Summary
Her en protokoll er presentert for å måle bakterie fangst av CD4 + T-celler som oppstår i løpet av antigen-presentasjon via transinfection fra pre-infiserte dendrittiske celler (DC). Vi viser hvordan du utfører de nødvendige skritt: isolering av primærceller, infeksjon i DC, DC / T-celle konjugat formasjon, og måling av bakterie T-celle transfeksjon.
Introduction
Når et patogen infiserer sin vert, er det vanligvis en aktivering av den medfødte og ervervede immunresponser, er nødvendig for bakteriell klaring. Medfødt immunitet er den første forsvarslinje som hindrer de fleste infeksjoner. Medfødt immunitet skille på en presis måte elementer som er bevart blant brede grupper av mikroorganismer (patogen-forbundet molekylære mønstre, PAMPS) 1. Mekanismene for medfødt immunitet inkluderer fysiske barrierer som hud, kjemikalier barrierer (antimikrobielle peptider, lysozym) og medfødte leukocytter, som inkluderer de fagocytter (makrofager, nøytrofile og dendrittiske celler), mastceller, eosinofile, basofile og naturlige drepeceller 2. Disse cellene identifisere og eliminere patogener, enten ved å angripe dem gjennom kontakt eller via fagocytose, som inkluderer patogen engulfing og drap. Dette system tillater ikke livslang forsvar, i motsetning til adaptiv immunitet, som gi immunologisk hukommelse mot pathogens. Den adaptive immunsystem er den andre linjen i forsvaret og er i stand til å gjenkjenne og reagere på spesifikke antigener på multippel mikrobiell og ikke-mikrobielle stoffer 3. De viktigste komponentene i det adaptive immunsystemet er de lymfocytter, som inkluderer B-og T-celler. B-celler er involvert i den humorale respons, som utskiller antistoffer mot patogener eller eksogene proteiner. Imidlertid T-celler representerer cellemediert immunitet, modulering av immunrespons med cytokiner sekresjon eller drepe patogen-infiserte celler 4.
Antigenpresenterende celler (APC) inkludert dendrittiske celler eller makrofager, bestanddeler av den medfødte immunsystemet, kan gjenkjenne fagocyttere patogener og prosesskomponenter i bakterielle antigener, som er presentert på celleoverflaten av hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) 5-7. Etter APC har phagocytized patogener, de vanligvis migrere til drenering lymfeknuter, hvor de samhandler med Tceller. T-lymfocytter kan gjenkjenne spesifikke peptid-MHC komplekser av sine T cellereseptorer. Immun synapse (IS) oppstår i grenseflaten mellom et antigen belastet APC og en lymfocytt i antigenpresentasjon 8,9. Noen bakterier kan overleve fagocytose og spre systematisk innen APC. I denne visningen infiserte APC tjene som bakterielle reservoarer eller "trojanske hester" som letter bakteriespredning 10. Den intime kontakt mellom APC og lymfocytter som finner sted i løpet av IS dannelse også fungere som en plattform for utveksling av deler av membraner, genetisk materiale og exosomes og kan kapret for noen virus for å infisere T-celler; denne prosessen kalles transinfection 11-13.
Noen av patogene bakterier (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, og Shigella flexneri) er i stand til å invadere T-lymfocytter in vivo og modifisere sin oppførsel 14-16. Vi harnylig beskrevet som T-lymfocytter er også i stand til å fange opp bakterier ved transinfection fra tidligere infiserte dendrittiske celler (DCS) i løpet av antigenpresentasjon 16. T-celle bakteriell fangst av transinfection meget mer effektiv (1,000-4,000x) enn direkte infeksjoner. T celler fangst patogen og ikke-patogene bakterier indikerer enn transinfection er en prosess drevet av T-celler. Påfallende, transinfected T (Tit) celler raskt drept de fangede bakteriene og gjorde det mer effektivt enn profesjonelle fagocytter 16. Disse resultatene, som bryter et dogme for immunologi, viser at cellene i adaptiv immunitet kan utføre funksjoner som var tilsynelatende eksklusivt av medfødt immunitet. I tillegg viste vi at tit celler utskiller store mengder av pro-inflammatoriske cytokiner og beskytte mot bakterielle infeksjoner in vivo.
