Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Bakterienerfassung durch CD4 + T-Zellen, die während der Antigenpräsentation über transinfection aus bereits infizierten dendritischen Zellen (DC) auftritt, zu messen. Wir zeigen, wie man die notwendigen Schritte durchführen: Isolierung von primären Zellen, Infektion von DC, DC / T-Zell-Konjugat-Bildung, und die Messung der bakteriellen T-Zell-Transfektion.
Introduction
Wenn ein Erreger infiziert seinen Wirt, gibt es normalerweise eine Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunreaktionen, für die bakterielle Clearance erforderlich. Angeborene Immunität ist die erste Verteidigungslinie, die meisten Infektionen verhindert. Angeborenen Immunität zu unterscheiden in einer präzisen Art und Weise Elemente, die in breiten Gruppen von Mikroorganismen konserviert sind (pathogen-associated molecular patterns, PAMPS) 1. Die Mechanismen der angeborenen Immunität umfassen physikalische Barrieren, wie Haut, Chemikalien Barrieren (antimikrobielle Peptide, Lysozym) und die angeborenen Leukozyten, der die Phagozyten (Makrophagen, Neutrophile, und dendritische Zellen), Mastzellen, Eosinophile, Basophile und natürliche Killerzellen umfassen 2. Diese Zellen identifizieren und zu beseitigen Krankheitserreger, entweder durch einen Angriff auf sie durch den Kontakt oder über die Phagozytose, die Erreger engulfing und Tötung umfasst. Dieses System erlaubt keine lebenslange Verteidigung, im Gegensatz zum adaptiven Immunität, die immunologisches Gedächtnis gegen p zu verleihenathogens. Die adaptiven Immunsystems ist die zweite Linie der Verteidigung und in der Lage zu erkennen und zu reagieren, um spezifische Antigene von mehreren mikrobiellen und nicht-mikrobielle Substanzen 3. Die Hauptkomponenten des adaptiven Immunsystems sind die Lymphozyten, die B und T-Zellen enthalten. B-Zellen werden in der humoralen Antwort beteiligt sind, die Antikörper gegen Pathogene oder exogenen Proteinen. Jedoch T-Zellen stellen die zellvermittelte Immunität, die Modulation der Immunantwort mit Cytokinen Sekretion oder Tötung pathogen-infizierten Zellen 4.
Antigen-präsentierende Zellen (APCs), die dendritischen Zellen oder Makrophagen, Bestandteile des angeborenen Immunsystems kann phagozytieren Pathogene und Prozess bakteriellen Komponenten in Antigene, die an der Zelloberfläche durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) präsentiert werden 5-7 erkennt. Nach APCs haben Krankheitserreger phagozytiert, sie in der Regel zu den Lymphknoten, wo sie mit T interagieren migrierenZellen. T Lymphozyten spezifischen Peptid-MHC-Komplexe mit ihren T-Zell-Rezeptoren erkennen. Die Immun Synapse (IS) geschieht in der Grenzfläche zwischen einem Antigen-beladenen APC und einem Lymphozyten während der Antigenpräsentation 8,9. Einige Bakterien können Phagozytose überleben und systematisch zu verbreiten innerhalb von APCs. In dieser Ansicht dienen infizierte APCs als bakterielle Reservoirs oder "Trojanische Pferde", die bakterielle Ausbreitung 10 zu erleichtern. Der innige Kontakt zwischen APCs und Lymphozyten, die im Laufe des IS Bildung stattfinden, ebenfalls als Plattform für den Austausch eines Teils der Membranen, genetisches Material und Exosomen und kann für einige Viren, um T-Zellen zu infizieren missbraucht werden; Dieser Vorgang wird als transinfection 11-13.
Einige pathogene Bakterien (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica und Shigella flexneri) sind in der Lage, T-Lymphozyten in vivo überfallen und ihr Verhalten 14-16 modifizieren. Wir habenkürzlich beschrieben, dass T-Lymphozyten können auch Bakterien durch transinfection von zuvor infizierten dendritischen Zellen (DCs) im Verlauf der Antigen-Präsentation 16 zu erfassen. T-Zell-bakterielle Gefangennahme durch transinfection überaus effektiver (1,000-4,000x) als direkte Infektionen. T-Zellen-Capture pathogen und nicht-pathogene Bakterien anzeigt als transinfection ist ein Prozess, durch T-Zellen angetrieben. Auffallend ist, transinfected T (TIT) Zellen rasch getötet die aufgenommenen Bakterien und tat dies effizienter als professionelle Phagozyten 16. Diese Ergebnisse, die ein Dogma der Immunologie zu brechen, zu zeigen, dass die Zellen der adaptiven Immunität Funktionen, die vermeintlich exklusive der angeborenen Immunität waren durchführen können. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Zellen sezer TIT große Mengen von pro-inflammatorischen Zytokinen und zum Schutz vor bakteriellen Infektionen in vivo.
