Introduction
조직 공학은, 유지, 복원 또는 기본 조직을 강화하고 기능 대체의 개발에 생물학 및 공학의 원리를 사용합니다. 조직 공학뿐만 아니라 세포 기반 센서, 약물 / 독성 검사, 조직 또는 종양 모델 및 기타 과학 및 기술의 발전을 촉진 할 필요에 입체 생체 모방 형 구조를 생성하는 능력. 면밀히 세포 및 조직에서의 원시 세포 외 기질의 고도로 조직화 된 상호 작용을 모방해야하므로 조직 공학 구조물의 3 차원 조직의 제조 방법의 기본적인 구성 요소이다.
생분해 성 및 성형 가공 삼차원 지지체는 세포가 세포의 이차원 층을 형성하기 때문에 신규 이주 조직 구조를 생성하는 중요한 요인이 있지만 선호 입체에서 성장하는 능력이 부족하다. 지지체는 세포의 임시 토대가됩니다부착 및 증식, 그래서 제어 다공성 생분해 성, 그리고 충분한 기계적 integrit와 물질로 구성되어야한다. 지지체 물질은 세포 독성이거나 호스트로부터 부정적인 반응을 만들면 안됩니다. 하이드로 겔은 일반적으로 조직 공학 기술에 사용되어 왔으며, 그들의 친수성 하이드로 겔은 structur 걸쳐 유체 및 가스 교환을 허용한다. 다른 하이드로 겔을 조합하여, 합성 하이드로 겔의 특성은 별개의 애플리케이션 요건을 충족시키는 수정 가능하다.
기존의 조직 공학 방법은 세포 후 FABRICATIO 파종되는 무 세포 다공성 희생 비계의 생성을 포함한다. 많은 기술들은 섬유 접합체, 주조 용매로서 사용하고, 용융 성형하지만, 조직 공학 응용을위한 최소한의 성공적인 것으로 입증되어왔다. 섬유 접합 방법은 섬유가 특정 형상으로 배열 될 수 있도록하지만, 이들은 프로 만 할 수있다매우 얇은 비계으로 줄. 용매 주조 방법은 다공성 구조를 생성하지만 큰 제조 막은 thic 만 3 mm였다. 따라서, 입체적인 구조물을 만드는 것은 이러한 기술을 이용하여 가능하지 않다. 용융 성형 기술은 삼차원 지지체의 제조에 성공 입증 있지만, 이러한 고온은 생물학적 물질 생산 사전 처리 중에 혼입 될 수없는 것이 요구된다. 지지체는 미리 정의 된 또는 가변 마이크로 및 3 차원 지지체를 제조하는 조직 공학의 요구 사항을 충족 할 수있는 능력에 제한이 후 제조 시드. 고체 지지체에 파종 기술과의 또 다른 주요 문제는 혈관과 가난한 기계의 부족이다.
Bioprinting 이후 종래의 단점을 극복하는 비 독성, 생분해 성, 열 가역성 겔의 사용을 통해 입체적으로 확장되었다. 고체 프리폼 제조 t의 몇현재 사용중인 echniques 레이저를 이용한 bioprinting 및 잉크젯 인쇄입니다. 레이저를 이용한 bioprinting 기법 펄스 레이저 소스, 타겟 판과 입체감을 생성하는 수용 기판을 사용한다. 그러나,이 기술로 인해 낮은 스루풋, 낮은 세포 생존에 한정되고, 단지 광경 화성 프리폴리머는 가교 하이드로 겔을 형성하는데 사용될 수 있기 때문에, 제조 된 구조에만 한정 배열을 생성 할 수있다. 잉크젯 인쇄는 피코 리터의 잉크를 증착함으로써 기판 상에 디지털 화상 데이터를 재생 비접촉 방법으로 개발되었다. 그러나, 고해상도의 구조를 생성하지 않는 잉크젯 인쇄는, 경험 빠른 단백질 변성을 구성하고, 세포의 대부분은 증착 동안 용균.
현재, 새로운 첨가제 bioprinting 제조 방법이 개발되었다. 이러한 시스템에서 세포, 단백질, 성장 인자, 및 생체 모방 하이드로 겔은 일반적으로 매트릭스 메이터에 통합IALS 제조 공정 중에 동시에 밀접 고유의 미세 구조를 모방 한 입체 지지체 계 세포 함유 구조물을 생성하기 위해 컴퓨터 제어 액추에이터를 이용하여 증착. 세포 함유 하이드로 겔은 여러 세포 유형, 또는 균질 이루어진 이질적 일 수 bioink를 구성한다. 첨가제 제조 시스템 금고 bioink 드롭하여 놓기 X, Y, Z 방향으로 이동 가능한 컴퓨터 제어 또는 스테이지로 층별 일회용 주사기 팁 비아. 컴퓨터 소프트웨어를 통해, 인쇄 된 스캐 폴드의 구조가 용이하게 어플리케이션의 요구 사항에 따라 조작 될 수있다. 종래 기술과는 달리 입체 의료 기술 (자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영) 환자 별 구조를 생성, 디자인에 혼입 될 수있다. 작 제물은 더 높은 L로 제조되기 때문에 이러한 방법들은 또한 혈관 교체 제조 가능성을 허용OCAL 세포 밀도, 세포 - 세포 상호 작용을 허용하고 사후 주입 surviva의 가능성을 향상시킨다.
