Summary
여기 프로토콜은 사전에 감염된 수지상 세포 (DC)에서 transinfection 통해 항원 제시 동안 발생하는 CD4 + T 세포에 의해 세균 캡처를 측정하기 위해 제공됩니다. 일차 전지, DC, DC / T 세포 복합체 형성의 감염, 박테리아 T 세포 형질의 측정의 분리 : 우리는 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
병원균은 숙주를 감염 할 때, 일반적으로 세균 통관에 필요한 타고난 및 적응 면역 반응의 활성화가있다. 선천성 면역은 대부분의 감염을 방지 방어의 첫 번째 줄입니다. 선천성 면역은 미생물의 다양한 그룹들 사이에서 보존되는 정확한 방법 요소 (병원체 관련 분자 패턴, PAMPS) 1 구분합니다. 선천성 면역 메카니즘 식세포 (대 식세포, 호중구 및 수지상 세포), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및 천연 킬러 세포를 포함 실제 피부와 같은 장벽 화학 장벽 (항균 펩티드 리소자임) 및 선천적 백혈구를 포함 2. 이 세포는 접촉을 통해 또는 병원체 덮어 및 살해를 포함 식균 작용을 통해 그들을 공격하여 하나 확인하고 병원균을 제거한다. 이 시스템은 P에 대한 면역 학적 기억을 부여 적응 면역, 대조적으로, 평생 방어를 허용하지 않습니다athogens. 적응 면역 시스템은 방어의 두 번째 라인 및 인식하고 여러 미생물 및 비 미생물 물질 3의 특정 항원에 반응 할 수있다. 적응 면역 시스템의 주요 구성 요소는 B 및 T 세포 림프구를 포함이다. B 세포는 병원체 또는 외래 단백질에 대한 항체를 분비, 체액 성 반응에 관여한다. 그러나, T 세포의 사이토 카인 분비 또는 죽이는 병원체에 감염된 세포를 4 면역 반응을 조절, 세포 성 면역을 나타낸다.
주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 5-7에 의해 세포 표면에 제시되는 항원에 탐식 병원균 세균성 및 공정 요소를 인식 할 수있는 수상 세포 또는 대 식세포, 선천 면역의 성분을 포함하여 항원 제시 세포 (APC를). 장갑차가 병원균을 phagocytized 한 후, 그들은 일반적으로 그들이 T와 상호 작용 배수 림프절로 이동세포. T 림프구는 T 세포 수용체에 의해 특정 MHC 펩티드 복합체를 인식 할 수있다. 면역 시냅스 (IS) 항원 제시 8,9 동안 항원 - 로딩 APC 및 림프구 사이의 인터페이스에서 발생한다. 일부 박테리아는 식균 작용을 생존과 장갑차 내에서 체계적으로 보급 할 수 있습니다. 이보기에서 감염된 장갑차는 세균 저수지 또는 세균 확산 (10)를 용이하게 "트로이 목마"의 역할을한다. 장갑차 및 IS 형성 도중에 일어난다 림프구 사이의 긴밀한 접촉은 또한 막, 유전 물질 및 엑소 좀의 일부의 교환을위한 플랫폼으로 기능과 T 세포를 감염시킬 수있는 어떤 바이러스 탈취 할 수있다; 이 과정은 transinfection 11 ~ 13이라고합니다.
일부 병원성 세균 (리스테리아, 살모넬라 엔테과 시겔의 flexneri)은 생체 내에서 T 림프구를 침공과 행동 14-16을 수정할 수 있습니다. 우리는 가지고있다최근 T 림프구는 항원 제시 16의 과정 이전에 감염된 수지상 세포로부터 transinfection 의해 박테리아를 캡처 할 수있는 것을 설명했다. T 세포의 직접 감염보다 (1,000-4,000x) 대단히 더 효과적 transinfection에 의해 세균 캡처. 보다 transinfection 나타내는 T 세포 캡처 병원체 및 비 병원균 박테리아는 T 세포에 의해 구동되는 프로세스이다. 놀랍게도, 세포는 빠르게 캡처 박테리아를 죽이고 전문 식세포 (16)보다 그렇게 더 효율적으로 한 T (가슴) transinfected. 면역학 도그마 휴식이 결과, 적응 면역 세포는 선천성 면역의 가정 배타적이었다 기능을 수행 할 수 있음을 보여준다. 또, 유방 세포 염증성 사이토 카인의 다량 분비 및 생체 내에서 세균 감염으로부터 보호하는 것으로 나타났다.