Her presenterer vi de ulike protokollene som brukes for å studere bakteriell transinfection prosessen musemodell. Denne modellen er basert på bruk av CD4 + T-celler fra transgene mus OTII, som bærer en TCR som er spesifikke for peptid 323-339 av OVA (OVAp) i forbindelse med I-Ab 17 som kommuniserer spesifikt med bakterieinfisert ben marrow- avledet DCs (BMDCs) 18,19 lastet med OVAp, danner stabile immun synapser.
T-celle transinfection kan visualiseres og spores ved hjelp av fluorescens mikroskopi. I tillegg flowcytometri kan brukes for å påvise infiserte celler ved å utnytte fluorescensen avgitt av bakterier som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) 16,20. Videre kan T-celle transinfection kvantifiseres ved en mer sensitiv tilnærming, gentamicin overlevelse analyse som tillater måling av et stort antall hendelser. Gentamicin er et antibiotikum som ikke kan trenge inn i eukaryote celler. Derfor, ved bruk av dette antibiotikum tillater differensiering av intracellulære bakterier som overlevde antibiotikumet tilsetning frOM ekstracellulære de som ble drept 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av forskningsetiske komité for av Universidad Autónoma de Madrid og utført under oppsyn av Universidad Autónoma de Madrid Head of Animal Welfare and Health i samsvar med spanske og europeiske retningslinjer. Mus ble avlet i spesifikk patogen gratis (SPF) bolig, og de ble avlivet av fagfolk og ved hjelp av karbondioksid (CO 2) innånding metoden.
1. Mouse benmargavledede DC Differensiering og infeksjons
NB: Figur 1 oppsummerer dette første trinnet. Alle prosedyrer skal utføres i panseret fra dette punktet, med kun sterile medier, instrumenter, pipettespisser og kultur retter.
- Mus benmargavledede DC Differensiering
- Dissekere tibias og lårben fra en C57 / BL6 mus 22 og overfør til en plastskål med 10 ml RPMI-medium. Skjær hver epifysen av, med steril saks og utsett benmarg, som har en karakteristisk lys rød farge.
- Sette mot innsiden av benet med 10 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (PBS / BSA / EDTA buffer) ved hjelp av en steril sprøyte på en steril Petri parabolen.
- Samle cellesuspensjonen og sentrifuger i en tube ved 600 x g i en avkjølt sentrifuge (4 ° C).
- Suspender cellene i 1 ml Ammonium-klorid-Kalium (ACK) lysebuffer (0,15 M NH4CI, 10 mM KHCO 3 og 0,1 mM EDTA) og inkuberes i 30 sekunder ved romtemperatur for å fjerne de røde blodceller.
- Tilsett 10 ml RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og filtrer gjennom en celle sil (70 mikrometer) for å fjerne beinrester og celleklumper før sentrifugering ved samme hastighet (600 x g), fordi klumpene ble eliminert ved filtrering.
- Telle celler end justere til 5 x 10 5 celler / ml med RPMI 10% FBS (inneholdende 50 mM B-merkaptoetanol, 1 mM natriumpyruvat), og legge til 20 ng / ml av rekombinant murint granulocytt-makrofag koloni-stimulerende faktor (rm-GM-CSF) som en sluttkonsentrasjon.
- Legg denne suspensjon i en steril, mikrobiologisk kvalitet, 15 cm petriskål, og kultur i en CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Hver tredje dag, spinne ned både ikke-adherente celler og frigjorte celler med 5 mM EDTA i PBS og resuspendert i 5 x 10 5 celler / ml av celletettheten, med friskt medium inneholdende 20 ng / ml rm-GM-CSF.