팔메 프린터 입체 이종 조직 구조 (도 1)를 생성하기 위해 프로그램 가능한 로봇 제조 방법을 사용하여 지정 구축 입체 멀티 디스펜서 시스템이다. 이 고유 조합의 복수의 재료의 사용은 이종 구조를 제조 할 수있다. bioprinter의 초기화는 당신이 bioprinted 구조의 인쇄 성을 최적화하기 위해 다양한 매개 변수를 설정할 수 있기 때문에 bioprinting에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다.
bioprinter은 사용자가 대화 형 터치 스크린 제어 패널을 통해 동작하는 프로그래머블 로직 컨트롤러 (PLC) (도 1)에 의해 제어되는 기동, 동작 및 종료 순서와 배치 식 공정을 포함한다. 생체의 오염을 방지하기 위해서논리 재료 bioprinter가 양으로 압력을 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 묶인 고효율 미립자 arrestance (HEPA)와 (PMMA) 챔버 공기 순환 시스템을 -filtered (도 1, B, C). 프린터 내부에는 내장 자외선 광원 (도 1, D)를 사용하여 멸균 할 수있다. bioprinter의 핵심 구성 요소는 재현성 10 마이크로 미터 (그림 1, E)의 정확도로 디스펜서 팁을 배치 할 수 있습니다 완전히 프로그램 위치 로봇입니다. 로터리 스크류를 사용하여 230 NL (그림 1, F)로 작은 볼륨을 입금 할 수있는 세 가지 디스펜서가 있습니다. 그들은 각각의 디스펜서에 대한 (그림 1, G)를 인쇄 매개 변수를 관리하는 별도의 컴퓨터를 사용하여 독립적으로 프로그래밍 할 수 있습니다. 회전 축 디스펜스 주사기 아래 팁 주사기 밖으로 이동 bioink 전동 스크류의 회전을 이용한다. 이 디스펜서는 pneumatical에 장착된다LY 제어 도구 네스트 (도 2A는, B), 로봇 제어 프로그램 (도 1, H) 하에서 Z 축 로보트 팔에 장착 된 디스펜서를 전환 할 수 있도록.
XYZ 로봇 (그림 1, I)를 실행하는 컴퓨터 디자인 소프트웨어에서 인쇄 명령을받습니다. 각 프로그램은 분배 위치, 교정 루틴 및 디스펜서 변화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 각 디스펜서 물질을 증착 곳에 주로 XYZ로 구성되어 생성 된 구조의 디자인은 조정합니다. bioprinter는 XYZ이 시린지 선단의 좌표를 결정하는 두 개의 광학 광 센서 (도 2C)을 포함한다. 이 센서는 디스펜서 선단의 위치를 계산하기 위해 다음을 사용하여 로봇에 좌표 정보를 보냅니다. ACCURA와의 거리를 측정하기 위해 30 × 100 마이크로 미터의 스폿 크기 633 nm의 적색 레이저 다이오드 빔을 투영 추가적인 변위 레이저 (도 2D)가 존재0.1 마이크로 미터의 CY. 빔이 고도로 집중되는 경우 로봇이 인쇄면의 Z 거리를 결정한다. 이 측정 및 Z의 선단의 광학 광 센서 측정은, 정확한 Z의 산출이 인쇄면에 대하여 팁 디스펜서를 배치하는 데 사용되는 좌표를 허용한다. 디스펜서 팁 Y 및 Z 센터를 찾는 X 축 배향 된 광학 광 센서를 통해 측 방향 및 수직으로 이동하고, 측 방향으로 Y 축 센서를 통해 X 축의 중심을 찾는. 표면이 분배 선단의 위치에 상대적인 위치를 결정할 CZ + = d만큼 도끼 + : 인쇄면은 XYZ 공간에서 평탄면에 대한 식을 사용하여 매핑된다. 프린터 단계 (그림 1, j)는 직경 80mm에 샘플 페트리 접시를 보유하고 설정 온도 (그림 1, K)를 유지하기 위해 재순환 수조를 사용합니다. 스테이지 온도는 -20의 범위로 설정하고 내에 안정적으로 유지 될 수있다. USB 카메라가 1 마운트Z 로봇 아암 상에 프린팅 공정 (도 1, L) 중에 분배 팁의 확대도를 제공한다. 프린팅 공정 (도 1, L) 중에 bioprinter의 완전한 뷰를 제공하는 챔버 내부의 상단을 향해 장착 번째 카메라가있다.
컴퓨터 지원 설계 드로잉 소프트웨어는 증착 패턴을 결정하고, 사용자가 점진적으로 이격 방울과 복잡한 구조 (도 3)를 생성하도록 허용한다. 세 가지 차원 경로를 수동으로 프린터와 호환되는 디자인 소프트웨어에 코딩 또는 별도의 컴퓨터 지원 설계 도면 소프트웨어 (그림 4, 표 1)에서 가져올 수 있습니다. 프린터 호환 소프트웨어 허용 같은 시린지 선단과 SUBST 사이 증착법 (단일 액적 증착 또는 연속적인 통로 증착) 경로의 입체 기하학, 증착 속도, 거리로 인쇄 파라미터 변동레이트 인쇄 표면, 개별 방울 및 높이를 증착하고 주사기를 가속화하는 시간은 방울의 증착 사이에 상승된다. 각 프로그램은 인쇄 중, 운영자의 개입없이, 무균 환경을 제공하기 위해 XYZ 분배 위치, 팁 교정 루틴 및 디스펜서 변화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 로봇의 프로그램 가능한 논리 제어기 (PLC)를 설계 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터 명령어를 수신하고, 외부 컨트롤러의 이벤트의 타이밍 (예를 들면, 디스펜서)를 제어한다.이를 위해, PLC는 디스펜서를 제어하는 반복 기법을 사용 로봇 위치 결정 장치, 및 환경 요인.
