Summary
Här ett protokoll presenteras för att mäta bakteriell infångning av CD4 ^ T-celler som inträffar under antigenpresentation via transinfection från pre-infekterade dendritiska celler (DC). Vi visar hur du utför nödvändiga åtgärder: isolering av galvaniska element, infektion i DC, DC / T-cell konjugatbildning och mätning av bakterie T-cell transfektion.
Introduction
När en patogen infekterar sin värd, finns det oftast en aktivering av de medfödda och adaptiva immunsvar, som är nödvändiga för bakteriell clearance. Medfödd immunitet är den första försvarslinjen som hindrar de flesta infektioner. Medfödd immunitet skilja på ett exakt sätt element som är konserverade bland breda grupper av mikroorganismer (patogen-associerade molekylära mönster, PAMPS) 1. Mekanismerna för medfödd immunitet innefattar fysiska hinder såsom hud, kemikalier barriärer (antimikrobiella peptider, lysozym) och de medfödda leukocyter, vilka inbegriper fagocyter (makrofager, neutrofiler, och dendritiska celler), mastceller, eosinofiler, basofiler, och naturliga mördarceller 2. Dessa celler identifiera och eliminera patogener, antingen genom att angripa dem genom kontakt eller via fagocytos, vilket inkluderar patogener uppsluka och dödande. Detta system tillåter inte livslångt försvar, i motsats till adaptiv immunitet, som ger immunologiskt minne mot pathogens. Den adaptiva immunsystemet är den andra försvarslinjen och kan känna igen och reagera på specifika antigener av flera mikrobiella och icke-mikrobiella ämnen 3. De viktigaste komponenterna i det adaptiva immunsystemet är de lymfocyter, som omfattar B- och T-celler. B-celler är involverade i det humorala svaret, som utsöndrar antikroppar mot patogener eller exogena proteiner. Emellertid T-celler representerar den cellförmedlade immuniteten, modulering av immunsvaret med cytokiner sekretion eller dödande patogenfria infekterade celler 4.
Antigenpresenterande celler (APC) inklusive dendritiska celler eller makrofager, beståndsdelar i det medfödda immunförsvaret, kan känna igen fagocytera patogener och process bakteriella komponenter till antigener, som presenteras på cellytan av MHC (MHC) 5-7. Efter APC har fagocyterats patogener, de brukar migrera till dränering lymfkörtlar, där de interagerar med Tceller. T-lymfocyter kan känna igen specifika peptid-MHC-komplex av deras T-cellreceptorer. Immun synaps (IS) förekommer i gränsytan mellan ett antigen-loaded APC och en lymfocyt under antigenpresentation 8,9. Vissa bakterier kan överleva fagocytos och sprida systematiskt inom APC. I den här vyn, infekterade APC fungerar som bakterie reservoarer eller "trojanska hästar" som underlättar bakteriespridning 10. Den intima kontakten mellan APC och lymfocyter som äger rum under IS formation fungerar också som en plattform för utbyte av en del av membran, genetiskt material och exosomes och kan kapas för vissa virus att infektera T-celler; denna process kallas transinfection 11-13.
Vissa patogena bakterier (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica och Shigella flexneri) kan invadera T-lymfocyter in vivo och ändra sitt beteende 14-16. Vi harnyligen beskrivit att T-lymfocyter har även möjlighet att fånga bakterier genom transinfection från tidigare infekterade dendritiska celler (DC) under loppet av antigenpresentation 16. T-cell bakterie fångst av transinfection ytterst effektivare (1,000-4,000x) än direkta infektioner. T-celler fånga patogen och icke-patogena bakterier indikerar än transinfection är en process som drivs av T-celler. Påfallande, transinfected T (TIT) celler dödade snabbt de infångade bakterier och gjorde det mer effektivt än professionella fagocyter 16. Dessa resultat, som bryter en dogm immunologi, visar att cellerna i adaptiv immunitet kan utföra funktioner som var förment exklusive medfödd immunitet. Dessutom visade vi att Tit celler utsöndrar stora mängder av proinflammatoriska cytokiner och skydda mot bakterieinfektioner in vivo.
Här presenterar vi de olika protokoll som används för att studera den bakteriella transinfection processen ien musmodell. Denna modell bygger på användning av CD4 + T-celler från transgena OTII möss, som bär en TCR specifik för peptid 323-339 av OVA (OVAp) inom ramen för I-Ab 17 som samverkar specifikt med bakterie infekterade ben marrow- härledda DCs (BMDCs) 18,19 laddade med OVAp, bildar stabila immun synapser.
