenti diversi durante lo sviluppo embrionale nel MGE e CGE 7, 8. Questi e altri corticali marcatori interneuroni GABAergici sono stati utilizzati per generare specifiche linee di Cre-driver per molti di questi sottogruppi 9-11.
Il trapianto di progenitori MGE è emersa come una terapia cellulare potenziale per il trattamento di disturbi che possono essere causati da squilibriin eccitazione / inibizione 12 - 24. Questi benefici terapeutici possono essere dovuti in parte alla capacità unica di progenitori MGE (per disperdere, differenziare e integrare in un cervello host), o potenzialmente perché molti peri-somatiche PV inibitorio + cellule derivano dalla MGE. Cellule MGE possono anche essere rapido ed efficiente trasdotte con lentivirus prima del trapianto 15, consentendo alle cellule che sono geneticamente modificati in vitro da studiare in vivo. Il razionale per lo sviluppo di questo approccio è stato quello di superare i blocchi stradali in studio GABAergici sviluppo interneuroni corticale e la maturazione. In particolare, MGE il trapianto ha permesso ai ricercatori di studiare lo sviluppo di cellule mutanti in vivo, quando il mouse mutante avrebbe altrimenti morto in un punto di tempo in anticipo. Inoltre, introducendo geni di interesse prima del trapianto, gli effetti di geni specifici su un fenotipo mutante possono essere valutati in un effmaniera icient.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per trasdurre cellule MGE con lentivirus prima del trapianto. Inoltre, si mostra come questa tecnica può essere adattato per esprimere un gene di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni da un gruppo eterogeneo di precursori degli interneuroni corticali, utilizzando una combinazione di lentivirus espressione Cre-dipendenti e disponibili linee del mouse Cre-driver. Inoltre, questo protocollo introduce tecniche e una piattaforma per i ricercatori di modificare geneticamente GABAergici precursori degli interneuroni corticali per studi in vivo in un modo unico. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci attuali è che le cellule trapiantate MGE si disperderanno di distanza dal sito di iniezione. Inoltre, a differenza di iniezioni virali focali, dopo che le cellule MGE disperdono la loro morfologia è più facile da valutare. Questo approccio può essere usato per studiare l'effetto di introdurre geni di interesse in tipo selvatico o mutante cellule, introducendo un tipo di cellula specificogiornalista per valutare la morfologia, o potenzialmente per studiare l'effetto della malattia alleli in vivo.
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Protocol
Dichiarazione etica: Le seguenti procedure sono state approvate dal nostro protocollo istituzione e animali. Assicuratevi di ottenere l'approvazione per tutte le procedure che comportano interventi chirurgici di sopravvivenza prima di iniziare gli esperimenti e verificare tutti i protocolli siano aggiornati.
1. Lentivirus Preparazione (Fase Opzionale)
- Split tre 10 piatti di cellule HEK293T cm per ogni lentivirus da effettuare, alla presenza di 10 ml DMEM / 10% FBS, e crescere a ~ 60-70% di confluenza. Grow cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Trasfettare i seguenti plasmidi DNA (10 mg totali) in ogni piatto con un reagente di trasfezione: 6.4 mg CAG-Flex-GFP vettori lentivirali (sequenza di DNA del vettore di cui alla tabella 1), 1.2 mg pMD2.G (codifica VSV-g), 1.2 mcg pRSV-Rev, e 1,2 mg pMDLg / pRRE. I tre vettori lentivirali imballaggio sono disponibili in commercio (Tabella
Nota: Questo particolare approccio utilizza generazione lentivir 3 °AL vettori ma vettori di 2 ° generazione e plasmidi associati anche lavorare. - Preparare un contenitore di rifiuti contenente una soluzione di candeggina al 10% entro un cappuccio BSL2 certificato per inattivare eventuali soluzioni o dispositivi che hanno contattato o che contengono lentivirus. Avanti, rimuovere completamente i media 4-6 ore dopo la trasfezione nella soluzione di candeggina, sostituire con lo stesso volume di nuovi media, e permettono alle cellule di crescere.
- Dopo 4 giorni, raccogliere i media in 50 ml provette coniche e centrifugare a 1000 xg per 15 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Successivamente, filtrare il surnatante con una membrana da 0,45 micron. Ogni proteina filtro vincolante basso, come PVDF, funziona bene. Attenzione: posto sia i rifiuti solidi e liquidi virale nella soluzione di candeggina.
- Carico 30 ml filtrati surnatante in provette ultracentrifuga e in un'ultracentrifuga. Centrifugare a 100.000 xg per 2,5 ore a 4 ° C. Aprire le provette in un cappuccio BSL2 e rimuovere il surnatante in 10% Bleach. Aggiungi ~ 100 ml di PBS al pellet, che produce titoli di 1x10 ^ 7-8 infettive unità / ml. Aliquota della giornata e negozio successivo a -80 ° C. Lentivirus aliquote sono stabili a -80 ° C per almeno sei mesi.
- Considerazione importante: molte istituzioni hanno ora core virali. Acquisire virus concentrato con un titolo minimo di 1x10 7 infettive unità / ml, per ottenere risultati ottimali.
2. I topi donatori per MGE Dissection
- In primo luogo, impostare un accoppiamento a tempo tra una linea Cre-espressione di interessi e di un wild type (WT) mouse o un mouse che esprimerà un giornalista dopo ricombinazione Cre-mediata.