회전 축, 액체 분배 시스템을 이용하여 입체적인 직접 기록 bioprinting보다 효율적 정확하고, 이전의 방법보다 쉬울에 셀을 증착하는 프로세스를 허용한다. 이 연구는 사용자 정의 내장 bioprinter는 CE를 생성 할 수 표시높은 세포 생존과 LL 함유 하이드로 겔 구축합니다.
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Protocol
알긴산 히드로 겔의 3 차원 Bioprinting에 대한 젤라틴 함유 기판 1. 준비
- 고 함량의 감소와 연관된 가능성을 피하기 위해 Pataky 등 11에 의해 기술 된 칼슘 / 젤라틴 기재 방법에 따라 칼슘 / 젤라틴 기판을 준비한다. 칼슘 / 젤라틴 기판 방법은 아래에 나열되어 있습니다.
- 증류수에 염화칼슘에 탈수 (1.5 중량 %), 염화나트륨 (0.9 중량 %), 및 돼지 젤라틴 (2 중량 %)을 합하여 100 mM의 젤라틴 용액을 만들기 위해 2 분 동안 끓인다.
- 젤 O에 냉장고에 평평한 표면에, 100mm 표준 배양 접시에 젤라틴 / 칼슘 용액 5 ㎖를 붓고 심지어 표면에 코팅하기 위해 주변의 솔루션을 소용돌이, 장소 / N은 (GEL 할 수 있도록 최소한 8 사용하기 전에 시간).
- 젤라틴 / CaCl2를 용액에 산화 티탄 (0.3 중량 %)를 추가하고, 기판 표면의 불투명도를 증가. 10 분 동안 교반한다. AUT그것을 살균 30 분 동안 액체 사이클에 젤라틴 / 이산화 티탄 용액을 oclave.
- 이전에 조제한 젤라틴 판의 표면에 젤라틴 / 이산화 티탄 용액 3 ㎖를 추가한다. 이 고르게 표면에 분산되어 있는지 확인하기 위해 혼합물을 소용돌이. 4 ° C 냉장고 O에 젤을 허용 / N (사용하기 전에 적어도 8 시간 겔 할 수 있습니다). 기판 3 일 이내에 사용해야합니다.
2. 알긴산 산화
- 후술 Bouhadir 동부 등 30에 의해 부분적으로 산화 알긴산 방법 다음 소듐 알지네이트 bioink 산화.
- 5 % 산화 알지네이트 용액을 증류수 100ml에 알긴산 나트륨 1g을 용해. 5 %의 산화 용액을 제조, 요오드 산 나트륨 수용액 (0.25 M, 0.25 밀리몰), 산화제를 추가한다. 실온에서 19 시간 동안 교반한다. REA을 종료 24 시간 후, 용액에 40 ml의 에틸렌 글리콜을 추가ction의.
- 용액에 염화나트륨 2.5 g을 용해. 산화 된 알기 네이트를 침전 (1 비율 2) 에틸 알코올 과량을 추가. 침전물을 수집하기 위해 1,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기 및 증류수을 다시 녹인다. 에탄올 세척을 반복합니다.
- 동결 건조는 사용 전까지 -20 ° C에서 산화 알긴산 펠릿 저장합니다.
- 나트륨의 비율을 측정함으로써, 산화의 정도를 확인 에틸렌 글리콜에 의해 종료되기 전에 소비 요오.
- 요오드화 칼륨 용액 (V / w 20 %, pH가 7.0 인산 나트륨 완충액)과 thyodene 용액 (V / w, 10 %, pH가 7.0 인산 나트륨 완충액)을 준비한다. 실온에서 산화 알긴산과 두 개의 솔루션을 섞는다.
- 서서히 요오드화 칼륨과 theodyne 용액을 반응 혼합물에 알긴산 나트륨과 요오드 용액을 드롭. 분광 광도계로 426 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정한다. 이 도달하면최대, V 1과 알긴산 나트륨과 요오드 용액의 부피 이용을 기록한다.
- 반응은
. 반응 요오드 산 나트륨의 양은 
- 나트륨의 양은 요오드 섭취를 결정하기 위해 원래의 농도에서 반응과 요오드 산 나트륨의 양을 뺀다. 이전의 공식을 사용하여, 아르 긴산의 최종 산화 정도를 결정한다.
. 반응 요오드 산 나트륨의 양은 
3. 알긴산 펩타이드 활용
- 세포 부착 및 확산을 촉진하기 위해 아래에 설명 로리 등 (31)에 의해 RGD-알긴산 활용 방법을 수행하여 이전에 제조 된 산화 알긴산에 노출 된 아르기닌 - 글리신 - 아스 파르 테이트 시퀀스 (펩타이드)와 복합체 리간드.