T-cell transinfection kan visualiseras och spåras med hjälp av fluorescensmikroskopi. Dessutom flödescytometri kan användas för att detektera infekterade celler genom att dra nytta av den fluorescens som emitteras av bakterier som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) 16,20. Dessutom kan T-cell transinfection kvantifieras genom en känsligare metod, gentamicin överlevnadsanalysen som medger mätning av ett stort antal evenemang. Gentamicin är ett antibiotikum som inte kan tränga eukaryota celler. Därför använder detta antibiotikum medger differentiering av intracellulära bakterier som överlevde den antibiotiska tillsats frOM extracellulära de som dödades 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Experimentella förfaranden godkändes av kommittén för forsknings- av Universidad Autònoma de Madrid och genomförs under överinseende av Universidad Autònoma de Madrid chef för djurskydd och hälsa i enlighet med spanska och europeiska riktlinjer. Möss uppvuxna i specifika patogenfria (SPF) bostäder och de avlivades av utbildad och kvalificerad personal med hjälp av koldioxid (CO 2) inandning metod.
1. musbenmärg härrörande DCs differentiering och infektion
Anmärkning: Figur 1 sammanfattar detta första steg. Alla procedurer bör genomföras i luvan från denna punkt på, med endast sterila media, instrument, pipettspetsar och odlingsskålar.
- Mus benmärgshärledda DCs Differentiering
- Dissekera skenben och lårben från en C57 / BL6 mus 22 och överför till en plastskål med 10 ml RPMI-medium. Skär varje epifysen av, med steril sax och exponera benmärgen, som har en karakteristisk klarröd färg.
- Ingjuta insidan av benet med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (PBS / BSA / EDTA-buffert) med användning av en steril spruta på en steril petri maträtt.
- Samla cellsuspensionen och centrifugera i ett rör vid 600 xg i en kyld centrifug (4 ° C).
- Resuspendera cellerna i 1 ml Ammonium-klorid-Kalium (ACK) lyseringsbuffert (0,15 M NH4CI, 10 mM KHCO3 och 0,1 mM EDTA) och inkubera under 30 sek vid RT för att eliminera röda blodkroppar.
- Tillsätt 10 ml RPMI 1640-medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) och filtrera genom ett cellfilter (70 | im) för avlägsnande av benfragmenten och cellklumpar innan centrifugering vid samma hastighet (600 xg) eftersom klumpar eliminerades genom filtrering.
- Räkna cellerna end justera till 5 x 10 5 celler / ml med RPMI 10% FBS (innehållande 50 | iM B-merkaptoetanol, 1 mM natriumpyruvat) och tillsätt 20 ng / ml rekombinant murint granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (rm-GM-CSF) som en slutlig koncentration.
- Lägg denna suspension till en steril, mikrobiologisk kvalitet, 15 cm petriskål och kultur i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Var tredje dag, spinn ner både icke-adherenta celler och lösgjorda celler med 5 mM EDTA i PBS och återsuspendera vid 5 x 10 5 celler / ml i celldensitet, med färskt medium innehållande 20 ng / ml rm-GM-CSF.
- Mognad av DCs och Antigen Loading
- Vid dag 9, resuspendera cellerna vid 5 x 10 5 celler / ml i densitet i medium innehållande 20 ng / ml rm-GM-CSF. Tillsätt sedan 20 ng / ml lipopolysackarid (LPS) för att tillåta hög MHC-II-expression på celler och inkubera i en icke-vävnadskultur-behandlade steril 15 cm Petri-skål för 24 timmar.
- Efter endag av LPS-stimulering, färga några DC-celler med antikroppar mot mus-CD11c, MHCII och Gr-1 för att kontrollera DC differentiering genom flödescytometri. Ett exempel på flödescytometri analys av DC: er visas i fig 3A och 3B.
- Inkubera DCs (5 x 10 5 celler / prov) med en anti-mus-CD16 / CD32 monoklonal antikropp vid 2,5 | ig / ml slutlig koncentration i 50 pl PBS / BSA / EDTA-buffert per prov. Efteråt, tillsätt 50 pl av antikropparna mot MHCII (IA / IE), CD11c och Gr-1 konjugerad med olika fluorokromer vid 1: 100, 1: 200 och 1: 500 i PBS / BSA / EDTA-buffert respektive.
