Summary
Her en protokol præsenteres til at måle bakteriel fange af CD4 + T-celler, som opstår i løbet af antigen præsentation via transinfection fra præ-inficerede dendritiske celler (DC). Vi viser, hvordan du udfører de nødvendige skridt: isolering af primærelementer, infektion af DC / T-celle-konjugat dannelse, og måling af bakteriel T-celle transfektion.
Introduction
Når et patogen inficerer sin vært, er der normalt en aktivering af de medfødte og adaptive immunrespons, som er nødvendige for bakteriel clearance. Medfødte immunforsvar er den første linje i forsvaret, der forhindrer de fleste infektioner. Medfødte immunforsvar skelner i et præcist elementer, der er bevaret blandt brede grupper af mikroorganismer (patogen-associeret molekylære mønstre, PAMPS) 1. Mekanismerne i medfødte immunitet omfatter fysiske barrierer, såsom hud, kemikalier barrierer (antimikrobielle peptider, lysozym) og de medfødte leukocytter, som omfatter fagocytter (makrofager, neutrofiler og dendritiske celler), mastceller, eosinofiler, basofiler og naturlige dræberceller 2. Disse celler identificere og fjerne patogener, enten ved at angribe dem gennem kontakt eller via fagocytose, som omfatter patogen oversvømmer og drab. Dette system tillader ikke livslang forsvar, i modsætning til adaptiv immunitet, som giver immunologisk hukommelse mod pathogens. Det adaptive immunsystem er den anden linje i forsvaret og er i stand til at genkende og reagere på specifikke antigener af multipel mikrobiel og ikke-mikrobielle stoffer 3. De vigtigste komponenter i det adaptive immunsystem er de lymfocytter, som omfatter B- og T-celler. B-celler er involveret i det humorale respons, der secernerer antistoffer mod patogener eller exogene proteiner. Imidlertid repræsenterer T-celler celle-medieret immunitet, modulering af immunresponset med cytokiner sekretion eller dræbe patogene-inficerede celler 4.
Antigenpræsenterende celler (APC'er), herunder dendritiske celler eller makrofager, bestanddele af det medfødte immunsystem, kan genkende fagocytere patogener og proces bakterielle bestanddele i antigener, der præsenteres på celleoverfladen af Major Histocompatibility Complex (MHC) 5-7. Efter APC har fagocyteres patogener, de normalt migrere til dræning lymfeknuder, hvor de interagerer med Tceller. T-lymfocytter kan genkende specifikke peptid-MHC-komplekser med deres T-cellereceptorer. Immun synapse (IS) forekommer i grænsefladen mellem et antigen-loaded APC og en lymfocyt under antigenpræsentation 8,9. Nogle bakterier kan overleve fagocytose og formidle systematisk inden APC. I denne opfattelse, inficerede APC'er tjener som bakterielle reservoirer eller "trojanske heste", som letter bakteriel spredning 10. Den intime kontakt mellem APC og lymfocytter, der finder sted i løbet af IS-dannelse fungerer også som en platform for udveksling af en del af membraner, genetisk materiale og exosomer og kan kapret for nogle virus til inficerer T-celler; denne proces kaldes transinfection 11-13.
Nogle sygdomsfremkaldende bakterier (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica og Shigella flexneri) er i stand til at invadere T-lymfocytter in vivo og ændre deres adfærd 14-16. Vi harfor nylig beskrevet, at T-lymfocytter er også i stand til at fange bakterier ved transinfection fra tidligere inficerede dendritiske celler (DC'er) i løbet af antigenpræsentation 16. T-celle bakteriel indfange transinfection overordentlig mere effektiv (1,000-4,000x) end direkte infektioner. T-celler capture patogen og ikke-patogen bakterier indikerer end transinfection er en proces, der drives af T-celler. Slående, transinfected T (TIT) celler hurtigt dræbte de erobrede bakterier og gjorde det mere effektivt end professionelle fagocytter 16. Disse resultater, der bryder et dogme for immunologi, viser, at cellerne i adaptiv immunitet kan udføre funktioner, der var angiveligt eksklusive den medfødte immunitet. Endvidere viste vi, at Tit celler udskiller store mængder af pro-inflammatoriske cytokiner og beskytte mod bakterielle infektioner in vivo.
