Summary
GABA能中间神经元皮质祖分散，开发和突触融入移植后的主机皮层。这些细胞可以移植在体内研究转基因GABA能前体的前容易地转导。这里，我们表明病毒标记技术到目标使用现有的Cre线和依赖于Cre的记者特定中间神经元亚群。
Abstract
GABA能皮质的interneurons，从胚胎内侧和尾神经节隆起（MGE和CGE）得出，在功能和形态多样。进展已在理解的不同的皮层中间神经元亚群的作用，但是，也有可能向不同类型的GABA能细胞的发育和成熟仍有许多机制来制定。此外，改变的GABA能信令可以有助于孤独症，精神分裂症和癫痫的表型。特异性表达Cre-驱动线已经开始包裹出独特的中间神经元亚群的功能。尽管在小鼠模型中的进步，它往往是难以有效地研究GABA能皮层中间神经元祖细胞与分子的方法在体内进行 。用于研究这些细胞的细胞中自主编程的一个重要的技术是移植的MGE细胞向宿主皮层。这些移植的细胞广泛迁移，分化，一第二功能集成。此外，MGE细胞可以有效地转导的慢病毒立即移植前，允许多种分子的方法。下面我们详细的协议移植体内分析之前，有效地转导MGE细胞，利用现有的Cre-驱动线和依赖于Cre的表达载体。这种做法是有利的，因为它结合了精确的遗传操作与这些细胞的分散移植后，允许在体内更大的细胞类型特异性的分辨率的能力。
Introduction
GABA能皮质的interneurons包括在哺乳动物大脑皮质的神经元〜20-30％，而其余的对应兴奋性，谷氨酸主要神经元。的interneurons在电生理特性，轴突和树突形态和突触目标1高度多样化，并在兴奋/抑制色调失衡假设是背后的神经/精神神经疾病，包括孤独症，精神分裂症和癫痫2部分的表型。本文所描述的协议的总体目标是提供对移植的体内分析之前有效地遗传修饰GABA能皮层中间神经元祖细胞的方法。
皮质GABA能中间是出生在内侧和尾神经节隆起（MGE和CGE，分别）3,4，以及视前区5。皮质中间神经元祖细胞经过长距离迁移切线后面通过放射状迁移，达到他们的最终目标。抵达目的地，这些皮质的interneurons必须正确集成到现有网络中的神经元，每个独特的中间神经元亚组会以特定的方式有助于皮质电路。四个主要子组，可以区分由分子标记：MGE衍生的促生长素抑制素（SST）+和小清蛋白（PV）+亚组，和CGE衍生血管活性肠肽（VIP）+和颤+; SST -亚组6。不同皮层中间神经元亚群都在MGE和CGE 7,8胚胎发育过程中所生了不同的时间。这些和其他皮质GABA能中间神经元标记物已被用于产生特异的Cre驱动线许多这些亚组9-11的。
MGE祖细胞的移植已成为一个潜在的基于细胞的疗法来治疗可通过不平衡引起的疾病励磁/抑制12 - 24。这些治疗益处可能部分是由于MGE祖细胞（分散，分化和整合入宿主脑），或可能是因为许多关节周围的体细胞抑制性的PV +细胞是从MGE衍生的独特能力。 MGE细胞也可以快速和有效地转导的移植15之前慢病毒，允许被遗传修饰在体外的细胞在体内进行研究。开发这种方法的原理是克服障碍在研究GABA能中间神经元皮质发育和成熟。特别是，移植的MGE允许研究人员研究突变的细胞在体内的发展，当突变小鼠将否则在早期时间点死亡。此外，通过引入移植前感兴趣的基因上的突变体的表型的特定基因的作用，可以在一个EFF评估icient方式。
在这里，我们提供了一个详细的协议转导的MGE细胞移植前的慢病毒。此外，我们显示如何这种技术可以适用于从皮层中间神经元前体的一组异质性表达在特定中间神经元亚群的目的基因，采用依赖于Cre的表达慢病毒和可用Cre的驱动鼠标线的组合。此外，该协议引入的技术和研究人员的一个平台，以基因修饰GABA能中间神经元的皮质前体的体内研究以独特的方式。这种技术比其他现有方法的一个优点是，移植的MGE细胞将分散远离注射部位。此外，与焦病毒注射后的MGE细胞分散它们的形态是更容易评估。这种方法可用于研究引入感兴趣基因引入野生型或突变体细胞中，引入的细胞类型特异性的效果记者评估形态，或潜在学习的疾病等位基因体内的效果。
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Protocol
伦理学声明：以下程序已通过我们的机构和动物的协议。确保获得批准，涉及生存手术开始实验前的所有程序，并确认所有的协议都是最新的。
1.慢病毒准备（可选步骤）
- 拆分HEK293T细胞的3个10 CM平板的每个慢病毒被制成，以10ml的DMEM / 10％FBS的存在下，并生长至〜60-70％汇合。生长的细胞在培养箱中在37℃，5％的CO 2。