- Slutligen, tvätta DC: er med PBS / BSA / EDTA-buffert och analysera genom flödescytometri enligt tillverkarens protokoll.
Obs: Om cellerna är väl differentierade, cellerna är redo för antigenbelastning.
- Tvätta DC med RPMI 10% FBS (utan antibiotika) och inkubera dem med 10 | ig / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) på ett plaströr i en ml RMPI 10% FBS-medium per 5 x 10 6 DCs för minimal 1 timme vid 37 ° C. Som en negativ kontroll, lämnar DCs utan inkubation med OVAp.
- Infektion av DC
- Infect DCs vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 10 bakterier (10 bakterier per DC) för en timme i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Wash DC-celler 3x i PBS och 1 x i RMPI 10% FBS och centrifugera vid 450 x g för att tvätta de flesta av extracellulära bakterier. Slutligen återsuspendera cellerna i RMPI 10% FBS-medium (utan antibiotika) på 20 x 10 6 celler / ml.
2. Isolering av CD4 + T-lymfocyter från OTII transgena möss
Anmärkning: Figur 1 sammanfattar detta andra steg. Lymfkörtlar bör användas i stället för mjälte att isolera CD4 -T-celler, eftersom andelen av CD4 + -lymfocyter i lymfkörtelns (~ 50%) är större än i mjälte (~ 25%) och därför skulle reningen bli mer effektiv.
- Gör encelliga suspension av lymfkörtlar
- Ta inguinal, armhålan, brachial, livmoderhalscancer och kröslymfknutor 23 från OTII transgena möss och överför till en plastskål med 10 ml RPMI 10% FBS-medium.
- Grind lymfkörtlar under en steril huva med två frostade objektglas. Placera lymfkörtlar på en frostad sida av ett objektglas, och gnugga med frostat sidan av den andra sliden till dess organ har malts.
- Tvätta enda cellsuspension i PBS / BSA / EDTA-buffert.
- Filtrera cellerna även om en cellfilter (70 | im) för avlägsnande av bindväv och tvätta med PBS / BSA / EDTA-buffert.
- Resuspendera cellerna i 1 ml ACK-lysbuffert och inkubera i 1 min vid RT för att eliminera röda blodkroppar.
- Isolering av CD4 + -T-celler
- Tvätta igen som i steg 2.1.3 och räknaceller för att återsuspendera dem på 100 x 10 6 celler / ml i PBS / BSA / EDTA-buffert. Lägg biotinylerade antikroppar mot CD8, IgM, B220, CD19, MHC klass II (I-Ab), CD11b, CD11c och DX5 vid ett: 250 för 30 minuter på is för senare negativ selektion av CD4 + -T-celler.
- Tvätta cellerna i PBS / BSA / EDTA-buffert och inkubera cellerna (100 X 10 6 celler / ml) med streptavidin mikrokorn vid den koncentration som rekommenderas i tillverkarens protokoll för 15 min på is.
- Tvätta cellerna i PBS / BSA / EDTA-buffert och filtrera dem även om en cellfilter (30 ^ m) innan CD4 ^ T-cellisolering.
- Isolera CD4 + T-celler genom negativ selektion med användning av en magnetisk cellseparation maskin enligt tillverkarens protokoll.
- Räkna celler och justera till 4 x 10 6 celler / ml med RPMI 10% FBS-medium (utan antibiotika).
- Fix och hålla på is isolerade CD4 + T-celler (3 x 10 5 celler) för att kontrollera renheten av flödetcytometer såsom beskrivits 24. Ett exempel på CD4 + -T-celler rening visas i figur 3C.
3. T-cell Transinfection Mätning av Gentamicin Protection Assay
Obs: I figur 2 sammanfattas detta tredje steg i protokollet.
- T-cell Transinfection
- Inkubera isolerade CD4 + -T-celler med infekterade DC-celler (1: 1) (de DC infekterades under en timme och tvättades för att eliminera fria bakterier) i 30 min för att medge immun synaps bildning i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Lägg 0,5 ml isolerade CD4 + T-celler (2 x 10 6 celler) och 0,1 ml av infekterade DC: er (2 x 10 6 celler) på en 24-brunnars odlingsplatta. Som negativ kontroll infektera direkt 0,5 ml CD4 + -T-celler vid en MOI av 10 bakterier under 30 min.