- 수성 carbod를 사용하여G 4 RGDSPto 접합체 (31)와 iimide 화학.
- 0.1 M 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 5 % 산화 알긴산 1g을 용해 (MES) 완충액 (pH는 4 = 1- 에틸 - (디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드 (EDC, 0.54 밀리몰)를 첨가하고, N- 히드 록시 2에서 NHS, 0.27 밀리몰) : 1 비율 아미드 중간체를 형성한다.
- 터미널 아민 통해 알기 네이트 중합체의 백본에 0.28 밀리몰 펩타이드, 커플 링을 추가합니다. RT O / N에서 저어.
- 용액에 2.5 g의 염화나트륨을 첨가하여 커플 링 반응을 정지. 산화 된 알기 네이트를 침전 (1 비율 2) 에틸 알코올 과량을 추가. 침전물을 수집하기 위해 5 분 동안 4,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 세포 배양 후드에서 미디어 대기음 증류수에 침전을 재용. 에탄올 세척을 반복합니다.
- 이 완전히 건조 될 때까지 (흰색 가루 물질로 나타납니다) 침전물을 건조 동결하고 나중에 C 냉장고 °에서 -20 저장사용합니다.
4. 인간 지방 조직의 기질 세포 (hADSC의) 세포 배양
- 배양 인간 지방 조직의 간질 세포 (hADSC의) 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 %의 글루타민, 및 1 % antimycin 15 ml의 낮은 글루코스 DMEM 덮여 세포 배양 플라스크 (T75 플라스크) 처리 75cm에서. 그들은 포화 상태 (80~90%)에 도달 할 때까지 매 2 일 세포 배양 후드에서, 미디어를 변경합니다.
- 합류 후에 세포 배양 후드 T75 플라스크를 전송하고 hADSC 이제 트립신 효소 절단 방법을 사용하여 정지.
- 후드, 셀 오프 세포 배양 배지를 모두 대기음. 칼슘과 마그네슘 (DPBS ++)와 둘 베코 인산염 완충 식염수 5 ㎖로 씻어. 세포 떨어져 DPBS ++를 대기음.
- 후드에있는 동안, 1 ml의 트립신 4 ml의 DPBS ++를 혼합하여 트립신과 DPBS ++의 솔루션을합니다. 각 플라스크 오디오 솔루션을 5 mL를 필요이온 그래서 합류 플라스크의 수에 해당하는 부피를. 각 플라스크에 트립신 / DPBS ++ 5 mL를 추가하고 2 분 동안 인큐베이터에 넣어.
- 2 분 후, 플라스크를 제거하고 가볍게 바닥에서 세포를 풀어 그들의 측면을 누릅니다. 세포가 일시 중단됩니다 확인하기 위해 현미경으로 각 플라스크 봐. 다시 세포 배양 후드에서 플라스크를 배치하고, 각 플라스크에 적당한 세포 배양액 3 ㎖를 추가한다. 이 트립신 반응을 종료합니다.
- 각 플라스크에서 세포 함유 미디어를 전송하고 50 ML 원뿔에 넣어. 5 분 동안 1,000 XG에서 그들을 원심 분리기. 세포는 원뿔의 바닥에 작은 흰색 펠렛으로 표시해야한다. 다시 세포 배양 후드에 전송하고 미디어를 대기음. 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁.
- 현미경을 이용하여 혈구 세포를 카운트. 세포가 계산되고 나면, 미디어 배양 후드에서, 분취 량은 1.3 ~ 만 달러를 포함N 세포와 15 ML 원뿔로 전송. 원심 1,000 x g에서 5 분 동안 다시 세포를 함유하는 15 ml의 원추형.
- 배양 후드에서, 각각의 플라스크에 ~ 350,000 세포의 농도를 첨가 여러 T-75 플라스크에 남아있는 세포를 시드. DMEM 매체의 15 ML을 추가하고 다시 합류 할 때까지 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 원심 분리기 사이클이 완료되면, 세포 배양 물에 15 ml의 원추형을 반환. 세포 펠렛으로부터 미디어 대기음, 종종 용액을 terteriating, bioink의 밀리리터 당 130 만개의 세포 농도로 수성 알지네이트 용액에 세포를 재현 탁하여 그렇게 bioink 걸쳐 세포의 분포가 균일하다. 멸균 프린터 호환 3 ML의 주사기로 세포 함유 솔루션을로드하고 멸균 22 G 플라스틱 팁에 나사.
5. Bioprinter 설정
- bioprinter, 디스펜서 각 컴퓨터 및 recirculat를 켭니다물 목욕을 보내고.
- 수동으로 겔화 메커니즘에 재순환 수조 온도를 설정합니다.
- 수동으로 상관 디스펜서 컴퓨터의 각 디스펜서에 대한 인쇄 매개 변수를 설정합니다. 0 backsteps 230 NL, 수에 분배 볼륨을 설정하고 분배 비율은 -sec 10μL 할 수 있습니다.
- 설계 소프트웨어와 컴퓨터의 USB 카메라의 디스플레이를보기위한 프로그램을 연다.
- 소프트웨어를 사용하여 수동으로 방울 사이에 2.4 mm의 간격이 5 × 5 점 배열에 대한 좌표를 입력합니다.