- 转染以下DNA质粒（10微克总）转换成使用任何转染试剂各板：6.4微克CAG-FLEX-GFP的慢病毒载体（DNA载体序列在表1中提供），1.2微克pMD2.G（编码VSV-G），1.2微克PRSV-REV，和1.2微克pMDLg / pRRE。三个慢病毒包装载体是可商购的（表
注意：这种特殊的方法利用第三代lentivir人的载体，但第二代媒介和相关质粒也将正常工作。 - 准备包含BSL2认证罩内10％的漂白粉溶液灭活的联系，或包含任何慢病毒解决方案或设备废料容器。接下来，转染到漂白粉溶液后，彻底去除媒体4-6小时，更换新媒体的同一卷，并允许细胞生长。
- 后4天，收集培养基入50ml锥形管中并离心以1000×g离心15分钟以沉淀任何细胞碎片。接着，过滤所述上清液通过0.45μm的膜。任何低蛋白结合过滤器，如PVDF，效果很好。注意：将固体和液体废弃物病毒进入漂白粉溶液。
- 负载30毫升过滤的上清液到超速离心管并进入超速离心机。离心机以100,000×g离心2.5小时，在4℃。打开离心管中BSL2罩和上清到10％的漂白粉。添加〜100微升的PBS到PEllet，这将产生1×10 ^ 7-8传染性单位/ ml的滴度。分装在次日并且储存在-80ºC。慢病毒等份是稳定的，在-80℃下至少6个月。
- 重要的考虑因素：许多机构现在有病毒的核心。获得浓缩的病毒用1×10 7感染单位/ ml的滴度最低，以获得最佳的结果。
2.供体小鼠的MGE解剖
- 首先，建立了利益的Cre表达线，无论是野生型（WT）鼠标或鼠标，将表达Cre重组酶介导的重组后的记者之间的定时交配。
注：很多的Cre-驱动线转基因和维护，并孕育在半合状态。因此，只有一半的胚胎将包含酶Cre转基因。 DNA可从胚胎迅速准备一个短的PCR来检测酶Cre等位基因。所述酶Cre +胚胎然后可收获，使得所期望的基因型的仅MGE组织被使用。 Alternatively，一个依赖于Cre的报道，可以使用，以选择胚胎MGE解剖和移植。 - 计算这一天将对应于E13.5。如果动物配对前的晚上，插头的一天是0.5。为了定时孕鼠或WT女性，P1幼崽，以时间为出生后（P）1小鼠当天的供体组织将E13.5。另外，在房子配对供体动物的前一星期设置这些交配。
注意：产生两个E13.5和P1胚胎的前策略/幼仔为同一天往往很难做到可靠。
3.准备的媒体，工具和设备。
- 制备的试剂和工具的MGE细胞制剂（ 见表2）。
- 制备一个清洁的表面，并把清洁的镊子，剪刀以及一个显微刀或细镊子（用于精确组织解剖）的表面上。
- 制备Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中，f或剥离，并Dulbeco改进的Eagle培养基（DMEM）中，用10％胎牛surem（FBS），用于转导。
- 预温育20-30毫升的DMEM / 10％FBS在37℃组织培养箱进行约1小时。该盖应松开，以允许介质气体交换和pH平衡。
注：媒体可以预孵育刚开始解剖前准备。
4. MGE细胞的制备
- 根据批准的动物协议牺牲孕小鼠并取出胚胎成含有冰冷的HBSS 10cm的培养皿。
- 从使用解剖范围每个胚胎取出脑（做一次一个，留下的胚胎的其余部分在冰冷的HBSS）中，然后进行切出的MGE组织。
注意：下面详细，并在图1中 ，也展示了如何删除MGE关键步骤。另外， 图2是示出电影的整个解剖流程。- 定位大脑腹侧朝上（ 图1A，A“）。注意：它也还可以有背侧朝上。切开大脑中的一半沿矢状平面上以生成两片。一个例子切成对半的脑示（ 图1B，B'）中 ，请注意，背侧（上覆皮质）和脑盖腹侧方面和包围该神经节隆起（GE）的组织。
- 接着，用优势手，保持或者非常细的镊子或stabknife（ 表2），而固定带由非优势手保持镊子的半球。 （半球的内侧方面应朝上）。展开背，腹组织钳和刺一刀，露出底层的GE组织（ 图1C和图解图1C“）。
注意：删除从解剖培养皿一些媒体可以更容易稳定，而PE的组织rforming的MGE清扫。 - 使直线切割与stabknife或细镊子分离专家咨询小组，LGE和室间隔组织（见例如削减记为红色虚线， 图1D和D'）。这些切口可以以任何顺序进行。