- Inkludera ytterligare kontroller som separerar infekterade DC från T-celler genom att användaen polykarbonattranswell barriär (med 3 um porstorlek), hindrar DC-T fysisk kontakt. Lägg 0,1 ml DC inuti transwell och 0,5 ml av CD4 + -T-celler in i den undre avdelningen av brunnen (24-brunnar).
- Slutligen, tills det är komplett med RMPI mediet 0,6 ml i varje brunn för att göra lika stora volymer i alla prover.
- Efter 30 min av immun synaps bildning, tillsätt 100 | ig / ml gentamicin och inkubera i 1 h före uppsamling av celler i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Återisolering av CD4 + T-celler
- Samla in icke-vidhäftande celler och återsuspendera dem i PBS / BSA / EDTA-buffert. De flesta av DCs sitter kvar på plastodlingsplatta. Vortexrör försiktigt för att säkerställa cell uppdelning. Håll 500 il cellsupernatant som kontroll för att visa att gentamicin har fungerat bra.
- Åter isolera CD4 ^ T-celler från prover som innehåller DCs och T-celler tillsammans som i steg 2,2, Även om de flesta av DCS borde ha fäst på plattan. Håll kontrollprover på is. Ta hänsyn endast experiment med mindre än 2% föroreningar. Ett exempel på CD4 + -T-celler rening efter transinfection visas i figur 3D.
- Lyse T-celler och utsäde dem på bakterier Medium-agarplattor.
- Tvätta CD4 + T-celler två gånger med PBS.
- Räkna celler och återsuspendera dem med 2 x 10 6 celler / ml i PBS.
- Tillsätt 500 pl av 0,1% Triton X-100 i 500 | il av T-celler för att lysera dem med 1 x 10 6 celler / ml, frigöra intracellulära bakterier av T-cellerna.
- Gör 3 serie decimala utspädningar av lyserade celler och utsäde 50 fil av varje spädning på bakterier medel agarplattor. Dela upp plattor i 4 portioner och ympa olika utspädningar av lyserade celler i varje del. Representativa resultat visas i Figur 4.
- Som en kontroll, också pläteralagrad cellsupematanten av konjugaten på agar, för att säkerställa att gentamicin har fungerat bra. Också platta infekterade DC som en ytterligare kontroll. Vid låg DC kontaminering sker (<2%), subtrahera kolonibildande enheter (CFU) som motsvarar låg DC förorening.
4. Kvantifiering av T-cell Transinfection med flödescytometri
Obs: I figur 2 sammanfattas här steget.
- T-cell Transinfection
- Infect BMDCs som i steg 1.3, men använd GFP uttrycka bakterier i det här fallet.
- Fläcken CD4 + T-celler (som isolerats från lymfkörtlar i steg 2,2) med en cell tracker klormetyl aminocoumarin (CMAC) under 30 minuter vid 37 ºC enligt tillverkarens protokoll.
- Tvätta märkta CD4 + T-celler två gånger med RMPI 10% FBS (utan antibiotika).
- Inkubera infekterade DCs (efter 1 h inkubation med bakterier) med märkt CD4 +T-celler under 30 min för att medge immun synaps bildning vid 37 ° C innefattande alla kontroller som förklarar i steg 3.1.1.
- Färgning av Infekterade CD4 + T-celler
- Efter 30 minuter av DC-T immun synaps bildning, samla celler och tvätta dem i PBS / BSA / EDTA.
- Efter två tvättar med PBS / BSA / EDTA-buffert, olika aggregerade celler genom att försiktigt vortexa rören.
- Fäst samplen i 0,2 ml / rör av PBS innehållande 3% PFA i 15 min vid RT. Tvätta dem sedan i PBS.
- Inkubera med anti-mus-CD16 / CD32 monoklonal antikropp (2,5 | j, g / ml) i 50 | il / prov av PBS / BSA / EDTA under 15 min på is för att blockera Fc-receptorer av dendritiska celler.
- Lägg till en kanin anti-bakterier antikropp (10 | ig / ml som slutkoncentration) i 50 | il / prov av PBS / BSA / EDTA under 30 min på is för att färga extracellulära bakterier.