Her præsenterer vi de forskellige protokoller, der anvendes til at studere den bakterielle transinfection procesen musemodel. Denne model er baseret på brugen af CD4 + T-celler fra transgene OTII mus, der bærer en TCR specifik for peptid 323-339 af OVA (OVAp) i forbindelse med I-Ab 17, der interagerer specifikt med bakteriel-inficerede knogle marrow- afledte DC'er (BMDCs) 18,19 lastet med OVAp, danner stabile immune synapser.
T-celle transinfection kan visualiseres og spores ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Derudover flowcytometri kan anvendes til påvisning af inficerede celler ved at drage fordel af fluorescens udsendt af bakterier, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) 16,20. Endvidere kan T-celle transinfection kvantificeres ved en mere følsom metode, gentamicin overlevelse assay, der tillader måling af en lang række arrangementer. Gentamicin er et antibiotikum, ikke kan trænge eukaryote celler. Derfor bruger dette antibiotikum muliggør differentiering af intracellulære bakterier, der overlevede den antibiotiske tilsætning frOM ekstracellulære dem, der blev dræbt 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Eksperimentelle procedurer blev godkendt af Udvalget for Forskning Etik af Universidad Autónoma de Madrid og gennemføres under tilsyn af Universidad Autónoma de Madrid Leder af dyrevelfærd og sundhed i overensstemmelse med spanske og europæiske retningslinjer. Mus blev opdrættet i specifik patogen fri (SPF) hus, og de blev aflivet af uddannet og kvalificeret personale ved hjælp af kuldioxid (CO 2) indånding metode.
1. Mus knoglemarv-afledte DC'er Differentiering og infektion
Bemærk: Figur 1 opsummerer dette første skridt. Alle procedurer skal udføres i hætten fra dette punkt på, ved hjælp af kun sterile medier, instrumenter, pipettespidser og kultur retter.
- Mus knoglemarv-afledte DCs Differentiering
- Dissekere skinneben og lårben fra en C57 / BL6 musen 22 og overføres til en plastik skål med 10 ml RPMI-medium. Skær hver epiphysis off, med steril saks og eksponere knoglemarv, som har en karakteristisk rød farve.
- Indgyde indersiden af knoglen med 10 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (PBS / BSA / EDTA buffer) under anvendelse af en steril sprøjte på en steril Petri fad.
- Saml cellesuspensionen og centrifuger i et rør ved 600 xg i en kølecentrifuge (4 ° C).
- Resuspender cellerne i 1 ml Ammonium Chloride-Kalium-(ACK) lyseringsbuffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM EDTA) og inkuberes i 30 sekunder ved stuetemperatur for at fjerne røde blodlegemer.
- Der tilsættes 10 ml RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og filtreres gennem et cellesigte (70 um) for at fjerne knoglefragmenter og celleklumper før centrifugering ved samme hastighed (600 x g), fordi klumper blev fjernet ved filtrering.
- Tæl cellerne end justere til 5 x 10 5 celler / ml med RPMI 10% FBS (indeholdende 50 pM B-mercaptoethanol, 1 mM natriumpyruvat) og tilsæt 20 ng / ml rekombinant murin granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (rm-GM-CSF) som slutkoncentration.
- Denne suspension Tilføj til en steril, mikrobiologiske kvalitet, 15 cm petriskål, og kultur i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Hver tredje dag, spin ned både ikke-adhærente celler og løsrevne celler med 5 mM EDTA i PBS og resuspender med 5 x 10 5 celler / ml celledensitet med frisk medium indeholdende 20 ng / ml rm-GM-CSF.