Nota: Molte linee Cre driver sono transgenici e sono mantenuti e allevati in stato emizigote. Pertanto, solo la metà degli embrioni conterrà il transgene Cre. DNA può essere rapidamente preparato dagli embrioni per un breve PCR per rilevare l'allele Cre. I + embrioni Cre possono essere raccolte in modo che venga utilizzato solo il tessuto MGE del genotipo desiderato. Alternativamente, un reporter Cre-dipendente può essere utilizzato, per selezionare gli embrioni per MGE dissezione e di trapianto. - Calcola che giorno corrisponderà E13.5. Se gli animali sono stati accoppiati la sera prima, il giorno della spina è 0,5. Ordine topo gravide temporizzata o una femmina con i cuccioli WT P1 per tempo avere postnatale (P) 1 topi nel giorno del tessuto del donatore sarà E13.5. In alternativa, impostare queste accoppiamenti in casa una settimana prima l'accoppiamento degli animali donatori.
Nota: La prima strategia di generare sia E13.5 e embrioni P1 / cuccioli per lo stesso giorno è spesso difficile da fare in modo affidabile.
3. Preparazione di media, strumenti e attrezzature.
- Preparare i reagenti e gli strumenti per la preparazione di cellule MGE (Tabella 2).
- Preparare una superficie pulita e posizionare pinze pulite, forbici e un coltello o microchirurgico o pinza sottile (per una precisa dissezione dei tessuti) sulla superficie.
- Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), fo dissezione, e mezzo di Eagle modificato di Dulbeco (DMEM) con il 10% fetale bovino surem (FBS), per la trasduzione.
- Preincubare 20-30 ml DMEM / 10% FBS in un tessuto C cultura incubatore 37 ° per circa 1 ora. Il coperchio deve essere allentato per permettere lo scambio di gas e pH equilibrio dei media.
Nota: La preincubazione dei media può essere preparata poco prima di iniziare la dissezione.
4. MGE cellulare Preparazione
- Sacrifica il mouse incinta secondo un protocollo animali approvato e rimuovere gli embrioni in una capsula di Petri 10 centimetri contenente ghiacciata HBSS.
- Rimuovere il cervello da ogni embrione utilizzando un ambito dissezione (fare uno alla volta, lasciando il resto degli embrioni in ghiacciata HBSS) e quindi procedere a tagliare il tessuto MGE.
Nota: Si riporta di seguito, e in Figura 1, sono passaggi chiave che mostrano come rimuovere il MGE. Inoltre, la figura 2 è un film che mostra tutta la dissezioneprocedura.- Posizionare il cervello con lato ventrale rivolto verso l'alto (figure 1A, A '). Nota: è anche giusto avere la dorsale verso l'alto. Tagliare il cervello a metà lungo il piano sagittale per generare due pezzi. Un esempio hemisected cervello viene mostrato (figure 1B, B '), notare che dorsale (la corteccia sovrastante) e gli aspetti ventrale del coperchio cervello e circondano il tessuto eminenza gangliare (GE).
- Poi, con la mano dominante, tenere sia pinza molto sottili o un stabknife (tabella 2), mentre immobilizzare l'emisfero con una pinza detenuti da una mano non dominante. (Mediale del dell'emisfero deve essere rivolto verso l'alto). Aprire la dorsale e ventrale del tessuto con una pinza e un coltello pugnalata per rivelare il tessuto sottostante GE (Figura 1C e schematizzato in figura 1C ').
Nota: la rimozione alcuni media dal piatto dissezione di Petri può rendere più facile per stabilizzare il tessuto mentre performing la dissezione MGE. - Fare tagli rettilinei con stabknife o una pinza sottile per separare la CGE, LGE e tessuti del setto (vedi esempio tagli indicati con colore rosso linee tratteggiate, figure 1D e D '). Questi tagli possono essere realizzati in qualsiasi ordine.
Nota: Immaginate il MGE come una 'scatola' che è tagliato fuori dal tessuto circostante. In questo modo contribuisce a rendere riproducibile tagli simili per ogni dissezione, riducendo così la variabilità in dissezioni dei tessuti. - Infine, girare il MGE su un lato e tagliare la parte inferiore (quella che era la parte laterale del cervello). Questo elimina la zona manto della MGE (scartare nelle figure 1E e 1E ') dal resto del MGE. L'ultimo aspetto della MGE contiene zone prevalentemente ventricolare e porzioni zona subventricolare di MGE, che contiene quasi tutte le cellule progenitrici MGE. Procedere con questo tessuto.
- Considerazione importante: L'aggiunta di gel di silicone al fondo di una capsula di Petri can servire come un eccellente superficie dissezione in quanto protegge le delicate punte di pinza e fornisce una superficie morbida per appuntare il tessuto con una pinza.
4.3 strategie aggiuntive per MGE Dissection.
- Tagliare la pelle dell'embrione con pinze come le forbici per rimuovere rapidamente il cervello. Come l'embrione depone su un lato, tenere il tessuto alla base della testa con le pinze utilizzati per ancorare il tessuto. In primo luogo, tagliare anteriore ventrale al cervello e posteriore ventrale al cervello, e quindi collegare i due tagli lungo il lato dell'embrione. Poi afferrare il lembo di pelle e tirarlo sopra la parte superiore del cervello. Il cervello può essere rapidamente sezionato dal tessuto rimanente.
