Summary
GABAergiska kortikal interneuronen stamceller skingra, utveckla och synaptically integreras i en värd cortex efter transplantation. Dessa celler kan lätt transduceras före transplantation för in vivo-studier av genetiskt modifierade GABAergiska prekursorer. Här visar vi virala märkningstekniker för att inrikta sig på specifika interneuronen undergrupper med hjälp av befintliga Cre linjer och Cre-beroende reportrar.
Abstract
GABAergiska kortikala interneuronen, som härrör från den embryonala mediala och stjärt ganglieblockerande höjder (MGE och CGE), är funktionellt och morfologiskt skiftande. Inbrytningar har gjorts i förståelsen roller distinkta kortikala interneuronen subgrupper, men det finns fortfarande många mekanismer som ska utarbetas som kan bidra till utveckling och mognad av olika typer av GABAergiska celler. Dessutom kan förändras GABAergic signalering bidra till fenotyper av autism, schizofreni och epilepsi. Specifika Cre-drivrutins linjer har börjat paket ut funktioner unika interneuronen undergrupper. Trots framstegen inom musmodeller, är det ofta svårt att effektivt studera GABAergiska kortikala interneuronen stamfäder med molekylära metoder in vivo. En viktig teknik som används för att studera cell autonoma programmeringen av dessa celler är transplantation av MGE celler i värd cortex. Dessa transplanterade celler migrerar i stor utsträckning, differentiera, ennd funktionellt integrera. Dessutom kan MGE celler effektivt omvandlas med lentivirus omedelbart före transplantation, vilket möjliggör en mängd molekylära metoder. Här har vi detalj ett protokoll för att effektivt omvandla MGE celler före transplantation för in vivo analys, med hjälp av tillgängliga Cre-förare linjer och Cre-beroende expressionsvektorer. Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt eftersom det kombinerar exakt genetisk manipulation med förmågan hos dessa celler att dispergera efter transplantation, vilket medger större celltypsspecifik upplösning in vivo.
Introduction
GABAergiska kortikala interneuronen omfattar ~ 20-30% av nervceller i däggdjur neocortex, medan resten motsvarar excitatoriska, glutamaterga huvud neuroner. Interneuronen är mycket skiftande i elektrofysiologiska egenskaper, axon och dendrit morfologi och synaptic inriktning 1, och obalanser i excitatoriska / hämmande tonen är en hypotes att ligga bakom vissa fenotyper av neurologiska / neuropsykiatriska störningar, inklusive autism, schizofreni och epilepsi 2. Det övergripande målet för det protokoll som beskrivs häri är att tillhandahålla ett sätt att effektivt genetiskt modifiera GABAergiska kortikala interneuronen gångare före transplantation för in vivo analyser.
Kortikal GABAerga interneuronen föds i de mediala och stjärt ganglieblockerande höjder (MGE och CGE, respektive) 3,4 samt preoptiska området 5. Kortikala interneuronen gångare genomgår långväga tangentiell migration följtgenom radiell migration för att nå sina slutliga mål. Vid ankomsten till sina destinationer, måste dessa kortikala interneuronen korrekt integreras i det befintliga neuronala nätverket, och varje unik interneuronen undergrupp kommer att bidra till kortikal kretsar på speciella sätt. Fyra huvudundergrupper kan urskiljas genom molekylära markörer: MGE-derived somatostatin (SST) + och parvalbumin (PV) + undergrupper, och CGE-härledda vasoaktiv intestinal peptid (VIP) + och Reelin +; SST - subgrupper 6. Olika kortikala interneuronen grupper föds över olika tider under fosterutvecklingen i MGE och CGE 7, 8. Dessa och andra kortikala GABAergic interneuronen markörer har använts för att generera specifika Cre-drivrutins linjer för många av dessa undergrupper 9-11.
Transplantation av MGE stamceller har vuxit fram som en potentiell cellbaserad terapi för att behandla sjukdomar som kan orsakas av obalanseri exciterings / hämning 12-24. Dessa terapeutiska fördelar kan bero delvis på den unika förmågan hos MGE stamceller (för att skingra, differentiera och integrera i en värd hjärnan), eller potentiellt eftersom många peri-somatiska hämmande PV + celler härrör från MGE. MGE celler kan också vara snabbt och effektivt omvandlas med lentivirus före transplantation 15, vilket gör att celler som är genetiskt modifierade in vitro som ska studeras in vivo. Den logiska grunden för att utveckla detta tillvägagångssätt var att övervinna hinder i att studera GABAergic kortikal interneuronen utveckling och mognad. Särskilt MGE transplantation får forskare att studera utvecklingen av muterade celler in vivo, när mutant musen annars skulle ha dött i ett tidigt tidpunkt. Dessutom, genom att införa gener av intresse innan transplantation, effekterna av specifika gener på en mutantfenotypen kunde bedömas på ett efficient sätt.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för att omvandla MGE celler med lentivirus före transplantation. Dessutom visar vi hur denna teknik kan anpassas för att uttrycka en gen av intresse i specifika interneuronen grupper från en heterogen grupp av kortikala interneuronen prekursorer, med hjälp av en kombination av Cre-beroende uttryck lentivirus och tillgängliga Cre-driver mus linjer. Dessutom införs detta protokoll tekniker och en plattform för forskare att genetiskt modifiera GABAergiska kortikal interneuronen prekursorer för in vivo-studier på ett unikt sätt. En fördel med denna teknik jämfört med andra aktuella metoder är att de transplanterade MGE cellerna kommer skingra bort från injektionsstället. Dessutom, till skillnad fokala virala injektioner, efter MGE celler sprider deras morfologi är lättare att bedöma. Kan användas Detta tillvägagångssätt för att studera effekten av att införa gener av intresse i vildtyp eller mutanta celler, införande av en celltyp specifikreporter att bedöma morfologi, eller potentiellt för att studera effekten av sjukdoms alleler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Följande procedurer har godkänts av vår institution och djurprotokoll. Se till att få godkännande för alla förfaranden som rör överlevnads operationer innan experiment och kontrollera alla protokoll är uppdaterade.
