Summary
GABAergische corticale interneuron voorouders te verspreiden, te ontwikkelen en synaptically integreren in een gastheer cortex na transplantatie. Deze cellen kunnen gemakkelijk worden getransduceerd voor transplantatie in vivo studies van genetisch gemodificeerde GABAerge precursoren. Hier tonen we virale etikettering technieken om specifieke interneuron subgroepen met behulp van bestaande Cre lijnen en Cre-afhankelijke verslaggevers richten.
Abstract
GABAergische corticale interneuronen, afgeleid van de embryonale mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE), zijn functioneel en morfologisch divers. Vooruitgang hebben geboekt in het begrijpen van de rol van afzonderlijke corticale interneuronen subgroepen, maar er zijn nog vele mechanismen worden uitgewerkt die kunnen bijdragen aan de ontwikkeling en rijping van verschillende GABAerge cellen. Bovendien kan veranderd GABAerge signalering bijdragen aan fenotypen van autisme, schizofrenie en epilepsie. Specifieke Cre-driver lijnen zijn begonnen met het verkavelen van de functies van unieke interneuron subgroepen. Ondanks de vooruitgang in muismodellen, is het vaak moeilijk om efficiënt studeren GABAerge interneuronen corticale progenitorcellen met moleculaire benaderingen in vivo. Een belangrijke techniek die gebruikt wordt om de cel autonome programmering van deze cellen te bestuderen is transplantatie van MGE cellen in gastheer cortex. De getransplanteerde cellen migreren uitgebreid, differentiëren, eennd functioneel integreren. Bovendien kunnen MGE cellen efficiënt worden getransduceerd met lentivirus onmiddellijk voorafgaand aan transplantatie, waardoor een veelheid aan moleculaire benaderingen. Hier hebben we detail een protocol om efficiënt transduceren MGE cellen voor transplantatie voor in vivo analyse, met behulp van beschikbare Cre-driver lijnen en Cre-afhankelijke expressie vectoren. Deze benadering is voordelig omdat het een combinatie nauwkeurige genetische manipulatie het vermogen van deze cellen te verspreiden na transplantatie, waardoor grotere celtype bepaalde resolutie in vivo.
Introduction
GABAerge corticale interneuronen omvatten ~ 20-30% van neuronen in het zoogdier neocortex, terwijl het overige overeen met prikkelende, glutamaat OG neuronen. Interneuronen zijn zeer divers in elektrofysiologische eigenschappen, axon en dendriet morfologie en synaptische targeting 1, en onevenwichtigheden in prikkelende / remmende toon worden verondersteld om een aantal fenotypes van neurologische / neuropsychiatrische aandoeningen zoals autisme, schizofrenie en epilepsie 2 ten grondslag liggen. Het algemene doel van de hierin beschreven protocol is een middel om GABAerge interneuronen corticale progenitorcellen efficiënt genetisch modificeren vóór transplantatie in vivo analyse te verschaffen.
Corticale GABAergische interneuronen zijn geboren in de mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE, respectievelijk) 3,4 evenals de preoptic gebied 5. Corticale interneuron voorouders ondergaan lange afstand tangentiële migratie gevolgddoor radiale migratie naar hun uiteindelijke doelen te bereiken. Bij aankomst op de plaats van bestemming, moeten deze corticale interneuronen correct te integreren in het bestaande netwerk van neuronen, en elke unieke interneuron subgroep zal bijdragen aan corticale circuits op specifieke manieren. Vier belangrijke subgroepen kunnen worden onderscheiden door moleculaire markers: MGE-afgeleide somatostatine (SST) + en parvalbumine (PV) + subgroepen, en CGE-afgeleide vasoactieve intestinale peptide (VIP) + en Reelin +; SST - subgroepen 6. Verschillende corticale interneuronen subgroepen geboren op verschillende momenten tijdens de embryonale ontwikkeling in de MGE en CGE 7, 8. Deze en andere corticale GABAerge interneuronen merkers zijn gebruikt om specifieke Cre-driver lijnen voor veel van deze subgroepen 9-11 genereren.
De transplantatie van MGE progenitorcellen ontstaan als potentiaalvrij celtherapie stoornissen die kunnen worden veroorzaakt door onbalans behandelenin excitatie / inhibitie 12-24. Deze therapeutische voordelen kunnen deels te wijten aan het unieke vermogen van MGE voorlopers (te verspreiden, differentiëren en integreren in een gastheer hersenen), of potentieel omdat veel peri-somatische remmende PV + cellen afkomstig zijn van de MGE. MGE cellen kunnen ook snel en efficiënt getransduceerd met lentivirussen vóór transplantatie 15, waardoor cellen die genetisch gemodificeerd in vitro worden bestudeerd in vivo. De reden voor de ontwikkeling van deze aanpak was om wegversperringen in het bestuderen GABAergic corticale interneuron ontwikkeling en rijping te overwinnen. Vooral MGE transplantatie liet onderzoekers de ontwikkeling van mutante cellen in vivo onderzoeken bij de mutante muis anders zou gestorven in een vroeg tijdstip. Bovendien, door het introduceren genen van belang voor transplantatie, de effecten van specifieke genen op een mutant fenotype worden vastgesteld bij een efficient manier.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol te MGE transduceren met lentivirussen voorafgaand aan de transplantatie. Daarnaast tonen we hoe deze techniek kan worden aangepast om een gen van belang in specifieke interneuron subgroepen expressie uit een heterogene groep van corticale interneuronen voorlopers, met een combinatie van Cre-afhankelijke expressie lentivirussen en beschikbare Cre-driver muizenlijnen. Bovendien, dit protocol introduceert technieken en een platform voor onderzoekers genetisch GABAerge corticale interneuronen voorlopers in vivo studies wijzigen op een unieke manier. Een voordeel van deze techniek boven andere huidige benaderingen is dat de getransplanteerde cellen MGE weg van de injectieplaats uiteenvalt. Ook, in tegenstelling focale virale injecties, na MGE cellen verspreiden hun morfologie is gemakkelijker te beoordelen. Deze benadering kan worden gebruikt om het effect van het introduceren van genen van interesse in wildtype of mutante cellen introduceren van een celtype specifieke studiereporter morfologie beoordelen of potentieel het effect van ziekte allelen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring: De volgende procedures zijn door onze instelling en dier protocol goedgekeurd. Zorg ervoor dat u toestemming voor alle procedures waarin survival operaties voor het begin van experimenten te krijgen en controleren van alle protocollen zijn up-to-date.