- In alternativa, ancorare la faccia posteriore tutto il cervello dietro la corteccia. Nel frattempo, afferrare ciascun emisfero all'aspetto caudale più dorsale della corteccia e strappare la corteccia lontano dal tessuto ancorata in direzione anteriore. In questo modo, sia cortices possono essere rimossi e le eminenze gangliari bilaterali sono rivelati, ancora attaccato al resto del tessuto preservare l'anatomia mediale-laterale.
- Passare alla pugnalata coltello per fare tagli precisi in tutto il MGE su ogni emisfero. Utilizzare un set pulito separata di pinze per raccogliere il MGE o una pipetta con una grande punta (es., P1000).
Nota: Mantenere il tessuto raccolti lontano da ogni altro materiale sezionato, come alcuni media è inevitabilmente trasferito quando il MGE viene raccolto. - Raccogliere il MGE e mettere il tessuto in una provetta da 1,5 ml di raccolta contenente DMEM / 10% FBS, (un volume di 500 microlitri è sufficiente per raccogliere i MGEs). Ripetere l'operazione per l'altro emisfero e luogo nello stesso tubo di raccolta. I campioni in ghiaccio fino a quando tutti i tessuti vengono raccolti.
5. etichettatura lentivirali e Trapianti
- Spostare i tubi di tessuto MGE in una cappa BSL2 certificato e rimuovere il supporto.
Nota: IlTessuto MGE è abbastanza grande da essere visibili a occhio e si depositano sul fondo della provetta consentendo media fredde per essere facilmente e delicatamente rimossi. - Aggiungi ~ 500 ul dei media DMEM / 10% FBS, che è stato preincubata in un 37 ° C tessuto cultura incubatore. Successivamente, aggiungere polibrene facilitare trasduzione a ciascun tubo ad una concentrazione finale di 8 mg / ml. Triturare il tessuto MGE per creare una sospensione di cellule singole, con una punta P1000 pipetta. Infine, aggiungere ~ 15-20 ml di lentivirus concentrato ad ogni provetta.
- Considerazione importante: Una triturazione di 10-12 volte è sufficiente a rompere il tessuto MGE da un unico embrione, ma più triturazioni può essere richiesto se più MGEs sono raggruppate. Provate diverse condizioni triturazione per determinare che cosa funziona meglio.
- Chiudere bene ogni tubo, miscelare, di luogo tutti i tubi in un C incubatore 37 °. Incubare le cellule in lentivirus per almeno 30 minuti e fino a 1 ora. Tempi più lunghi hanno portato a devitalità cellulare sgualcito. Invertire i tubi ogni 10 minuti fino a quando il tempo è scaduto.
- Dopo l'incubazione con lentivirus, togliere i tubi dal incubatore e centrifugare a ~ 700 xg per 3 minuti per far sedimentare le cellule. Nel cofano BSL2, rimuovere il surnatante e gettarlo in candeggina al 10%. Successivamente, aggiungere 1 ml DMEM / 10% FBS e triturare il pellet 2-3 volte per lavare, centrifugare di nuovo alla stessa velocità per sedimentare le cellule. Ripetere questo lavaggio-passo 2-3 più volte per rimuovere il virus in eccesso.
Nota: Eseguire le operazioni di centrifugazione a 4 ° C, tuttavia, ridotta vitalità non è stato osservato quando brevi rotazioni vengono eseguite a temperatura ambiente. - Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il più media come possibile e mettere ogni tubo in ghiaccio. Grazie ai media residua sui lati del tubo, ~ 2-3 microlitri di supporti finirà copre il pellet dal tempo della procedura di trapianto è iniziato.
6. Trapianti e Validazione
- Acquisire cuccioli P1 ospitanti e preparare la proceduraArea spruzzando giù con il 70% di etanolo. Per mantenere la sterilità durante la procedura si raccomanda di eseguire queste procedure in una stanza pulita procedura dedicata. Inoltre, utilizzare uno strumenti chirurgici autoclavato sterilizzare le superfici che i cuccioli saranno in contatto con con il 70% di etanolo. Un esempio di equipaggiamenti rappresentativi necessari per effettuare trapianti e un'area procedimento rappresentativo è mostrato in Figura 3.
Nota: Mentre questo procedimento è una iniezione di piccoli volumi, e non una procedura chirurgica che richiederebbe un'incisione, ferita aperta o suture, è comunque raccomandato che una nuova micropipetta viene utilizzato per ogni mouse da iniettare. Le micropipette sono sterilizzati calore quando tirato e smussato su una superficie che è stata spruzzata con etanolo al 70% immagazzinato in un contenitore sigillato.
- Generare micropipette avere un diametro di punta tra i 40-80 micron. A seguito di queste dimensioni sarà resa ottimalerisultati. Calore sterilizzare le micropipette quando tirato e smussato su una superficie e spruzzare con il 70% di etanolo prima di riporre le micropipette in un contenitore sigillato.