여기에서 우리는에 세균 transinfection 과정을 연구하는 데 사용되는 다른 프로토콜을 제시마우스 모델. 이 모델은 박테리아에 감염된 뼈 구체적 I-Ab의 상호 작용 (17)의 맥락에서 OVA (OVAp)의 펩티드 3백23부터 3백39까지 대한 TCR의 특정 베어 OTII 트랜스 제닉 마우스에서 CD4 + T 세포의 사용에 기초한다 marrow- 안정적인 면역 시냅스를 형성 OVAp로드 유래 수지상 세포 (BMDCs) 18, 19,.
T 세포 transinfection 시각화 및 형광 현미경을 사용하여 추적 될 수있다. 또한, 유동 세포 계측법, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 박테리아 16, 20에 의해 방출 된 형광을 이용하여 감염된 세포를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, T 세포는 transinfection 더 민감한 방법, 이벤트의 다수의 측정이 가능 젠타 생존 분석으로 정량 할 수있다. 겐타 마이신은 진핵 세포에 침투 할 수 없습니다 항생제이다. 따라서,이 항생제를 사용하는 것은 항생제 첨가 FR 살아남은 세포 내 박테리아의 분화를 허용(21) 사망했다 톰 외 것.
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Protocol
참고 : 실험 절차는 대학교 Autònoma 마드리드의 연구 윤리위원회의 승인을 스페인과 유럽 지침에 따라 동물 복지 및 보건 대학교 Autònoma 마드리드 헤드의 감독하에 실시 하였다. 마우스는 특정 병원체 무료 (SPF) 하우징에 자란하고 이산화탄소를 사용하여 훈련과 자격을 갖춘 사람 (CO 2) 흡입 방법으로 안락사시켰다.
1. 마우스 뼈 수지상 세포의 분화 및 감염 골수 유래
참고 : 그림 1은 첫 번째 단계를 요약 한 것입니다. 모든 절차 만 멸균 미디어, 악기, 피펫 팁 및 배양 접시를 사용하여,이 시점에서 후드에서 수행되어야한다.
- 마우스 골수 유래 수지상 차별화
- 하나 C57 / BL6 마우스 (22)에서 경골과 대퇴골을 해부하고 RPMI 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다. 멸균 가위, 각 골단을 잘라 특성 밝은 붉은 색이 골수를 노출.
- 멸균 페트리에 멸균 주사기를 사용하여 0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 식염수 10 ㎖ (PBS) (BSA), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (PBS / BSA / EDTA 완충액)로 뼈의 내부 달이다 요리.
- 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 600 XG에 튜브에 세포 현탁액을 원심 분리기를 수집합니다.
- 암모늄 염화 칼륨 (ACK) 용균 완충액 (0.15 M NH4Cl 등, 10mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA) 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 적혈구를 제거하기 위해 RT에서 30 초 동안 배양한다.
- 덩어리는 여과에 의해 제거 되었기 때문에 동일한 속도 (600 XG)에서 원심 분리하기 전에 뼈 조각 세포 덩어리를 제거하기 위해 셀 스트레이너 (70 μm의)을 통하여, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 RPMI 1640 배지 10 ㎖를 첨가하고 필터.
- 셀 개수D RPMI, 10 % FBS (함유 50 μM의 B 머 캅토 에탄올, 1 mM 나트륨 피루 베이트)를 5 × 105 세포 / ml로 조정하고 20 NG / ml의 재조합 쥣과 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (RM-GM-CSF)를 추가 최종 농도.
- CO 2 배양기에서 멸균, 미생물 학적 품질, 15cm 페트리 접시, 문화에 현탁액을 추가 (37 ℃, 5 % CO 2).
- 3 일마다 20 NG / ㎖ RM-GM-CSF를 함유하는 신선한 배지로 세포 밀도 5 × 105 세포 / ml에서 비 - 부착 세포 및 PBS에 5mM의 EDTA와 분리 된 세포와 재현 탁을 모두 스핀 다운.
- DC의 항원로드의 성숙
- 9 일에, 20 NG / ㎖ RM-GM-CSF를 함유하는 배지에서의 밀도 5 × 105 세포 / ㎖로 세포를 재현 탁. 그런 다음 세포에 높은 MHC-II의 발현을 허용하고 24 시간 동안이 아닌 조직 배양 처리 된 멸균 15cm 페트리 접시에서 배양 20 NG / 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)의 ㎖에 추가 할 수 있습니다.