1. Lentivirus Voorbereiding (optionele stap)
- Split drie 10 cm platen van HEK293T cellen voor elk lentivirus te maken, in aanwezigheid van 10 ml DMEM / 10% FBS, en groeien tot ~ 60-70% confluentie. Groeien cellen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Transfecteren de volgende DNA-plasmiden (10 pg totaal) in elke plaat met elke transfectie reagens: 6.4 ug CAG-Flex-GFP lentivirale vector (vector DNA sequentie verschaft in Tabel 1), 1,2 ug pMD2.G (codeert voor VSV-G), 1.2 ug pRSV-Rev, en 1,2 ug pMDLg / pRRE. De drie lentivirale verpakking vectoren zijn commercieel verkrijgbaar (Tabel
Opmerking: Deze bijzondere aanpak maakt gebruik van 3e generatie lentiviral vectoren maar 2e generatie vectoren en bijbehorende plasmiden zullen ook werken. - Bereid een afvalcontainer met een 10% bleekwater oplossing binnen een BSL2 gecertificeerde kap om eventuele oplossingen of apparaten die contact of bevatten lentivirus inactiveren. Volgende, volledig te verwijderen van de media 4-6 uur na transfectie in de bleekwater oplossing, vervangen met hetzelfde volume van nieuwe media, en laat de cellen om te groeien.
- Na 4 dagen, verzamel medium in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 15 min om alle celresten te pelleteren. Vervolgens, filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn membraan. Elke laag eiwit bindende filter, zoals PVDF, werkt goed. Let op: plaats zowel vaste als vloeibare virale afval in de bleekwater oplossing.
- Load 30 ml gefiltreerde bovenstaande in ultracentrifugebuizen en in een ultracentrifuge. Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 2,5 uur bij 4 ° C. Open de centrifuge buizen in een BSL2 motorkap en verwijder supernatant tot 10% bleekmiddel. Voeg ~ 100 pl PBS om het pellet, die titers van 1x10 ^ 7-8 infectieuze eenheden / ml oplevert. Aliquot de volgende dag en bewaar bij -80 ºC. Lentivirus aliquots zijn stabiel bij -80 ° C gedurende ten minste zes maanden.
- Belangrijke overweging: Veel instellingen hebben nu virale kernen. Verwerven geconcentreerde virus met een minimum titer van 1x10 7 infectieuze eenheden / ml, voor een optimaal resultaat.
2. donormuizen voor MGE Dissection
- Ten eerste, het opzetten van een getimede paring tussen een Cre-uiting lijn van rente en ofwel een wild-type (WT) muis of een muis die een verslaggever na Cre-gemedieerde recombinatie zal uiten.
Opmerking: Veel Cre-driver lijnen zijn transgene en worden onderhouden en getogen in de hemizygoot staat. Aldus zal slechts de helft van de embryo de Cre transgen bevatten. DNA kan snel worden bereid uit de embryo kort PCR om het Cre allel te detecteren. De Cre + embryo kan vervolgens worden geoogst zodat alleen de MGE weefsel van het gewenste genotype wordt gebruikt. Alternatitief kan een Cre-afhankelijke reporter worden gebruikt om de embryo's voor MGE dissectie en transplantatie selecteren. - Berekenen welke dag zal overeenkomen met E13.5. Als dieren vóór werden gekoppeld de avond, de dag van de plug is 0,5. Bestel timed-zwangere muizen of een WT vrouw met P1 pups om tijd met postnatale (P) 1 muizen op de dag dat de donor weefsel zal E13.5 zijn. Als alternatief, het opzetten van deze paringen in het huis van een week voorafgaand aan de donordieren koppelen.
Opmerking: De eerstgenoemde strategie genereren zowel E13.5 en P1 embryo / pups dezelfde dag vaak niet betrouwbaar te doen.
3. Voorbereiding van de Media, apparatuur en toebehoren.
- Bereid de reagentia en instrumenten voor MGE celpreparaat (tabel 2).
- Bereid een zuiver oppervlak en schoon forceps, scharen en hetzij een microchirurgische mes of fijne pincet (nauwkeurige weefseldissectie) op het oppervlak.
- Bereid Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), fof dissectie en middelgrote Dulbeco's gemodificeerd Eagle's (DMEM) met 10% foetaal runderserum surem (FBS) voor transductie.
- Preincubate 20-30 ml DMEM / 10% FBS in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 1 uur. Het deksel moet worden losgemaakt om voor gasuitwisseling en pH evenwicht van de media.
Opmerking: De media preïncubatie kunnen worden bereid net voor aanvang van de dissectie.
4. MGE Cell Voorbereiding
- Offeren de zwangere muis volgens een goedgekeurde dier protocol en verwijder de embryo's in een 10 cm petrischaaltje met ijskoude HBSS.
- Verwijder de hersenen van elk embryo met behulp van een dissectie scope (doe een tegelijk, waardoor de rest van het embryo in de ijskoude HBSS) en ga dan verder uit te snijden de MGE weefsel.