- Modningen av DC og Antigen Loading
- På dag 9, resuspender cellene ved 5 x 10 5 celler / ml i medium densitet inneholdende 20 ng / ml rm-GM-CSF. Deretter tilsettes 20 ng / ml lipopolysakkarid (LPS) for å tillate høy MHC-II-ekspresjon på celler og inkuberes i et ikke-vevskultur-behandlede sterile 15 cm petriskål i 24 timer.
- Etter ettdag av LPS-stimulering, beis noen DC-celler med antistoffer mot mus CD11c, MHCII og Gr-1 for å kontrollere DC differensiering ved strømningscytometri. Et eksempel på flowcytometri analyse av DC er vist i figur 3A og 3B.
- Inkuber DC (5 x 10 5 celler / prøve) med et anti-mus-CD16 / CD32 monoklonalt antistoff ved 2.5 ug / ml sluttkonsentrasjon i 50 mL PBS / BSA / EDTA-buffer per prøve. Etterpå, tilsett 50 ul av antistoffer mot MHCII (IA / IE), CD11c og Gr-1 konjugert med forskjellige fluorokromer ved 1: 100, 1: 200 og 1: 500 i PBS / BSA / EDTA-buffer hhv.
- Til slutt vaskes DC med PBS / BSA / EDTA-buffer og analysere ved flowcytometri i henhold til produsentens protokoll.
Merk: Hvis cellene er godt differensiert, cellene er klare for antigen lasting.
- Vask DC RPMI med 10% FBS (uten antibiotika) og inkuber dem med 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) på et plastrør i 1 ml av RMPI 10% FBS-medium pr 5 x 10 6 DC for minimum 1 time ved 37 ° C. Som en negativ kontroll, la DC uten ruger med OVAp.
- Infeksjon av DCs
- Infisere DC ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10 bakterier (10 bakterier pr DC) i 1 time i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Wash DC cellene 3x i PBS og 1 x i RMPI 10% FBS og sentrifuger ved 450 xg for å vaske de fleste av ekstracellulære bakterier. Til slutt, resuspender cellene i RMPI 10% FBS-medium (uten antibiotika) 20 x 10 6 celler / ml.
2. Isolering av CD4 + T-lymfocytter fra OTII gene mus
NB: Figur 1 oppsummerer dette andre trinnet. Lymfeknutene bør brukes i stedet for milt å isolere CD4 + T-celler, fordi andelen av CD4 + lymfocytter i lymfeknutes (~ 50%) er større enn i milten (~ 25%) og derfor rensing ville være mer effektivt.
- Gjør Single-celle Suspensjon av lymfeknuter
- Fjern lyske, axillaris, brachialis, cervical og mesenteriske lymfeknuter 23 fra OTII gene mus og overføre til en plastskål med 10 ml RPMI 10% FBS medium.
- Grind lymfeknuter under ett sterilt hetten med to frostede objektglass. Plasser lymfeknuter på en frostet side av ett objektglass, og gni med frostet siden av andre lysbildet før organene har vært bakken.
- Vask enkeltcelle-suspensjon i PBS / BSA / EDTA-buffer.
- Filtrere cellene skjønt et cellefilter (70 mikrometer) for å fjerne bindevev og vask med PBS / BSA / EDTA-buffer.
- Suspender cellene i 1 ml lysisbuffer ACK og inkuberes i 1 min ved romtemperatur for å fjerne de røde blodceller.
- Isolering av CD4 + T-celler
- Vask igjen som i trinn 2.1.3 og tellingceller for å resuspendere dem på 100 x 10 6 celler / ml i PBS / BSA / EDTA-buffer. Legg biotinylerte antistoffer mot CD8, IgM, B220, CD19, MHC klasse II (I-Ab), CD11b, CD11c og DX5 ved 1: 250 i 30 minutter på is for senere negativ seleksjon av CD4 + T-celler.