- 한 후LPS 자극의 날, 유동 세포 계측법에 의해 수지상 세포의 분화를 확인하기 위해 마우스의 CD11c, MHCII 및 GR-1에 대한 항체와 일부 DC 세포를 얼룩. 수지상 세포의 유세포 분석의 예는도 3a 및도 3b에 도시된다.
- 샘플 당 50 μl의 PBS / BSA / EDTA 버퍼에 최종 농도 2.5 ㎍ / ㎖의에서 항 - 마우스-CD16 / CD32 단클론 항체와 DC가 (5 × 10 5 세포 / 샘플)을 품어. 그 후, MHCII (IA / IE)에 대한 항체의 50 μl를 추가하는 CD11c 1에서 서로 다른 형광 색소와 결합 GR-1 : 100, 1 : 200, 1 : 각각 PBS / BSA / EDTA 버퍼 (500).
- 마지막으로, PBS / BSA / EDTA 버퍼와 DC가 씻어 제조 업체의 프로토콜에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석한다.
참고 : 세포가 잘 분화 된 경우, 세포는 항원 로딩을위한 준비가되어 있습니다.
- 워시 RPMI와 DC가 10 % (항생제없이) FBS, 10 μg의 / ㎖ OTII OVAp (OVA 323-339으로 그들을 품어; ISQA37 ºC에서 최소 1 시간 동안 5 × 106 수지상 RMPI 당 10 % FBS 배지 1 ㎖에 플라스틱 튜브 VHAAHAEINEAGR). 음성 대조군으로, OVAp으로 배양하지 않고 DC가 둡니다.
- 수지상 세포의 감염
- CO 2 인큐베이터에서 1 시간 동안 10 세균 (박테리아 DC 당 10)의 감염 다중도 (MOI)에서 DC의 감염 (37 ° C, 5 % CO 2).
- 워시 DC 세포는 세포 외 박테리아의 대부분을 세척하기 위해 RMPI 10 % FBS 450 XG에 원심 분리기에 PBS와 1 배에서 3 배. 마지막으로, 20 × 106 세포 / ml에서 (항생 물질없이) RMPI 10 % FBS 배지에서 세포를 재현 탁.
OTII 형질 전환 마우스에서 CD4 + T 림프구의 2. 분리
참고 : 그림 1은이 두 번째 단계를 요약 한 것입니다. 림프절은 대신 CD4 + T 세포를 분리하는 비장의 표기 림프절에서의 CD4 + 림프구 비율 때문에S (~ 50 %), 비장 (~ 25 %) 때문에, 정제가 더 효과적 일 것보다 크다.
- 림프절의 단일 세포 현탁액을 확인
- OTII 형질 전환 마우스에서 23 노드 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부 및 장간막 림프절을 제거하고 RPMI 10 % FBS 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다.
- 두 프로스트 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 아래 갈기 림프절. 한 현미경 슬라이드의 프로스트 측에 림프절을 배치하고 장기 지상 될 때까지 두 번째 슬라이드의 프로스트면 문질러.
- PBS / BSA / EDTA 버퍼에 단일 세포 현탁액을 씻으십시오.
- 셀 스트레이너 (70 μm의)가 결합 조직을 제거하고 PBS / BSA / EDTA 버퍼로 씻어 불구하고 세포를 필터링합니다.
- ACK 용해 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 적혈구를 제거하기 위해 RT에서 1 분 동안 배양한다.
- CD4 + T 세포의 분리
- 단계 2.1.3 카운트로 다시 세척세포를 PBS / BSA / EDTA 완충액에서 100 × 106 세포 / ml로 재현 탁 그들을한다. 1 CD8, IgM의, B220, CD19, MHC 클래스 II (I-AB), CD11b를, 중 CD11c 및 DX5에 비오틴 항체를 추가 : (250)을 30 분 동안 얼음에 CD4 + T 세포의 이상 음의 선택에.
- PBS / BSA / EDTA 버퍼에 세포를 씻고 얼음에 15 분 동안 제조 업체의 프로토콜에서 권장하는 농도에서 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 세포 (100 × 10 6 세포 / ml)을 품어.