- Modning af DC'er og antigen Loading
- På dag 9, resuspender cellerne ved 5 x 10 5 celler / ml densitet i medium indeholdende 20 ng / ml rm-GM-CSF. Derefter tilsættes 20 ng / ml lipopolysaccharid (LPS) for at tillade høj MHC-II-ekspression på celler og inkuberes i en ikke-vævskultur-behandlet sterile 15 cm petriskål i 24 timer.
- Efter endag i LPS-stimulering, plette nogle DC-celler med antistoffer mod muse CD11, MHCII og Gr-1 til at kontrollere DC'er differentiering ved flowcytometri. Et eksempel på flowcytometri analyse af DC'er er vist i figur 3A og 3B.
- Inkuber DC'er (5 x 10 5 celler / prøve) med et monoklonalt anti-muse-CD16 / CD32 antistof ved 2,5 ug / ml slutkoncentration i 50 pi PBS / BSA / EDTA-buffer per prøve. Bagefter tilsættes 50 pi af antistoffer mod MHCII (IA / IE), CD11c og Gr-1 konjugeret med forskellige fluorochromer ved 1: 100, 1: 200 og 1: 500 i PBS / BSA / EDTA-buffer henholdsvis.
- Endelig vaskes DC'er med PBS / BSA / EDTA-buffer og analysere ved flowcytometri ifølge producentens protokol.
Bemærk: Hvis cellerne er godt differentierede, celler er klar til antigen belastning.
- Vask DC'er med RPMI 10% FBS (uden antibiotika) og inkuberes dem med 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) på et plastrør i 1 ml RMPI 10% FBS-medium per 5 x 10 6 DC'er i minimum 1 time ved 37 ºC. Som en negativ kontrol, forlader DC'er uden inkubation med OVAp.
- Infektion af DC'er
- Infect DC'er ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 bakterier (10 bakterier pr DC) i 1 time i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Wash DC celler 3x i PBS og 1x i RMPI 10% FBS og der centrifugeres ved 450 xg for at vaske det meste af ekstracellulære bakterier. Endelig resuspender cellerne i RMPI 10% FBS-medium (uden antibiotika) 20 x 10 6 celler / ml.
2. Isolering af CD4 + -T-lymfocytter fra OTII transgene mus
Bemærk: Figur 1 opsummerer dette andet trin. Lymfeknuder bør anvendes i stedet for milten at isolere CD4 + -T-celler, fordi andelen af CD4 + lymfocytter i lymfeknudernes (~ 50%) er større end i milten (~ 25%), og derfor oprensningen ville være mere effektiv.
- Gøre Single-celle Suspension af lymfeknuder
- Fjern lyskebrok, aksil, brachialis, livmoderhalskræft lymfeknuder og mesenteriallymfeknuderne 23 fra OTII transgene mus og overføre ind i en plastik skål med 10 ml RPMI 10% FBS medium.
- Grind lymfeknuder under en steril hætte ved hjælp af to frostede objektglas. Placer lymfeknuder på en matteret side af et objektglas, og gnid med matteret side af andet objektglas før organer har været jorden.
- Vask enkelt cellesuspension i PBS / BSA / EDTA-buffer.
- Filter cellerne selvom en cellesigte (70 um) for at fjerne bindevævet og vask med PBS / BSA / EDTA-buffer.
- Resuspender cellerne i 1 ml ACK-lysepuffer og inkuberes i 1 min ved stuetemperatur for at fjerne røde blodlegemer.
- Isolering af CD4 + T-celler
- Vask igen som i trin 2.1.3 og tællerceller at resuspendere dem på 100 x 10 6 celler / ml i PBS / BSA / EDTA-buffer. Tilføj biotinylerede antistoffer mod CD8, IgM, B220, CD19, MHC-klasse II (I-Ab), CD11b, CD11c og DX5 ved 1: 250 for 30 min på is til senere negativ selektion af CD4 + T-celler.