- Vask celler i PBS / BSA / EDTA-buffer og inkuberes cellene (100 x 10 6 celler / ml) med streptavidin-mikroperler ved den konsentrasjon som er anbefalt i produsentens protokoll i 15 minutter på is.
- Vask celler i PBS / BSA / EDTA-buffer og filtrere dem selv et cellefilter (30 um) før CD4 + T celleisolasjon.
- Isolere CD4 + T-celler ved negativ seleksjon ved anvendelse av en magnetisk celleseparasjons maskin i henhold til produsentens protokoll.
- Telle celler og juster til 4 x 10 6 celler / ml med RPMI 10% FBS medium (uten antibiotika).
- Fikse og holde på is isolert CD4 + T-celler (3 x 10 5 celler) for å sjekke renheten av flytcytometer som beskrevet 24. Et eksempel på CD4 + T-celler rensing er vist i figur 3C.
3. T Cell Transinfection Måling av Gentamicin Protection Assay
Merk: Figur 2 oppsummerer denne tredje trinn av protokollen.
- T-celle Transinfection
- Inkuber isolerte CD4 + T-celler med infiserte DC-celler (1: 1) (DCS ble infisert i 1 time og vasket for å fjerne frie bakterier) i 30 min for å tillate immun synapse formasjonen i en CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Tilsett 0,5 ml av isolerte CD4 + T-celler (2 x 10 6 celler) og 0,1 ml av infiserte DC (2 x 10 6 celler) på en 24-brønners kulturplate. Som negativ kontroll, direkte infisere 0,5 ml av CD4 + T-celler ved en MOI på 10 bakterier i 30 minutter.
- Inkluder flere kontroller skille infiserte DCs fra T-celler ved hjelpen polykarbonat transwell barriere (med tre mikrometer av pore størrelse), som hindrer DC-T fysisk kontakt. Tilsett 0,1 ml av DC inne i transwell og 0,5 ml av CD4 + T-celler til det nedre kammeret av brønnen (24-brønns plate).
- Til slutt, komplett med RMPI medium inntil det er 0,6 ml i hver brønn for å gjøre like store volumer i alle prøver.
- Etter 30 min av immun synapse formasjon, tilsett 100 ug / ml gentamicin og inkuberes i 1 time før oppsamling av cellene i et CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Re-isolering av CD4 + T-celler
- Samle ikke-adherente celler og resuspender dem i PBS / BSA / EDTA-buffer. De fleste av DC være festet til plastkulturplaten. Vortex rør forsiktig for å sikre celle dekomponering. Hold 500 mL av cellesupernatant som kontroll for å vise at gentamicin har fungert godt.
- Re-isolere CD4 + T-celler fra prøvene som inneholder DC og T-celler sammen som i trinn 2.2, Selv om de fleste av DC burde ha festet på plate. Hold kontrollprøvene på is. Ta hensyn til bare eksperimenter med mindre enn 2% forurensning. Et eksempel på CD4 + T-celler etter rensing transinfection er vist i Figur 3D.
- Lyse T-celler og frø dem på Bakterier Medium-agar plater.
- Vask CD4 + T-cellene to ganger med PBS.
- Tell cellene og resuspender dem på 2 x 10 6 celler / ml i PBS.
- Legg 500 mL av 0,1% Triton X-100 i 500 ul av T-celler til å lysere dem ved 1 x 10 celler / ml 6, frigjøring av intracellulære bakterier ut av T-cellene.
- Gjør 3 serie desimaltall fortynninger av lyserte celler og frø 50 mL av hver fortynning på bakterier mediumagarplater. Dele platene inn i 4 deler og frø de ulike fortynninger av lyserte celler i hver del. Representative resultater er vist i figur 4.