Hier die verschiedenen Protokolle verwendet, um die bakterielle transinfection Prozess studieren präsentieren wirein Mausmodell. Dieses Modell basiert auf der Verwendung von CD4 + T-Zellen von transgenen OTII Mäusen, die einen TCR spezifisch für Peptid 323-339 von OVA (OVAp) im Kontext mit I-Ak 17, die spezifisch mit bakteriell-infizierten Knochen in Wechselwirkung zu tragen basierend marrow- abgeleiteten DCs (BMDCs) 18,19 mit OVAp geladen, Bildung stabiler Immun Synapsen.
T-Zell-transinfection visualisiert werden können und verfolgt mittels Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich Durchflusszytometrie zur Detektion infizierten Zellen unter Ausnutzung der Fluoreszenz durch Bakterien grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, 16,20 emittiert werden. Darüber hinaus können T-Zell transinfection durch eine empfindlichere Ansatz, der Gentamicin-Überlebenstests, die Messung einer großen Anzahl von Ereignissen kann quantifiziert werden. Gentamicin ist ein Antibiotikum, das nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann. Daher ist die Verwendung dieses Antibiotikums erlaubt die Unterscheidung von intrazellulären Bakterien, die das Antibiotikum Zusätzlich fr lebtenom extrazellulären diejenigen, die getötet wurden 21.
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Protocol
Hinweis: Experimentelle Verfahren wurden vom Ausschuss für Forschungsethik der Universidad Autónoma de Madrid genehmigt und in Übereinstimmung mit spanischen und europäischen Richtlinien unter der Aufsicht von der Universidad Autónoma de Madrid Leiter der Tierschutz und Tiergesundheit durchgeführt. Die Mäuse wurden in spezifischen pathogenfreien (SPF) Gehäuse gezogen und sie von geschultem und qualifiziertem Personal unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) Inhalationsmethode eingeschläfert wurden.
1. Maus-Knochenmark-abgeleitete DCs Differenzierung und Infektion
ANMERKUNG: Abbildung 1 fasst diesen ersten Schritt. Alle Verfahren sollten in der Haube von diesem Zeitpunkt an durchgeführt werden, nur mit sterilen Medien, Instrumente, Pipettenspitzen und Kulturschalen.
- Maus-Knochenmark stammende DC Differentiation
- Sezieren Tibia und Femur von einer C57 / BL6 der Maus 22 und Überführung in eine Plastikschale mit 10 ml RPMI-Medium. Schneiden Sie die einzelnen Epiphyse aus, mit einer sterilen Schere und setzen Knochenmark, die eine charakteristische leuchtend rote Farbe hat.
- Infundieren das Innere des Knochens mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (PBS / BSA / EDTA-Puffer) unter Verwendung einer sterilen Spritze auf eine sterile Petri Gericht.
- Sammeln der Zellsuspension und Zentrifuge in einem Rohr bei 600 · g in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C).
- Resuspendieren der Zellen in 1 ml von Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA) und Inkubation für 30 s bei RT, um rote Blutzellen zu beseitigen.
- 10 ml RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und durch ein Zellsieb (70 um), um Knochenfragmente und Zellklumpen vor dem Zentrifugieren mit derselben Geschwindigkeit (600 × g), da Klumpen wurden durch Filterung eliminiert entfernen.
- Zählen Sie die Zellen eind einzustellen bis 5 x 10 5 Zellen / ml RPMI mit 10% FBS (mit 50 & mgr; M B-Mercaptoethanol, 1 mM Natriumpyruvat) und fügen Sie 20 ng / ml rekombinantem murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor (rm-GM-CSF) als Endkonzentration.
- Fügen Sie diese Suspension in einem sterilen, mikrobiologische Qualität, 15 cm Petrischale, und die Kultur in einem CO 2 Inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Alle drei Tage, Spin-down sowohl nicht-adhärenten Zellen und abgelöste Zellen mit 5 mM EDTA in PBS und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml Zelldichte, mit frischem Medium, enthaltend 20 ng / ml RM-GM-CSF.