- Vask cellerne i PBS / BSA / EDTA-buffer og inkuberes cellerne (100 x 10 6 celler / ml) med streptavidin mikroperler ved koncentrationen anbefalet i fabrikantens protokol i 15 minutter på is.
- Vask cellerne i PBS / BSA / EDTA-buffer og filtreres dem selv en cellesigte (30 um), før CD4 + T-celle-isolation.
- Isoler CD4 + -T-celler ved negativ selektion under anvendelse af en magnetisk celleadskillelse maskine ifølge producentens protokol.
- Tæl cellerne og juster til 4 x 10 6 celler / ml med RPMI 10% FBS-medium (uden antibiotika).
- Fix og holde på is isoleret CD4 + T-celler (3 x 10 5 celler) for at kontrollere renheden af strømcytometeret som beskrevet 24. Et eksempel på CD4 + -T-celler rensning er vist i figur 3C.
3. T-celle Transinfection Måling af Gentamicin Protection Assay
Bemærk: Figur 2 opsummerer denne tredje trin i protokollen.
- T-celle Transinfection
- Inkuber isolerede CD4 + -T-celler med inficerede DC-celler (1: 1) (udviklingslandene blev inficeret i 1 time og vasket for at fjerne frie bakterier) i 30 minutter for at tillade immune synapsedannelse i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Tilsæt 0,5 ml af isolerede CD4 + T-celler (2 x 10 6 celler) og 0,1 ml af inficerede DC'er (2 x 10 6 celler) på en 24-brønds dyrkningsplade. Som negativ kontrol inficere direkte 0,5 ml CD4 + -T-celler ved en MOI på 10 bakterier i 30 minutter.
- Medtag yderligere kontrol adskiller inficerede DC'er fra T-celler ved hjælp afet polycarbonat transwell barriere (med 3 um porestørrelse), hvilket hæmmer DC-T fysisk kontakt. Tilføj 0,1 ml af DC'er inde i transwell og 0,5 ml CD4 + -T-celler i det nedre kammer af brønden (24-brønds plade).
- Endelig, komplet med RMPI medium, indtil der er 0,6 ml i hver brønd for at gøre lige store volumener i alle prøver.
- Efter 30 minutter af immune synapsedannelse, tilsættes 100 ug / ml gentamicin og inkuberes i 1 time før opsamling af celler i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Re-isolering af CD4 + -T-celler
- Indsamle ikke-adhærente celler og resuspender dem i PBS / BSA / EDTA-buffer. De fleste af DC'er forblive på plastik dyrkningsplade. Vortexrør forsigtigt for at sikre celle opdeling. Hold 500 pi cellesupernatant som kontrol for at vise, at gentamicin har fungeret godt.
- Re-isolere CD4 + -T-celler fra prøver, der indeholder DC'er og T-celler sammen som i trin 2.2, Selv om de fleste af DCS skulle have fastgjort på pladen. Hold kontrolprøverne på is. Kun tage hensyn til forsøg med mindre end 2% forurening. Et eksempel på CD4 + -T-celler efter rensning transinfection er vist i figur 3D.
- Lyse T-celler og frø dem på Bakterier Medium-agarplader.
- Vask CD4 + T-celler to gange med PBS.
- Tæl cellerne og resuspendere dem på 2 x 10 6 celler / ml i PBS.
- Der tilsættes 500 pi 0,1% Triton X-100 i 500 pi T-celler til at lysere dem på 1 x 10 6 celler / ml, hvilket frigiver de intracellulære bakterier ud af T-cellerne.
- Lav 3 serielle tifoldsfortyndinger af lyserede celler og frø 50 ul af hver fortynding på bakterier medium agarplader. Opdel plader i 4 portioner og frø af de forskellige fortyndinger af lyserede celler i hver del. Repræsentative resultater er vist i figur 4.