- Som en kontroll ble også porsjonlagret celle supernatant av konjugatene på agar, for å sikre at gentamicin har fungert godt. Også plate infiserte DC som en ekstra kontroll. I tilfelle det oppstår lavt DC forurensning (<2%), trekker de kolonidannende enheter (CFU) svarende til lav DC forurensning.
4. Kvantifisering av T Cell Transinfection av flowcytometrisystemer
Merk: Figur 2 oppsummerer dette trinnet.
- T Cell Transinfection
- Infisere BMDCs som i trinn 1,3, men bruker som uttrykker GFP bakterier i dette tilfellet.
- Flekk CD4 + T-celler (isolert fra lymfeknuter i trinn 2.2) med en celle tracker klormetyl aminocoumarin (CMAC) i 30 minutter ved 37 ºC i henhold til produsentens protokoll.
- Vask merkede CD4 + T-celler to ganger med RMPI 10% FBS (uten antibiotika).
- Inkuber infiserte DCs (etter en time inkubasjon med bakterier) med merket CD4 +T-celler i 30 min for å tillate immun synapse formasjon ved 37 ºC inkludert alle kontrollene som forklarer i trinn 3.1.1.
- Farging av Infiserte CD4 + T celler
- Etter 30 min av DC-T immune synapse formasjon, samle celler og vaske dem i PBS / BSA / EDTA.
- Etter to vaskinger med PBS / BSA / EDTA-buffer, separate aggregerte celler ved forsiktig virvling rørene.
- Fix prøvene på 0,2 ml / tube av PBS inneholdende 3% PFA i 15 min ved RT. Deretter vaske dem i PBS.
- Inkuber med anti-muse-CD16 / CD32 monoklonalt antistoff (2,5 ug / ml) i 50 ul / prøve av PBS / BSA / EDTA i 15 minutter på is for å blokkere Fc-reseptorer av dendrittiske celler.
- Legg til en kanin anti-bakterier antistoff (10 pg / ml som endelig konsentrasjon) i 50 ul / prøve av PBS / BSA / EDTA i 30 minutter på is for å farge ekstracellulære bakterier.
- Vask cellene med PBS / BSA / EDTA og inkuberes med et antistoff mot mus CD11c konjugert med fykoerytrin (PE) og et secondary antistoff mot kanin-konjugert med andre fluorkrom som Alexa-Fluor 647 til 1: 200 i 100 ul / prøve av PBS / BSA / EDTA i 30 min på is.
- Vask celler og analysere prøver av strømningscytometri. Ikke glem å ta en prøve av transinfected T-celler ved hjelp av ikke-fluorescerende bakterier som negativ kontroll og prøver merket med bare én av hver fluorokromkonjugerte brukt i forsøket å kompensere prøvene og juster flowcytometri innstillinger 25. Representative analysen er vist i figur 5.