- Reifung der DCs und Antigen Loading
- Am Tag 9, Resuspendieren der Zellen bei 5 × 10 5 Zellen / ml der Dichte in Medium, das 20 ng / ml RM-GM-CSF. Dann fügen Sie 20 ng / ml Lipopolysaccharid (LPS) hohe MHC-II-Expression auf Zellen zu ermöglichen und Inkubation in einem Nicht-Gewebekultur-behandelte sterile 15 cm Petrischale 24 h.
- Nach einerTag der LPS-Stimulation, färben einige DC-Zellen mit Antikörpern gegen Maus-CD11c, MHCII und Gr-1, um DCs Differenzierung mittels Durchflusszytometrie zu überprüfen. Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie-Analyse von DCs ist in 3A und 3B gezeigt.
- Inkubieren DCs (5 × 10 5 Zellen / Probe) mit einem Anti-Maus-CD16 / CD32-monoklonalen Antikörper bei 2,5 ug / ml Endkonzentration in 50 ul PBS / BSA / EDTA-Puffer pro Probe. Anschließend werden 50 ul der Antikörper gegen MHCII (IA / IE), CD11c und Gr-1 mit verschiedenen Fluorochromen konjugierten bei 1: 100, 1: 200 und 1: 500 in PBS / BSA / EDTA-Puffer auf.
- Schließlich waschen DCs mit PBS / BSA / EDTA-Puffer und Analyse durch Durchflusszytometrie nach dem Protokoll des Herstellers.
Hinweis: Wenn die Zellen gut differenziert, sind Zellen, bereit für die Antigenbeladung.
- Wash DCs mit RPMI 10% FBS (ohne Antibiotika) und inkubieren Sie sie mit 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) auf einem Kunststoffröhrchen in 1 ml RMPI 10% FBS Medium pro 5 x 10 6 DCs für mindestens 1 Stunde bei 37 ºC. Als Negativkontrolle, lassen DCs ohne Inkubation mit OVAp.
- Die Infektion von DCs
- Infizieren DCs bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 Bakterien (10 Bakterien pro DC) für 1 Stunde in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Wasch DC Zellen 3x in PBS und 1 × in RMPI 10% FBS und Zentrifuge bei 450 × g, um die meisten der extrazellulären Bakterien zu waschen. Schließlich Die Zellen in RMPI 10% FBS-Medium (ohne Antibiotika) bei 20 x 10 6 Zellen / ml.
2. Isolierung von CD4 + T-Lymphozyten von transgenen Mäusen OTII
Hinweis: Abbildung 1 fasst diesen zweiten Schritt. Lymphknoten sollte statt Milz CD4 + T-Zellen zu isolieren, verwendet werden, da der Anteil von CD4 + Lymphozyten in Lymphknotens (~ 50%) größer ist als in der Milz (~ 25%), und daher wäre die Reinigung effektiver.
- Machen Einzelzellsuspension von Lymphknoten
- Entfernen Leisten, Achsel, brachial und Hals-und Mesenteriallymphknoten 23 aus OTII transgenen Mäusen und Transfer in einer Kunststoffschale mit 10 ml RPMI 10% FBS-Medium.
- Grind Lymphknoten unter einer sterilen Haube mit zwei mattierten Objektträger. Zeigen Lymphknoten auf einem mattierten Seite von einem Mikroskop-Objektträger, und reiben Sie mit satiniertem Seite der zweiten Schieber, bis Organen geschliffen worden.
- Waschen Einzelzellsuspension in PBS / BSA / EDTA-Puffer.
- Filtern Sie die Zellen, wenn eine Zelle Sieb (70 & mgr; m) Bindegewebe zu entfernen und waschen mit PBS / BSA / EDTA-Puffer.
- Resuspendieren der Zellen in 1 ml ACK-Lysepuffer und Inkubation für 1 min bei RT, um rote Blutzellen zu beseitigen.
- Isolierung von CD4 + T-Zellen
- Erneut waschen wie in Schritt 2.1.3 und ZählungZellen, um sie bei 100 x 10 6 Zellen / ml in PBS / BSA / EDTA-Puffer resuspendieren. Hinzufügen biotinylierten Antikörper gegen CD8, IgM, B220, CD19, MHC Klasse II (I-Ab), CD11b, CD11c und DX5 auf 1: 250 für 30 Minuten auf Eis für eine spätere negative Selektion von CD4 + T-Zellen.
- Wash-Zellen in PBS / BSA / EDTA-Puffer und Inkubation der Zellen (100 x 10 6 Zellen / ml) mit Streptavidin-Mikroperlen in der in dem Protokoll des Herstellers empfohlen, für 15 Minuten auf Eis-Konzentration.