- 로 인쇄 매개 변수를 설정 선단과 기판 표면 사이의 거리 = 0.1 mm; 높이 주사기가 증언 사이에 상승 = 20mm; 당 증착 시간은 1 초 =.
- 프로그램을 저장하고 로봇을 보낼 수 있습니다.
- 4 ° C 프린터 무대에 젤라틴 / 이산화 티탄이 함유 배양 접시를 놓습니다. 닫고 챔버 문을 잠급니다.
- INI하기 위해 PLC를 사용하여자외선 광원 tialize, 90 초 동안 살균 챔버.
- 살균이 완료되면, 챔버를 열고 hADSC의 건에 알긴산 현탁 1. 근접 함유 주사기를로드 챔버 도어를 잠글.
- 팬 시스템을 켜 평형 내부 압력이 30 초를 기다려야 PLC를 사용합니다.
- 컴퓨터에서 기하학적 경로 및 인쇄 매개 변수를 포함하는 프로그램을 실행합니다.
- 인쇄 프로세스를 통해, 정확하고 균일 한 인쇄를 확인하기 위해 컴퓨터에 USB 카메라의 디스플레이를 본다.
- 인쇄가 완료되면, 구조는 40 분 동안 겔 할 수 있습니다.
6. 세포 생존 능력 평가
- 영상의 시간이 될 때까지 인큐베이터에서 즉시 DMEM에서 후 인쇄 및 저장을 이미지화 될 수 없습니다 구조를 커버.
- 구조물의 생존율을 정량화하기 위해, 형광 기반 생존력 / 세포 독성 분석을 사용하여 염색공 초점 현미경을 사용하여 차의 이미지입니다.
- 키트 지시에 따라, 칼 세인 AM을 및에 티듐 호모 다이머 -1을 함유하는 염색 액을 준비한다. , 염색 액 10 ㎖을 에티 디움 호모 다이머-1의 20 μL와 칼 세인의 5 μl를 추가하려면 멸균 10 ㎖에 오전, 조직 배양 등급 둘 베코 인산염 완충 식염수 (+ 마그네슘 + 칼슘, DPBS ++).
- 어둠 속에서 15 분 동안 염색 용액에 담가 bioprinted 구조.
- 화상 일 0과 8에 공 초점 현미경 시스템을 사용하여 염색 된 구조는 300 ㎛의 깊이에 걸쳐 30 광학 슬라이스 Z 스택 파라미터를 이용하여, 각 bioprinted 구조체의 다수의 사진을 촬영하고, 직접 세포를 카운트. 세포가 노란색 표시 또는 빨간색 경우 녹색 그들로 살아 카운트, 그리고 만약 그들이 죽은 계산합니다.
- 구조체의 셀의 총 개수로 나눈 생균 수와 세포 생존 비율을 계산하게하고; 세포 생존 = 수살아있는 세포 (녹색 + 노란색) / 총 세포 수 (녹색 + 빨강 + 노랑) × 100 %.
- 0 일에 세포 수로 나눈 8 일째의 세포 수와 같은 각각의 샘플에 대한 세포 증식의 양을 계산하게하고; 하루 8 / 살아있는 세포에 세포 증식이 = 라이브 세포 수는 일 0 X 100 %에 계산합니다.
7. RGD 펩타이드 활용 분석
- 알긴산에 RGD 펩티드 결합의 성공을 분석, RGD 공역 알긴산 및 비공 알긴산과 비교. ( '6 Diamidino -2- 페닐 인돌, 다이 하이드로 클로라이드 4)를 사용하여 (DAPI)와 팔로이 딘 얼룩을이, 이미지 인쇄 구조를 수행합니다.
- DPBS ++의 200 μL와 메탄올 원액의 5 μl를 희석하여 솔루션을 작업 phalloidins합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
- (0.10509 G / L) / (350.3 g / 몰) = 3 × 10 -4 M = 0.0003 M = 0.300 밀리미터 = 300 μM : 방정식 다음 DAPI 얼룩의 300 μm의 주식 솔루션을 확인하십시오. 일을 확인E는 DAPI 원액을 희석 한 용액을 사용 : ++ DPBS 100 3 μM 용액을 얻었다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
- 완전히 4 % 파라 포름 알데히드에서 샘플 잠수함. 실온에서 1 시간 동안 품어. 이 솔루션은 5 분마다 세척 동안 앉아있게 DPBS ++로 3 회 세척 할 것. 그 과정에서 이상 젤을 내리고, 유리 슬라이드에 우물에서 젤 샘플을 전송합니다. 10 분 동안 0.1 % DPBS에서 트리톤 X-100 (0.1 g / 100 ㎖)에 ++ 겔 담가. 각각의 세척을 위해 5 분을 허용, DPBS ++로 3 회 세척 할 것.
- 작동 용액에 침지시켜 그들을 팔로이 딘으로 인쇄 얼룩 구조. 호일로 덮고 4 시간 동안 품어. 팔로이 딘 얼룩을 제거하고 DPBS ++로 3 회 세척한다. 첫 번째 세척은 후자의 세척은 5 분마다 앉아야, 빠른해야합니다.
- DAPI 작업 솔루션을 담금으로써 DAPI와 인쇄 구조를 얼룩. 호일로 덮고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 빨래각 세척을 허용 DPBS ++와 세 번, 5 분 동안 앉아있다. 공 초점 현미경 시스템에 샘플을 관찰하고 이미지입니다.