注：想象一下，MGE的'盒子'被切出的周围组织。这样做有助于重复做类似的削减每个解剖，从而减少可变性的组织解剖。 - 最后，打开MGE在其一侧并修剪掉所述底部（什么是脑的外侧面）。这消除了MGE的地幔区（丢弃在图1E和1E'）从MGE的其余部分。 MGE其余方面主要包含脑室区和MGE，其中包含几乎所有的MGE祖细胞的脑室下区部分。当您的组织。
- 重要的考虑因素：添加硅氧烷凝胶至培养皿CA的底部ñ作为一个很好的剥离面，因为它可以保护镊子的细腻技巧，并提供了一个柔软的表面钉扎组织用钳子。
4.3其他策略MGE解剖。
- 削减使用镊子似剪刀，迅速取出脑胚胎的皮肤。作为胚胎规定在其一侧，保持所述组织在头部与用于锚定组织的钳子的基极。首先，切割前腹侧到大脑和后部腹侧到大脑，然后连接所述两个切口沿着胚胎的一侧。然后抓住皮肤的护翼并在大脑的顶部拉出。大脑然后可以迅速解剖远离剩余的组织。
- 可替代地，锚定皮质背后的全脑的后部的方面。同时，掌握每个半球的皮层的最背侧尾方面和撕裂皮层远离锚定组织中的前方向。以这种方式，使用Cortices可以被删除，双侧神经节隆起都显露出来，仍然附着于组织保持内侧 - 外侧解剖学的其余部分。
- 切换到刺一刀，使周围的MGE精确的削减对每个半球。使用一个单独的干净的一套镊子收集MGE或一大笔小费吸管（ 即 ，P1000）。
注意：保持组织收集远离所有其他剖分材料，作为当MGE收集一些媒体不可避免地转移。 - 收集MGE和把组织成含有DMEM / 10％FBS（500微升的体积是足以收集MGEs）1.5ml的收集管。重复其他半球的地方在同一个收集管。保持样品在冰上，直到所有组织收集。
5.慢病毒标签和移植
- 移动MGE组织的管成BSL2认证的发动机罩和取出介质。
注意：MGE组织是大到足以被肉眼可见的，并会沉降到管允许成为冷介质容易且轻轻除去的底部。 - 添加〜500微升的DMEM / 10％FBS的培养基中，该预孵育在37℃组织培养孵化器。接下来，添加凝聚胺以促进传导到每个管中以8微克/毫升的最终浓度。磨碎的MGE组织以建立一个单一的细胞悬浮液，使用的是P1000的枪头。最后，添加〜15-20微升浓缩慢病毒向每个管中。
- 重要的考虑因素：10-12倍甲研磨足以从单个胚胎分手MGE组织，但也可需要更triturations如果多个MGEs汇集在一起。尝试不同的研磨条件来决定什么效果最好。
- 盖紧每个试管，颠倒混合，比地方所有的管子在37℃的孵化器。孵育细胞中的慢病毒为至少30分钟和最多1小时。更长的时间导致德折痕细胞活力。反转管每隔10分钟，直到时间到了。
- 孵育慢病毒后，从孵化器和离心机在〜700×g离心试管3分钟以沉淀细胞。在BSL2罩，除去上清液并丢弃到10％的漂白剂。接着，加入1 ml的DMEM / 10％FBS和磨碎沉淀2-3次洗涤，然后再离心以相同的速度，以沉淀细胞。重复此洗涤步骤2-3多次，以除去过量的病毒。
注意：执行离心步骤在4℃下，然而，降低的生存力没有被观察到，当短的自旋都在室温进行。 - 最后一次洗涤后，除去尽可能多的介质尽可能并把各管在冰上。由于在管的侧面残留介质，〜2-3微升介质将最终由移植过程的开始时间覆盖细胞沉淀。
6.移植和验证
- 掌握主机P1的幼仔，并准备程序区域通过喷洒下来，用70％的乙醇。以在操作过程中保持无菌，建议在一个专用清洁过程室执行这些过程。另外，使用高压灭菌手术工具消毒表面，该幼仔将在接触与使用70％的乙醇。执行移植和有代表性的程序区所需代表性的设备的一个例子示于图3。
注意：虽然此步骤是注射小体积，并且不会在外科手术过程，将需要一个切口，开放性伤口或缝合线，它仍然是建议一个新微量用于每个鼠被注入。的微量是热拉和斜面上被喷上70％的乙醇被存储在密封容器中的表面时进行灭菌。
- 产生微量具有直径在前端40-80微米之间。以下这些方面将产生最佳结果。热灭菌微量时拉出并斜面上的表面和存储微量在密封容器中之前喷以70％的乙醇。
注意：可替代地，如果获得所需要创建这些针状物（ 表2）的装置是限制性的，可以使用任何其他注射装置。但是，这些可能不那么适合作为由于不同直径的微量。 - 制定矿物油成1ml注射器，并用一个30 1/2 G针，完全填满玻璃吸管与矿物油。接下来，安装活塞到立体定位装置，然后装上玻璃吸管的立体装置和负载到活塞。使用液压驱动器，移动大约一半柱塞进入玻璃吸管，除去矿物油泄漏出来，用干净干净的纸巾。
- 可替代地使用注射器，淹没在矿物油中的移液管的后端和填充通过毛细管作用。为了防止气泡在pipettE，维持注射器正压，直到完全脱离玻璃吸管。