- Wasche die Zellen in PBS / BSA / EDTA-Puffer und filtern, wenn eine Zelle Sieb (30 um) vor CD4 + T-Zellisolations.
- Isolieren CD4 + T-Zellen durch negative Selektion unter Verwendung eines magnetischen Zelltrennmaschine nach dem Protokoll des Herstellers.
- Zähle die Zellen und stellen bis 4 x 10 6 Zellen / ml mit RPMI 10% FBS-Medium (ohne Antibiotika).
- Fix und halten auf Eis isoliert CD4 + T-Zellen (3 x 10 5 Zellen), um die Reinheit von Fluss überprüfenZytometer wie beschrieben 24. Ein Beispiel für CD4 + T-Zellen, Reinigung wird in 3C gezeigt.
3. T-Zell-Transinfection Messung von Gentamicin Protection Assay
Anmerkung: Abbildung 2 zeigt diese dritte Stufe des Protokolls.
- T-Zell-Transinfection
- Isolierten CD4 + T-Zellen zu inkubieren mit infizierten DC-Zellen (1: 1) für 30 Minuten (die DCs wurden für 1 Stunde infiziert und gewaschen, um eliminieren freie Bakterien), Immunsynapsenbildung in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C ermöglichen, 5% CO 2).
- 0,5 ml der isolierten CD4 + T-Zellen (2 x 10 6 Zellen) und 0,1 ml der infizierten DCs (2 × 10 6 Zellen) auf einer 24-Well-Kulturplatte. Als negative Kontrolle infizieren direkt 0,5 ml von CD4 + T-Zellen bei einer MOI von 10 Bakterien für 30 min.
- Fügen Sie zusätzliche Kontrollen trennt infizierte DCs von T-Zellen unter Verwendung vonein Polycarbonat-Transwell-Barriere (mit 3 & mgr; m Porengröße), behindern DC-T körperlichen Kontakt. 0,1 ml von DCs in der Transwell und 0,5 ml von CD4 + T-Zellen in der unteren Kammer der Wanne (24-Well-Platte).
- Schließlich, bis es komplett mit RMPI Medium 0,6 ml in jeder Vertiefung zu gleichen Volumina in allen Proben zu machen.
- Nach 30 min von Immunsynapsenbildung wird mit 100 & mgr; g / ml Gentamicin und Inkubation für 1 h vor dem Sammeln von Zellen in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Re-Isolierung von CD4 + T-Zellen
- Sammeln nicht-adhärenten Zellen und Resuspendieren sie in PBS / BSA / EDTA-Puffer. Die meisten von DCs an der Kunststoff-Kulturplatte befestigt. Wirbelröhren leicht zu Zelle Disaggregation zu gewährleisten. Halten Sie 500 ul Zellüberstand als Kontrolle, um zu zeigen, dass Gentamicin hat gut funktioniert.
- Wieder isolieren CD4 + T-Zellen aus Proben, die DCs und T-Zellen, wie in Schritt 2.2 zusammen enthaltenObwohl die meisten der DCs sollte auf der Platte befestigt sind. Halten Sie die Kontrollproben auf Eis. Berücksichtigen Sie nur Experimente mit weniger als 2% Verunreinigungen. Ein Beispiel für CD4 + T-Zellen, Reinigung nach transinfection wird in 3D gezeigt.
- Lyse T-Zellen und entkernen auf Bakterien Medium-Agar-Platten.
- Waschen CD4 + T-Zellen zweimal mit PBS.
- Zählen der Zellen und Resuspendieren sie bei 2 x 10 6 Zellen / ml in PBS.
- Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 in 500 & mgr; l von T-Zellen, um sie auf 1 x 10 6 Zellen / ml zu lysieren, die Freigabe der intrazellulären Bakterien aus den T-Zellen.
- Machen 3 serielle Dezimalverdünnungen lysierten Zellen und Samen 50 ul jeder Verdünnung auf Bakterien Medium-Agar-Platten. Teilen Sie Platten in 4 Portionen und Samen der verschiedenen Verdünnungen der lysierten Zellen in jedem Teil. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.
- Als Kontrolle wurde auch die Plattegespeicherten Zellüberstand der Konjugate auf Agar, um diese Gentamicin sicherzustellen gut funktioniert hat. Auch Platte infizierten DCs als zusätzliche Kontrolle. In Fall tritt niedrigen DCs Verunreinigungen (<2%), subtrahieren die koloniebildenden Einheiten (KBE) entsprechend niedrige Gleich Verschmutzung.