- Som en kontrol, også pletterelagret cellesupernatant af konjugaterne på agar, at sikre, at gentamicin har fungeret godt. Plade Også inficerede udviklingslandene som en ekstra kontrol. I tilfælde opstår lav udviklingslandene forurening (<2%), trække de kolonidannende enheder (CFU'er) svarende til lav DC forurening.
4. Kvantificering af T-celle Transinfection ved flowcytometri
Bemærk: Figur 2 opsummerer dette trin.
- T-celle Transinfection
- Infect BMDCs som i trin 1.3, men brug GFP udtrykke bakterier i dette tilfælde.
- Stain CD4 + T-celler (isoleret fra lymfeknuder i trin 2.2) med en celle tracker chlormethyl aminocoumarin (CMAC) i 30 minutter ved 37 ºC i henhold til fabrikantens protokol.
- Vask mærkede CD4 + T-celler to gange med RMPI 10% FBS (uden antibiotika).
- Inkuber inficerede DC'er (efter 1 times inkubation med bakterier) med mærket CD4 +T-celler i 30 minutter for at tillade immune synapsedannelse ved 37 ºC herunder alle former for kontrol forklarer i trin 3.1.1.
- Farvning af inficerede CD4 + -T-celler
- Efter 30 minutter af DC-T immune synapse formation, indsamle celler og vaskes i PBS / BSA / EDTA.
- Efter to gange vask med PBS / BSA / EDTA-buffer, separate aggregerede celler ved forsigtigt vortexing rørene.
- Fix prøverne i 0,2 ml / rør af PBS indeholdende 3% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaske dem i PBS.
- Inkuber med anti-muse-CD16 / CD32 monoklonalt antistof (2,5 ug / ml) i 50 pl / prøve af PBS / BSA / EDTA i 15 minutter på is for at blokere Fc-receptorer af dendritiske celler.
- Tilføj en kanin anti-bakterier antistof (10 ug / ml som en slutkoncentration) i 50 pl / prøve af PBS / BSA / EDTA i 30 min på is for at farve ekstracellulære bakterier.
- Vask cellerne med PBS / BSA / EDTA og inkuberes med et antistof mod muse CD11 konjugeret med phycoerythrin (PE) og en secondary antistof mod kanin konjugeret med andre fluorokrom som Alexa-Fluor 647 ved 1: 200 i 100 pi / prøve af PBS / BSA / EDTA i 30 minutter på is.
- Vask cellerne og analysere prøver ved flowcytometri. Glem ikke at medtage en prøve af transinfected T-celler ved hjælp af ikke-fluorescerende bakterier som negativ kontrol og prøver mærket med blot én af hver fluorokrom anvendt i eksperimentet at kompensere prøverne og juster flowcytometri indstillinger 25. Repræsentativ undersøgelse er vist i figur 5.
Bemærk: Hvis bakterier ikke udtrykker GFP, at skelne intracellulære og ekstracellulære bakterier, label ekstracellulære bakterier, fix, og permeabiliserer prøver med Triton X-100 ved 0,5% i PBS i 5 min. Bagefter pletten samlede bakterier (intracellulære + ekstracellulære) med en anden fluorokrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heri beskrev vi, hvordan du udfører murine T-celle bakteriel transinfection fra inficerede knoglemarv afledt-DCs og hvordan man måler bakteriel transinfection via to forskellige tilgange: flowcytometri og gentamicin overlevelse assay Figur 1 opsummerer procedure for at opnå cellerne.. DC'er genereres ved inkubation af knoglemarvsceller med GM-CSF i 9 dage. Derefter er DC'er modnes med LPS for at øge MHCII på membranen for at indlæse dem på et senere tidspunkt med et specifikt peptid af OVA (OVAp). Som en kontrol, er nogle udviklingslandene ikke indlæst med OVAp. Begge DC'er (OVAp-læsset og ubelastet) er inficeret ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 bakterier. På den anden side, er CD4 + T-celler isoleret fra lymfeknuder fra OTII transgene mus, som genkender specifikke OVAp. Figur 2 viser fremgangsmåden til at udføre