注：其他的设备可以用来成功地移植MGE细胞14。任何设备，可提供一个容积超过或接近100 NL作品以及在此过程中少。
- 可替代地使用注射器，淹没在矿物油中的移液管的后端和填充通过毛细管作用。为了防止气泡在pipettE，维持注射器正压，直到完全脱离玻璃吸管。
- 接下来，使用消毒纸巾，或任何吸收材料，具有扭曲成一个细点的角落，微妙去除上面的MGE细胞沉淀多余的介质。这一步浓缩的细胞密度，以便较小的注射体积就可以实现。接下来，使用低容积（P2优先）吸管慢慢地拟定细胞沉淀和移动细胞悬液到疏水表面之前磨碎1-2次。量应略低于1微升。移动针进入细胞悬浮液的尖端，并使用液压驱动，绘制出细胞悬浮到吸管。
- 麻醉通过低温一个P1小狗（包装在一个乳胶手套，并雪藏了〜2-4分钟）。检查麻醉与有害刺激效果。捏脚趾之间的皮肤用细镊子：如果捏了一把小狗应该是反应迟钝。接着，将小狗到一个模具，它是注射装置之下，然后使由拉回皮肤上的头部，并与标准实验室胶带固定拉紧皮肤。
注：虽然低温是对新生小鼠，并导致低死亡率非常有效，程序必须要快，因为幼崽将开始在10分钟中恢复。此外，在冰上4分钟是什么是可以容忍的上限。试图只诱导低温一次，如果需要用于注射的时间较长。但是，如果小狗的早期复苏，首先让小狗再次引起体温过低前完全恢复。此外，仅诱导低温一个更多的时间来执行注射。幼崽将在低温5-10分钟恢复。这可以通过将垃圾，在妈妈的幼崽，或者将小狗在一个温暖的面传热提供便利E要恢复。 - 使用立体定位装置，定位玻璃吸管的尖端的表面上的小狗的头部，在垂直于头部的表面上。当吸移管是在与头部接触，认为这是“0”。接着，通过皮肤和颅骨插入皮层的表面推移液管，然后插入并停止之前缩回移液器〜2倍。为了获得最佳的细胞靶向到新皮质，注射时执行微量是在0.1毫米的深度。然而，这应该由用户进行优化（见下面的注释）。
注意：当该深度可靠地与上述设备的目标更深新皮层的层，几个深度应测试经验确定。此外，一系列的深度不同rostro-尾鳍和内 - 外位置应当进行测试，以确定是什么深度是最佳的在每个站点。另外，在初始穿刺应迅速，因为缓慢渗透到大脑皮层减弱的能力到cleanly穿透所述组织。尝试不同的速度时，首先启动该程序，找出最。此外，用于测试的坐标，没有真正的替代使用标记的细胞，如染料已经靠不住来表示的位置。 - 一旦针在位置，旋转液压装置来推进所述柱塞进入玻璃吸管，推细胞悬浮液的设定容积进皮层。注入每个站点50-70 NLS。重复此过程在3-6不同站点在不同的延髓 - 尾的水平，如果目标是获得细胞的整个皮层一个宽的分布。
注意：100 NL或更高的卷可能导致损伤和导致注射细胞未能有效地迁移出注射部位的大的团块。因此，较小的进样体积（〜70 NL或更少）是最优的，在更多的网站，如果时间允许。 - 当注射完成后，从舞台上拆下小狗并标记（趾裁剪是一种可靠的方式来识别PUPS更高版本）。一旦小狗已经恢复，并能够将其自己的（这种情况发生时从舞台中取出后几分钟内），把它带回了妈妈和垃圾。
注：由于这是一种微创手术，没有手术后的程序一旦小狗可自由移动和温暖。然而，幼仔应检查不仅程序，但也翌日，以确保后它们具有健康状况恶化的迹象。 - 开始的下一个小狗的过程之前，喷向下面积，用70％的乙醇，以保持无菌的工作区。允许注入的幼仔开发然后评估所述组织在适当的发育阶段（多个）。
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Representative Results
因为MGE细胞具有迁移并在移植到宿主新皮层16整合的独特能力，它们在体内的研究之前提供用于遗传操作的优良模型系统。这里，我们显示如何能够从E13.5胚胎分离的MGE组织（ 图1和2），然后可以用慢病毒在体外或在移植体内研究前一个快速的方式转导。通过慢病毒标记MGE已经使用了增强驾驶GFP的GABA能神经元15日前已执行。但是，表达能力从异质群体的基因特定亚群在移植前会大大有助于这些细胞的扩散和融合的研究。在此，我们寻求发展为目标的荧光蛋白质的表达，以一个特定的中间神经元的亚组，那些表达促生长素抑制素（SST）+的装置。