1. Lentivirus Preparation (valfritt steg)
- Split tre 10 cm plattor av HEK293T celler för vardera lentivirus som skall göras, i närvaro av 10 ml DMEM / 10% FBS, och växa till ~ 60-70% konfluens. Odla celler i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Transfektera följande DNA-plasmider (10 pg totalt) till varje platta med användning av någon transfektionsreagens: 6,4 ug CAG-Flex-GFP lentivirusvektor (DNA-vektor-sekvens som tillhandahålls i tabell 1), 1,2 | ig pMD2.G (kodar VSV-g), 1,2 ug pRSV-Rev, och 1,2 mikrogram pMDLg / pRRE. De tre lentivirala förpackningar vektorer är kommersiellt tillgängliga (Tabell
Obs: Denna speciella metod använder 3: e generationen lentiviral vektorer men 2nd generation vektorer och tillhörande plasmider kommer också att arbeta. - Förbered en avfallsbehållare som innehåller en 10% blekmedel lösning inom en BSL2 certifierad huva för att inaktivera eventuella lösningar eller enheter som kontaktade eller innehåller lentivirus. Nästa, helt ta bort media 4-6 tim efter transfektion in i blekmedel, ersätta med samma volym av nya medier, och låta cellerna att växa.
- Efter fyra dagar, samla material i 50 ml koniska rör och centrifugera vid 1000 xg under 15 min till pellets varje cellrester. Nästa, filtrera supernatanten genom ett 0,45 | im membran. Alla låg proteinbindningsfilter, som PVDF, fungerar bra. Varning: plats både fast och flytande viral avfall i blekmedel.
- Last 30 ml filtrerad supernatanten i ultracentrifugrör och in i en ultracentrifug. Centrifugera vid 100.000 xg under 2,5 h vid 4 ° C. Öppna centrifugrör i en BSL2 huva och avlägsna supernatanten i 10% Bleach. Lägg ~ 100 l PBS till peLLET, vilket ger titrar av 1x10 ^ 8/7 infektiösa enheter / ml. Alikvotera följande dag och förvara vid -80 ºC. Lentivirus portioner är stabila vid -80 ° C under minst sex månader.
- Viktig faktor: Många institutioner har nu virala kärnor. Förvärva koncentrerat virus med ett minimum titer av 1x10 7 infektiösa enheter / ml, för optimala resultat.
2. Donor Möss för MGE Dissection
- Först, skapa en tidsinställd parning mellan en Cre-uttrycklinjen av intresse och antingen en vildtyp (WT) mus eller en mus som kommer att uttrycka en reporter efter Cre-medierad rekombination.
Obs: Många Cre-förare linjer är transgena och underhålls och uppvuxna i hemizygot staten. Således kommer endast hälften av embryona innehålla Cre-transgenen. DNA kan snabbt framställas från embryona för en kort PCR för att detektera Cre allelen. CRE + embryon kan sedan skördas så att endast MGE vävnaden av den önskade genotypen används. Alternatitivt kan en Cre-beroende reporter användas för att välja de embryon för MGE dissekering och transplantation. - Beräkna vilken dag kommer att motsvara E13.5. Om djuren parade kvällen före, är dagen av pluggen 0.5. Beställ tt-dräktiga möss eller en WT hona med P1 valpar för att tiden med postnatal (P) 1 möss på dagen donatorvävnaden blir E13.5. Alternativt inrätta dessa parningar i hus en vecka före parning donatordjuren.
Obs: Den tidigare strategin att generera både E13.5 och P1 embryon / valpar för samma dag är ofta svårt att göra tillförlitligt.
3. Beredning av media, verktyg och utrustning.
- Förbered reagensen och verktyg för framställning MGE cellen (tabell 2).
- Förbered en ren yta och placera rena pincett, sax och antingen en mikrokirurgisk kniv eller fin pincett (för exakt vävnad dissektion) på ytan.
- Förbered Hanks balanserade saltlösning (HBSS), feller dissektion, och Dulbeco modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt bovint surem (FBS), för transduktion.
- Preinkubera 20-30 ml DMEM / 10% FBS i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator under ca 1 h. Locket ska lossas för att möjliggöra gasutbyte och pH-jämvikt av medierna.
Obs! Media preinkubation kan förberedas strax innan dissekering.
4. MGE Cell Förberedelser
- Offra den gravida musen enligt godkänd djur protokoll och ta bort embryon till en 10 cm petriskål med iskall HBSS.
- Ta hjärnan från varje embryo med hjälp av en dissekera omfattning (gör en i taget, medan resten av de embryon i iskallt HBSS) och sedan fortsätta att skära ut MGE vävnaden.
Obs: Detaljerad nedan och i figur 1, är viktiga steg som visar hur du tar bort MGE. Dessutom är fig 2 en film som visar hela dissektionförfarande.- Placera hjärnan med ventrala sidan uppåt (figur 1A, A '). Obs: det är också okej att ha ryggaspekten uppåt. Skär hjärnan i hälften längs saggital planet att generera två stycken. Ett exempel hemisected hjärna visas (Figur 1B, B '), märker att rygg (den överliggande cortex) och ventrala aspekter av hjärnan täcker och omger ganglionär eminens (GE) vävnad.