Nota: In alternativa, se l'accesso ai dispositivi necessari per creare questi aghi (Tabella 2) è limitante, utilizzare qualsiasi altro dispositivo di iniezione. Tuttavia, questi non possono essere adatti come le micropipette causa di diversi diametri. - Elaborare olio minerale in una siringa da 1 ml, e con un ago 30 G 1/2, riempire completamente la pipetta di vetro con olio minerale. Successivamente, montare il pistone sul dispositivo stereotassico, quindi collegare la pipetta di vetro al dispositivo di carico e stereotassico sul pistone. Utilizzando l'unità idraulica, sposta lo stantuffo a metà strada nella pipetta di vetro, la rimozione di olio minerale che si riversa con un pulito un tovagliolo di carta pulito.
- In alternativa all'utilizzo di una siringa, immergere l'estremità posteriore della pipetta in olio minerale e riempito per azione capillare. Per evitare bolle d'aria nel pipette, mantenere la pressione positiva sulla siringa fino completamente fuori dalla pipetta di vetro.
Nota: Altri dispositivi possono essere utilizzati per trapiantare con successo cellule MGE 14. Qualsiasi dispositivo in grado di fornire un volume inferiore o vicino 100 opere nl anche per questa procedura.
- In alternativa all'utilizzo di una siringa, immergere l'estremità posteriore della pipetta in olio minerale e riempito per azione capillare. Per evitare bolle d'aria nel pipette, mantenere la pressione positiva sulla siringa fino completamente fuori dalla pipetta di vetro.
- Quindi, utilizzare un tovagliolo di carta sterili, o qualsiasi materiale assorbente, con l'angolo contorto in una punta sottile per rimuovere delicatamente l'eccesso dei media sopra il pellet MGE. Questo passaggio concentra la densità cellulare in modo che i volumi di iniezione più piccoli possono essere raggiunti. Avanti, utilizzare un volume basso (P2 è preferito) pipetta di elaborare lentamente il pellet e triturare 1-2 volte prima di passare la sospensione cellulare su una superficie idrofobica. Il volume dovrebbe essere appena sotto 1 ml. Spostare la punta dell'ago nella sospensione cellulare e con il motore idraulico, elabora la sospensione cellulare nella pipetta.
- Anestetizzare un cucciolo P1 tramite ipotermia (avvolgere in un guanto in lattice e messo in ghiaccio per ~ 2-4 minuti).Verificare l'efficacia di anestesia con uno stimolo nocivo. Pizzica la pelle tra le dita dei piedi con una pinza sottile: il cucciolo deve essere insensibile se pizzicato. Quindi, posizionare il cucciolo su uno stampo che si trova sotto il dispositivo di iniezione, quindi rendere la pelle tesa tirando indietro la pelle sulla testa e fissare con nastro adesivo di laboratorio standard.
Nota: Durante l'ipotermia è molto efficace su topi e si traduce in basso tasso di mortalità neonatale, le procedure devono essere fatte in fretta, come cuccioli cominceranno a recuperare in meno di 10 min. Inoltre, 4 min in ghiaccio è un limite superiore di ciò che può essere tollerato. Cercate di indurre ipotermia solo una volta se è richiesto un tempo più lungo per preparazioni iniettabili. Tuttavia, se un cucciolo recupera presto, prima permettere al cucciolo di riprendersi completamente prima di indurre nuovamente ipotermia. Inoltre, solo indurre ipotermia uno più tempo per eseguire le iniezioni. Pups si riprenderà entro 5-10 minuti di ipotermia. Questo può essere facilitato mettendo i cuccioli con lettiera e la mamma o mettendo il cucciolo in un surfac caldoe per recuperare. - Utilizzando un dispositivo stereotassico, posizionare la punta della pipetta di vetro sulla superficie sulla testa del cucciolo, perpendicolare alla superficie della testa. Quando la pipetta è in contatto con la testa, considerare questo come '0'. Successivamente, spingere la pipetta attraverso la superficie della pelle e del cranio nella corteccia, quindi inserire e ritirare la pipetta ~ 2 volte prima di fermarsi. Per ottimale il targeting delle cellule nella neocorteccia, iniezioni vengono eseguite quando la micropipetta è ad una profondità di 0,1 mm. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato dall'utente (vedi nota sotto).
Nota: Durante questa profondità si rivolge in modo affidabile gli strati più profondi neocorticali con i dispositivi sopra descritti, alcuni profondità dovrebbe essere testato determinati empiricamente. Inoltre, un campo di profondità in posizione rostro-caudale e medio-laterale differente deve essere testato per determinare quali profondità è ottimale in ogni sito. Inoltre, la puntura iniziale deve essere rapida, come lenta penetrazione nella neocorteccia diminuisce la capacità di cleanly penetrare il tessuto. Provare diverse velocità al primo avvio di questa procedura per trovare ciò che funziona meglio. Inoltre, per le coordinate di prova, non esiste un vero sostituto per l'utilizzo di cellule marcate, come i coloranti sono stati inaffidabili per indicare la posizione. - Una volta che l'ago è in posizione, ruotare il dispositivo idraulico per avanzare lo stantuffo nella pipetta di vetro, spingendo un determinato volume di sospensione cellulare nella corteccia. Iniettare 50-70 nls per sito. Ripetere questa procedura in 3-6 siti diversi a diversi livelli rostrale-caudale se l'obiettivo è quello di ottenere una vasta distribuzione delle cellule in tutto il neocorteccia.