我们科幻首先亚克隆市售依赖于Cre的GFP报告（矢量信息， 表2）到一个慢病毒主链。该载体首先亚克隆含GFP从AAV载体loxP位两侧的磁带并将它连接到一个慢病毒载体骨干15使用XbaI和PflMI酶切位点，产生的（仅此录像带包含一些CAG启动子）。接着，在CAG启动子的其余部分从用SpeI和XbaI位点的PCAGGS哺乳动物表达载体切出，并连接入慢病毒载体内，产生的Plenti-CAG-FLEX-GFP的XbaI位点。 5'的插入SpeI位点是互补的XbaI和因而破坏了5'位点，而3'XbaI位点是保守。所得载体（架构图4A中 ，载体序列表1）中的第一个在体外酶Cre（ 体外测定法的模式， 图4B）的存在或不存在测试。 MGE从AI14 FLOX / + E13.5胚胎原代神经元培养和转导的慢病毒的组合。少至没有的GFP +或tdTomato +细胞，观察与CAG-FLEX-GFP的慢病毒（ 图4C，4F和4I）只转导。 TdTomato荧光存在于转用CMV-Cre重组慢病毒，表明Cre重组酶的表达（ 图4D，4G和4J）的MGE细胞。最后，共转导的MGE细胞导致许多tdTomato +细胞也表达GFP，表明CAG-FLEX-GFP的慢病毒正在如预期（ 图4E，4H和4K）。一些罕见的GFP +细胞，观察到没有tdTomato +，这可能是由于转导结合记者旁边的一个强启动子，占所有GFP +细胞<2％。
内容“移植到野生型宿主新皮质分散，成熟和整合入宿主皮层16 E13.5 SST-IRES-的Cre +> MGE细胞; AI14 FLOX / + MGE细胞在P1被移植到野生neocortices（架构， 图图5A）和它们的分布研究，在7天和35天移植后（DPT）。在这两个年龄段，tdTomato +细胞可以在整个新皮层（ 图5B和5C）所示。在图5B和5C的图像是利用MGE移植代表。细胞从一个单一的胚胎细胞进行测试如何有效MGE可以标记与SST-IRES-Cre重组+本文所述，MGE细胞协议; AI14 FLOX / +胚胎转导与CAG-FLEX-GFP慢病毒和移植的同样地，对于这些实验，〜15微升conce的ntrated慢病毒（〜1×10 7感染单位/毫升），利用与来自一个胚胎的每个移植组合MGEs。然后将这些细胞移植到P1的WT主机皮层和在7 DPT（ 图5D-5F）进行分析。移植的细胞（tdTomato +）的，大约20％为GFP +，表明转导与CAG-FLEX-GFP的慢病毒（ 图5G）。这些数据表明，用上述慢病毒的量和滴度，〜移植的MGE细胞的20％可被标记。病毒的量既可以减少或增加，或可能的其它变量，如病毒潜伏期的持续时间可以改变，以实现稀疏或密集的细胞标记。利用MGE组织从与CAG-FLEX-GFP的慢病毒结合一个依赖于Cre的记者鼠标线可以限制可通过免疫荧光进行探测的额外的标记的数目。因此，SST-IRES-Cre重组+ < / SUP> E13.5 MGE组织收集并以可视化所表达的Cre那些移植的MGE细胞转导的CAG-FLEX-GFP的慢病毒（将GFP +）。将这些细胞移植到P1的WT皮层和在35 DPT（见实验设计， 图6A），当成熟中间神经元标记物被表达的时间点进行评估。在35 DPT，〜的GFP +细胞的85％的共表达的SST，但只有〜4％表示光伏（ 图6B-6H）。这些数字是用SST-IRES-Cre的小鼠品系的谱系分析，这也命运映射一致〜光伏+细胞9（沃格特和鲁宾斯坦，未发表的结果）的5-10％。这些数据表明，MGE病毒标记是有效的，并且可以是一种适用的方法在体内分析之前引入一个记者或潜在的感兴趣的基因。
740fig1.jpg“/>
图1.代表程序的 MGE组织E13.5 MGE组织。例如清扫无论是小学文化或移植的清扫 。E13.5的大脑解剖（AE）的图像，和（A'-E'）图表突出结构和从腹侧方面来看，在步骤（A，A'）代表E13.5脑的重要步骤。红色线表示了第一关，这将hemisect大脑分为两部分：（B，B'）查看一个大脑半切。内侧的方面是可见的，与外侧面下来。从背皮层（蓝色）的组织覆盖在神经节隆起。此外，腹侧组织，将被删除的橙色显示。（C，C'）查看和插图覆组织后，露出神经节隆起已经剥离。（D，D'）的暴露神经节EMI同样的看法 nences如在（C，C'），但显示为红色的详细切割位点虚线。后MGE是根据表示在（D，D'）的线切出，所述组织被接通其一侧（E，E'）和外侧面被修剪掉并丢弃。在MGE组织的解剖和隔离代表性的步骤。缩写：（CGE）尾神经节隆起，（LGE）的横向神经节隆起（MGE）内侧ganglionice隆起。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2显示电影的E13.5 MGE清扫。影片描绘了一个去除脑部E13.5其次是后续的展开和去除覆组织的。在MGE标记并去除周围组织的削减是展现在逐步秩序。。 MGEdissect movie.mov“目标=”_空白“>请点击此处观看该视频。