Opmerking: hieronder Gedetailleerde, en in figuur 1, zijn de belangrijkste stappen zien hoe de MGE verwijderen. Bovendien, figuur 2 een film met de volledige ontledingprocedure.- Plaats de hersenen met ventrale zijde naar boven (de figuren 1A, A '). Let op: het is ook goed om de dorsale zijde naar boven. Snijd de hersenen in de helft langs de saggitale vliegtuig naar twee stukken te genereren. Een voorbeeld hemisected hersenen wordt getoond (Figuur 1B, B '), merkt dat dorsale (de bovenliggende cortex) en ventrale aspecten van de hersenen dekking en rondom het ganglion eminence (GE) weefsel.
- Vervolgens, met een dominante hand de beide zeer fijne tang of stabknife (tabel 2), terwijl immobiliseren de halve bol met een tang gehouden door een niet-dominante hand. (Mediale aspect Het halfrond moet naar boven wijzen). Vouw de dorsale en ventrale weefsel met een pincet en een steek mes om de onderliggende GE weefsel (figuur 1C en schematisch in figuur 1C) onthullen.
Opmerking: Het verwijderen van sommige media van de dissectie petrischaal kan het gemakkelijker maken om het weefsel terwijl pe stabiliserenrforming de MGE dissectie. - Maak rechte sneden met de stabknife of fijne tang om de CGE, LGE en septale weefsels te scheiden (zie voorbeeld bezuinigingen aangegeven door rode stippellijnen, Figuren 1D en D '). Deze besparingen kunnen worden gemaakt in een willekeurige volgorde.
Opmerking: Stel je de MGE als een 'doos', dat is gesneden uit het omliggende weefsel. Dit helpt reproduceerbaar te maken vergelijkbaar bezuinigingen voor elke dissectie, waardoor de variabiliteit in weefsel dissecties verminderen. - Tot slot zet de MGE op zijn kant en trim van de bodem (wat was het laterale aspect van de hersenen). Dit verwijdert de mantel zone van de MGE (gooi in de figuren 1E en 1E ') van de rest van de MGE. De resterende aspect van MGE bevat voornamelijk ventriculaire zone subventriculaire zone gedeelten van de MGE, waarvan bijna alle MGE voorlopercellen bevat. Doorgaan met dit weefsel.
- Belangrijk overweging: De toevoeging van siliconengel onderaan een petrischaal can dienen als een uitstekende dissectie oppervlak beschermt de gevoelige uiteinden van forceps en verschaft een zacht aan pinnen weefsel met een pincet.
4.3 Aanvullende strategieën voor MGE Dissection.
- Snijd de huid van het embryo met behulp van een tang, zoals een schaar om snel de hersenen te verwijderen. Aangezien het embryo ligt op zijn kant, houdt het weefsel aan de basis van de kop met de tang gebruikt om het weefsel te verankeren. Eerste, snijd voorste ventrale naar de hersenen en achterste ventrale naar de hersenen, en sluit vervolgens de twee sneden langs de zijkant van het embryo. Dan grijp de flap van de huid en trek deze over de bovenkant van de hersenen. De hersenen kan dan snel worden ontleed van het restmateriaal.
- Als alternatief, verankeren het achterste deel van het hele brein achter de cortex. Ondertussen, pakt elk halfrond op de meest dorsale caudale aspect van de cortex en scheur de cortex weg van de verankerde weefsel in een anterieure richting. Op deze manier kan zowel cortices kan worden verwijderd en de bilaterale ganglion grootheden worden onthuld, nog aan de rest van het weefsel behouden de mediale-laterale anatomie.
- Schakelaar om de stab-mes om precies te zagen rond de MGE op elk halfrond te maken. Gebruik ofwel een aparte schone set tang om de MGE of een pipet met een grote tip (dwz., P1000) te verzamelen.
Opmerking: Bewaar het verzamelde weefsel weg van alle andere ontleed materiaal, zoals sommige media is onvermijdelijk overgedragen wanneer de MGE wordt verzameld. - Verzamel de MGE en plaats het weefsel in een 1,5 ml verzamelbuis DMEM / 10% FBS, (een volume van 500 gl voldoende is om de MGEs verzamelen). Herhaal dit voor het andere halfrond en plaats in dezelfde collectie buis. Houd monsters op ijs tot alle weefsel wordt verzameld.
5. Lentiviral etikettering en Transplantatie
- Beweeg de buizen van MGE weefsel in een BSL2 gecertificeerd motorkap en verwijder de media.
Opmerking: DeMGE weefsel groot genoeg zichtbaar voor het oog en zal naar de bodem van de buis waardoor de koude media gemakkelijk en voorzichtig verwijderd. - Voeg -500 ul DMEM / 10% FBS medium dat werd geïncubeerd in een 37 ° C weefselkweek incubator. Voeg vervolgens polybreen transductie aan elk buisje een eindconcentratie van 8 ug / ml vergemakkelijken. Vermaal de MGE weefsel om een enkele celsuspensie te maken met behulp van een P1000 pipetpunt. Voeg tenslotte ~ 15-20 ul geconcentreerd lentivirus aan elke buis.
- Belangrijk beoordeling: A trituratie 10-12 keer voldoende te breken MGE weefsel van een embryo, maar verwrijvingen kan nodig zijn als meerdere MGEs elkaar worden samengevoegd. Probeer verschillende aanwrijven voorwaarden om het beste bepalen wat werkt.
- Stevig te sluiten elke buis, omkeren om te mengen, dan plaats alle buizen in een 37 ° C incubator. Incubeer de cellen in lentivirus gedurende ten minste 30 minuten en tot 1 uur. Langere tijden hebben geleid tot degevouwen levensvatbaarheid van de cellen. Keer de buizen elke 10 minuten, totdat de tijd om is.