4. Quantifizierung der T-Zell Transinfection durchflusszytometrisch
Hinweis: Abbildung 2 zeigt diesen Schritt.
- T-Zell-Transinfection
- Infizieren BMDCs, wie in Schritt 1.3, sondern verwenden GFP exprimierenden Bakterien in diesem Fall.
- Flecken CD4 + T-Zellen (aus Lymphknoten isoliert in Schritt 2.2) mit einem Zellenverfolger Chlor Aminocumarin (CMAC) für 30 min bei 37 ºC nach dem Protokoll des Herstellers.
- Waschen markierten CD4 + T-Zellen zweimal mit RPMI 10% FBS (ohne Antibiotika).
- Inkubieren infizierten DCs (nach 1 Stunde Inkubation mit Bakterien) mit markierten CD4 +T-Zellen für 30 min, um Immunsynapsenbildung bei 37 ºC einschließlich aller Kontrollen Erläuterung in Schritt 3.1.1 ermöglichen.
- Färbung infizierter CD4 + T-Zellen
- Nach 30 min DC-T Immunsynapsenbildung, sammeln Zellen und waschen Sie sie in PBS / BSA / EDTA.
- Nach zweimaligem Waschen mit PBS / BSA / EDTA-Puffer, separate aggregierte Zellen durch vorsichtiges Vortexen der Röhren.
- Fixieren die Proben in 0,2 ml / Röhrchen PBS, das 3% PFA für 15 min bei RT. Dann waschen Sie sie in PBS.
- Inkubieren mit Anti-Maus-CD16 / CD32-monoklonalen Antikörpers (2,5 ug / ml) in 50 ul / Probe von PBS / BSA / EDTA für 15 min auf Eis an Fc-Rezeptoren von dendritischen Zellen blockieren.
- Hinzufügen eines Kaninchen-Anti-Bakterien-Antikörper (10 ug / ml als Endkonzentration) in 50 ul / Probe von PBS / BSA / EDTA für 30 Minuten auf Eis, um extrazelluläre Bakterien zu färben.
- Wasche die Zellen mit PBS / BSA / EDTA und Inkubation mit einem Antikörper gegen den Maus-CD11c mit Phycoerythrin (PE) konjugiert, und eine sedäre Antikörper gegen Kaninchen mit anderen Fluorochrom wie Alexa-Fluor 647 konjugiert bei 1: 200 in 100 ul / Probe von PBS / BSA / EDTA für 30 Minuten auf Eis.
- Wash-Zellen und Analyse von Proben mittels Durchflusszytometrie. Nicht zu vergessen, eine Probe des transinfected T-Zellen unter Verwendung nicht-fluoreszierenden Bakterien als negative Kontrolle und Proben mit nur einem der einzelnen Fluorochrom in dem Experiment verwendet, um die Proben zu kompensieren und die Durchflusszytometrie Einstellungen 25 einzustellen markierten enthalten. Repräsentative Analyse ist in 5 gezeigt.
Hinweis: Wenn Bakterien nicht GFP zum Ausdruck bringen, den intra- und extrazellulären Bakterien, Label extrazellulären Bakterien, die mit Triton X-100 bei 0,5% in PBS für 5 min zu unterscheiden, zu beheben, und permeabilisieren Proben. Anschließend färben Gesamt Bakterien (intrazelluläre + extrazellulären) mit einem anderen Fluorochrom.