图3.代表的程序区，例如注射针新生儿移植的。（A，A'）显示的示例设置完成移植到新生小鼠的图像。显微镜（1）位于上述一个阶段包含一个模具，可容纳一个新生小鼠（5）和一个立体定位装置（2）。（A'）的放大图像（A）示出用于保存立体装置的区域玻璃注射针（6）与插入的柱塞（7）。柱塞由一个细的液压驱动器（4）的控制和移动玻璃针，其介导向内和向外从针流内的矿物油。玻璃注射针（B）的实施例用一个斜尖。对于统治者（B），每个主要划分为100微米。所示物品（C）库存清单（A，A'）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 体外试验证明GFP表达从酶Cre的存在下CAG-FLEX-GFP的慢病毒。如何慢病毒CAG-FLEX-GFP载体工程酶Cre的存在下（A）的图式。（B）的图式主要MGE细胞培养实验，以评估是否慢病毒CAG-FLEX-GFP将表达GFP的细胞中的Cre表达。简要地说，从一个依赖于Cre的记者MGE细胞，AI14（表达tdTomato中铬的存在下e）中， 在体外生长和转导的Cre和/或Flex-GFP的慢病毒。（CK）E13.5的MGE初级培养物的该转导用CMV-CRE，CAG-FLEX-GFP或两者免疫荧光图像。培养成像原生tdTomato表达GFP和DAPI。在（K）比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
移植和转导，SST-IRES-Cre重组+图5.代表图像; AI14 FLOX / + MGE细胞。（A）的实验设计模式，以单独或慢病毒转导入野生型（WT）主机，（DPT）天后移植无论是MGE细胞移植后。简言之，将E13.5 SST-IRES-的Cre +; AI14 FLOX / + MGE细胞要么移植或转导的移植入WT neocortices之前CAG-FLEX-GFP的慢病毒，并在7 DPT评估（B，C）的免疫荧光图像neocortices在7或35 DPT示出代表性的MGE移植细胞（tdTomato +）。（DF）转导与CAG-FLEX-GFP的慢病毒在7 DPT评估的MGE细胞的免疫荧光图像。（G）的 tdTomato +细胞的比例的定量是表达绿色荧光蛋白在7 DPT。比例尺的（C）和（F）= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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E13.5 的CAG-FLEX-GFP慢病毒图6.代表性的图像转，SST-IRES-Cre重组+ MGE移植的共表达MGE派生的中间神经元群的标志。（A）架构SST-IRES-Cre重组+ MGE细胞采集和转导与CAG-FLEX-GFP慢病毒和移植到P1 WT主机的评估之前，大脑皮层在35 DPT。合并的代表性图像从移植主机表示的GFP表达的新皮层，从Flex矢量（B，E），共染色要么生长抑素（SST）（C）或小清蛋白（PV）（F）（D，G）图像共同用DAPI染色。GFP细胞的该共表达的SST或PV的比例（H）的定量。数据代表平均值±SEM（N）=（G）中3.比例尺= 100微米。/52740fig6large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
所述pLentiviral-CAG-FLEX-GFP DNA载体的表1中。FASTA文件。
| 试剂和设备MGE细胞制备和转导 | 目录＃ | 公司 | ||||||
| 1） | Dulbecco氏改进的Eagle培养基，用高浓度葡萄糖 | 12491-015 | Life Technologies公司 | |||||
| 2） | 热灭活胎牛血清 | 10437-077 | Life Technologies公司 | |||||
| 3） | Hanks平衡盐溶液（HBSS），无钙或镁 | 14170-112 | Life Technologies公司 | |||||
| 4） | 的1.5 ml离心管（或其他与盖收集管） | 3810X | Eppendorf公司国际 | |||||