- Tvätta cellerna med PBS / BSA / EDTA och inkubera med en antikropp mot mus-CD11c konjugerat med fykoerytrin (PE) och en för sigcondary antikropp mot kanin konjugerad med andra fluorokrom som Alexa-Fluor 647 vid 1: 200 i 100 ul / prov av PBS / BSA / EDTA under 30 minuter på is.
- Tvätta celler och analysera prov genom flödescytometri. Glöm inte att ta med ett prov av transinfected T-celler med användning av icke-fluorescerande bakterier som negativ kontroll och prover märkta med bara en av varje fluorokrom som används i försöket att kompensera proverna och justera flödescytometri inställningar 25. Representativ analys visas i Figur 5.
Obs: Om bakterier inte uttrycker GFP, för att skilja intracellulära och extracellulära bakterier, etikett extracellulära bakterier, fixa och permeabilize prover med Triton X-100 vid 0,5% i PBS under 5 min. Efteråt färga totala bakterier (intracellulära + extracellulära) med en annan fluorokrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Häri vi beskrivit hur du utför murin T-cell bakterie transinfection från infekterad benmärg härledda-DC och hur man mäter bakterie transinfection via två olika metoder: flödescytometri och gentamicin överlevnadsanalys Figur 1 sammanfattar förfarandet för att erhålla cellerna.. DCs genereras genom inkubation av benmärgsceller med GM-CSF under 9 dagar. Därefter är DC maturated med LPS för att öka MHCII på membranet för att ladda dem senare med en specifik peptid OVA (OVAp). Som en kontroll, är några DCs inte lastad med OVAp. Båda DCs (OVAp-belastade och icke-laddad) infekteras vid en infektionsmultiplicitet (MOI) av 10 bakterier. Å andra sidan, är CD4 + T-celler isolerade från lymfkörtlar från OTII transgena möss, som känner igen den specifika OVAp. Figur 2 visar förfarandet för att utföra och kvantifiera T-cell transinfection inklusive lämpliga negativa kontroller. Som descrisäng innan, vissa DCs inte lastad med OVAp. I detta fall, det finns en interaktion mellan DCs och T-celler, men inte immun synaps bildning på grund av frånvaron av OVAp. En ytterligare kontroll ingår, separera DCs och T-celler med en polykarbonattranswell barriär (med 3 um porstorlek), vilket hindrar DC-T fysisk kontakt. DCs ingår inuti transwell; som ett resultat är de inte kan passera genom denna porstorlek. En annan negativ kontroll är också införlivas, den direkta cellinfektion T, genom att inkubera T-celler direkt vid en MOI av 10 bakterier. T-cells transinfection kan kvantifieras genom två metoder: flödescytometri eller gentamicin överlevnadsanalys. För att mäta med flödescytometri, borde DCs har infekterats tidigare med bakterier-GFP och CD4 + -T-cellerna färgas med en cellspåraren (T-celler-blå). Efter konjugatbildning, bör cellerna färgas med antikroppar mot DC (CD11c-PE). De extracellulära bakterier bör också färgas för att quantify andelen infekterade CD4 + T-celler genom flödescytometri senare. För att mäta transinfection av gentamicin överlevnadsanalys, inkuberas celler med gentamicin under en timme för att döda extracellulära bakterier, då T-celler återisolerades till utsäde på agarplatta. Decimal serieutspädningar görs för att ympa 50 pl av varje spädning på agarplatta och underlätta räkning av CFU.
Såsom visas i fig 3, har DC differentiering som skall kontrolleras genom flödescytometri (figur 3A och 3B). DCs bör uttrycka CD11c och MHCII (figur 3A) och inte Gr-1, som är en markör för neutrofiler. Som framgår av Figur 3B, vissa neutrofiler (3,27% av Gr-1 +, MHC -) presenterades i kulturen, men DCs kultur med mer än 5% av neutrofiler kontaminering bör inte användas. CD4 + T-celler renhet ska kontrolleras efter isolering från lymph noder (figur 3C) och efter separation från DC konjugat bildning (Figur 3D). Ta hänsyn till experimenten med mindre än 2% av föroreningar efter konjugat formation.
Figur 4 visar ett exempel på T transinfection experiment med Salmonella. Såsom visas i figur 4A, är plattor uppdelas i fyra portioner för att ympa de seriella spädningar i varje del. Salmonella vuxit på LB-agarplattor och kolonibildande enheter kan räknas. Såsom visas i fig 4A, var Salmonella fångades av T-celler från infekterade DC och denna process var klart förbättrad med OVAp igenkänning (plattor till vänster i figur 4A och figur 4B). Men då det fanns en fysisk barriär som hindrar kontakt mellan DCS och T-celler, det fanns nästan ingen transinfection, såsom i fallet av att göra en direkt T cell infektion (plattor till höger i figur 4A och figur 4B).