- PBS / BSA / EDTA 버퍼에 세포를 씻으와 CD4 + T 세포 분리하기 전에 셀 스트레이너 (30 μm의) 비록을 필터링 할 수 있습니다.
- 제조사의 프로토콜에 따라, 자기 세포 분리 장치를 사용하여 음성 선별하여 CD4 + T 세포를 분리.
- 세포를 세어 (항생 물질없이), 10 % FBS RPMI 배지 4 × 106 세포 / ml로 조정한다.
- 수정 및 유동에 의해 순도를 확인하는 얼음 절연 CD4 + T 세포 (3 × 105 세포)에 유지같은 사이토 (24)을 설명했다. CD4 + T 세포를 정제의 예는도 3C에 도시되어있다.
3. T 세포 Transinfection 측정 겐타 마이신 보호 분석에 의한
참고 : 그림 2는 프로토콜의 세 번째 단계를 요약 한 것입니다.
- T 세포 Transinfection
- 감염된 DC 세포 (1 : 1)과 함께 격리 CD4 + T 세포를 부화 CO2 인큐베이터 (37 ° C에서 면역 시냅스 형성을 허용하도록 30 분 동안 (DC에서 1 시간 동안 감염 제거하기 위해 세척 한 후 무료 박테리아), 5 % CO 2).
- 추가 절연 CD4 + T 세포 (2 × 106 세포) 및 24 웰 배양 접시에 감염된 수지상 세포 (2 × 106 세포)를 0.1 mL의 0.5 mL의. 음성 대조군으로서, 30 분 동안 10 박테리아의 MOI에서 직접 0.5ml를 CD4 + T 세포를 감염.
- 사용하여 T 세포에서 감염 DC가 분리 추가 컨트롤을 포함DC-T 물리적 접촉을 방해 (공경이 3 μm)와 폴리 카보네이트 트랜스 웰 배리어. 잘 (24 웰 플레이트)의 하부 구획으로 0.1 트랜스 웰 내부의 DC ㎖의 CD4 + T 세포의 0.5 ML을 추가합니다.
- 마지막으로, RMPI 매체를 갖춘 모든 샘플에서 동일한 볼륨을 만들기 위해 각 웰에 0.6 ml의가있을 때까지.
- 면역 시냅스 형성의 30 분 후, 겐타 마이신 100 ㎍ / ㎖의 추가 및 CO 2 인큐베이터에서 세포를 수집하기 전에 1 시간 동안 배양 (37 ℃, 5 % CO 2).
- 다시 격리 CD4 + T 세포의
- 비 부착 세포를 수집하고 PBS / BSA / EDTA 버퍼를 재현 탁. DC가 대부분의 플라스틱 배양 접시에 부착 된 상태로 유지. 소용돌이 튜브는 부드럽게 세포 세분화을 보장합니다. 겐타 마이신이 잘 작동 것을 보여 제어와 같은 세포 상층 액 500 μl를 유지합니다.
- 단계 2.2에서와 같이 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 샘플로부터 CD4 + T 세포를 다시 분리, DC가 있지만 대부분은 접시에 부착해야합니다. 얼음에 제어 샘플을 보관하십시오. 계정에 2 % 미만 오염 만 실험을 가져 가라. transinfection 후 CD4 + T 세포를 정제의 예는도 3D에 도시된다.
- 를 Lyse T 세포와 박테리아 중간 한천 플레이트에 그들을 씨앗.
- PBS로 두 번 CD4 + T 세포를 씻으십시오.
- 세포를 세어 PBS에서 2 × 106 세포 / ml로 재현 탁 그들을.
- T 세포의 세포 밖으로 방출 박테리아, 1 × 106 세포 / ml에서 그들을 용해시키기 위해 T 세포를 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 X-100 500 ㎕를 추가하기.
- 용해 세포의 3 연속 진수 희석을 확인하고 박테리아 매체 한천 플레이트에 각 희석의 50 μl를 시드. 4 부분으로 판을 나누고 각 부분에 용해 세포의 다른 희석 씨앗. 대표적인 결과를도 4에 나타낸다.
- 대조군으로서, 또한 판형그 겐타 마이신을 보장하기 위해 한천의 접합체의 저장 세포 상층 액을 잘 근무하고있다. 또한 추가 제어로 감염된 DC의 플레이트. 경우 낮은 DC가 오염 (<2 %), 낮은 DC 오염에 대응하는 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 빼기 발생합니다.