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Representative Results
Hier beschrieben wir, wie man murine T-Zell-bakterielle transinfection von infizierten Knochenmark-DCs und wie bakterielle transinfection über zwei verschiedene Ansätze Messung durchführen: Durchflusszytometrie und Gentamicin-Überlebenstests Abbildung 1 fasst die Vorgehensweise, um die Zellen zu erhalten.. DCs werden durch Inkubation der Knochenmarkszellen, die mit GM-CSF für 9 Tage erzeugt. Dann werden DCs mit LPS gereift zu MHCII auf ihrer Membran zu erhöhen, um sie später mit einem spezifischen Peptid OVA (OVAp) zu laden. Als Kontrolle werden einige DCs nicht OVAp geladen. Beide DCs (OVAp-belasteten und unbelasteten) bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 Bakterien infiziert. Andererseits sind CD4 + T-Zellen aus Lymphknoten OTII transgenen Mäusen, die die spezifische OVAp erkennen isoliert. 2 zeigt das Verfahren zur Durchführung und zu quantifizieren, T-Zell-transinfection einschließlich der entsprechenden Negativkontrollen. Wie descriBett vor, einige DCs nicht OVAp geladen. In diesem Fall gibt es eine Wechselwirkung zwischen DCs und T-Zellen, aber nicht immun Synapsenbildung aufgrund der Abwesenheit von OVAp. Eine zusätzliche Kontrolle ist im Preis inbegriffen, die Trennung DCs und T-Zellen mit einem Polycarbonat-Transwell-Barriere (mit 3 & mgr; m Porengröße), die DC-T physischen Kontakt behindert. DCs sind in der Transwell enthalten ist; als Ergebnis sind sie nicht in der Lage, durch diese Porengröße bestehen. Eine weitere Negativkontrolle ist ebenfalls integriert, die direkte T-Zell-Infektion, durch Inkubieren von T-Zellen direkt bei einer MOI von 10 Bakterien. T-Zell-transinfection kann durch zwei Ansätze quantifiziert werden: Durchflusszytometrie oder Gentamicin-Überlebensassay. Durch Durchflusszytometrie zu messen, sollte DCs zuvor mit Bakterien-GFP und CD4 + T-Zellen infiziert wurden Fleck mit einem Zellenverfolger (T-Zellen-blau). Nach Konjugatbildung, sollten die Zellen mit Antikörpern gegen DCs (CD11c-PE) gefärbt werden. Die extrazellulären Bakterien sollte auch um quantif angefärbt werdeny den Prozentsatz der infizierten CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie später. Um transinfection von Gentamicin-Überlebenstests messen, werden Zellen mit Gentamicin für 1 h inkubiert, um extrazelluläre Bakterien zu töten, dann T-Zellen werden erneut getrennt auf Agarplatte Samen. Dezimal Reihenverdünnungen werden gebildet, um 50 & mgr; l jeder Verdünnung auf Agarplatte Saatgut und zur Erleichterung der Zählung von KBE.
Wie in 3 gezeigt, hat DC Differenzierung durch Durchflusszytometrie (3A und 3B) überprüft werden. DCs sollte CD11c und MHCII (3A) und nicht Gr-1, das ein Marker für die Neutrophilen exprimieren. Wie in 3B dargestellt, ein paar Neutrophilen (3,27% des Gr-1 +, MHC -) wurden in die Kultur präsentiert, aber DCs Kultur mit mehr als 5% der Neutrophilen-Verunreinigungen sollte nicht verwendet werden. CD4 + T-Zellen Reinheit sollten nach Isolierung aus ly überprüft werdenmph Knoten (3C) und nach Trennung von DCs Konjugate Formation (Figur 3D). Berücksichtigen die Experimente mit weniger als 2% der Schadstoffe nach Konjugate Bildung.
Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für T transinfection Experiment mit Salmonellen. Wie in 4A dargestellt ist, werden die Platten in vier Abschnitte unterteilt, um die seriellen Verdünnungen in jedem Teil. Salmonellen wurden auf LB-Agarplatten und koloniebildende Einheiten gezüchtet gezählt werden Samen. Wie in 4A gezeigt, wurde Salmon durch T-Zellen aus infizierten DCs erfasst und dieses Verfahren wurde deutlich mit OVAp Erkennung (Platten auf der linken Seite der 4A und 4B) verbessert. Jedoch, wenn es eine physikalische Barriere behindert den Kontakt zwischen DCs und T-Zellen, gibt es praktisch keine transinfection, wie in dem Fall, daß man eine direkte T Zellinfektion (Platten auf der rechten Seite der 4A und 4B).
Wie in Figur 5 dargestellt ist, kann T-Zell transinfection durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Bakterien eine helle GFP-exprimierenden quantifizieren. DCs und T-Zellen können nach ihrer Größe und Komplexität in einer Vorwärts- und Seitenstreudiagramm unterschieden werden, aber verschiedene Marker verwendet werden, um gut zu unterscheiden sie. CD4 + T-Zellen wurden mit einem Zell tracker (CMAC) und DC, die mit einem Antikörper gegen CD11c markiert. Extrazelluläre Bakterien wurden mit einem Kaninchen-Antikörper gegen Salmonellen und sekundäre Antikörper anti-Kaninchen mit Alexa Fluor 647. Daher ist der Anteil der infizierten CD4 + T-Zellen konjugiertem quantifiziert werden können, weil sie mit CMAC markierten (nicht mit CD11c-PE) und drückte GFP (Bakterien-GFP), aber sie wurden nicht mit dem Antikörper gegen die extrazelluläre Bakterien (Alexa Fluor 647) gefärbt.