Nota: I volumi di 100 nl o superiori possono causare lesioni e portare a grandi ciuffi di cellule iniettate che non riescono a migrare in modo efficiente del sito di iniezione. Così, volumi di iniezione più piccoli (~ 70 nl o meno) sono ottimali, su più siti se il tempo lo permette. - Quando le iniezioni sono, rimuovere il cucciolo dal palco e segnare (tep clipping è un modo affidabile per identificare il pups in seguito). Una volta che il cucciolo ha recuperato ed è in grado di muoversi da solo (questo avviene in pochi minuti di rimuoverli dal palco), la rimise con la mamma e la lettiera.
Nota: Dal momento che si tratta di una procedura minimamente invasiva non ci sono procedure di post-chirurgiche, una volta che il cucciolo è liberi di muoversi e riscaldato. Tuttavia, cuccioli devono essere controllati, non solo dopo la procedura, ma anche il giorno seguente per assicurare non hanno segni di deterioramento della salute. - Prima di avviare la procedura sul successivo cucciolo, spruzzare giù la zona con etanolo al 70% per mantenere una zona di lavoro sterile. Lasciare i cuccioli iniettati di sviluppare e poi valutare il tessuto in fase di sviluppo appropriato (s).
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Representative Results
Poiché le cellule MGE hanno la capacità unica di migrare e integrare quando trapiantati in un neocorteccia serie 16, che forniscono un ottimo sistema modello per la manipolazione genetica prima di studi in vivo. Qui, si mostra come si possa isolare il tessuto MGE da embrioni E13.5 (Figure 1 e 2), che possono poi essere trasdotte con lentivirus sia in vitro o in modo rapido prima del trapianto per gli studi in vivo. Etichettatura MGE via lentivirus è stata eseguita prima di utilizzare un esaltatore di guida GFP in neuroni GABAergici 15. Tuttavia, la capacità di esprimere geni in sottogruppi specifici da una popolazione eterogenea prima del trapianto può notevolmente aiutare studi di dispersione e di integrazione queste cellule. Qui, abbiamo cercato di sviluppare un mezzo per indirizzare l'espressione di una proteina fluorescente ad uno specifico sottogruppo interneuroni, quelli che esprimono la somatostatina (SST) +.
Abbiamo Fiprima subclonato un reporter disponibile in commercio Cre-dipendente GFP (informazioni vettoriali, tabella 2) in una spina dorsale lentivirale. Il vettore è stato generato dal primo subcloning la cassetta contenente GFP fiancheggiata da siti loxP dal vettore AAV e legando in un vettore lentivirale backbone 15 con XbaI e PflMI siti di restrizione, (questa cassetta conteneva solo alcune promotore CAG). Successivamente, il resto del promotore CAG è stato asportato da un vettore di espressione di mammifero pCAGGs con siti SpeI e XbaI e ligato nel sito XbaI del vettore lentivirale per generare Plenti-CAG-Flex-GFP. Il 5 'sito SpeI dell'inserto è gratuita per XbaI e quindi distrutto il 5' del sito, mentre il sito 3 'XbaI è stato conservato. Il vettore risultante (schema Figura 4A, sequenza vettoriale Tabella 1) è stata sperimentata dapprima in vitro in presenza o assenza di Cre (schema di test in vitro, Figura 4B). MGE neuroni primari da AI14 Flox / + E13.5 embrioni sono stati coltivati e trasdotte con una combinazione di lentivirus. Pochi o nessun GFP + o + cellule tdTomato sono stati osservati solo con la trasduzione del CAG-Flex-GFP lentivirus (figure 4C, 4F e 4I). TdTomato fluorescenza era presente nelle cellule MGE trasdotte con lentivirus CMV-Cre, indicativa di espressione Cre (figure 4D, 4G e 4J). Infine, co-trasduzione delle cellule MGE ha provocato molti tdTomato + cellule che anche espresso GFP, che indica che il CAG-Flex-GFP lentivirus lavorava come previsto (figure 4E, 4H e 4K). Sono stati osservati Alcune cellule GFP + rari che non erano tdTomato +, potenzialmente a causa della giornalista trasdotte incorpora accanto a un forte promoter, che ha rappresentato per <2% di tutte le cellule GFP +.