4. 정량 유동 세포 계측법에 의한 T 세포 Transinfection의
참고 : 그림 2는이 단계를 요약 한 것입니다.
- T 세포 Transinfection
- 단계 1.3에서와 같이 BMDCs 감염,하지만이 경우 GFP 표현 박테리아를 사용합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 37에서 30 분 동안 세포 추적기 클로로 aminocoumarin (CMAC)와 (단계 2.2에서 림프절에서 격리) 얼룩 CD4 + T 세포 ºC.
- 두 번 (항생제없이) RMPI 10 % FBS으로 표시 CD4 + T 세포를 씻으십시오.
- 감염된 수지상 세포를 품어 표시 CD4 +와 (박테리아와 1 시간 배양 후)30 분 동안 T 세포 단계 3.1.1에서 설명하는 모든 컨트롤을 포함하여 37 ºC에서 면역 시냅스 형성을 허용합니다.
- 감염된 CD4 + T 세포의 염색
- DC-T 면역 시냅스 형성의 30 분 후, 세포를 수집하고 PBS / BSA / EDTA에 씻어.
- PBS / BSA / EDTA 버퍼, 부드럽게 튜브를 텍싱하여 별도의 집계 세포와 두 세척 후.
- 0.2 ㎖ / PBS 실온에서 15 분 동안 3 % 함유의 PFA 튜브에 샘플을 고정한다. 그런 다음 PBS로 씻어.
- 수지상 세포 된 Fc 수용체를 차단하는 얼음에 15 분 동안 PBS / BSA / EDTA 50 μL / 샘플에서 항 - 마우스 CD16 / CD32 모노클로 날 항체 (2.5 μg의 / ml)로 배양한다.
- 세포 외 박테리아를 얼룩 얼음에 30 분 동안 50 μL / PBS / BSA / EDTA의 샘플에서 항균 항체 (최종 농도 10 μg의 / ㎖) 토끼를 추가합니다.
- PBS / BSA는 / EDTA로 세포를 씻으 및 피코 에리 트린 (PE)가 결합 마우스의 CD11c에 대한 항체 및 그 자체로 품어토끼에 대한 condary 항체는 1 알렉사 - 형석 647과 같은 다른 형광 색소가 결합 : 얼음에 30 분 동안 PBS / BSA / EDTA의 200 μL 100 / 샘플.
- 세포를 세척하고 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 비 - 형광성 박테리아에게 샘플들을 보상 및 설정 (25) 유동 세포 계측법을 조정 실험에 사용 된 각각의 형광 색소로 표지 한 음성 대조군 샘플을 사용 transinfected T 세포의 시료를 포함하는 것을 잊지 마십시오. 대표 분석은 그림 5에 표시됩니다.
참고 : 박테리아가 GFP를 표현하지 않는 경우, 5 분 동안 PBS에 0.5 %에서 트리톤 X-100 샘플을, 세포 내와 세포 외 박테리아, 라벨 외 박테리아를 구별 수정 및 Permeabilize 하시려면 할 수 있습니다. 그 후 다른 형광 색소와 총 박테리아 (세포 + 세포)를 얼룩.