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Figur 1 Ablaufdiagramm des DC Erzeugung und CD4 + T-Zellen Isolation. Auf der linken Seite der Figur, der Prozess zu dendritischen Zellen (DCs) von Knochenmarkzellen zu differenzieren ist detailliert. Nach dem Sezieren Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen, Knochenmarkzellen aus dem Inneren der Knochen extrahiert. Anschließend werden die roten Blutkörperchen (RBC) lysiert und Knochenmarkszellen, die mit rekombinanten murinen Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) für 9 Tage kultiviert werden. Sobald sie gut differenziert sind, werden DCs mit Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert, um Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC II) Expression zu erhöhen. Dann werden DC, die mit einem bestimmten Ovoalbumin Peptid (OVAp) geladen und mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 Bakterien infiziert. Einige von ihnen werden nicht mit OVAp als Steuer geladen. Auf der rechten Seite der Figur, wie manIsolieren CD4 + T-Zellen von transgenen Mäusen OTII dargestellt. Lymphknoten (LNS) entfernt und gemahlen, wodurch eine Einzelzellsuspension. Schließlich werden CD4 + T-Zellen durch negative Selektion unter Verwendung eines magnetischen Zellseparation Maschine isoliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 Flussdiagramm der T-Zell transinfection Verfahren. Infizierte (Bakterien sind grün dargestellt) und OVAp geladen-DCs (Erythrozyten) mit CD4 + T-Zellen (blaue Zellen) inkubiert, um die Immunsynapsenbildung zu ermöglichen. Infizierten DCs (aber nicht mit OVAp geladen) werden auch mit T-Zellen, die Interaktion zwischen den beiden Zellen ohne Immunsynapsenbildung ermöglicht inkubiert. Eine zusätzliche Kontrolle ist im Preis inbegriffen, die Trennung CD4 + Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Durchflusszytometer Analyse der Knochenmark-DCs und isolierte CD4 + T-Zellen. Repräsentative Dot-Plots von Knochenmark-DCs analysiert durchDurchflusszytometrie. (A) DCs exprimiert MHCII und CD11c (85,8%; oberen rechten Quadranten) (B) DCs exprimiert MHCII aber nicht Gr-1 (85%; untere rechte Quadrant). Allerdings gab es eine 3,27% der Zellen, Gr-1, aber nicht MHCII-Zellen (obere linke Quadrant) ausgedrückt. Diese Zellen waren gering kontaminierten Neutrophilen. (C und D), Histogramme, die die Reinheit der CD4 + T-Zellen aus Lymphknoten (C) isoliert und nach Konjugatbildung mit dendritischen Zellen (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. T-Zell-transinfection durch Gentamicin-Überlebensassay quantifiziert. LB-Agar-Platten wurden in 4 Abschnitte entsprechend DECIMA geteiltl serieller Verdünnungen von lysierten CD4 + T-Zellen. (A) koloniebildenden Einheiten von Salmonella ente gewachsen auf LB-Agarplatten, entsprechend T-Zell transinfection in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) des OVAp auf der Oberfläche der infizierten DC, und unter Bedingungen, die DC / T-Zell-Kontakt (- TW) oder in Gegenwart einer physischen Barriere behindert solcher Kontakte (+ TW). Eine leere Platte entspricht, direkten T-Zell-Infektion (Negativkontrolle) wird ebenfalls angezeigt. Es gab fast keine transinfection als DC / T-Zell-Kontakt wurde behindert (+ TW). (B) Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten (CFUs) von mehreren Experimenten, die die Rate der bakteriellen durch T-Zellen aus infizierten DCs eingefangen. Direkte T-Zell-Infektion und Bedingungen behindert DC / T-Zell-Kontakt zu erzeugen wenig bis gar keine Ebenen der T-Zell-Infektion. Als DC / T-Zell-Kontakte erlaubt wurde, war T-Zell transinfection, und es wurde von der Antigenerkennung (+ OVAp) verbessert. Spalte Balken repräsentieren den Mittelwert von 3 independent Experimenten. Fehlerbalken zeigen die SD. Signifikante Unterschiede sind durch *** vertreten, was p <0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. T-Zell-transinfection mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Repräsentative Dot-Plot zeigt DCs und T-Zell-Konjugate nach transinfection Prozess. CD4 + T-Zellen klein und rund, wie Vorwärts- und Seitenstreuung sind (FCS - SSC) Dot-Blot-Shows, und um gut differenziert zu sein, wurden sie mit einer Zelle Tracker (CMAC) angefärbt wurden. DCs CD11c exprimieren, werden nicht mit CMAC markiert und sind größer als T CD4 + T-Zellen mit unregelmäßiger Form. Infizierten CD4 + T-Zellen, die intrazelluläre Bakterien-GFP, aber negativer extracelzelluläre Bakterien (6,19%) in der unteren rechten Quadranten dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
T-Zellen oder T-Lymphozyten sind eine Art von Leukozyten, die eine zentrale Rolle bei der zellvermittelten Immunität spielen und gehören zu der adaptiven Immunantwort 26. T-Zellen sind resistent gegen in vitro infiziert aber einige Berichte zeigen, dass sie in vivo 14,15 infiziert werden. Die intime Kontakte des APC und T-Zellen während der Immunsynapse als Plattform für den Austausch von biologischem Material 13, darunter auch einige Viren wie HIV 11 dienen. Es wurde vor kurzem, dass im Gegensatz zu dem Dogma, T-Zellen gezeigt, das Paradigma der Zellen des adaptiven Immunität, sind auch in der Lage, effizient zu erfassen Bakterien durch transinfection aus infizierten DCs 11,16. Wir zeigen hier, er detaillierte Protokolle, um T-Zellen bakterielle transinfection in vitro aus infizierten BMDCs quantifizieren.