Såsom visas i figur 5, kan T-cell transinfection kvantifieras genom flödescytometri med hjälp av bakterier som uttrycker en ljus GFP. DCS och T-celler kan differentieras med avseende på storlek och komplexitet i en framåt- och sidospridningsdiagram, men olika markörer kan användas för att väl skilja dem. CD4 + T-celler märktes med en cellspåraren (CMAC) och DCS med en antikropp mot CD11c. Extracellulära bakterier färgades med en kaninantikropp mot Salmonella och sekundär antikropp-anti-kanin konjugerad med Alexa Fluor 647. Därför andelen infekterade CD4 + T-celler kan kvantifieras eftersom de är märkta med CMAC (ej med CD11c-PE) och uttrycktes GFP (bakterier-GFP), men de var inte färgas med antikroppen mot extracellulära bakterier (Alexa Fluor 647).
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Flödesschema för likströmsgenerering och CD4 + -T-celler isolering. På den vänstra sidan av figuren, till processen differentiera dendritiska celler (DC) från benmärgsceller är detaljerade. Efter att dissekera lårben och skenben, är benmärgsceller utvinns från insidan av benen. Efteråt är röda blodkroppar (RBC) lyserades och benmärgsceller odlas med rekombinant murint granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF) under 9 dagar. När de är väl differentierade, är DC inkuberas med lipopolysackarid (LPS) för att öka major histokompatibilitetskomplex II (MHCII) uttryck. Därefter är DC: er laddade med en specifik ovoalbumin peptid (OVAp) och infekterades med en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 bakterier. Några av dem är inte laddade med OVAp som kontroll. På den högra sidan av figuren, hur manisolera CD4 + -T-celler från OTII transgena möss är representerad. Lymfkörtlar (LNS) tas bort och marken, erhålla en encelliga suspension. Slutligen CD4 + T-celler isolerades genom negativ selektion med användning av en magnetisk cellseparations maskin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flödesschema av T-cell transinfection förfarande. Infected (bakterier avbildas i grönt) och OVAp laddades-DC: er (röda blodkroppar) inkuberas med CD4 + T-celler (blå celler) för att tillåta immun synaps bildning. Infekterade DCs (men inte lastas med OVAp) är också inkuberas med T-celler, vilket gör att samverkan mellan de båda cellerna utan immun synaps bildning. En ytterligare kontroll ingår, separerande CD4 ^ Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. flödescytometer analys av benmärg härledd-DCs och isolerade CD4 + -T-celler. Representativa punktdiagram av benmärg härledda-DC: er analyserades genomflödescytometri. (A) DC uttryckte MHCII och CD11c (85,8%, övre högra kvadranten) (B) DC uttryckte MHCII men inte Gr-1 (85%; nedre högra kvadranten). Det fanns emellertid en 3,27% av cellerna som uttryckte Gr-1 men inte MHCII celler (övre vänstra kvadranten). Dessa celler var små förorenade neutrofiler. (C och D) Histogram representerar renhet av CD4 + T-celler isolerade från lymfkörtlar (C), och efter konjugatbildning med dendritiska celler (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. T-cells transinfection kvantifieras genom gentamicin överlevnadsanalys. LB-agarplattor var uppdelade i 4 delar motsvarande Décimal serieutspädningar av lyserade CD4 + -T-celler. (A) kolonibildande enheter av Salmonella enterica växte på LB-agarplattor som motsvarar T-cell transinfection i närvaro (+) eller frånvaro (-) av OVAp på ytan av infekterade DC och under förhållanden som medger DC / T-cellkontakt (- TW) eller i närvaro av en fysisk barriär som hindrar sådana kontakter (+ TW). En tom platta motsvarar direkt T-cell-infektion (negativ kontroll) visas även. Det fanns nästan ingen transinfection när DC / T-cellkontakt hindrades (+ TW). (B) Kvantifiering av kolonibildande enheter (CFU) från flera experiment som visar graden av bakteriell fångas av T-celler från infekterade DC. Direkt T-cell infektion och villkor hindrar DC / T-cell kontakt producerar liten eller ingen nivåer av T-cellsinfektion. När tilläts DC / T-cellkontakter, fanns T-cell transinfection, och det har förbättrats genom antigenigenkänning (+ OVAp). Kolumn staplarna representerar