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Representative Results
유동 세포 계측법 및 겐타 마이신 생존 분석 그림 1은 세포를 획득하는 절차를 요약 한 것입니다. 여기에서 우리는 감염된 골수 유래-DC가 어떻게 두 개의 서로 다른 접근 방식을 통해 박테리아 transinfection을 측정하는 방법에서 쥐의 T 세포 박테리아 transinfection을 수행하는 방법을 설명했다. 수지상 9 일간 GM-CSF와 골수 세포를 배양하여 생성된다. 그리고 DCS는 OVA (OVAp)의 특정 펩타이드 나중에 그들을로드의 막에 MHCII을 증가 LPS와 숙성된다. 대조군으로, 어떤 DC가이 OVAp으로로드되지 않습니다. (OVAp -로드 및 비 로딩)는 모두 DC의 감염 다중도 (10)의 박테리아 (MOI)로 감염된다. 한편, CD4 + T 세포는 특정 OVAp 인식 OTII 트랜스 제닉 마우스의 림프절로부터 분리된다. (2)가 수행하고 적절한 음성 대조군을 포함하여 T 세포 transinfection를 정량화하는 절차를 도시 한 도표. descri으로침대 전에, 어떤 DC가이 OVAp으로로드되지 않습니다. 이 경우, 인해 OVAp의 부재로 수지상 세포 및 T 아니지만 면역 시냅스 형성 사이의 상호 작용이있다. 추가 제어는 DC-T 물리적 접촉을 방해 (공경이 3 μm)와 폴리 카보네이트 트랜스 웰 배리어로 수지상과 T 세포를 분리하여 포함된다. 수지상 세포는 트랜스 웰 내부에 포함되어 있습니다; 결과적으로 그들은이 기공 크기를 통과 할 수 없다. 다른 대조군은 10 박테리아의 MOI에서 직접 T 세포를 배양함으로써, 직접 T 세포 감염을 포함된다. T 세포 transinfection은 두 가지 방법에 의해 정량화 될 수있다 : 유세포 또는 겐타 마이신 생존 분석. 유동 세포 계측법에 의해 측정하기 위해 DC가 박테리아 GFP와 CD4 + T 세포와 이전에 감염되어 있어야 세포 추적기와 얼룩 (T 세포 블루). 결합체 형성 후, 수지상 세포 (의 CD11c-PE)에 대한 항체로 염색한다. 세포 외 박테리아는 quantif하기 위해 염색한다Y 나중에 유동 세포 계측법에 감염된 CD4 + T 세포의 백분율. 겐타 마이신 생존 분석에 의해 transinfection을 측정하기 위해, 세포는 세포 외 박테리아를 죽일 1 시간 동안 겐타 마이신과 함께 배양 한 후 T 세포는 한천 플레이트에 시드 다시 격리됩니다. 소수 직렬 희석는 한천 플레이트에 각 희석의 50 μl를 씨와 CFUs의 계산을 용이하게하기 위해 만들어집니다.
도 3에 도시 된 바와 같이, DC 분화는 유동 세포 계측법 (도 3a 및 3b)에 의해 확인되어야한다. DC가이 중 CD11c 및 MHCII (그림 3A)이 아닌 GR-1, 호중구 마커 표현한다. 도 3b에 제시된 바와 같이, 약간의 호중구 (GR-1 +, MHC의 3.27 %는 -) 배양에서 제시되었지만 호중구 오염의 5 % 이상으로 수지상 세포의 배양이 사용되어서는 안된다. CD4 + T 세포의 순도는 LY에서 분리 한 후 확인해야시속 노드 (그림 3C) 및 수지상에서 분리 한 후 형성 (그림 3D)를 공액. 접합체 형성 후의 오염물이 2 % 미만으로 고려 실험 걸릴.
도 4는 살모넬라 균을 이용하여 T transinfection의 실험 예를 나타낸다. 도 4a에 도시 된 바와 같이, 플레이트 카운트 수 LB 아가 플레이트 및 콜로니 형성 단위를 성장하는 각 부품. 살모넬라의 연속 희석을 시드하는 네 개의 부분으로 분할된다. 도 4a에 도시 된 바와 같이, 살모넬라 감염의 DC로부터 T 세포에 의해 캡처하고,이 프로세스는 명확 OVAp 인식 (도 4a 및도 4b의 좌측 판) 향상되었다. 수지상 세포와 T 세포 사이의 접촉을 방해하는 물리적 장벽이있을 때 그러나, 사실상 transinfection는 직접적인 T를 수행하는 경우와 같이, 없었다 세포 감염 (그림 4a 및도 4b의 오른쪽에 판).
도 5에 도시 된 바와 같이, T 세포는 밝은 transinfection GFP를 발현하는 박테리아를 이용한 유동 세포 계측법에 의해 정량화 될 수있다. 수지상 세포 및 T 세포를 전방 및 측면 산란 플롯의 크기 및 복잡성에 의해 구별 될 수 있지만, 다른 마커는 잘 구별 할 수있다. CD4 + T 세포 중 CD11c 대한 항체와 세포 추적기 (CMAC) 및 수지상 세포로 표지 하였다. 이들은 CMAC 표지 (하지의 CD11c-PE 포함) 및 표현되기 때문에 세포 외 박테리아 정량화 할 수있다 따라서 알렉사 형석 647, 감염된 CD4 + T 세포의 백분율 공액 살모넬라 및 이차 항체 항 - 토끼 대해 토끼 항체로 염색 하였다 GFP (박테리아-GFP), 그러나 그들은 세포 외 박테리아 (알렉사 플 루어 647)에 대한 항체로 염색되지 않았다.