- Nästa, med en dominerande handen, håll antingen väldigt fin pincett eller en stabknife (tabell 2), medan immobilisera halvklotet med pincett som innehas av en icke-dominanta handen. (Den halvklotet s mediala aspekten ska vara vänd uppåt). Fäll ut den dorsala och ventrala vävnad med pincett och ett hugg kniv för att avslöja den underliggande GE vävnad (Figur 1C och i diagramform i Figur 1C).
OBS: Ta bort vissa medier från dissektion petriskål kan göra det lättare att stabilisera vävnaden medan performing MGE dissektion. - Gör raka snitt med stabknife eller fin pincett för att separera CGE, LGE och septala vävnader (se exempel nedskärningar betecknas med röda streckade linjer, figurer 1D och D '). Dessa nedskärningar kan göras i valfri ordning.
OBS: Tänk MGE som en "låda" som skärs ut från den omgivande vävnaden. Om du gör det hjälper reproducerbart göra liknande nedskärningar för varje dissektion, vilket minskar variationen i vävnads dissektioner. - Slutligen slår MGE på sidan och trimma bort botten (vad som var den laterala aspekten av hjärnan). Detta tar bort manteln zon MGE (släng i figurerna 1E och 1E ') från resten av MGE. Resterande del av MGE innehåller främst kammar zon och subventrikulära zonen delar av MGE, som innehåller nästan alla MGE progenitorceller. Fortsätt med denna vävnad.
- Viktig faktor: Tillägget av silikongel till botten av en petriskål can fungera som en utmärkt dissekering yta eftersom den skyddar den känsliga tips av pincett och ger en mjuk yta för klämma fast vävnad med pincett.
4.3 Ytterligare strategier för MGE Dissection.
- Skär huden av embryot med pincett som en sax för att snabbt ta bort hjärnan. Som embryot lägger på sin sida, håller vävnaden vid basen av huvudet med pincett används för att förankra vävnad. Först skär anterior ventrala till hjärnan och bakre ventrala till hjärnan, och anslut sedan de två snitten längs sidan av embryot. Greppa sedan flik av hud och dra den över toppen av hjärnan. Hjärnan kan då snabbt dissekeras bort från den kvarvarande vävnaden.
- Alternativt, förankra den bakre aspekten av hela hjärnan bakom cortex. Under tiden, ta tag varje hemisfär på den mest dorsala caudal aspekt av hjärnbarken och riva cortex bort från den förankrade vävnaden i en anterior riktning. På detta sätt kan både cortices kan tas bort och de bilaterala ganglieblockerande höjder avslöjas, fortfarande sitter i resten av vävnaden bevara den mediala-laterala anatomi.
- Växla till knivhugg-kniv för att göra exakta snitt runt MGE på varje halvklotet. Använd antingen en separat ren uppsättning pincett för att samla in MGE eller en pipett med en stor spets (dvs., P1000).
Obs: Håll insamlade vävnaden bort från alla andra dissekerade material, som vissa media oundvikligen överförs när MGE samlas. - Samla MGE och placera vävnaden i en 1,5 ml uppsamlingsrör innehållande DMEM / 10% FBS, (en volym av 500 | il är tillräckligt för att samla in de MGEs). Upprepa för den andra halvklotet och plats i samma provrör. Håll prover på is tills all vävnad uppsamlas.
5. Lentiviral märkning och transplantation
- Flytta rören i MGE vävnad i en BSL2 certifierad huva och ta bort media.
Obs!MGE vävnad är tillräckligt stor för att vara synliga för ögat och kommer att lösa till botten av röret möjliggör de kalla media för att vara lätt och försiktigt bort. - Lägg ~ 500 ul DMEM / 10% FBS-medium, blev det förinkuberades i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator. Därefter lägger polybren för att underlätta transduktion till varje rör vid en slutlig koncentration av 8 ug / ml. Triturera MGE vävnad för att skapa en enkelcellsuspension, med användning av en P1000 pipettspetsen. Slutligen lägger ~ 15-20 l koncentrerad lentivirus till varje rör.
- Viktig faktor: En rivning av 10-12 gånger är tillräckligt för att bryta upp MGE vävnad från en enda embryo, men fler triturationerna kan behövas om flera MGEs poolas ihop. Prova olika pulverisering villkor för att avgöra vad som fungerar bäst.
- Stänga ordentligt varje rör, invertera att blanda, än plats alla rören i en 37 ° C inkubator. Inkubera cellerna i lentivirus under åtminstone 30 minuter och upp till en timme. Längre tider har resulterat i deskrynkligt cellviabilitet. Vänd rören var 10 min tills tiden är slut.
- Efter inkubering med lentivirus, avlägsna rören från inkubatorn och centrifugera vid ~ 700 xg under 3 min för att pelletera cellerna. I BSL2 huva, avlägsna supernatanten och kassera in 10% blekmedel. Nästa, tillsätt 1 ml DMEM / 10% FBS och mal sönder pelleten 2-3 gånger för att tvätta, centrifugera igen vid samma hastighet för att pelletera cellerna. Upprepa detta tvätt steg 2-3 flera gånger för att avlägsna överskott viruset.
OBS: Utför centrifugeringssteg vid 4 ° C, dock minskad lönsamhet har inte observerats vid korta spins utförs vid RT. - Efter den slutliga tvätten, ta bort så mycket media som möjligt och sätta varje rör på is. På grund av att kvarvarande medier på sidorna av röret, ~ 2-3 | il av media kommer att hamna täcker cellpelleten med tiden som transplantationsförfarandet har börjat.