| 5） | 凝聚胺 | SC-134220 | 圣克鲁斯生物技术 | |||||
| 6） | 捅一刀直22.5°（可选） | REF 72-2201 | 外科专业公司 | |||||
| 7） | 陪替氏培养皿（10厘米），用于组织解剖 | FB0875713 | Fisher Scientific公司 | |||||
| 8） | 2精尖镊子，像杜蒙＃5 | 11254-20 | 精细科学工具 | |||||
| 9） | 37℃组织培养箱中，用5％的CO 2的输入 | C150 | 粘结剂 | |||||
| 10） | 台式离心机，可旋转的1.5 ml离心管 | |||||||
| 11） | 任何P1000吸管可用于细胞研磨 | |||||||
| 12） | 生物安全2级罩 | |||||||
| 试剂和设备，用于在体外MGE初级培养 | 目录＃ | 公司 | ||||||
| 1） | 实验室TekII chamberslides有盖的8孔 | 154941 | 赛默飞世 | |||||
| 2） | 聚-L-赖氨酸0.1％重量/体积 | P8920 | Sigma Aldrich公司 | |||||
| 3） | 鼠标层粘连蛋白，0.5-2毫克/毫升 | 23017-015 | Life Technologies公司 | |||||
| 4） | Neurobasal培养基 | 21103-049 | Life Technologies公司 | |||||
| 5） | B27无血清补充 | 17504044 | Life Technologies公司 | |||||
| 6） | 谷氨酰胺，100倍的股票 | 35050-061 | Life Technologies公司 | |||||
| 7） | 青霉素 - 链霉素，100倍的库存 | 15070-063 | Life Technologies公司 | |||||
| 8） | 葡萄糖，（制备在水中的25％溶液） | G5400 | Sigma Aldrich公司 | |||||
| 试剂和设备MGE细胞移植 | 目录＃ | 公司 | ||||||
| 1） | 1ml注射器 | REF 309602 | BD，Becton Dickinson公司和公司 | |||||
| 2） | 30 1/2 G针 | 305106 | BD，Becton Dickinson公司和公司 | |||||
| 3） | 预Cision公司孔提供5微升（自带柱塞） | 5-000-1005 | 德拉蒙德科学公司 | |||||
| 4） | 封口膜 | PM-999 | 自Polysciences公司 | |||||
| 5）** | 立体显微镜boomstand | MZ6 | 徕卡 | |||||
| 6）** | 数字只小鼠立体定位仪 | 51725D | Stoelting公司 | |||||
| 7）** | 单轴油压精显微 | MO-10 | NARISHIGE | |||||
| 8） | 金刚石涂层旋转倒角 | 呐 | 在家里做 | |||||
| 9） | 针吸管TE拉马 | 730 | 科普夫仪器 | |||||
| 10） | 矿物油 | 呐 | 任何药店或药房 | |||||
| 11） | 任何移液器和技巧，可以reliaby措施1微升量 | |||||||
| **这是我们使用的特定型号，但许多其他的设置应该工作 | ||||||||
| Optiona升试剂（制作慢病毒） | 目录＃ | 公司 | ||||||
| 1） | 25mm时，0.45微米的过滤器 | 09-719B | Fisher Scientific公司 | |||||
| 2） | 超清晰的离心管（25×89毫米） | 344058 | 贝克曼Coulter® | |||||
| 3） | 脂质体2000 | （1.5毫升大小） | 11668019 | 英杰 | ||||
| 其它市售用品 | 目录＃ | 公司 | ||||||
| 1） | pMDLg / pRRE质粒编码GAG / POL | 12251 | Addgene | |||||
| 2） | PRSV-REV质粒编码版本 | 12253 | Addgene | |||||
| 3） | pMD2.G质粒编码VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4） | 质粒pAAV-FLEX-GFP | 28304 | Addgene | |||||