Merk: Hvis bakterier ikke uttrykker GFP, for å skille intracellulære og ekstracellulære bakterier, label ekstracellulære bakterier, fikse og permeabilize prøver med Triton X-100 på 0,5% i PBS i 5 min. Etterpå beis totale bakterier (intracellulære + ekstracellulære) med en annen fluorokrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heri beskrev vi hvordan du utfører murine T-celle bakteriell transinfection fra infiserte benmarg avledet-DC og hvordan man kan måle bakterie transinfection via to ulike tilnærminger: flowcytometri og gentamicin overlevelse analyse Figur 1 oppsummerer prosedyren for å skaffe cellene.. DC er generert av inkubasjon av benmargceller med GM-CSF for 9 dager. Deretter blir DCs maturated med LPS å øke MHCII på sin membran for å laste dem senere med en bestemt peptid OVA (OVAp). Som en kontroll, er noen DCs ikke lastet med OVAp. Begge DCs (OVAp lastede og ikke-lastet) er smittet på et mangfold av infeksjon (MOI) på 10 bakterier. På den annen side er CD4 + T-celler isolert fra lymfeknuter OTII transgene mus, som gjenkjenner den spesifikke OVAp. Figur 2 viser fremgangsmåten for å utføre og kvantifisere T-celle transinfection herunder passende negative kontroller. Som detaljert beskrevetseng før, er noen DCs ikke lastet med OVAp. I dette tilfellet er det en vekselvirkning mellom DC og T-celler, men ikke immun synapse dannelse på grunn av fravær av OVAp. En ytterligere kontroll er inkludert, separering av DC og T-celler med en polykarbonat transwell barriere (med 3 um porestørrelse), som hindrer DC-T fysisk kontakt. DC er inkludert inne transwell; som et resultat de ikke er i stand til å passere gjennom denne porestørrelse. En annen negativ kontroll er også innlemmet, direkte T-celle-infeksjon, ved å inkubere T-celler direkte ved en MOI på 10 bakterier. T-celle transinfection kan kvantifiseres ved to tilnærminger: flowcytometri eller gentamicin overlevelse analyse. For å måle ved flowcytometri, DCs skal ha blitt smittet tidligere med bakterier-GFP og CD4 + T-celler flekken med en celle tracker (T-celler-blå). Etter konjugat formasjon, bør cellene farget med antistoffer mot DC (CD11c-PE). Den ekstracellulære bakterier bør også være farget for å quantify prosentandelen av infiserte CD4 + T-celler ved flow cytometri senere. For å måle transinfection av gentamicin overlevelse analyse, blir cellene inkubert med gentamicin i 1 time for å drepe ekstracellulære bakterier, så T-cellene kan re-isolert i frø på agar plate. Desimaltall seriefortynninger er laget for å seede 50 mL av hver fortynning på agar plate og legge til rette for telling av CFU.
Som vist i figur 3, DC differensiering har til å bli kontrollert ved flowcytometri (figur 3A og 3B). DC skal uttrykke CD11c og MHCII (figur 3A) og ikke Gr-1, som er en markør for nøytrofiler. Som vist i figur 3B, noen neutrofiler (3,27% av Gr-1 +, MHC -) ble presentert i kultur, men DC kultur med mer enn 5% av nøytrofile forurensning bør ikke brukes. CD4 + T celler renhet bør kontrolleres etter isolering fra lymph noder (Figur 3C) og etter separasjon fra DCs konjugater dannelse (Figur 3D). Ta hensyn til forsøkene med mindre enn 2% av forurensninger etter konjugater formasjonen.
Figur 4 viser et eksempel på T transinfection eksperiment ved hjelp av Salmonella. Som illustrert i figur 4A, er platene delt i fire porsjoner for å seede de serielle fortynninger i hver del. Salmonella er dyrket på LB-agarplater og kolonidannende enheter kan telles. Som vist i figur 4A, ble Salmonella fanget av T-celler fra infiserte DC og denne prosessen var tydelig forbedret med OVAp gjenkjenning (platene på venstre side av figur 4A og 4B). Imidlertid da det var en fysisk barriere som hindrer kontakt mellom DCS og T-celler, var det praktisk talt ingen transinfection, som i tilfelle for å gjøre en direkte T celle infeksjon (platene på høyre side av figur 4A og 4B).
Som vist i figur 5, kan T-celle transinfection kvantifiseres ved strømningscytometri ved bruk av bakterier som uttrykker en lys GFP. DCS og T-celler kan bli differensiert av størrelsen og kompleksiteten i en forover og sidespredningsdiagram, men forskjellige markører kan anvendes for å skille dem godt. CD4 + T-celler ble merket med en celle tracker (CMAC) og DC med et antistoff mot CD11c. Ekstracellulære bakterier ble farget med et kanin-antistoff mot Salmonella og sekundært antistoff anti-kanin-konjugert med Alexa Fluor 647. Derfor er prosentandelen av infiserte CD4 + T-celler kan kvantifiseres fordi de er merket med CMAC (ikke med CD11c-PE) og uttrykt GFP (bakterier-GFP), men de var ikke farget med antistoff mot ekstracellulære bakterier (Alexa Fluor 647).