6. Transplantation och validering
- Förvärva värd P1 valpar och förbereda förfarandetområde genom besprutning ned med 70% etanol. För att bibehålla sterilitet under förfarandet rekommenderas att utföra dessa förfaranden i en särskild ren förfarande rum. Dessutom använder antingen autoklave kirurgiska verktyg sterilisera ytor som valparna kommer att vara i kontakt med hjälp av 70% etanol. Ett exempel på representativa utrustning som behövs för att utföra de transplantationer och ett representativt förfarande området visas i figur 3.
OBS: Även om detta förfarande är en injektion av små volymer, och inte ett kirurgiskt ingrepp som skulle kräva ett snitt, öppet sår eller suturer, är det fortfarande rekommenderas att en ny mikropipett används för varje mus som ska injiceras. De mikropipetter är värmesteriliseras när dras och avfasade på en yta som sprutades med 70% etanol lagras i en sluten behållare.
- Generera mikropipetter för att ha en diameter vid spetsen mellan 40-80 | im. Efter dessa dimensioner kommer att ge optimalresultat. Heat sterilisera mikropipetter när dras och avfasade på en yta och spraya med 70% etanol innan lagra mikropipetter i en sluten behållare.
Obs: Alternativt, om tillgång till de enheter som behövs för att skapa dessa nålar (tabell 2) är begränsande, använda någon annan insprutningsanordning. Men dessa kanske inte är så väl lämpade som mikropipetter på grund av olika diametrar. - Upprätta mineralolja i en 1 ml spruta, och med en 30 1/2 G nål, fylla glaspipett helt med mineralolja. Därefter montera kolven på stereotaxic enhet, fäst sedan glaspipett till stereotaxic enhet och belastning på kolven. Med hjälp av hydrauliska enheten, flytta kolven ungefär halvvägs in i glaset pipett avlägsna mineralolja som spiller ut med en ren en ren pappershandduk.
- Alternativt till att använda en spruta, dränka den bakre änden av pipetten i mineralolja och fylls genom kapillärverkan. För att förhindra luftbubblor i pipette, upprätthålla positivt tryck på sprutan tills helt ur glaspipett.
Obs: Andra enheter kan användas för att framgångsrikt transplantera MGE celler 14. Varje enhet som kan leverera en volym mindre än eller i närheten av 100 nl fungerar bra för detta förfarande.
- Alternativt till att använda en spruta, dränka den bakre änden av pipetten i mineralolja och fylls genom kapillärverkan. För att förhindra luftbubblor i pipette, upprätthålla positivt tryck på sprutan tills helt ur glaspipett.
- Nästa, använd en steril pappershandduk eller något absorberande material, med hörnet tvinnas till en fin spets för att försiktigt avlägsna överskott medier ovanför MGE cellpelleten. Detta steg koncentrerar celldensiteten så att kan uppnås mindre injektionsvolymer. Nästa, använd en låg volym (P2 är att föredra) pipett långsamt utarbeta cellpelleten och mal sönder 1-2 gånger innan du flyttar cellsuspension på en hydrofob yta. Volymen bör vara strax under 1 pl. Flytta spetsen på nålen i cellsuspensionen och använda den hydrauliska enheten, utarbeta cellsuspensionen i pipetten.
- Söva en P1 valp via hypotermi (linda in i en latexhandske och sätta på is för ~ 2-4 min).Kontrollera om effektivitet anestesi med en skadlig stimulus. Nyp ihop huden mellan tårna med fin pincett: valpen ska inte svarar om kläm. Placera sedan valpen på en form som är under injektions enheten och sedan göra huden spänd genom att dra tillbaka huden på huvudet och säkra med standard lab tejp.
Obs: När hypotermi är mycket effektiv på nyfödda möss och ger låg dödlighet, ska rutiner göras snabbt, eftersom valpar kommer att börja återhämta sig på under 10 minuter. Dessutom 4 min på is är en övre gräns för vad som kan tolereras. Försök att bara framkalla hypotermi gång om det krävs en längre tid för injektionsvätskor. Men om en valp återhämtar tidigt, först låta valpen att återhämta sig helt innan inducera hypotermi igen. Dessutom bara framkalla hypotermi en gång för att utföra injektioner. Valpar kommer att återhämta inom 5-10 min av hypotermi. Detta kan underlättas genom att placera valparna med strö och mamma eller genom att placera valpen på en varm surface att återhämta sig. - Med hjälp av en stereotaktisk anordning, placera spetsen på glaspipett på ytan på pup huvud, vinkelrätt mot ytan på huvudet. När pipetten är i kontakt med huvudet, betrakta detta som "0". Därefter trycker pipetten genom ytan av huden och skallen i hjärnbarken, sedan in och dra tillbaka pipetten ~ 2 gånger innan den stannar. För optimal inriktning av celler in i hjärnbarken, är injektioner utförs när mikropipett är på ett djup av 0,1 mm. Detta bör dock optimeras av användaren (se anmärkning nedan).
OBS: Även om detta djup riktar tillförlitligt djupare hjärnbarkens lager med de anordningar som beskrivs ovan, bör några djup testas empiriskt. Dessutom bör en rad djup vid olika rostro-kaudala och medio-sidoläge testas för att avgöra vilket djup är optimal vid varje plats. Dessutom bör den initiala punkteringen vara snabb, eftersom långsam inträngning i neocortex minskar förmågan att cleanly penetrera vävnaden. Pröva olika hastigheter när man börjar denna procedur för att hitta vad som fungerar bäst. Dessutom, för att testa koordinater, finns det inget verkligt alternativ till användning av märkta celler, såsom färgämnen har varit otillförlitligt för att beteckna positionen. - När nålen är i läge, rotera den hydrauliska anordningen för att föra in kolven i glaspipett, driver en bestämd volym av cellsuspension i cortex. Injicera 50-70 nls per plats. Upprepa denna procedur vid 3-6 olika platser vid olika rostralt-caudal nivåer om målet är att få en bred spridning av celler i hela neocortex.