- Na incubatie met lentivirus, verwijdert de buizen uit de incubator en centrifugeer bij ~ 700 xg gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren. In de BSL2 kap, verwijder het supernatant af en gooi die in 10% bleekwater. Voeg vervolgens 1 ml DMEM / 10% FBS en vermaal de pellet 2-3 keer te wassen, opnieuw gecentrifugeerd bij dezelfde snelheid om de cellen te pelleteren daarna. Herhaal deze wash-stap 2-3 keer om overtollig virus te verwijderen.
Opmerking: Voer centrifugatiestappen bij 4 ° C, maar verminderde levensvatbaarheid werd niet waargenomen wanneer korte spins worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. - Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel media mogelijk en zet elke buis op ijs. Door resterende media aan de zijkanten van de buis, ~ 2-3 gl media eindigen voor de celpellet door de tijd transplantatie procedure begonnen.
6. Transplantation and Validation
- Verwerven gastheer P1 pups en voorbereiden van de proceduregebied door spuiten naar beneden met 70% ethanol. Om de steriliteit te behouden tijdens de procedure is het raadzaam om deze procedures uit te voeren in een speciale procedure schone kamer. Daarnaast gebruiken ofwel geautoclaveerd chirurgische instrumenten te steriliseren oppervlakken die de pups in contact met 70% ethanol. Een voorbeeld van representatieve apparatuur nodig transplantaties en een representatieve procedure stippellijn voeren wordt getoond in figuur 3.
Opmerking: deze procedure is een injectie van kleine volumes, en niet een chirurgische procedure die een insnijding, open wonden of hechtingen vereist, wordt het nog steeds aanbevolen dat een nieuwe micropipet wordt gebruikt voor elke muis worden geïnjecteerd. De micropipetten zijn warmte gesteriliseerd wanneer getrokken en afgeschuind op een oppervlak dat werd bespoten met 70% ethanol wordt opgeslagen in een verzegelde container.
- Genereer micropipetten tot een diameter aan de top hebben tussen de 40-80 micrometer. Naar aanleiding van deze afmetingen zal optimale opbrengstresultaten. Hitte steriliseren de micropipetten wanneer getrokken en afgeschuind op een oppervlak en spuit met 70% ethanol voor het opslaan van de micropipetten in een gesloten container.
Opmerking: Als alternatief, als toegang tot de inrichtingen die nodig zijn om deze naalden te maken (tabel 2) wordt beperkt, op een andere injectie-inrichting. Desalniettemin kunnen niet zo geschikt als de micropipetten gevolg van verschillende diameters. - Opstellen van minerale olie in een spuit van 1 ml, en met een 30 1/2 G naald, vul de glazen pipet met minerale olie. Mount vervolgens de zuiger op de stereotaxische apparaat en bevestig vervolgens de glazen pipet om de stereotaxische apparaat en de belasting op de zuiger. Met behulp van de hydraulische aandrijving, bewegen de zuiger ongeveer halverwege in de glazen pipet, het verwijderen van minerale olie die uit morsen met een schone een schone papieren handdoek.
- Als alternatief voor een injectiespuit, onderdompelen achterkant van de pipet in minerale olie en gevuld door capillaire werking. Om te voorkomen dat luchtbellen in het pipette handhaven positieve druk op de spuit totdat volledig uit de glazen pipet.
Opmerking: Andere apparaten kunnen worden gebruikt om MGE cellen 14 met succes te transplanteren. Elk apparaat dat kan leveren een volume kleiner dan of in de buurt van 100 nl werkt goed voor deze procedure.
- Als alternatief voor een injectiespuit, onderdompelen achterkant van de pipet in minerale olie en gevuld door capillaire werking. Om te voorkomen dat luchtbellen in het pipette handhaven positieve druk op de spuit totdat volledig uit de glazen pipet.
- Vervolgens gebruikt u een steriele papieren handdoek, of een absorberend materiaal, met de hoek gedraaid tot een fijne punt om delicaat verwijderen overtollige media boven de MGE cel pellet. Deze stap concentreert de celdichtheid zodat kleinere injectievolume worden bereikt. Vervolgens gebruikt u een laag volume (P2 heeft de voorkeur) pipet langzaam het opstellen van de cel pellet en vermaal 1-2 keer vóór het verplaatsen van de celsuspensie op een hydrofoob oppervlak. Het volume moet net onder 1 pl. Beweeg de punt van de naald in de cel schorsing en het gebruik van de hydraulische aandrijving, het opstellen van de celsuspensie in de pipet.
- Verdoven een P1 pup via onderkoeling (verpakken in een latex handschoen en op ijs gezet voor ~ 2-4 min).Controleren op effectiviteit van anesthesie met een schadelijke stimulus. Neem de huid tussen de tenen met fijne tang: de pup moet niet meer reageert als geknepen. Plaats vervolgens de pup op een schimmel die onder de injectie apparaat, dan maken de huid strak door terug te trekken van de huid op het hoofd en het beveiligen met standaard lab tape.
Opmerking: Terwijl onderkoeling is zeer effectief op neonatale muizen en resulteert in lage sterftecijfer, moet procedures snel worden gedaan, als pups zal beginnen te herstellen in minder dan 10 min. Daarnaast, 4 min op ijs is een bovengrens van wat kan worden getolereerd. Probeer alleen onderkoeling veroorzaken keer als er een langere tijd nodig is voor injecties. Echter, als een pup herstelt vroeg, eerst toestaan dat de pup zich volledig te herstellen voordat u opnieuw onderkoeling. Bovendien kunnen alleen onderkoeling één induceren meer tijd om injecties te voeren. Pups zullen herstellen binnen 5-10 min van onderkoeling. Dit kan worden vergemakkelijkt door het plaatsen van de pups met strooisel en moeder of door het plaatsen van de pup op een warme surface om te herstellen. - Met een stereotaxische apparaat, plaatst het uiteinde van de glazen pipet op het oppervlak op het hoofd van het jong, loodrecht op het oppervlak van de weg. Wanneer de pipet in contact met het hoofd, beschouwen dit als '0'. Vervolgens duw de pipet door het oppervlak van de huid en de schedel in de cortex, steek en trek de pipet ~ 2 keer alvorens te stoppen. Voor optimale targeting van cellen in de neocortex, worden injecties uitgevoerd wanneer de micropipet is op een diepte van 0,1 mm. Dit moet echter worden geoptimaliseerd door de gebruiker (zie opmerking hieronder).