content "> cellule MGE trapiantate in un tipo selvaggio neocorteccia ospitanti disperdono, maturo e integrano nella neocorteccia ospitante 16 E13.5 SST-IRES-Cre +;. AI14 Flox / + MGE cellule sono state trapiantate in neocorteccia WT a P1 (schema, Figura 5A) e la loro distribuzione esaminati in 7 e 35 giorni dopo il trapianto (DPT). In entrambi i secoli, + cellule tdTomato potrebbe essere visto in tutta la neocorteccia (figure 5B e 5C). Le immagini delle figure 5B e 5C sono trapianti rappresentativi utilizzando il MGE . le cellule da un unico embrione Per testare l'efficienza delle cellule MGE potrebbe essere etichettato con il protocollo qui descritto, le cellule MGE da SST-IRES-Cre +; AI14 Flox / + embrioni sono stati trasdotte con il lentivirus CAG-Flex-GFP e trapiantate nel Per questi esperimenti, ~ 15 ul di conce stesso modo.lentivirus ntrated (~ 1x10 7 unità infettive / ml) è stato utilizzato con i MGEs combinati da un embrione per ogni trapianto. Le cellule sono state poi trapiantate in una corteccia serie P1 WT e analizzati a 7 DPT (figure 5D-5F). Delle cellule trapiantate (tdTomato +), circa il 20% erano GFP +, indicando trasduzione con il CAG-Flex-GFP lentivirus (Figura 5G). Questi dati suggeriscono che con la quantità e titolo di lentivirus descritti sopra, ~ 20% delle cellule trapiantate MGE può essere etichettato. La quantità di virus può sia essere diminuita o aumentata, o potenzialmente altre variabili come durata dell'incubazione virale può essere modificata, per realizzare l'etichettatura cella rada o più denso.Utilizzando tessuti MGE da una linea di topi giornalista Cre-dipendente in collaborazione con il lentivirus CAG-Flex-GFP può limitare il numero di marcatori aggiuntivi che possono essere sondato dal immunofluorescenza. Pertanto, SST-IRES-Cre + < / Sup> tessuto E13.5 MGE è stato raccolto e trasdotto con CAG-Flex-GFP lentivirus per visualizzare le cellule MGE trapiantate che esprimono Cre (saranno GFP +). Queste cellule sono state trapiantate in P1 WT corteccia e valutati a 35 DPT (vedi disegno sperimentale, figura 6A), un punto di tempo in cui i marcatori interneuroni maturi sono espressi. Al 35 DPT, ~ 85% di cellule GFP + co-espresso SST, ma solo ~ 4% ha espresso PV (figure 6B-6H). Questi numeri sono coerenti con l'analisi stirpe della linea di mouse SST-IRES-Cre, che anche il destino mappe di ~ 5-10% delle cellule FV + 9 (Vogt e Rubenstein, risultati non pubblicati). Questi dati suggeriscono che l'etichettatura virale MGE è efficiente e può essere un approccio applicabile ad introdurre un reporter o potenzialmente un gene di interesse prima dell'analisi in vivo.
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Figura 1. Procedura rappresentante per la dissezione di E13.5 MGE tessuti. Esempio dissezione dei tessuti MGE sia per colture primarie o trapianti. (AE) Immagini di E13.5 dissezioni del cervello, e (A'-E '), schemi per evidenziare le strutture e passi importanti nella procedura. (A, A ') Rappresentante E13.5 cervello visto dal punto di vista ventrale. La linea rossa indica il primo taglio fatto, che hemisect il cervello in vista di una emisezione cervello due pezzi. (B, B '). L'aspetto mediale è visibile, con faccia laterale verso il basso. Tessuto dalla corteccia dorsale (colore blu) si sovrappone eminenze gangliari. Inoltre, il tessuto ventrale che verrà rimosso è indicato in arancione. (C, C '), Vista e illustrazione delle eminenze gangliari esposti dopo sovrastante tessuto è stato staccato. (D, D') Stesso vista ganglionic esposti emi nences come in (C, C '), ma con i punti tagliati dettagliate mostrati in rosso linee tratteggiate. Dopo MGE è tagliato secondo le linee denotati in (D, D '), il tessuto viene girato su un lato (E, E') e la faccia laterale viene rifilata e scartato. Passi rappresentante nel dissezione e l'isolamento del tessuto MGE. Abbreviazioni: (EGC) caudale eminenza gangliare, (LGE) laterale eminenza gangliare, (MGE) mediale ganglionice eminenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. filmato che mostra una dissezione E13.5 MGE. Film descrive la rimozione di un cervello E13.5 seguita da successiva dispiegarsi e la rimozione del tessuto sovrastante. Il MGE è etichettato e i tagli effettuati per rimuovere il tessuto circostante sono spettacolo in un ordine graduale.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere il video.
Figura 3. zona Rappresentante procedura e l'esempio di iniezione ago per trapianti neonatali. (A, A ') Immagini che mostrano un esempio di configurazione per eseguire trapianti in topi neonati. Un microscopio (1) è posizionato sopra una fase contenente uno stampo che può contenere un mouse neonatale (5) ed un dispositivo stereotassico (2). (A ') Un'immagine ingrandita di (A) che mostra la regione del dispositivo stereotassico che contiene l'ago di iniezione di vetro (6) con un pistone inserito (7). Il pistone è controllato da un'unità multa idraulico (4) e sposta olio minerale ai ago di vetro che media verso l'interno e verso l'esterno il flusso dall'ago. (B) Esempio di un ago per iniezione di vetro con una punta smussata. Per il sovrano a (B), ogni grande demarcazione = 100 micron. (C) Inventario di elementi riportati nel (A, A '). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In vitro test Figura 4. dimostrano l'espressione di GFP da un lentivirus CAG-Flex-GFP in presenza di Cre. (A) Schema di funzionamento del lentivirale CAG-Flex-GFP vettore in presenza di Cre. (B) Schema di esperimenti di coltura cellulare MGE primario di valutare se il lentivirale CAG-Flex-GFP esprimerebbe GFP in quelle cellule con espressione Cre. Brevemente, le cellule MGE da un reporter Cre-dipendente, AI14 (esprime tdTomato in presenza di Cre), sono state coltivate in vitro e trasdotte con Cre e / o Flex-GFP lentivirus. (CK) immagini immunofluorescenza di colture primarie E13.5 MGE che sono state trasdotte con un CMV-Cre, CAG-Flex-GFP o entrambi. Le culture sono state ripreso per l'espressione tdTomato nativo, GFP e DAPI. Bar Scala in (K) = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Immagini rappresentative della trapiantati e trasdotte, SST-IRES-Cre +; AI14 Flox / + MGE cellule. (A) Schema di disegno sperimentale di trapianto sia cellule MGE sola o dopo lentiviral trasduzione in un tipo selvaggio (WT) host (DPT) giorni post trapianto. Brevemente, E13.5 SST-IRES-Cre +;. AI14 Flox / + MGE cellule sono state trapiantate sia o trasdotte con il lentivirus CAG-Flex-GFP prima del trapianto in neocorteccia WT e valutati a 7 DPT (B, C) le immagini di immunofluorescenza neocorteccia a 7 o 35 DPT mostrano MGE trapiantato cellule rappresentative (tdTomato +). (DF) immagini immunofluorescenza di cellule MGE trasdotte con il lentivirus CAG-Flex-GFP valutata a 7 DPT. (G) quantificazione della percentuale di + cellule tdTomato che esprimono GFP a 7 DPT. Bar Scala in (C) e (F) = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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La raccolta delle cellule Figura 6. Immagini rappresentative della CAG-Flex-GFP lentivirus trasdotte, SST-IRES-Cre + MGE trapianti che co-express interneuroni marcatori sottogruppo MGE-derivato. (A) Schema di E13.5 SST-IRES-Cre + MGE e trasduzione con un lentivirus CAG-Flex-GFP e trapianto nel neocorteccia degli eserciti P1 WT prima valutazione a 35 DPT. Immagini rappresentative della neocorteccia degli eserciti trapiantati che mostrano l'espressione di GFP, dal vettore di Flex (B, E), co-colorati sia per la somatostatina (SST) (C) o parvalbumina (PV) (F). (D, G) Fusione Immagini co-colorati con DAPI. (H) Quantificazione della percentuale di cellule GFP che co-express SST o PV. I dati rappresentano ± SEM, (n) = bar 3. Scale in (G) = 100 micron./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. il file FASTA del vettore pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA.
| Reagenti e attrezzature per la preparazione delle cellule MGE e trasduzione | Catalog # | Azienda | ||||||
| 1) | Dulbecco Modified Eagle Medium, con alte concentrazioni di glucosio | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Calore inattivato siero fetale bovino | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS), senza calcio o magnesio | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1,5 ml microprovette (o altroprovette per il prelievo con coperchio) | 3810X | Eppendorf Italia | |||||
| 5) | Polibrene | sc-134220 | SantaCruz Biotecnologia | |||||
| 6) | Coltello Stab diritta 22,5 ° (optional) | REF 72-2201 | Specialità chirurgiche corporation | |||||
| 7) | Capsula di Petri (10 cm), per dissezioni dei tessuti | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 pinze punta fine, come Dumont # 5 | 11254-20 | Belle Attrezzi Scientifici | |||||
| 9) | 37 ° C coltura tissutale incubatore con 5% di ingresso CO 2 | C150 | Legante | |||||
| 10) | Tabletop centrifuga che può girare 1,5 ml microprovette | |||||||
| 11) | Qualsiasi pipetta P1000 che può essere utilizzato per triturazione cellule | |||||||
| 12) | Livello di biosicurezza 2 Cappa | |||||||
| Reagenti e attrezzature per in vitro MGE colture primarie | Catalog # | Azienda | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides con la copertura, 8 e | 154.941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poly-L-lisina 0,1% peso / volume | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Topo laminina, 0,5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neurobasal media | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | Siero B27 supplemento gratuito | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, magazzino 100x | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicillina-streptomicina, magazzino 100x | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glucosio, (preparare una soluzione al 25% in acqua) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Reagenti e attrezzature per il trapianto di cellule MGE | Catalog # | Azienda | ||||||
| 1) | Siringa da 1 ml | REF 309.602 | BD, Becton Dickinson e società | |||||
| 2) | 30 1/2 G ago | 305.106 | BD, Becton Dickinson e società | |||||
| 3) | Preforo cisione di consegnare 5 microlitri (viene fornito con pistone) | 5-000-1005 | Drummond società scientifica | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Microscopio stereo con boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digital solo per strumento di topi stereotassica | 51725D | Società Stoelting | |||||
| 7) ** | Olio singolo asse idraulico micromanipolatore bene | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamante rivestito beveler rotante | n / a | fatto in casa | |||||
| 9) | Ago pipettate puller | 730 | Strumenti Kopf | |||||
| 10) | Olio minerale | n / a | Ogni farmacia o farmacia | |||||
| 11) | Ogni pipetta e suggerimenti che possono reliaby misura 1 ml di volume di | |||||||
| ** Questi sono i modelli particolari che usiamo, ma molte altre configurazioni dovrebbero funzionare | ||||||||
| OptionaReagenti l (per fare lentivirus) | Catalog # | Azienda | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 micron filtro | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Provette Ultra-clear (25 x 89 mm) | 344.058 | Beckman Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Altre forniture disponibili in commercio | Catalog # | Azienda | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plasmide codificante gag / pol | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev plasmide codificante Rev | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plasmide codificante VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | paav-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |||||
Tabella 2. Inventario dei reagenti e strumenti. Un inventario dei reagenti disponibili in commercio, tra cui media, strumenti di dissezione, equipaggiamenti rappresentativi per i Trapianti e DNA vettori. (Na) Non disponibile o applicabile.