Anm: Volymer av 100 nl eller större kan orsaka lesioner och leda till stora klumpar av injicerade celler som misslyckas med att effektivt migrera ut från injektionsstället. Således mindre injektionsvolymer (~ 70 nl eller mindre) är optimala, över fler platser om tiden tillåter. - När injektioner är klar, ta bort valpen från scenen och markera det (toe klippning är ett tillförlitligt sätt att identifiera pups senare). När valpen har återhämtat sig och kan röra sig på egen hand (detta inträffar inom några minuter att ta bort dem från scenen), lägger tillbaka med mamma och strö.
Notera: Eftersom detta är ett minimalt invasiv förfarande finns det inga postoperativa procedurer när valpen är fritt rörliga och värmde. Dock bör valpar kontrolleras inte bara efter ingreppet, men även följande dag för att försäkra att de inte har några tecken på försämrade hälsa. - Innan du börjar proceduren på nästa valp, spraya ner området med 70% etanol för att upprätthålla ett sterilt arbetsområde. Låt de injicerade valparna att utveckla och sedan utvärdera vävnaden vid lämplig utvecklingsstadium (s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom MGE celler har en unik förmåga att migrera och integrera när transplanteras in i en värd neocortex 16, ger de ett utmärkt modellsystem för genetisk manipulation innan in vivo-studier. Häri visar vi hur man kan isolera MGE vävnad från E13.5 embryon (figurer 1 och 2), som sedan kan transduceras med lentivirus antingen in vitro eller i ett snabbt sätt före transplantation för in vivo-studier. Märkning MGE via lentivirus har utförts innan du använder en förstärkare driver GFP i GABAerga neuron 15. Men förmågan uttrycka gener i specifika undergrupper från en heterogen population innan transplantation kan till stor hjälp studier av dessa celler "spridning och integration. Häri, försökte vi utveckla ett sätt att rikta expression av ett fluorescerande protein till en specifik interneuronen subgrupp, de som uttrycker somatostatin (SST) +.
Vi fiRST subklonat en kommersiellt tillgänglig Cre-beroende GFP reporter (vektorinformation, tabell 2) i en lentiviral ryggrad. Vektorn genererades genom först subkloning av kassett innehållande GFP flankerad av loxP-ställen från AAV-vektor och ligera det in i en lentivirusvektor ryggrad 15 med användning av Xbal- och PflMI restriktionsställen, (denna kassett innehöll endast en del av CAG-promotorn). Därefter tillsattes resten av CAG-promotorn exciderades från en pCAGGS däggdjursexpressionsvektor med Spel och Xbal-ställen och ligerades in i Xbal-stället i lentivirusvektorn att generera pLenti-CAG-Flex-GFP. Den 5 'Spel-ställe för skäret är komplementär till Xbal och därmed förstörde 5', medan det 3 'Xbal-stället var konserverade. Den resulterande vektorn (schema figur 4A, vektorsekvens Tabell 1) testades först in vitro i närvaro eller frånvaro av Cre (schema av analys in vitro, Figur 4B). MGE primära neuroner från Ai14 Flox / + E13.5 embryon odlades och omvandlas med en kombination av lentiviruses. Få eller ingen GFP + eller tdTomato + celler observerades med enbart transduktion av CAG-Flex-GFP lentivirus (Siffrorna 4C, 4F och 4I). TdTomato fluorescens var närvarande i MGE celler transducerade med en CMV-Cre lentivirus, indikativ för Cre-uttryck (fig 4D, 4G och 4J). Slutligen samar transduktion av MGE celler resulterade i många tdTomato + celler som också uttryckte GFP, vilket indikerar att CAG-Flex-GFP lentivirus arbetade som förväntat (figur 4E, 4H och 4K). Några sällsynta GFP + celler observerades att inte tdTomato +, eventuellt på grund av den omvandlade reportern innehåller bredvid en stark promotor, som stod för <2% av alla GFP + celler.
innehåll "> MGE celler transplanterade in i en vild typ värd neocortex skingra, mogna och integreras i värd neocortex 16 E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE celler transplanteras in WT neocortices på P1 (schema, figur 5A) och deras fördelning undersöktes vid 7 och 35 dagar efter transplantationen (DPT). Vid båda åldrar, kunde tdTomato + celler ses hela neocortex (Siffrorna 5B och 5C). Bilderna i figurerna 5B och 5C är representativa transplantationer utnyttjar MGE . celler från en enda embryo vill testa hur effektivt MGE celler kan märkas med det protokoll som beskrivs häri, MGE celler från SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + embryon transducerades med CAG-Flex-GFP lentivirus och transplanteras i samma sätt. För dessa experiment, ~ 15 ul av concentrated lentivirus (~ 1x10 7 infektiösa enheter / ml) användes med de kombinerade MGEs från ett embryo för varje transplantation. Cellerna sedan transplanteras in i en P1 WT värd cortex och analyseras på 7 DPT (Siffrorna 5D-5F). Av de transplanterade cellerna (tdTomato +), ca 20% var GFP +, vilket indikerar transduktion med CAG-Flex-GFP lentivirus (Figur 5G). Dessa data tyder på att med den mängd och titer av lentivirus beskrivits ovan, ~ 20% av transplanterade MGE celler kan märkas. Mängden virus kan antingen minskas eller ökas, eller potentiellt andra variabler såsom varaktighet viral inkubation kan ändras, för att uppnå glesare eller tätare cellmärkning.Använda MGE vävnad från en Cre-beroende reporter mus linje i samband med CAG-Flex-GFP lentivirus kan begränsa antalet ytterligare markörer som kan sonderas genom immunofluorescens. Därför, SST-IRES-Cre + < / Sup> E13.5 MGE vävnad uppsamlades och transducerades med CAG-Flex-GFP lentivirus i syfte att visualisera dessa transplanterade MGE celler som uttryckte Cre (blir GFP +). Dessa celler transplanteras in P1 WT cortex och bedömas vid 35 DPT (se experimentell design, figur 6A), en tidpunkt då mogna interneuronen markörer uttrycks. Vid 35 DPT, ~ 85% av GFP + celler samuttryckt SST, men bara ~ 4% uttryckt PV (Siffrorna 6B-6H). Dessa siffror överensstämmer med härstamning analys av SST-IRES-Cre mus linjen, vilket också öde kartor till ~ 5-10% av PV + celler 9 (Vogt och Rubenstein, opublicerade resultat). Dessa data tyder på att virus märkning av MGE är effektiv och kan vara en tillämplig metod för att införa en reporter eller potentiellt en gen av intresse innan in vivo analys.