Noot: Hoewel deze diepte betrouwbaar richt diepere neocorticale lagen met de hierboven beschreven inrichtingen, enkele diepten worden getest empirisch bepaald. Bovendien moet een reeks verschillende diepten rostro-caudale en medio-laterale positie worden getest om te bepalen welke diepte optimaal bij elke plaats. Ook moet de initiële punctie snel zijn, zo langzaam penetratie in de neocortex vermindert het vermogen tot cleanly doordringen in de weefsels. Probeer verschillende snelheden bij de eerste start van deze procedure te vinden wat het beste werkt. Bovendien, voor het testen coördinaten, is er geen echt alternatief voor het gebruik van gemerkte cellen, kleurstoffen onbetrouwbaar positie duiden zijn. - Zodra de naald in positie is, draait u de hydraulische apparaat aan op de zuiger verder te gaan in de glazen pipet, het duwen van een reeks volume van celsuspensie in de cortex. Injecteren 50-70 nls per site. Herhaal deze procedure in 3-6 verschillende plaatsen en op verschillende rostrale-caudale niveau als het doel is om een brede verdeling van cellen in de neocortex verkrijgen.
Opmerking: De volumes van 100 nl of groter kan letsels veroorzaken en leiden tot grote pollen van geïnjecteerde cellen die niet aan efficiënt migreren uit de injectieplaats. Zo kleinere injectievolumes (~ 70 nl of minder) zijn optimaal, dan meer sites als de tijd het toelaat. - Wanneer injecties zijn voltooid, verwijdert u de pup vanaf het podium en markeer deze (teen clipping is een betrouwbare manier om de p identificerenups later). Zodra de pup is hersteld en is in staat om te bewegen op zijn eigen (dit gebeurt binnen enkele minuten na het verwijderen ze van het podium), zet het terug met de moeder en nest.
Opmerking: Aangezien dit een minimaal invasieve procedure zijn er geen post-operatieve procedures zodra de pup vrij kan bewegen en opgewarmd. Toch moet pups worden gecontroleerd niet alleen na de procedure, maar ook de volgende dag te verzekeren dat ze geen tekenen van verslechterende gezondheid. - Voordat u begint met de procedure op de volgende pup, spuit naar beneden het gebied met 70% ethanol tot een steriel werkgebied te handhaven. Laat de geïnjecteerde pups te ontwikkelen en vervolgens het weefsel beoordeeld op de juiste ontwikkelingsfase (s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien MGE cellen hebben het unieke vermogen om te migreren en te integreren wanneer getransplanteerd in een gastheer neocortex 16, die een uitstekend model voor genetische manipulatie voor in vivo studies. Hierin tonen we hoe men MGE weefsel isoleren van E13.5 embryo (Figuren 1 en 2), die vervolgens worden getransduceerd met lentivirussen hetzij in vitro of in een snelle wijze voor transplantatie in vivo studies. Etikettering MGE via lentiviruses is uitgevoerd voordat u een versterker rijden GFP in GABAergic neuronen 15. De mogelijkheid om genen in specifieke subgroepen uit een heterogene populatie geven alvorens transplantatie sterk kunnen bevorderen studies van dispersie en integratie van deze cellen. Hierin, zochten wij een middel om expressie van een fluorescerend eiwit naar een specifiek interneuron subgroep, die somatostatine tot expressie (SST) + ontwikkelen.
We first gesubcloneerd een commercieel verkrijgbaar Cre-afhankelijke GFP reporter (vector informatie, tabel 2) in een lentivirale ruggengraat. De vector werd gemaakt door eerst subkloneren van de cassette die GFP geflankeerd door loxP plaatsen van de AAV vector en het ligeren in een lentivirale vector backbone 15 met Xbal en PflMI restrictieplaatsen (de cassette bevatte slechts enkele van de CAG promotor). Vervolgens wordt de rest van de CAG promotor werd uit een pCAGGS zoogdier expressievector met Spel en Xbal plaatsen en geligeerd in de XbaI-plaats van de lentivirale vector op pLenti-CAG-Flex-GFP genereren. De 5 'Spel-plaats van het inzetstuk complementair aan XbaI en aldus vernietigde de 5' plaats, terwijl de 3'-XbaI plaats werd geconserveerd. De resulterende vector (schema figuur 4A, vectorsequentie Tabel 1) werd eerst onderzocht in vitro in de aanwezigheid of afwezigheid van Cre (schema van in vitro assay, figuur 4B). MGE primaire neuronen van Ai14 Flox / + E13.5 embryo's werden gekweekt en getransduceerd met een combinatie van lentivirussen. Weinig tot geen GFP + of tdTomato + cellen waargenomen met alleen de transductie van de CAG-Flex-GFP lentivirus (Figuren 4C, 4F en 4I). TdTomato fluorescentie was aanwezig in de MGE cellen getransduceerd met een CMV-Cre lentivirus, indicatief voor Cre expressie (Figuren 4D, 4G en 4J). Tenslotte co-transductie van de cellen MGE geleid tot veel tdTomato + cellen die ook GFP tot expressie, wat aangeeft dat de KG-Flex-GFP lentivirus werkte zoals verwacht (Figuur 4E, 4H en 4K). Enkele zeldzame GFP + cellen waargenomen die niet tdTomato +, mogelijk vanwege de getransduceerde reporter waarin naast een sterke promotor, goed voor <2% van alle GFP + cellen.