T-Zell-bakterielle transinfection wurde von Antigenerkennung 16 verbessert. Wir zeigten, dass durch die Verwendung CD4 + -T-Zellen, isoliert ausOTII transgenen Mäusen Erkennen eines spezifischen OVAp, BMDCs mit OVAp und Mäusen mit verschiedenen Bakterien (hier Daten von Salmonella enterica vorgelegt) infiziert geladen. CD4 + T-Zellen aus Mäusen isoliert OTII mit infizierten DCs für 30 min inkubiert, um Immunsynapsenbildung zu ermöglichen. Die hier präsentierten Daten entsprechen den Bakterien, die T-Zellen können von DCs in dieser kurzen Zeit zu erfassen. Wir wissen, dass längere Belichtungszeiten von T-Zellen zu infizierten DCs ergab größeren Bakterien Aufnahmen (nicht gezeigt), aber T-Zellen, die uptaken Bakterien sehr schnell zerstören auch die Quantifizierung von bakteriellen transinfection bei längeren DC / T-Zellen-Zeitkontakte auftretenden als schwierig erwiesen . Gentamicin-Überlebensassay ist ein sehr sensitives Verfahren, um T-Zell transinfection quantifizieren, da es in der Lage, eine einzige infizierende Bakterium 21 erkennen kann. Nach der Inkubation mit Gentamicin, die nur die extrazelluläre Bakterien zu töten, T-Zellen werden isoliert und lysiert, um Bakterien auf Agar-Medium pl SaatgutAtes. Isolierung von T-Zellen nach der Bildung von Konjugaten mit DCs ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Nur Versuche mit weniger als 2% an Verunreinigungen sollten berücksichtigt werden. DC Kontamination kann mittels Durchflusszytometrie und KBE entsprechend niedrige Gleich Verschmutzung sollte abgezogen werden, gemessen werden. Alternativ können CD4 + T-Zellen Reinheit durch Verwendung von Zellsortierung verbessert werden.
Ein weiterer Ansatz zur Quantifizierung von T-Zell-transinfection ist mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von GFP-exprimierenden Bakterien und Markierung der extrazellulären Bakterien mit einem kompatiblen Fluorophor. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass Bakterien, ein GFP, das ausreichend hell zum Erkennen infizierten Zellen gegenüber dem Autofluoreszenzhintergrund ist auszudrücken. Alternativ könnte Bakterien infizieren, bevor DCs mit einer Zell tracker gefärbt werden. Ein anderer Ansatz wäre Anfärben der extrazellulären Bakterien, Permeabilisieren der T-Zellen, wird die Kennzeichnung alle Bakterien (intrazellulär + extrazellulär)mit einem unterschiedlichen Fluorochrom.
In Bezug auf die zukünftige Ausrichtung des Protokolls, versuchen wir, die Einrichtung eines Protokolls, die Anzahl der T-Zellen, die Bakterien bei längerer Exposition gegenüber infizierten DCs erfasst, unter Verwendung von Bakterien mit magnetischen Partikeln verziert quantifizieren. T-Zellen, die Erfassung Bakterien würden die magnetischen Partikel binden und daher sollte es leicht ist, sie durch Verwendung von Magneten zu isolieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
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