740fig1.jpg "/>
Figur 1. Representant förfarande för dissekering av E13.5 MGE vävnad. Exempel dissektion av MGE vävnad för antingen primära kulturer eller transplantationer. (AE) Bilder från E13.5 hjärnan dissektioner, och (A'-E ') scheman för att markera strukturer och viktiga steg i proceduren. (A, A ') representant E13.5 hjärnan sedd från ventrala aspekten. Röd linje markerar den första snittet görs, vilket kommer hemisect hjärnan i två bitar. (B, B ') Vy över en hjärn hemisection. Den mediala aspekten är synlig, med laterala aspekten ner. Vävnad från den dorsala cortex (blå färg) ligger över ganglieblockerande höjder. Dessutom är ventral vävnad som kommer att tas bort visas i orange. (C, C ') Visa och illustration av de exponerade ganglieblockerande höjder efter liggande vävnad har skalat bort. (D, D') Samma syn på utsatta ganglionär emi nences som i (C, C '), men med detaljerade skurna platser visas som röda streckade linjer. Efter MGE skärs ut i enlighet med de linjer som betecknas i (D, D '), är vävnaden på högkant (E, E') och den laterala aspekten trimmas av och kastades. Representativa steg i dissekering och isolering av MGE vävnad. Förkortningar: (CGE) caudal ganglionär eminens, (LGE) lateral ganglionär eminens, (MGE) mediala ganglionice berömmelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Film visar en E13.5 MGE dissektion. Film skil avlägsnande av ett E13.5 hjärnan följt av efterföljande utbredning och avlägsnande av den överliggande vävnad. MGE märks och de nedskärningar för att avlägsna omgivande vävnad är show i en stegvis ordning.. MGEdissect movie.mov "target =" _ blank "> Klicka här för att se filmen.
Figur 3. Representant förfarande området och exempel på injektionsnål för neonatal transplantationer. (A, A ') bilder som visar ett exempel setup för att utföra transplantationer i neonatala möss. Ett mikroskop (1) är belägen ovanför en scen innehållande en form som kan hålla en neonatal mus (5) och en stereotaxisk anordning (2). (A ') En förstorad bild av (A) visar området av stereotaxic enhet som innehåller glasinjektionsnål (6) med en införd kolv (7). Kolven styrs av en fin hydraulisk enhet (4) och flyttar mineralolja inom glaset nålen som förmedlar in- och utflödet från nålen. (B) Exempel på en glasinjektionsnål med en avfasad spets. För linjalen i (B), varje större avgränsning = 100 nm. (C) Inventering lista med objekt som visas i (A, A '). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. In vitro-tester visar expressionen av GFP från en CAG-Flex-GFP lentivirus i närvaro av Cre. (A) Schema för hur Lentiviral CAG-Flex-GFP-vektorn fungerar i närvaro av Cre. (B) Schema av primär MGE cellodling experiment för att bedöma om den lentiviral CAG-Flex-GFP skulle uttrycka GFP i dessa celler med Cre uttryck. I korthet MGE celler från en Cre-beroende reporter, Ai14 (uttrycker tdTomato i närvaro av Cre), odlades in vitro och omvandlas med Cre och / eller Flex-GFP lentiviruses. (CK) Immunofluorescerande bilder av E13.5 MGE primära kulturer som omvandlats med en CMV-Cre, CAG-Flex-GFP eller båda. Kulturer avbildas för infödda tdTomato uttryck, GFP och DAPI. Skala bar i (K) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa bilder av transplanterade och omvandlade, SST-IRES-Cre +; Ai14 Flox / + MGE celler. (A) Schema för experimentell design för att transplantera antingen MGE celler enbart eller efter lentiviral transduktion i en vild typ (WT) värd, (DPT) dagar efter transplantation. Kortfattat, E13.5 SST-IRES-Cre +;. Ai14 Flox / + MGE celler antingen transplanterade eller omvandlade med CAG-Flex-GFP lentivirus innan transplantation till WT neocortices och bedömas vid 7 DPT (B, C) immunofluorescent bilder av neocortices på 7 eller 35 DPT visar representativa MGE transplanterade celler (tdTomato +). (DF) Immunofluorescerande bilder av MGE celler omvandlade med CAG-Flex-GFP lentivirus värderas till 7 DPT. (G) Kvantifiering av andelen tdTomato + celler som uttrycka GFP vid 7 DPT. Skala barer i (C) och (F) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2740fig6.jpg "/>
Figur 6. Representativa bilder av CAG-Flex-GFP lentivirus transducerad, SST-IRES-Cre + MGE transplantationer som samarexpress MGE-härledda interneuronen gruppsmarkörer. (A) Schema för E13.5 SST-IRES-Cre + MGE cellskörd och transduktion med en CAG-Flex-GFP lentivirus och transplantation i neocortex i P1 WT värdar innan bedömning vid 35 DPT. Representativa bilder från neocortex av transplanterade värdarna som visar uttryck av GFP, från Flex-vektorn (B, E), co-färgades för antingen somatostatin (SST) (C) eller parvalbumin (PV) (F). (D, G) Sammanslagna bilder samar färgas med DAPI. (H) Kvantifiering av hur stor andel av GFP celler som co-express SST eller PV. Data representerar ± SEM, (n) = 3. Skalstreck i (G) = 100 | am./52740fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. FASTA fil av pLentiviral-CAG-Flex-GFP DNA-vektor.