content "> MGE cellen getransplanteerd in een wild-type gastheer neocortex verspreiden, volwassen en integreren in het gastland neocortex E13.5 SST-IRES-Cre + 16;. Ai14 Flox / + MGE-cellen werden getransplanteerd in WT neocortices op P1 (schema, Figuur 5A) en hun verdeling op 7 en 35 dagen na de transplantatie (DPT). Op beide leeftijden, kon tdTomato + cellen worden gezien tijdens de neocortex (figuren 5B en 5C) onderzocht. De beelden in de figuren 5B en 5C zijn representatief voor transplantaties met behulp van de MGE . cellen van een enkel embryo Om te testen hoe efficiënt MGE cellen kon met de hierin beschreven, MGE cellen van SST-IRES-Cre + protocol worden geëtiketteerd; Ai14 Flox / + embryo's werden getransduceerd met de CAG-Flex-GFP lentivirus en getransplanteerd in de op dezelfde wijze. Voor deze experimenten, ~ 15 pi concentrated lentivirus (~ 7 1x10 infectieuze eenheden / ml) werd gebruikt met de gecombineerde MGEs van één embryo per transplantatie. De cellen werden vervolgens getransplanteerd in een P1 WT gastheer cortex en 7 DPT (Figuren 5D-5F) geanalyseerd. Van de getransplanteerde cellen (tdTomato +), ongeveer 20% was GFP +, aangeeft transductie met de CAG-Flex-GFP lentivirus (Figuur 5G). Deze gegevens suggereren dat het bedrag en de titer van lentivirus hierboven beschreven, ~ 20% van getransplanteerde MGE cellen kunnen worden gelabeld. De hoeveelheid virus kan ofwel worden verlaagd of verhoogd, of mogelijk andere variabelen zoals duur van virale incubatie kan worden gewijzigd, om sparser of dichtere cel labeling bereiken.Met behulp van MGE weefsel van een Cre-afhankelijke reporter muis lijn in combinatie met de CAG-Flex-GFP lentivirus kan het aantal extra markers die kunnen worden gepeild door immunofluorescentie beperken. Daarom SST-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE weefsel werd verzameld en getransduceerd met CAG-Flex-GFP lentivirus om deze getransplanteerde MGE cellen die Cre tot expressie visualiseren (wordt GFP + zijn). Deze cellen werden getransplanteerd in P1 WT cortex en beoordeeld op 35 DPT (zie experimenteel design, figuur 6A), een tijdstip waarop volwassen interneuron markers worden uitgedrukt. Op 35 DPT, ~ 85% van GFP + cellen co-expressie SST, maar slechts ~ 4% uitgedrukt PV (figuren 6B-6H). Deze nummers komen overeen met de lineage analyse van de SST-IRES-Cre muis lijn, die eveneens lot toegewezen aan ~ 5-10% PV + cellen 9 (Vogt en Rubenstein, ongepubliceerde resultaten). Deze gegevens suggereren dat virale etikettering van MGE efficiënt en kan een toepasselijke benadering voor het invoeren van een reporter of potentieel een gen van interesse voor in vivo analyse.
740fig1.jpg "/>
Figuur 1. Vertegenwoordiger procedure voor de dissectie van E13.5 MGE weefsel. Voorbeeld dissectie van MGE weefsel voor zowel primaire culturen of transplantaties. (AE) afbeeldingen van E13.5 hersenen dissecties, en (A'-E ') schema om structuren te markeren en belangrijke stappen in de procedure. (A, A ') Vertegenwoordiger E13.5 hersenen bekeken vanuit het ventrale aspect. Rode lijn geeft de eerste snede gemaakt, die in de hersenen zal hemisect in twee stukken. (B, B ') Zicht op een brein hemisectie. De mediale aspect is zichtbaar, met laterale aspect beneden. Weefsel uit de dorsale cortex (blauwe kleur) ligt over het ganglion grootheden. Bovendien wordt ventrale weefsel dat wordt verwijderd oranje weergegeven. (C, C ') weergeven illustratie van de blootgestelde ganglion grootheden nadat overliggende weefsel is afgepeld. (D, D') Dezelfde Gezien blootgesteld ganglion emi nences als in (C, C '), maar met gedetailleerde zaagvlakken weergegeven als rode stippellijnen. Na MGE is uitgesneden volgens de regels aangegeven in (D, D '), wordt het weefsel zijn kant aanzetten (E, E') en de laterale aspect wordt afgesneden en weggegooid. Vertegenwoordiger stappen in de dissectie en isolatie van MGE weefsel. Afkortingen: (CGE) caudale ganglionische eminence, (LGE) laterale ganglionische eminence, (MGE) mediale ganglionice eminentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Film toont een E13.5 MGE dissectie. Film toont de verwijdering van een E13.5 hersenen gevolgd door achtereenvolgende ontvouwen en verwijdering van de bovenliggende weefsel. De MGE is gelabeld en de bezuinigingen op het omliggende weefsel te verwijderen zijn show een stapsgewijze volgorde.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger procedure gebied en het voorbeeld van de injectienaald voor neonatale transplantaties. (A, A ') De beelden tonen een voorbeeld setup om transplantaties uit te voeren in neonatale muizen. Microscoop (1) is gepositioneerd boven een podium met een schimmel die een neonatale muis (5) en een stereotaxische inrichting (2). (A) Een vergroot beeld van (A) toont het gebied van de stereotaxische apparaat dat geldt kunnen vasthouden de glazen injectienaald (6) met een geplaatste plunjer (7). De plunjer wordt door een fijne hydraulische aandrijving (4) en beweegt minerale olie in het glazen naald die naar binnen en naar buiten bemiddelt stromen van de naald. (B) Voorbeeld van een glazen injectienaald met een afgeschuinde tip. Voor de heerser in (B), elke belangrijke afbakening = 100 micrometer. (C) Inventaris lijst van punten in (A, A '). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. In vitro tests blijkt de expressie van GFP van een CAG-Flex-GFP lentivirus in aanwezigheid van Cre. (A) Schema van hoe de lentivirale CAG-Flex-GFP vector werkt in aanwezigheid van Cre. (B) Schema van primaire MGE celcultuur experiment om te beoordelen of de lentivirale CAG-Flex-GFP GFP in die cellen met Cre expressie zou uitdrukken. Kort MGE cellen van een Cre-afhankelijke reporter, Ai14 (drukt tdTomato in aanwezigheid van Cre) werden gekweekt in vitro en getransduceerd met Cre en / of Flex-GFP lentivirussen. (CK) Immunofluorescentie afbeeldingen E13.5 MGE primaire kweken die zijn getransduceerd met een CMV-Cre, CAG-Flex-GFP of beide. Culturen werden afgebeeld voor inheemse tdTomato expressie, GFP en DAPI. Schaal bar in (K) = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Vertegenwoordiger beelden van getransplanteerde en getransduceerde, SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + MGE-cellen. (A) Schema van de experimentele opzet om ofwel MGE cellen alleen of na lentivirale transductie in een wild-type (WT) gastheer, (DPT) dagen transplanteren na de transplantatie. Kort E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE-cellen werden ofwel getransplanteerd of getransduceerd met de CAG-Flex-GFP lentivirus vóór transplantatie in WT neocortices en beoordeeld 7 DPT (B, C) Immunofluorescentie afbeeldingen neocortices 7 of 35 DPT toont representatieve MGE getransplanteerde cellen (tdTomato +). (DF) Immunofluorescentie afbeeldingen MGE cellen getransduceerd met de CAG-Flex-GFP lentivirus beoordeeld 7 DPT. (G) Kwantificering van de hoeveelheid tdTomato + cellen die uitdrukken GFP op 7 DPT. Schaalbalken in (C) en (F) = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2740fig6.jpg "/>