表2.库存的试剂和工具的列表。的市售试剂，包括媒体，清扫工具，具有代表性的设备进行移植和DNA载体的清单。 （NA）不可用或适用的。
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Discussion
从胚胎神经节隆起（GES）为基础的细胞治疗使用皮质GABA能中间神经元前体正显示出的承诺了很多条件，12 -1 4。需要精确的分子技术进行跟踪，并表示在特定的中间神经元亚组感兴趣的基因。在这里，我们提供了一个详细的协议，用于在移植前用慢病毒标记胚胎MGE细胞并展示如何这种技术可以用来表达的体内分析中的具体的皮层中间神经元亚群的兴趣基因。
本文描述的协议可以可靠地使用，然而，为了获得最佳再现性，必须坚持几个关键步骤。首先，对于病毒转导是有效的，生理温度和pH是必要的。如果这些参数都满足，MGE细胞可被转导在〜30分钟。其次，确保有，然后再继续密集MGE颗粒做了移植。这是很重要的，因为只有一个有限的体积可注入新生鼠脑在每个站点，而不会产生损害，且细胞将迁移远离注射部位，因此在移植时它们的密度是少一个令人关注的比可能预计。最后，运行一些测试条件与MGE细胞表达荧光记者，以确定哪些注射深度是最佳的。虽然这个协议所使用的MGE细胞，CGE细胞也可以以相同的方式使用。一个缺点是，有不限制表达整个CGE或到CGE衍生的interneurons特定亚组的许多Cre的驱动线路。然而，血管活性肠肽（VIP）9是一个可靠的Cre的线路可以用来分离出此子组CGE来源的细胞。随着新的线变得可用时，将有可能使用这个协议与多个遗传精度。
以前，我们和其他人已经表明通过电穿孔或用慢病毒15，17将基因导入的MGE细胞移植前。虽然这些技术均在导入基因用于体内分析有效的用途，MGE组织是异质的，产生了多个中间神经元亚群以及非神经元细胞4。此外，已经难以仅仅在特定的中间神经元的亚组以表达感兴趣的基因。很大的进步已产生了概括的许多皮质中间神经元亚群，包括表达模式的转基因株系，但不限于，SST-IRES-CRE，PV-IRES-CRE，PV-2A-Cre的一个ðVIP-Cre重组 9 -11，以及新线路的问世将有助于在未来阐明更多可能的人群。此外，与依赖于Cre的记者和表达载体，包括本文中所使用的依赖于Cre报道载体的产生，所关注的基因的一个更精确的表达可以实现。
一个限制该技术可能是一个可以可靠地包装成一慢病毒载体的片段的大小。此外，这种方法还没有被测试过自动增值服务。然而，一旦这一技术是由一个单独的最优化，也可以使用这种方法的许多变型。首先，这种方法描述这里将允许研究人员在特定的Cre-驱动线MGE供体细胞一起使用的依赖于Cre记者的慢病毒表达记者。这种技术可用于评估个体的MGE细胞的形态或潜在表达在不同亚组的目的基因，如果一个第二基因被克隆到载体中。其次，它也可能是使用一个Cre的表达与病毒依赖于Cre的记者MGE供体细胞或势的可行LLY利用不断变化的保守的DNA元素，启动子和增强，从一个异质群体带动细胞的不同人群的表达。
未来的障碍，以克服将被标记源于人的诱导多能干细胞或胚胎干细胞，以潜在地纯化和/或研究细胞的特定的组。有趣的是，保守的DNA增强剂，也可以使用病毒表达系统为目标在原代培养物GABA能神经元，注射到皮质后，和MGE细胞移植前15，18，19。增强子可以响应于这一障碍并会感兴趣的分子工具，新的技术要求来研究这些细胞在治疗中的效用。的确，侵蚀到发现增强剂可能潜在标记要么GABA能中间20或其他神经元亚型，包括谷氨酸能神经元21，正在进行。使用病毒标记方法在此，它可能会转导分化的人类来源的干细胞与细胞类型特异性增强剂移植前和体内分析来标记感兴趣的不同的细胞。
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Acknowledgments
这项工作是支持的补助，以JLRR：自闭症，尼娜爱尔兰，韦斯顿避风港基金会，NIMH R01 MH081880和NIMH R37 MH049428。 PRW是由来自台湾的国家科学委员会的奖学金支持。 SFS是由F32（MH103003）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
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