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DC 생성 및 CD4 + T 세포의 분리도 1 흐름도. 도면의 왼쪽에, 처리는 골수 세포로부터 수상 세포 (DCS)를 구별하기 상세이다. 대퇴골과 경골을 절개 한 후에, 골수 세포는 뼈의 내부로부터 추출된다. 이후, 적혈구 (RBC)를 용균 및 골수 세포 9 일간 뮤린 재조합 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 함께 배양했다. 그들이 잘 차별화 일단, 수지상는 주요 조직 적합성 복합체 II (MHCII) 발현을 증가하는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 함께 배양한다. 그 다음, 수지상 세포는 특정 ovoalbumin 펩티드 (OVAp) 로케이션 및 감염의 다중성 (10)의 박테리아 (MOI)로 감염된다. 그들 중 일부는 대조군으로 OVAp으로로드되지 않습니다. 도면의 오른쪽에, 방법OTII 트랜스 제닉 마우스가 표현에서 CD4 + T 세포를 분리. 림프절 (림프절)은 단일 세포 현탁액을 얻는 제거 및 접지이다. 마지막으로, CD4 + T 세포가 자기 세포 분리 기계를 사용하여 음의 선택에 의해 격리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 T 세포 transinfection 절차의 흐름도. (박테리아가 녹색으로 도시되어있다) 및 OVAp로드 - 수지상 세포 (적혈구) 감염은 면역 시냅스 형성을 허용하는 CD4 + T 세포 (청색 세포)와 함께 배양된다. 감염된 수지상 (그러나 OVAp로드하지 않음) 또한 두 셀들 사이의 상호 작용하지만 면역 시냅스 형성없이 허용 T 세포와 함께 배양된다. 추가 제어가 CD4 +를 분리 포함 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고립 된 CD4 + T 세포 - 유래 수지상 골수의 분석 사이토 그림 3. 흐름. 분석 골수 유래-DC를 대표 도트 플롯유동 세포 계측법. (; 오른쪽 상단 사분면 85.8 %) (B) DC가 MHCII하지만 GR-1 (; 오른쪽 아래 사분면 85 %)을 표현 (A)의 DC는 MHCII와의 CD11c 표현. 그러나, GR-1이 아닌 MHCII 세포 (왼쪽 사분면)을 표현 세포의 3.27 %가 있었다. 이 세포들은 경미한 오염 호중구 있었다. (C와 D) 림프절 (C)에서 분리 된 CD4 + T 세포의 순도를 나타내는 히스토그램, 그리고 수지상 세포 (D)와 복합체를 형성 한 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
겐타 마이신 생존 분석으로 정량도 4 T 세포 transinfection. LB 아가 플레이트는 시마 대응 4 부분으로 나누어분해 된 CD4 + T 세포의 L 연속 희석. (-) (A) 콜로니는 살모넬라 엔테 단위가 존재 (+) 또는 부재하에 T 세포 transinfection에 대응하는 LB 아가 플레이트상에서 성장 형성 감염 DC의 표면에 OVAp, 그리고 (DC / T 세포 접촉을 허용하는 조건 - TW) 또는 접점 (+ TW)을 방해하는 물리적 장벽의 존재. 직접 T 세포 감염 (음성 대조군)에 대응하는 빈 접시 또한 도시된다. DC / T 세포 접촉 (+ TW)을 방해 한 거의 transinfection이 있었다. DC의 감염에서 T 세포에 의해 캡처 된 박테리아의 속도를 보여주는 몇 가지의 실험에서 콜로니 형성 단위 (CFUs)의 (B) 부량. 직접 T 세포 감염 및 DC / T 세포 접촉을 방해하는 조건은 T 세포 감염의 수준으로 거의 생산. DC / T 세포 접촉이 허가되었을 때,이 T 세포 transinfection이었고, 이는 항원 인식 (+ OVAp)에 의해 강화되었다. 열 바는 3 I의 평균을 나타냅니다ndependent 실험. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. 유의 한 차이가 P <0.0001에 해당 ***로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 T 세포는 유동 세포 계측법 transinfection 의해 정량화. 주제 도트 플롯 transinfection 공정 후 수지상 세포 및 T 결합체를 도시. CD4 + T 세포와 같은 작은 둥근 전방 및 측면 스 캐터있다 (FCS - SSC) 도트 블롯 쇼, 잘 분화되기 위해, 이들은 셀 트랙커 (CMAC)으로 염색 하였다. 중 CD11c을 표현 수지상는 CMAC으로 표시하고 불규칙한 모양 T CD4 + T 세포보다 더 큰되지 않습니다. extracel에 대한 세포 내 세균-GFP하지만 부정적인를 포함 감염된 CD4 + T 세포오른쪽 아래 사분면에 표시됩니다적인 다공질 박테리아 (6.19 %). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