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Flytskjema for DC generasjon og CD4 + T-celler isolert. På venstre side av figuren, til prosessen skille dendrittiske celler (DCS) fra benmargsceller er detaljert. Etter dissekering lårben og tibias, er benmargceller utvinnes fra det indre av benene. Etterpå blir røde blodceller (RBC) lysert og beinmargsceller er dyrket med rekombinant murin granulocytt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) i 9 dager. Når de er godt differensiert, er DCs inkuberes med lipopolysakkarid (LPS) for å øke hovedhistokompatibilitetskompleks II (MHCII) uttrykk. Deretter blir DC lastet med en spesifikk ovalbumin peptid (OVAp) og infisert med en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 10 bakterier. Noen av dem ikke er lastet med OVAp som en kontroll. På høyre side av figuren, hvordanisolere CD4 + T-celler fra OTII transgene mus er representert. Lymfeknuter (LNS) er fjernet og jord, å oppnå en enkel cellesuspensjon. Endelig er CD4 + T-celler isolert av negative ved bruk av magnetisk celleseparasjons maskin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Flytskjema for T-celle transinfection prosedyre. Infisert (bakterier er vist i grønt) og OVAp lastet-DC (røde celler) ble inkubert med CD4 + T-celler (blå celler) for å tillate immun synapse formasjonen. Infiserte DCs (men ikke lastet med OVAp) er også inkuberes med T-celler, som tillater interaksjon mellom begge celler, men uten immun synapse formasjon. En ytterligere kontroll er inkludert, separering av CD4 + Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Flowcytometer analyse av benmarg avledet-DC og isolerte CD4 + T-celler. Representative prikkplotter av benmarg avledet-DCs analysert avflowcytometri. (A) DC uttrykte MHCII og CD11c (85,8%, øvre høyre kvadrant) (B) DC uttrykte MHCII men ikke Gr-1 (85%, nedre høyre kvadrant). Imidlertid var det en 3,27% av cellene som uttrykte Gr-1, men ikke MHCII celler (øvre venstre kvadrant). Disse cellene var små forurensede nøytrofile. (C og D) Histograms representerer renhet av CD4 + T celler isolert fra lymfeknuter (C), og etter konjugat formasjon med dendrittiske celler (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. T-celle transinfection kvantifisert ved gentamicin overlevelse analyse. LB-agarplater ble delt i 4 porsjoner svarende til Decimal serielle fortynninger av lyserte CD4 + T-celler. (A) kolonidannende enheter av Salmonella enterica vokste på LB-agar-plater som svarer til T-celle transinfection i nærvær (+) eller fravær (-) av OVAp på overflaten av infiserte DC, og i forhold som gir DC / T-celle-kontakt (- TW), eller i nærvær av en fysisk barriere som hindrer slike kontakter (+ TW). En tom plate svarende til direkte T-celle-infeksjon (negativ kontroll) er også vist. Det var nesten ingen transinfection når DC / T-celle kontakt ble hindret (+ TW). (B) Kvantifisering av kolonidannende enheter (CFU) fra flere eksperimenter som viser frekvensen av bakteriell fanget av T-celler fra infiserte DC. Direkte T-celle infeksjon, og forhold som hindrer DC / T-celle kontakt produserer lite eller ingen nivåer av T-celle infeksjon. Når DC / T-celle kontakter var tillatt, var det T-celle transinfection, og det ble forsterket av antigen anerkjennelse (+ OVAp). Kolonne stolper representerer gjennomsnittet av tre independent eksperimenter. Feilfelt angir SD. Signifikante forskjeller er representert med ***, tilsvarende p <0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. T-celle transinfection kvantifisert ved hjelp av strømningscytometri. Representative dot plot som viser DC og T-celle konjugater etter transinfection prosess. CD4 + T-celler er små og