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Representative Results
결과 bioprinter 정확하게 특정 입체 장소에서 세포를 함유 한 하이드로 겔 증착하고 일관 컴퓨터 지원 소프트웨어를 이용하여 입증 할 수있다. 이 소프트웨어는 각 방울의 위치를 확인하고 (그림 3,4) 분배에 대한 많은 매개 변수를 제어 할 수 있습니다. 적절하게 생체 물질을 증착하는 bioprinter의 반복은 조직 공학 응용 프로그램에서의 성공에 필수적입니다.
세포 생존, 성공적인 bioprinting 기술의 요구 사항 중 하나는, 1 시간, 후 인쇄 8일을 분석 하였다. 높은 세포 생존율은 생체 모방 형 구조를 제조하기위한 필수적이고 충분한 bioink의 직접적인 표현이다. RGD 펩티드 결합은 확산 셀을 홍보하여 오랜 기간 동안 세포 생존 능력을 향상시킨다. 형광 현미경 법은 프린팅 공정 후 구조물은 세포 생존율을 정량화하는 데 사용되었다. CONCENTR와 알긴산 bioink15 %와 5 %의 산화 ATION는 0 일 98 %의 생존율, 96 %의 4 일, 및 95 %의 8 일 (도 5)를 가졌다. 이러한 결과는 직접 기록 bioprinter의 증착 기술 중이나 인쇄 처리 후 생존 유지 구조물 생산하기에 충분한 세포를 부드럽게 돌출 나타낸다 (도 1, 2). 높은 세포 생존율은 5 %의 산화 및 15 % 농도의 알긴산 bioink 셀 증착을위한 적합한 비히클이고 세포 생존에 적합한 환경을 제공 나타낸다. 각 영역에서의 유사 셀 카운트 알긴산 bioink에서 균질 세포 분포, 인쇄 해상도의 기본적인 양상을 보였다.
대부분의 조직은 복잡한 조합 및 세포 외 기질 성분, 특정 생물과 기계의 영향을 각각의 그라데이션이 있습니다. 생체 재료는 네이티브 환경의 생체 모방하고 세포 기능을 촉진한다. 알긴 지지체의 다공성 허용세포는 의사 소통을하고 서로 네트워크, 또한 골격과 그 주변 환경 사이의 영양분과 대사 물질의 흐름을 용이하게 할 수 있습니다. 세포 외 매트릭스는 세포 부착 및 세포 증식 작용 성 조직으로 세포 외 매트릭스 분자의 조직이 발생하기 전에 조직 형성의 예비 단계이다. 세포의 증식은 상처 치유 및 조직의 성장에 중요한 역할을하고, 따라서 조직 공학 응용 프로그램 bioprinted 구문 분석이 매우 중요한 요소이다. 인쇄 된 구조의 RGD - 복합 알긴산 향상된 세포 부착, 개선 된 세포 확산 및 확산을 선도. 인쇄 된 지지체에 세포의 증식이 일에 별도의 세 가지 영역 0 8 (그림 6)를 계산하여 정량 하였다. 전체 세포 증식은 배양 8 일 후에 219.674 % 인 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 발판을 사용할 충분한 생체 적합성을 가지고 의미손상되거나 작동하지 않는 조직을 복구하는 세포를 제공하기위한 SA 합성 세포 외 기질.
알긴 bioink에 RGD 펩티드 결합의 성공을 분석, 비교 실험 셀 라덴 RGD 공역 15 % 농도 5 %의 산화 알긴 bioink 셀 라덴, 비공 15 % 농도 5 %의 산화를 이용하여 수행 하였다 알긴산 bioink. 핵 및 액틴 용 팔로이 딘 염색 용 DAPI 염색 (샘플 당 적어도 세 개의 랜덤 이미지) (30)의 Z-스택 변수를 이용하여 공 초점 현미경 시스템을 이용하여 촬영 한 각 시료의 날 인쇄 구조물은 제 이미지를 확산 세포를 분석하는데 사용 하였다 (300)의 깊이를 통해 광학 조각 (그림 7). 셀 RGD 공역 알지네이트와 시료에 도시 분산 시키면 알긴산에 펩티드의 성공적인 도입을 증명한다. 세포 이동은 조직 개발에서 중요한 단계입니다; 따라서 알긴산에 RGD 펩티드의 결합은 리튬을 향상이 bioink를 사용하여 생체 내 응용 프로그램의 kelihood.