| Reagenser och utrustning för beredning och transduktion MGE cell | Katalog # | Företag | ||||||
| 1) | Dulbeccos Modified Eagle Medium med hög glukos | 12491-015 | Life Technologies | |||||
| 2) | Värmeinaktiverat fetalt bovint serum | 10437-077 | Life Technologies | |||||
| 3) | Hanks balanserade saltlösning (HBSS), inget kalcium eller magnesium | 14170-112 | Life Technologies | |||||
| 4) | 1,5 ml mikrocentrifugrör (eller annanuppsamlingsrör med lock) | 3810X | Eppendorf International | |||||
| 5) | Polybren | sc-134220 | Santacruz Biotechnology | |||||
| 6) | Stab kniv rakt 22,5 ° (tillval) | REF 72-2201 | Kirurgiska specialiteter corporation | |||||
| 7) | Petriskål (10 cm), för vävnads dissektioner | FB0875713 | Fisher Scientific | |||||
| 8) | 2 fina spets pincett, som Dumont # 5 | 11254-20 | Fina vetenskapliga verktyg | |||||
| 9) | 37 ° C vävnadsodlingsinkubator med 5% CO 2 ingång | C150 | Bindemedel | |||||
| 10) | Bordscentrifug som kan snurra 1,5 ml mikrorör | |||||||
| 11) | Varje P1000 pipett som kan användas för cell finfördelning | |||||||
| 12) | Skyddsnivå 2 huva | |||||||
| Reagenser och utrustning för in vitro MGE primära kulturer | Katalog # | Företag | ||||||
| 1) | Lab-TekII chamberslides med lock, 8 väl | 154941 | Thermo Fisher | |||||
| 2) | Poly-L-lysin 0,1% vikt / volym | P8920 | Sigma Aldrich | |||||
| 3) | Muslaminin, 0,5-2 mg / ml | 23017-015 | Life Technologies | |||||
| 4) | Neurobasal-medium | 21103-049 | Life Technologies | |||||
| 5) | B27 serumfritt tillägg | 17504044 | Life Technologies | |||||
| 6) | Glutamax, 100x lager | 35050-061 | Life Technologies | |||||
| 7) | Penicillin-streptomycin, 100x lager | 15070-063 | Life Technologies | |||||
| 8) | Glukos, (framställa en 25% lösning i vatten) | G5400 | Sigma Aldrich | |||||
| Reagenser och utrustning för MGE celltransplantation | Katalog # | Företag | ||||||
| 1) | 1 ml spruta | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and Company | |||||
| 2) | 30 1/2 G nål | 305106 | BD, Becton Dickinson and Company | |||||
| 3) | Precision borrningen för att leverera 5 pl (levereras med kolven) | 5-000-1005 | Drummond Scientific Company | |||||
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |||||
| 5) ** | Stereomikroskop med boomstand | MZ6 | Leica | |||||
| 6) ** | Digital precis för möss stereotaktiska instrument | 51725D | Stoelting företag | |||||
| 7) ** | Single-axeln olja hydraulisk fina mikromanipulator | MO-10 | Narishige | |||||
| 8) | Diamant belagda roterande beveler | na | gjort i kammaren | |||||
| 9) | Needle pipettte avdragare | 730 | Kopf Instruments | |||||
| 10) | Mineralolja | na | Varje apotek eller apoteket | |||||
| 11) | Varje pipett och tips som kan reliaby åtgärd 1 l av volym | |||||||
| ** Dessa är de speciella modeller vi använder, men många andra inställningar bör arbeta | ||||||||
| Optional Reagenser (för att göra Lentiviruses) | Katalog # | Företag | ||||||
| 1) | 25 mm, 0,45 um filter | 09-719B | Fisher Scientific | |||||
| 2) | Ultra tydliga centrifugrör (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |||||
| 3) | Lipofectamine 2000 | (1,5 ml storlek) | 11668019 | Invitrogen | ||||
| Andra kommersiellt tillgängliga leveranser | Katalog # | Företag | ||||||
| 1) | pMDLg / pRRE plasmid kodande gag / pol | 12251 | Addgene | |||||
| 2) | pRSV-Rev plasmid kodande Rev | 12253 | Addgene | |||||
| 3) | pMD2.G plasmid kodande VSVG | 12259 | Addgene | |||||
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |||||
Tabell 2. Inventering lista över reagenser och verktyg. En inventering av kommersiellt tillgängliga reagenser inklusive media, dissektion verktyg, representativ utrustning för transplantation och DNA-vektorer. (Na) Ej tillgängligt eller tillämpligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av GABAergiska kortikal interneuronen prekursorer från embryonala ganglieblockerande höjder (GES) för cellbaserade terapier visar löftet för många villkor 12 -1 4. Exakta molekylära tekniker behövs för att spåra, och uttrycka gener av intresse i specifika interneuronen undergrupper. Här ger vi ett detaljerat protokoll för märkning embryonala MGE celler med lentivirus före transplantation och visa hur denna teknik kan användas för att uttrycka gener av intresse för specifika kortikala interneuronen undergrupper för in vivo analys.