runde som frem og side scatter (FCS - SSC) dot blot viser, og for å være godt differensiert, de ble farget med en celle tracker (CMAC). DC uttrykker CD11c er ikke merket med CMAC og er større enn T CD4 + T-celler med uregelmessig form. Infiserte CD4 + T celler som inneholder intracellulære bakterier-GFP men negativt for extracellular bakterier (6,19%) er vist i nedre høyre kvadrant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T-celler eller T-lymfocytter er en type av leukocytter som spiller en sentral rolle i celle-mediert immunitet, og hører til den adaptive immunrespons 26. T-celler er upåvirkelig for å bli infisert in vitro, men noen rapporter tyder på at de kan være infisert in vivo 14,15. Intime kontakter av APC og T-celler under immun synapse tjene som plattform for utveksling av biologisk materiale 13, inkludert noen virus som HIV 11. Det ble nylig vist at i motsetning til dogmet, T-celler, paradigme celler av adaptiv immunitet, er også i stand til å effektivt fange opp bakterier ved transinfection fra infiserte DCs 11,16. Heri viser vi han detaljert protokoller for å kvantifisere T celle bakteriell transinfection in vitro fra infiserte BMDCs.
T-celle-bakteriell transinfection ble forsterket av antigengjenkjenning 16. Vi har vist at ved hjelp av CD4 + T-celler isolert fraOTII gene mus som anerkjenner et bestemt OVAp, BMDCs lastet med OVAp og mus infisert med forskjellige bakterier (data er presentert fra Salmonella ente). CD4 + T-celle isolert fra OTII inkuberes med infiserte DC i 30 min for å tillate immun synapse formasjonen. Dataene presentert her tilsvare de bakterier som T-celler kan fange opp fra DC i løpet av kort tid. Vi vet at lengre eksponeringer av T-celler til infiserte DC resulterte i større bakteriefang (ikke vist), men som T-celler også ødelegge uptaken bakterier meget raskt, kvantifisering av bakteriell transinfection forekommer under lengre DC / T-celle-tid kontakter vist seg å være vanskelig . Gentamicin overlevelse analysen er en svært følsom metode for å kvantifisere T-celle transinfection fordi den er i stand til å oppdage en eneste infiserer bakterien 21. Etter inkubasjon med gentamicin som dreper bare ekstracellulære bakterier, T-celler isoleres og lysert i frø på bakterier medium agar plAtes. Isoleringen av T-celler etter dannelse av konjugater med DC er et kritisk trinn i protokollen. Kun eksperimenter med mindre enn 2% av forurensninger bør tas i betraktning. DC forurensning kan bli målt ved strømningscytometri og CFU tilsvarende lav DC forurensning skal trekkes. Alternativt kan CD4 + T-celler renhet forbedres ved hjelp av cellesortering.
En annen tilnærming til å kvantifisere T-celle transinfection er av flowcytometri, ved hjelp av GFP uttrykke bakterier og merking av ekstracellulære bakterier med en kompatibel fluorophore. En begrensning med denne tilnærmingen er at bakterier har til å uttrykke et GFP som er tilstrekkelig sterkt for å påvise infiserte celler mot autofluorescens bakgrunn. Alternativt kan bakteriene være farget før infisere DC med en celle tracker. En annen tilnærming ville være å farge de ekstracellulære bakterier, permeabilizing T-cellene, og deretter merking av alle bakterier (intracellulær + ekstracellulært)med en annen fluorokrom.
Om fremtidige retninger av denne protokollen, prøver vi å sette opp en protokoll for å kvantifisere antallet T-celler som fanget bakterier etter lengre utredning til infiserte DC, ved hjelp av bakterier dekorert med magnetiske partikler. T-celler fange bakterier ville beholde de magnetiske partiklene og derfor bør det være enkelt å isolere dem ved hjelp av magneter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