medelvärdet av tre independent experiment. Felstaplar visar SD. Signifikanta skillnader representeras av ***, vilket motsvarar p <0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. T-cell transinfection kvantifieras genom flödescytometri. Representativa punktdiagram som visar DCs och T-cell-konjugat efter transinfection processen. CD4 + T-celler är små och runda som framåt- och sidospridning (FCS - SSC) dot blot visar, och i syfte att vara väl differentierade, de färgades med en cellspåraren (CMAC). DCs uttrycker CD11c inte märkt med CMAC och är större än T CD4 + T-celler med oregelbunden form. Infekterade CD4 + T-celler som innehåller intracellulära bakterie GFP men negativt för extracellular bakterier (6,19%) visas i det nedre högra kvadranten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T-celler eller T-lymfocyter är en typ av leukocyter som spelar en central roll i cellförmedlad immunitet och hör till det adaptiva immunsvaret 26. T-celler är okänsliga för att smittas in vitro men vissa rapporter visar att de kan vara smittade in vivo 14,15. De intima kontakter APC och T-celler under immun synaps fungerar som plattformar för utbyte av biologiskt material 13, inklusive några virus såsom HIV 11. Det har nyligen visat att i motsats till dogm, T-celler, ett paradigm för celler av adaptiv immunitet, har också möjlighet att på ett effektivt sätt fånga bakterier genom transinfection från infekterade DC 11,16. Häri visar vi att han detaljerade protokoll för att kvantifiera T-cell bakterie transinfection in vitro från infekterade BMDCs.
T-cell bakterie transinfection förstärktes av antigenigenkänning 16. Vi visade att genom att använda CD4 + T-celler isolerade frånOTII transgena möss erkänner en viss OVAp, BMDCs lastad med OVAp och möss infekterade med olika bakterier (här uppgifterna presenteras från Salmonella enterica). CD4 * T-cell isolerad från OTII möss inkuberas med infekterade DC i 30 min för att medge immun synaps bildning. De data som presenteras här motsvarar de bakterier som T-celler kan fånga från DC: under denna korta tidsperiod. Vi vet att längre exponeringar av T-celler mot infekterade DCs gav större bakteriella fångar (ej visade), men såsom T-celler förstör också de uptaken bakterier mycket snabbt, kvantifiering av bakterie transinfection uppträder under längre DC / T-celltids kontakter visat sig vara svårt . Gentamicin överlevnadsanalys är en mycket känslig metod för att kvantifiera T-cell transinfection eftersom det är i stånd att detektera en enda infekterande bakterie 21. Efter inkubation med gentamicin som dödar bara extracellulära bakterier, T-celler isoleras och lyserades till utsäde på bakterier agarmedium plates. Isoleringen av T-celler efter formning konjugat med DCs är ett kritiskt steg inom protokollet. Endast experiment med mindre än 2% av föroreningar bör beaktas. DC kontamination kan mätas med flödescytometri och CFU motsvarande låg DC förorening ska dras. Alternativt kan CD4 + T-celler renhet förbättras genom användning av cellsortering.
Ett annat tillvägagångssätt för att kvantifiera T-cell transinfection är genom flödescytometri, med användning av GFP-uttryckande bakterier och märkning de extracellulära bakterier med en kompatibel fluorofor. En begränsning med denna metod är att bakterier måste uttrycka en GFP som är tillräckligt ljust för att detektera infekterade celler mot autofluorescens bakgrunden. Alternativt kan bakterier färgas innan infektera DC med en cell tracker. Ett annat tillvägagångssätt skulle vara färgning de extracellulära bakterier, permeabilisering T-cellerna, därefter märka alla bakterier (intracellulär + extracellulär)med en annan fluorokrom.
När det gäller framtida inriktningar av detta protokoll, försöker vi att inrätta ett protokoll för att kvantifiera antalet T-celler som fångade bakterier efter längre exponering för infekterade utvecklingsländerna, med hjälp av bakterier dekorerade med magnetiska partiklar. T-celler fånga bakterier skulle behålla de magnetiska partiklarna och därför bör det vara lätt att isolera dem med hjälp av magneter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