Figuur 6. Representatieve beelden van CAG-Flex-GFP lentivirus getransduceerde, SST-IRES-Cre + MGE transplantaties dat co-express-MGE afgeleid interneuron subgroep markers. (A) Schema van E13.5 SST-IRES-Cre + MGE celoogst en transductie met een CAG-Flex-GFP lentivirus en transplantatie in de neocortex van de P1 WT gastheren voordat beoordeling op 35 DPT. Representatieve beelden van de neocortex van getransplanteerde gastheren toont expressie van GFP van de Flex vector (B, E), co-gekleurd voor hetzij somatostatine (SST) (C) of parvalbumin (PV) (F). (D, G) samengevoegd afbeeldingen co-gekleurd met DAPI. (H) Kwantificering van de hoeveelheid GFP cellen die co-express SST of PV. Gegevens stellen ± SEM (n) = 3. Schaal bar (G) = 100 um./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1. FASTA bestand van de pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA-vector.
| Reagentia en apparatuur voor MGE celpreparaat en transductie | Catalog # | Vennootschap | ||||||
| 1) | Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium met hoog glucosegehalte | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Hitte geïnactiveerd foetaal runderserum | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1,5 ml microcentrifuge buizen (of andereverzameling buizen met deksels) | 3810X | Eppendorf International | |||||
| 5) | Polybreen | sc-134220 | SantaCruz Biotechnologie | |||||
| 6) | Stab mes straight 22,5 ° (optioneel) | REF 72-2201 | Chirurgische specialismen corporatie | |||||
| 7) | Petrischaal (10 cm), voor het weefsel dissecties | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 fijne punt tang, zoals Dumont # 5 | 11.254-20 | Fijn Scientific Tools | |||||
| 9) | 37 ° C weefselkweek incubator met 5% CO 2-ingang | C150 | Binder | |||||
| 10) | Tafelblad centrifuge die kunnen draaien op 1,5 ml microcentrifugebuisjes | |||||||
| 11) | Elke P1000 pipet die kan worden gebruikt voor mobiele trituratie | |||||||
| 12) | Biosafety level 2 kap | |||||||
| Reagentia en apparatuur voor in vitro MGE primaire culturen | Catalog # | Vennootschap | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides met deksel, 8 goed | 154.941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poly-L-lysine 0,1% gewicht / volume | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Mouse laminine 0.5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neurobasal medium | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 serum gratis supplement | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, 100x voorraad | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicilline-streptomycine, 100x voorraad | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glucose, (bereid een 25% oplossing in water) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Reagentia en apparatuur voor MGE celtransplantatie | Catalog # | Vennootschap | ||||||
| 1) | 1 ml spuit | REF 309.602 | BD, Becton Dickinson and Company | |||||
| 2) | 30 1/2 G naald | 305.106 | BD, Becton Dickinson and Company | |||||
| 3) | PreCision boring tot 5 ul leveren (geleverd met zuiger) | 5-000-1005 | Drummond wetenschappelijke bedrijf | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Stereo microscoop met boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digitale net voor muizen stereotaxisch instrument | 51725D | Stoelting bedrijf | |||||
| 7) ** | Single-as olie hydraulische fijne micromanipulator | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamant roterende beveler | nvt | in huis | |||||
| 9) | Naald pipette puller | 730 | Kopf instrumenten | |||||
| 10) | Minerale olie | nvt | Elke drogist of apotheek | |||||
| 11) | Elke pipet en tips die maatregel kan reliaby 1 pl volume | |||||||
| ** Dit zijn de bijzondere modellen die we gebruiken, maar veel andere opstellingen zou moeten werken | ||||||||
| Optional Reagentia (voor het maken Lentivirussen) | Catalog # | Vennootschap | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 urn filter | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Ultra-heldere centrifuge buizen (25 x 89 mm) | 344.058 | Beckman Coulter | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml grootte) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Andere commercieel beschikbare voorraden | Catalog # | Vennootschap | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plasmide dat codeert voor gag / pol | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev plasmide dat codeert voor Rev | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plasmide codeert VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |||||
Tabel 2. Inventaris lijst van reagentia en gereedschappen. Een inventaris van in de handel verkrijgbare middelen, waaronder media, dissectie gereedschappen, vertegenwoordiger van apparatuur voor transplantatie en DNA vectoren. (Na) niet beschikbaar of van toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van GABAergische corticale interneuron voorlopers van de embryonale ganglion grootheden (GET) voor cellen gebaseerde therapieën toont belofte voor vele voorwaarden 12 -1 4. Precieze moleculaire technieken zijn nodig om bij te houden en een automatische genen van belang in specifieke interneuron subgroepen. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het labelen embryonale MGE cellen met lentivirussen vóór transplantatie en hoe deze techniek kan worden gebruikt om genen van interesse in specifieke corticale interneuronen subgroepen in vivo analyse drukken.