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Discussion
L'uso di precursori degli interneuroni GABAergici corticale dalle eminenze gangliari embrionali (GES) per le terapie cellulari basate sta mostrando la promessa per molte condizioni 12 -1 4. Sono necessarie tecniche molecolari precisi per monitorare, ed esprimere geni di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni. Qui forniamo un protocollo dettagliato per etichettare le cellule MGE embrionali con lentivirus prima del trapianto e mostriamo come questa tecnica può essere usata per esprimere geni di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni corticali per l'analisi in vivo.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato in modo affidabile, tuttavia, per la riproducibilità ottimale è essenziale rispettare alcuni punti critici. Innanzitutto, per trasduzione virale per essere efficiente, temperatura e pH fisiologico sono necessari. Se sussistono tali parametri, cellule MGE possono essere trasdotti in ~ 30 minuti. In secondo luogo, assicurarsi di avere un MGE pellet densa prima di procedereper fare un trapianto. Questo è importante perché solo un volume limitato può essere iniettato nel cervello neonatale mouse ogni sito senza incorrere danni, e le cellule migrerà lontano dal sito di iniezione, per cui la loro densità al momento del trapianto è meno di una preoccupazione che potrebbe essere atteso. Infine, eseguire alcune condizioni di test con cellule MGE che esprimono un reporter fluorescente per determinare quali iniezione profondità sono ottimali. Mentre questo protocollo usato cellule MGE, cellule EGC potrebbero anche essere utilizzati nello stesso modo. Uno svantaggio è che non ci sono molte linee Cre driver che limitano l'espressione di tutta la CGE oa particolari sottogruppi di interneuroni CGE-derivati. Tuttavia, il peptide intestinale vasoattivo (VIP) 9 è una Cre-line affidabile che potrebbe essere utilizzato per separare questo sottogruppo di cellule CGE-derivati. Come le nuove linee saranno disponibili, sarà possibile impiegare questo protocollo con precisione più genetica.
In precedenza, noi ed altri abbiamo dimostratol'utilità di introdurre geni nelle cellule MGE prima del trapianto mediante elettroporazione o con lentivirus 15, 17. Sebbene queste tecniche erano efficaci ad introdurre geni per l'analisi in vivo, tessuti MGE è eterogenea e dà luogo a diversi sottogruppi interneuroni e cellule non neuronali 4. Inoltre, è stato difficile esprimere un gene di interesse solo in uno specifico sottogruppo interneuroni. Grandi passi avanti sono stati fatti per generare linee transgeniche che ricapitolano i pattern di espressione di molti sottogruppi di interneuroni corticali, tra cui, ma non solo, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre un d VIP-Cre 9 -11, e l'avvento di nuove linee aiuterà a chiarire ulteriori possibili popolazioni in futuro. Inoltre, con la generazione di giornalisti Cre-dipendenti e vettori di espressione, tra cui vettori giornalista Cre-dipendenti utilizzati in questo documento, l'espressione più precisa dei geni di interesse può essere raggiunto.
Una limitazione di questa tecnica può essere la dimensione del frammento che si può confezionare affidabile in un vettore lentivirale. Inoltre, questo approccio non è ancora stato testato con AAV. Tuttavia, una volta che questa tecnica è ottimizzata da un individuo, possono essere utilizzate molte varianti di questo approccio. In primo luogo, l'approccio qui descritto permetterà ai ricercatori di esprimere i giornalisti con un giornalista lentivirus Cre-dipendente in collaborazione con cellule del donatore MGE di specifiche linee di Cre-driver. Questa tecnica può essere usata per valutare la morfologia delle cellule MGE singole o potenzialmente per esprimere un gene di interesse in differenti sottogruppi se un secondo gene è clonato nel vettore. In secondo luogo, può anche essere possibile utilizzare un virus Cre-esprimono con Cre-dipendente cellule reporter di MGE donatori o potentially utilizzare evoluzione elementi di DNA conservati, promotori e stimolatori, a guidare l'espressione in distinte popolazioni di cellule provenienti da una popolazione eterogenea.
Un futuro ostacolo da superare sarà etichettare le cellule staminali pluripotenti indotte umane di derivazione o cellule staminali embrionali potenzialmente purificare e / o di studio di un gruppo specifico di cellule. È interessante notare, esaltatori di DNA conservati possono essere utilizzati anche in sistemi di espressione virale di indirizzare neuroni GABAergici in colture primarie, dopo l'iniezione nella corteccia, e prima del trapianto di cellule MGE 15, 18, 19. Enhancers possono essere una risposta a questo ostacolo e saranno di interesse come strumenti molecolari, come sono necessarie nuove tecniche per studiare l'utilità di queste cellule in terapia. Infatti, incursioni a esaltatori scoprendo che potrebbero potenzialmente etichettare sia GABAergici interneuroni 20 o altri sottotipi neuronali, compresi i neuroni glutamatergici 21, sono in corso. Utilizzando il metodo di etichettatura virale qui,può essere possibile per trasdurre cellule differenziate staminali umane di derivazione con esaltatori di specifiche cellule del tipo di etichettare le cellule distinte di interesse prima del trapianto e in analisi vivo.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a JLRR da: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880, e NIMH R37 MH049428. PRW è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Science Council di Taiwan. SFS è stato sostenuto da F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
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