Protokollet som beskrivs häri kan tillförlitligt användas, men det är viktigt för optimal reproducerbarhet att följa några viktiga steg. Först, för viral transduktion för att vara effektiv, fysiologisk temperatur och pH är nödvändiga. Om dessa parametrar är uppfyllda, kan MGE celler transduceras i ~ 30 minuter. För det andra, se till att ha en tät MGE pellet innan du fortsätteratt göra en transplantation. Detta är viktigt eftersom endast en begränsad volym kan injiceras i den neonatala musen hjärnan på varje plats utan att skada uppstår, och cellerna kommer att migrera bort från injektionsstället, så deras densitet vid tiden för transplantation är ett mindre problem än vad som kan vara förväntat. Slutligen, köra några testförhållanden med MGE celler som uttrycker en fluorescerande reporter att avgöra vad injektion djup är optimala. Även om detta protokoll som används MGE celler, kunde CGE celler också användas på samma sätt. En nackdel är att det inte finns många Cre-drivrutin linjer som begränsar uttrycket till hela CGE eller särskilda undergrupper av CGE-härledda interneuronen. Emellertid vasoaktiv intestinal peptid (VIP) 9 är en pålitlig Cre-linje som kan användas för att separera ut denna undergrupp av CGE-härledda celler. Som nya linjer blir tillgängliga, kommer det att vara möjligt att använda detta protokoll med mera genetisk precision.
Tidigare har vi och andra visatanvändbarheten av att införa gener i MGE celler före transplantation genom elektroporering eller med lentivirus 15, 17. Medan dessa tekniker var effektiva vid introducera gener för in vivo-analys, är MGE vävnad heterogena och ger upphov till flera interneuronen subgrupper samt icke-neuronala celler 4. Dessutom har det varit svårt att uttrycka en gen av intresse endast i ett visst interneuronen grupp. Stora framsteg har gjorts för att generera transgena linjer som rekapitulera uttrycksmönstren hos många kortikala interneuronen subgrupper, inklusive, men inte begränsat till, SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre en d VIP-Cre 9 -11, och tillkomsten av nya linjer kommer att hjälpa belysa ytterligare möjliga populationer i framtiden. Dessutom, med genereringen av Cre-beroende reportrar och expressionsvektorer, inklusive Cre-beroende reporter vektorer som används häri, kan uppnås en mer exakt uttryck av gener av intresse.
En begränsning med denna teknik kan vara storleken på det fragment som ett tillförlitligt kan få in i en lentivirusvektor. Dessutom har denna metod har ännu inte testats med AAV. Emellertid, när denna teknik optimeras av en individ, många varianter av detta tillvägagångssätt kan användas. Först beskrev strategin här kommer att tillåta forskare att uttrycka reportrar med hjälp av en Cre-beroende reporter lentivirus tillsammans med MGE givarceller av specifika Cre-förare linjer. Denna teknik kan användas för att bedöma morfologi individuella MGE celler eller potentiellt att uttrycka en gen av intresse för olika undergrupper om en andra gen klonas i vektorn. För det andra, kan det också vara möjligt att använda en Cre-uttryckande viruset med Cre-beroende reporter MGE givarceller eller potentially utnyttja utvecklas bevarade DNA-element, promotorer och förstärkare, för att driva uttryck i olika populationer av celler från en heterogen population.
En framtida hinder att övervinna kommer att märka inducerade pluripotenta stamceller mänskligt ursprung eller embryonala stamceller för att potentiellt rena och / eller studera en specifik grupp av celler. Intressant, kan konserverade DNA förstärkare också användas i virala expressionssystem att rikta GABAerga nervceller i primära kulturer, efter injektion i hjärnbarken, och innan transplantation av MGE celler 15, 18, 19. Enhancers kan vara ett svar på detta hinder och kommer att vara av intresse som molekylära verktyg, som nya tekniker som behövs för att studera användbarheten av dessa celler i terapi. Faktum inbrytningar till upptäcka förstärkare som skulle kunna märka antingen GABAerga interneuronen 20 eller andra neuronala subtyper, inklusive glutamaterga neuroner 21, pågår. Använda virala märkningsmetoden häri,det kan vara möjligt att transducera differentierade stamceller mänskligt ursprung med celltypsspecifik förstärkare för att märka distinkta celler av intresse före transplantation och in vivo-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag till JLRR från: Autism Speaks, Nina Irland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 och NIMH R37 MH049428. PRW stöddes av ett stipendium från National Science råd Taiwan. SFS stöddes av F32 (MH103003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and equipment for MGE cell transplantation | |||
| 1 ml syringe | REF 309602 | BD, Becton Dickinson and company | |
| 30 1/2 G needle | 305106 | BD, Becton Dickinson and company | |
| Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger) | 5-000-1005 | Drummond scientific company | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Stereo microscope with boomstand ** | MZ6 | Leica | |
| Digital just for mice stereotaxic instrument ** | 51725D | Stoelting company | |
| Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator ** | MO-10 | Narishige | |
| Diamond coated rotary beveler | made in house | ||
| Needle pipette puller | 730 | Kopf instruments | |
| Mineral oil | Any drug store or pharmacy | ||
| Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume | |||
| ** These are the particular models we use, but many other setups should work | |||
| Optional Reagents (for making Lentiviruses) | |||
| 25 mm, 0.45 µm filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofectamine 2000 (1.5 ml size) | 11668019 | Invitrogen | |
| Other commercially available supplies | |||
| pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plasmid encoding Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plasmid encoding VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
References
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
- Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
- Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
- Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
- Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
- Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).
- Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
- Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).
- Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).