T 세포 또는 T 림프구는 적응성 면역 반응 (26)에 세포 성 면역에 중요한 역할을 담당하고 속하는 백혈구 유형이다. T 세포는 시험 관내에서 감염에 반응하지만 일부 리포트들은 생체 14,15에 감염 될 수 있다는 것을 나타낸다. 면역 시냅스 동안 APC와 T 세포의 친밀한 접촉은 HIV (11)와 같은 일부 바이러스를 포함하는 생체 재료 (13)를 교환하기위한 플랫폼 역할을합니다. 그것은 최근에 교리, T 세포에 그 반대를 줬습니다 적응 면역 세포의 패러다임은, 또한 효율적으로 감염된 수지상 11,16에서 transinfection에 의해 박테리아를 캡처 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 그가 감염 BMDCs에서 체외에서 T 세포 박테리아 transinfection을 정량화하는 프로토콜을 자세히 보여줍니다.
T 세포는 박테리아 transinfection 항원 인식 (16)에 의해 강화되었다. 우리는 CD4 + T 세포를 이용하여 분리되었습니다특정 OVAp을 인식 OTII 형질 전환 마우스는 BMDCs는 OVAp하고 (여기에 데이터가 살모넬라 엔테에서 제시) 다른 박테리아에 감염된 쥐와 함께로드. OTII 생쥐로부터 단리 CD4 + T 세포는 면역 시냅스 형성을 허용하도록 30 분 동안 감염된 수지상 세포와 함께 배양된다. 여기에 제시된 데이터는 T 세포가이 짧은 시간에 수지상에서 캡처 박테리아에 대응한다. 우리는 감염된 수지상에 T 세포의 긴 노출 큰 박테리아 캡처 (도시 생략)의 결과 알지만, T 세포는 또한 매우 신속 uptaken 박테리아를 파괴로 긴 DC / T 세포 시간 콘택트 중에 발생하는 세균 transinfection 정량화는 어려웠다 . 겐타 마이신 생존 분석은 하나의 세균 감염 (21)를 검출 할 수 있기 때문에 T 세포 transinfection를 정량화하는 매우 민감한 방법이다. 겐타 마이신과 부화 후 T 세포가 분리되어 박테리아 매체 한천 (PL)에 씨앗에 용해, 단지 외 박테리아를 죽이고 그ATES. 수지상과 복합체를 형성 한 후 T 세포의 분리는 프로토콜 내에서 중요한 단계이다. 오염 물질이 2 % 미만으로 만 실험은 고려되어야한다. DC 오염은 유동 세포 계측법 및 낮은 DC 오염에 대응 CFUs 감산되어야 의해 측정 할 수있다. 대안 적으로, CD4 + T 세포의 순도는 세포 분류를 사용함으로써 개선 될 수있다.
또 다른 방법은 T 세포 transinfection는 GFP가 세균을 표현과 호환되는 형광 물질로 세포 외 세균에 레이블을 사용하여, 유동 세포 계측법입니다 정량화합니다. 이 방법의 한 가지 제한은 박테리아가 자기 형광 배경에 감염된 세포를 검출 충분히 밝은 GFP를 표현해야한다는 것입니다. 또한, 박테리아 세포 추적기와 DC가 감염되기 전에 염색 할 수있다. 또 다른 방법은, 세포 외 박테리아 오염 T 세포 permeabilizing, 모든 세균 (세포 + 세포)를 라벨링 될다른 형광 색소와.
이 프로토콜의 미래 방향에 대해 우리는 자성 입자로 장식 된 박테리아를 사용하여 수지상 세포로 감염 후에 박테리아 이상 설명 캡처 T 세포 수를 정량화하는 프로토콜을 설정하기 위해 시도하고있다. 박테리아를 캡처 T 세포는 자성 입자를 보유 것이고 그러므로 자석을 사용하여 그것들을 분리하기 쉽게한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | ||
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
References
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