De hierin beschreven protocol betrouwbaar kunnen gebruikt, maar voor optimale reproduceerbaarheid is beslist aanhouden enige kritische stappen. Eerste virale transductie efficiënt zijn fysiologische temperatuur en pH noodzakelijk. Als deze parameters wordt voldaan, kan MGE cellen worden getransduceerd in ~ 30 minuten. Ten tweede, zorg ervoor om een dichte MGE pellet alvorens verder te gaan hebbenom een transplantatie te doen. Dit is belangrijk omdat slechts een beperkt volume kan worden geïnjecteerd in de neonatale muizenhersenen op elke plaats zonder dat beschadiging, en de cellen weg van de injectieplaats migreren, zodat de dichtheid op het moment van transplantatie is minder groot probleem dan misschien verwacht. Tenslotte lopen sommige testomstandigheden met MGE cellen die een fluorescerende reporter te bepalen welke injectie diepten zijn optimaal te uiten. Hoewel dit protocol MGE cellen kan CGE cellen worden gebruikt op dezelfde manier. Een nadeel is dat er weinig Cre-driver lijnen die expressie beperken tot de gehele CGE of bepaalde subgroepen van CGE-afgeleide interneuronen. Echter, de vasoactieve intestinale peptide (VIP) 9 een betrouwbare Cre lijnen die kunnen worden gebruikt om scheiden deze subgroep van CGE-afgeleide cellen. Als nieuwe lijnen beschikbaar komen, zal het mogelijk zijn om dit protocol met meer genetische precisie in dienst.
Eerder wij en anderen hebben aangetoondhet nut van het introduceren van genen in cellen voor transplantatie MGE via elektroporatie of lentivirus 15, 17. Hoewel deze technieken effectief bij introduceren van genen in vivo analyse waren MGE weefsel heterogeen en geeft aanleiding tot veelvoudige interneuron subgroepen en niet-neuronale cellen 4. Bovendien is het moeilijk om een gen van interesse tot expressie slechts in een bepaald interneuron subgroep. Grote vooruitgang geboekt op transgene lijnen die de expressiepatronen van verschillende corticale interneuronen subgroepen, waaronder recapituleren genereren, maar niet beperkt tot, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre een d VIP-Cre 9 -11, en de komst van nieuwe lijnen zal helpen verhelderen extra mogelijk bevolkingsgroepen in de toekomst. Bovendien, met de generatie van Cre-afhankelijke reporters en expressievectoren, zoals Cre-afhankelijke reporter vectoren hierin gebruikt, nauwkeuriger expressie van genen van belang kan worden bereikt.
Een beperking deze techniek kan de grootte van het fragment dat betrouwbaar kan bundelen tot een lentivirale vector zijn. Bovendien is deze benadering nog niet getest met AAV. Echter, wanneer deze techniek wordt geoptimaliseerd door een individu, vele variaties van deze benadering kan worden gebruikt. Ten eerste, de aanpak hier beschreven kunnen de onderzoekers aan verslaggevers uit te drukken met behulp van een Cre-afhankelijke reporter lentivirus in combinatie met MGE donorcellen van specifieke Cre-driver lijnen. Deze techniek kan worden gebruikt om de morfologie van afzonderlijke MGE cellen beoordelen of mogelijk aan een gen van interesse in verschillende subgroepen drukken als een tweede gen wordt gekloneerd in de vector. Ten tweede kan het ook mogelijk om een Cre-expressie virus worden met Cre-afhankelijke reporter MGE donorcellen of potent zijnlly gebruiken evoluerende geconserveerd DNA-elementen, promotors en enhancers, tot uitdrukking in verschillende populaties van cellen rijden van een heterogene populatie.
Een toekomstige hindernis te overwinnen wordt het labelen van mensen afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen of embryonale stamcellen om potentieel te zuiveren en / of studie een bepaalde groep cellen. Interessant kan geconserveerde DNA enhancers ook gebruikt bij virale expressiesystemen voor GABA-erge neuronen in primaire doel, na injectie in de cortex, en vóór transplantatie van MGE cellen 15, 18, 19. Enhancers kan een antwoord zijn op dit obstakel en zal plaats als moleculaire instrumenten, nieuwe technieken nodig zijn om het nut van deze cellen in therapie te bestuderen. Inderdaad, doorgedrongen tot het ontdekken van enhancers dat zou kunnen bestempelen ofwel GABAergic interneuronen 20 of andere neuronale subtypes, inclusief glutamatergische neuronen 21, zijn in volle gang. De virale labelingsmethode hierinkan het mogelijk zijn om gedifferentieerde menselijke afgeleide stamcellen met celtype-specifieke enhancers transduceren tot afzonderlijke cellen van belang etiket vóór de transplantatie en in vivo analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies te JLRR uit: Autism Speaks, Nina Ierland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 en NIMH R37 MH049428. PRW werd ondersteund door een beurs van de National Science Raad van Taiwan. SFS werd ondersteund door F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