그림 1. 팔메 토 프린터. 프로그래머블 로직 컨트롤러는 모든 프린터 기능 (A)의 동작을 조정합니다. 흡입 여과 (C) 및 배기 (C)와 기밀 밀폐 실 (B)의 오염의 가능성을 줄이기 위해 조절 된 내부 양압을 유지한다. 챔버의 천장에 장착 된 듀얼 UV 등 (D)가 안전 간격으로 동작하도록 프로그래밍 될 수있다. JANOME 2300N XYZ 로봇 (E)는 프로그램과 통합 컴퓨터 (I)에 의해 제어된다. 세 디스펜서 컨트롤러 (G)이 컴퓨터 제어하에 로봇 Z 축 아암 (H) 상에 로딩 될 사용할 디스펜서 건 (F)의 출력을 조절하도록 프로그래밍된다. 로봇 샘플 홀더의 온도 (J)는 수조 제어기 (K)에 의해도 4 및 40 ° C 사이에서 설정된다. 듀얼 디지털 카메라 (L)를 사용할 수 T입니다 O 프린터 활성 및 샘플 형성을 모니터링한다. 하나의 카메라가 로봇 Z 축 팔에 장착하고 장전 된 총의 디스펜서 팁의 확대 이미지를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 도구 둥지, 광학 센서, Bioprinter의 변위 레이저. 전면에서 A. 언로드 도구 둥지보기. 정면에서 나로드 도구 둥지보기. C. 광학 센서는 3 차원 공간에서 분배 선단을 측정. Z는 인쇄면의 좌표를 측정 D. 거리 레이저. 를 클릭하십시오 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
bioprinted 구조의 외부 구조를 설계에 사용되는 컴퓨터 지원 설계 도면 소프트웨어의 그림 3. 시각 PathBuilder 소프트웨어. 이미지. 이 프로그램은 점진적으로 간격 방울과 복잡한 형상을 생성 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. JR-C 포인트 소프트웨어. 프린터 호환 설계 소프트웨어의 스크린 샷. 이 프로그램은 성막 방법을 제어하도록 사용자에게 허용한다 (즉, 한 방울의 증착 또는 연속적인 통로 증착), 증착 속도, 시린지 선단 인쇄 SU 사이의 거리 인쇄물 처리 표면, 각 드롭, 물방울 (표 1 참조)의 3 차원 위치의 증착을위한 할당 된 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
bioprinted 0 (A) 후 공 초점 현미경 시스템 (깊이 30여 광학 조각의 Z-스택 매개 변수)를 사용하여 촬영 한 구조 및 8 hADSC의 스테인드 hADSCs 후 인쇄. 세포 생존 / 세포 독성의 그림 5. 형광 이미지는 형광 이미지 ( B) 일. hADSC는 포유류의 세포 생존 / 세포 독성 분석을 사용하여 인쇄 후 표지 하였다. 라이브 세포는 녹색 염색하고, 죽은 세포가 빨간색으로 염색된다.3156fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. Bioprinted를 구축의 정량화 생존율은. 라이브와 죽은 세포의 수는 생존 / 세포 독성 분석법을 이용하여 정량 하였다. 일 0 라이브 / 죽은 세포 수의 (a)에 표시하고, 8 일의 카운트 (B)에 있습니다. 일 0, 8 각 영역에 대한 계산 살아있는 세포의 수는 (C)로 표시됩니다 세포 증식을 정량화하기 위해 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
셀 - 라덴, N 그림 7. 비교에 접합하고 RGD 공역 알기 네이트. 비공 액 (A)에 bioprinted hADSC 년대의 형광 이미지 및 RGD 공역 (B) 15 % 농도 5 %의 산화 알긴산 bioink는 (Z-스택 파라미터를 공 초점 현미경 시스템을 사용하여 촬영 깊이 이상 30 광학 조각). hADSC의이 구조의 각 확산 세포를 분석 팔로이 딘과 DAPI 얼룩 염색 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 명령 표 | |
| 명령 | 로봇 응답 |
| PTP 포인트 | X, Y, Z 공간에 표시된 posiiton로 로보트 팔 이동 |
| Find_Base_Z | T를 측정하기 위해 병자 레이저를 사용그 기판의 표면을 인쇄; 시린지 선단과 기판 표면 사이의 거리를 수동으로 설정된다. |
| 치 작동합니다. 번호 (직장 조정 번호) | 명령 로봇 건 1 건 2 건 또는 3 (기판 표면을 결정하기위한) SICK 레이저를 사용한다. |
| Get_1 | 명령 로봇 OT 검색하고 총 1로드 |
| Find_Tip1_YZ | 로봇은 Y 및 Z 방향에서의 총 (1)의 선단부를 찾아 |
| Find_Tip1_X | 로봇은 X 방향의 총 (1)의 선단부를 찾아 |
| 포인트 분배 | 로봇에서 결정된 X bioink 하나 방울을 분배한다, Y, Z 위치 |
| 팔레트 번호 (Pallte 번호) | 인쇄, 예를 들어, 배열에 대한 수동으로 코딩 된 디자인을 통합합니다. |
| 분배 시간 | 각각의 개별 방울의 증착을 위해 할당 된 시간이다. </ TD> |
| Store_1 | (0,0,0) : toolnest에 총 1을 반환하고, 홈 위치로 돌아갑니다 로봇을 명령. |
표 1. 프로그래밍 가능한 컴퓨터 소프트웨어 명령.이 차트는 로봇 팔과 인쇄 적성을 제어 파라미터들을 최적화하기 위해 사용되는 프로그램 가능한 컴퓨터 소프트웨어 명령을 설명합니다.
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Discussion
조직 공학의 주요 초점은 복원 유지, 또는 기본 조직 능을 향상시킬 수있는 생물학적 대체품을 개발하여 장기 이식 부족과 요구 사이의 갭을 연결한다. 이것은 내부 geometr을 통해 복잡한 해부학 적으로 정확한 외부 형상, 정밀 제어와 비계의 직접 제작하게되었다. 입체 bioprinting은 층별 approac를 이용한 디지털 모델의 다양한 크기와 형태의 입체 구조를 생성하기 위해 사용되는 방법이다. 입체 생체 모방 구조의 제조는 조직 공학의 발전에 중요한 역할을한다.