og kvantificere T-celle transinfection herunder de egnede negative kontroller. Som descriseng før, nogle udviklingslandene ikke indlæst med OVAp. I dette tilfælde er der en vekselvirkning mellem DC'er og T-celler, men ikke immune synapsedannelse på grund af fraværet af OVAp. En yderligere kontrol er inkluderet, adskillelse DC'er og T-celler med en polycarbonat transwell barriere (med 3 um porestørrelse), hvilket vanskeliggør DC-T fysisk kontakt. DC'er er inkluderet inde i transwell; som et resultat de ikke er i stand til at passere gennem denne porestørrelse. En anden negativ kontrol er også indarbejdet, direkte T-celle-infektion ved at inkubere T-celler direkte på en MOI på 10 bakterier. T-celle transinfection kan kvantificeres ved to metoder: flowcytometri eller gentamicin overlevelse assay. For at måle ved flowcytometri, bør DC'er er blevet inficeret med bakterier tidligere-GFP og CD4 + -T-celler farves med en celle tracker (T-celler-blue). Efter konjugatdannelse bør cellerne farves med antistoffer mod DC'er (CD11-PE). De ekstracellulære bakterier bør også farves med henblik på at quantify procentdelen af inficerede CD4 + -T-celler ved flowcytometri senere. Til måling transinfection af gentamicin overlevelse assay inkuberes celler med gentamicin i 1 time for at dræbe ekstracellulære bakterier, så T-cellerne genisoleret til frø på agarplade. Decimal serielle fortyndinger fremstilles til podning 50 pi af hver fortynding på agarplade og lette optællingen af CFU'er.
Som vist i figur 3, har DC differentiering skal kontrolleres ved flowcytometri (figur 3A og 3B). DC'er bør udtrykke CD11 og MHCII (figur 3A) og ikke Gr-1, som er en markør for neutrofiler. Som vist i figur 3B, nogle neutrofiler (3,27% af Gr-1 +, MHC -) blev præsenteret i kultur, men bør ikke anvendes DC'er kultur med mere end 5% af neutrofiler forurening. CD4 + T-celler renhed bør kontrolleres efter isolering fra lymph knudepunkter (figur 3C), og efter adskillelse fra DC'er konjugater dannelsen (figur 3D). Tage hensyn til forsøgene med mindre end 2% af forureninger efter konjugater formation.
Figur 4 viser et eksempel på T transinfection forsøg under anvendelse af Salmonella. Som illustreret i figur 4A, er pladerne inddelt i fire portioner for at pode serielle fortyndinger i hver del. Salmonella har dyrket på LB-agarplader og kolonidannende enheder kan tælles. Som vist i figur 4A, blev Salmonella fanget af T-celler fra inficerede DC'er og denne proces var klart forbedret med OVAp anerkendelse (plader i venstre side af figur 4A og figur 4B). Men når der var en fysisk barriere hindrer kontakt mellem DC'er og T-celler, var der næsten ingen transinfection, som det er tilfældet for at gøre en direkte T celleinfektion (plader på højre side af figur 4A og figur 4B).
Som vist i figur 5, kan T-celle transinfection kvantificeres ved flowcytometri under anvendelse af bakterier, der udtrykker et lyst GFP. DC'er og T-celler kan differentieres efter størrelse og kompleksitet i en fremadrettet og sidespredning plot, men kan bruges forskellige markører til godt skelne dem. CD4 + -T-celler blev mærket med en celle tracker (CMAC) og DCS med et antistof mod CD11. Ekstracellulære bakterier blev farvet med et kanin-antistof mod Salmonella og sekundært antistof-anti-kanin konjugeret med Alexa Fluor 647. Derfor procentdelen af inficerede CD4 + -T-celler kan kvantificeres, fordi de er mærket med CMAC (ikke med CD11-PE) og udtrykt GFP (bakterier-GFP), men de var ikke farvet med antistof mod ekstracellulære bakterier (Alexa Fluor 647).
ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1. Rutediagram DC generation og CD4 + T-celler isolation. På venstre side af figuren, at processen differentiere dendritiske celler (DC'er) fra knoglemarvsceller er detaljeret. Efter dissekering lårben og skinneben, er knoglemarvsceller ekstraheret fra det indre af knoglerne. Bagefter er røde blodlegemer (RBC) og lyseret knoglemarvsceller dyrkes med rekombinant murint granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) i 9 dage. Når de er godt differentieret, er DC'er inkuberet med lipopolysaccharid (LPS) for at forbedre Major Histocompatibility Complex II (MHCII) ekspression. Derefter er DC'er fyldt med en bestemt ovoalbumin peptid (OVAp) og inficeret med en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 bakterier. Nogle af dem er ikke fyldt med OVAp som kontrol. På højre side af figuren, hvordanisolere CD4 + T-celler fra OTII transgene mus er repræsenteret. Lymfeknuder (LN) fjernes og jorden, at opnå en enkeltstrenget cellesuspension. Endelig CD4 + T-celler isoleret ved negativ selektion ved hjælp af en magnetisk celleseparation maskine. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Rutediagram T-celle transinfection procedure. Infected (bakterier er vist i grønt) og OVAp indlæst-DC'er (erytrocytter) inkuberes med CD4 + T-celler (blå celler) for at tillade immune synapse formation. Inficerede DC'er (men ikke fyldt med OVAp) er også inkuberet med T-celler, hvilket tillader interaktion mellem de to celler, men uden immune synapse formation. En yderligere kontrol er inkluderet, adskillelse CD4 + Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. flowcytometer analyse af knoglemarv-afledte DC'er og isolerede CD4 + -T-celler. Repræsentative dot plots af knoglemarv-afledte DC'er analyseret vedflowcytometri. (A) DCs udtrykt MHCII og CD11c (85,8%; øverste højre kvadrant) (B) DC'er udtrykt MHCII men ikke Gr-1 (85% lavere højre kvadrant). Der var imidlertid en 3,27% af cellerne, der udtrykte Gr-1, men ikke MHCII celler (øverste venstre kvadrant). Disse celler blev mindre forurenede neutrofiler. (C og D) Histogrammer repræsenterer renheden af CD4 + T-celler isoleret fra lymfeknuder (C), og efter konjugatdannelsen med dendritiske celler (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. T-celle-transinfection kvantificeret ved gentamicin overlevelse assay. LB-agarplader blev opdelt i 4 portioner svarende til DECIMAl seriefortyndinger af lyserede CD4 + T-celler. (A) kolonidannende enheder af Salmonella enterica voksede på LB-agarplader, der svarer til T-celle transinfection i nærvær (+) eller fravær (-) af OVAp på overfladen af inficerede DC og i betingelser, der tillader DC / T-celle-kontakt (- TW) eller i nærvær af en fysisk barriere hindrer sådanne kontakter (+ TW). En tom plade svarende til direkte T-celle-infektion (negativ kontrol) er også vist. Der var næsten ingen transinfection når DC / T-celle kontakt blev hæmmet (+ TW). (B) Kvantificering af kolonidannende enheder (CFU'er) fra flere eksperimenter, der viser hastigheden af bakteriel fanget af T-celler fra inficerede DC'er. Direkte T-celle-infektion, og betingelserne vanskeliggør DC / T-celle-kontakt producerer lidt at ingen niveauer af T-celle-infektion. Når DC / T-celle-kontakter blev tilladt, der var T-celle transinfection, og det blev styrket ved antigengenkendelse (+ OVAp). Række søjler repræsenterer middelværdien af 3 iFRIE forsøg. Fejlsøjler indikerer SD. Signifikante forskelle er repræsenteret ved ***, svarende til p <0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. T-celle-transinfection kvantificeret ved flowcytometri. Repræsentant dot plot, der viser DC'er og T-konjugater efter transinfection proces. CD4 + -T-celler er små og runde som fremad og sidespredning (FCS - SSC) dot blot shows, og for at være godt differentieret, blev de farvet med en celle tracker (CMAC). DCer udtrykker CD11c er ikke mærket med CMAC og er større end T CD4 + T-celler med uregelmæssig form. Inficerede CD4 + T-celler indeholdende intracellulær bakterie-GFP, men negative for extracellastet, bakterier (6,19%) er vist i nederste højre kvadrant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T-celler eller T-lymfocytter er en type af leukocytter, som spiller en central rolle i cellemedieret immunitet og tilhører immunrespons adaptive 26. T-celler er resistente over for at blive smittet in vitro, men nogle rapporter tyder på, at de kan blive inficeret in vivo 14,15. De intime kontakter APC og T-celler under immune synapse fungere som en platform for udveksling af biologisk materiale 13, herunder nogle vira som HIV 11. Det blev for nylig vist, at i modsætning til dogmet, T-celler, paradigmet af celler fra adaptiv immunitet, er også i stand til effektivt at fange bakterier ved transinfection fra inficerede DC'er 11,16. Heri viser vi, han detaljerede protokoller til at kvantificere T-celle bakteriel transinfection in vitro fra inficerede BMDCs.
T-celle bakteriel transinfection blev styrket ved antigen-genkendelse 16. Vi viste, at ved anvendelse CD4 + -T-celler isoleret fraOTII transgene mus genkender en bestemt OVAp, BMDCs lastet med OVAp og mus inficeret med forskellige bakterier (her data præsenteret fra Salmonella enterica). CD4 + T-celle isoleret fra OTII mus inkuberes med inficerede DC'er i 30 minutter for at tillade immune synapse formation. De data, der præsenteres her svarer til bakterierne at T-celler kan fange fra DC'er i denne korte periode. Vi ved, at længere eksponeringer af T-celler til inficerede DC'er resulterede i større bakterielle fanger (ikke vist), men som T-celler også ødelægge uptaken bakterier meget hurtigt, kvantificering af bakteriel transinfection forekommer under længere DC / T-celle-tid kontakter vist sig at være vanskeligt . Gentamicin overlevelse assay er en meget følsom metode til at kvantificere T-celle transinfection fordi det er i stand til at detektere en enkelt inficerende bakterie 21. Efter inkubation med gentamicin, der dræber bare ekstracellulære bakterier, T-celler er isolerede og lyseres til frø på bakterier medium agar plates. Isoleringen af T-celler efter dannelse af konjugater med DC'er er et afgørende skridt i protokollen. Der bør kun tages hensyn eksperimenter med mindre end 2% af forureninger. DC forurening kan måles ved flowcytometri og CFU svarende til lav DC forurening skal trækkes. Alternativt kan CD4 + -T-celler renhed forbedres ved anvendelse af cellesortering.
En anden metode til at kvantificere T-celle transinfection er ved flowcytometri under anvendelse af GFP udtrykkende bakterier og mærkning af de ekstracellulære bakterier med en kompatibel fluorofor. En begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at bakterierne skal udtrykke et GFP, der er tilstrækkeligt lys til at detektere inficerede celler mod autofluorescens baggrund. Alternativt kunne bakterier farves før inficere DC'er med en celle tracker. En anden fremgangsmåde ville være farvning af ekstracellulære bakterier, permeabilisering T-cellerne, så mærkning af alle bakterier (intracellulær + ekstracellulære)med en anden fluorokrom.
Om fremtidige retninger af denne protokol, forsøger vi at oprette en protokol til at kvantificere antallet af T-celler, der erobrede bakterier efter længere udsættelse for inficerede DC'er, ved hjælp af bakterier dekoreret med magnetiske partikler. T-celler indfange bakterier ville bevare de magnetiske partikler, og derfor bør det være let at isolere dem ved hjælp af magneter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