생성 된 구조의 생체 모방 능의 영향을 설계 프로세스의 중요한 측면이 있습니다. 생체 재료 및 기판의 온도를 제어하는 능력은 하이드로 겔의 겔화기구 나 그 유지에 필수적인따라서 하이드로 겔 내에서 세포의 분포, 증식 및 분화에 영향을 미치는 기계적인 특성. 기관은 많은 세포 유형으로 구성되므로 다수의 디스펜서 이종 조직 형 구조의 제조에 중요하다. 외부 아키텍처의 컴퓨터 지원 설계는 별개의 상처 나 조직에 대한 사용자 정의 조직 대체의 생산을 할 수 있습니다. 이 환자 별 교체의 발전을 위해 필수적이다. 그것은 서로 밀착 적절한 셀을 배치하고이 세포 - 세포 접합부 -like 생체 내에서 형성 할 수 있으므로 구조 내에서 세포 - 세포의 관계에 영향을주기 때문에, 내부 구조는 동일하게 중요하다. 세포가 의사 소통을하고 서로 네트워크가 혈관 네트워크를 형성하고, 기본 조직에서 자신의 생체 활성을 모방하는 방법 세포의 정확한 위치를 결정합니다. 입체 bioprinting는 bioink 내에 균일하게 분산 세포뿐만 아니라, 공간 (P)에 우수한 정밀도를 제공한다세포의 lacement. 생성 된 지지체는 세포 분화 및 세포 외 매트릭스의 형성에 필수적인 높은 지방 세포 밀도를 갖는다.
안정적이고 지속적으로 생체 모방 하이드로 젤과 혼합하여 각각의 세포 또는 세포의 균일 한 방울을 분배 3D 로봇 bioprinter은 여기에 제시했다. 유사 bioprinters는 미리 융합 기술을 이용했다. 차동 접착 가설에 따르면, 각각의 세포가 융합되며 셀 SURFAC의 농도 및 부착 분자의 분포에 기초하여, 구성 형 또는 유사한 장치에 배치 될 때. 이러한 장치는 프리로드 또는 융합 후 디스펜서로 로딩 및 다른 융합 사전 또는 미리 만들어진 봉에 근접하게 배치 된 다른 기하학적 형상을 작성한 후 퓨즈 큰 형상으로 shap. 최종 형상은 이러한 미리 만들어진 단체로 구성 할 수 있습니다 무엇에 의해 제한됩니다. 여기에 구현은 고유 bioprinter 온도를 포함제어 환경이되는 세포 및 세포 - 겔 혼합물을 미리 융합의 필요성에 의해 제한되지 않는다. 이러한 조건 하에서, bioprinter 차동 접착 가설에 전적으로 의존하지 않다. 하이드로 겔 재료의 포함은 세포 분포를 안내하고 그 세포 융합 할 수 없거나, 특성에 따라서 구체적인 실험에 원하는 수있다. 세포 캡슐화를위한 생체 모방 하이드로 겔의 선택은 또한 세포의 표현형에 지대한 영향을 미친다. 물질은 세포 부착뿐만 아니라, 셀 크기와 morpholog에 효과를 갖는 것으로 알려져있다. 예컨대, 하이드로 젤의 점도와 같은 유동 학적 특성, 셀룰러 microenvironmen에 미치는 영향을 지시. 기본 알긴산은 불활성 쉽게 표현형의 제어에 참여하는 세포와 통신하지 않습니다. 그러나, 화학적으로 펩타이드 결합 및 산화를 통해 수정 된 알기 네이트를 사용하여, 생성 된 작 제물은 분해성을 제어 및 증가 된 세포를 표시 할첨부 파일 마이그레이션 및 proliferatio. 생체 재료의 물리 화학적 특성을 변경하면 조직 developmen는 영향을 미칠 수있다.
유동체 토출을 이용한 입체 bioprinting가, 직접 기록 장치가 인쇄 제물 해상도의 정도에 의해 제한되어, 하이드로 겔 재료의 초기 세포 사멸 후 인쇄의 가용성 및 생체 모방을 vascularize하는 능력. bioprinting의 중요한 특징은 해상도입니다. 모든 프린팅 법은 달성 가능한 가장 작은 세부 하부 기술적 한계 크기에 의해 정의된다. 분 세부 높은 해상도, 더 작은 최대 구조체 : 인쇄 된 구조물의 하한 사이즈 달성 스케일 간의 동적 관계가있다. bioprinter는 유사 시스템보다 더 높은 해상도를 제공, 매우 구체적이고 조직 패턴으로 볼륨을 작게 (230)로 NL을 증착 할 수있다. 하이드로 겔은 일반적으로 인해 bioprinting에 사용 된 그들의친수성, 생체 적합성, 세포 외 매트릭스 구조의 유사성, 그리고 modificatio의 용이성. 하이드로 겔의 높은 수분 함량은 생체 적합성을 향상 시키지만, 큰 기계적 강도를 감소시킨다. bioadditive 제조 압출 동안 유체 전달에 적합한 기계적 특성을 가진 최적 하이드로 부족하다. 따라서, 면역 학적으로 불활성 성공적으로 유체 전달을 이용하여 압출 될 수 cytocompatible 겔화 메커니즘을 가지고 있고, 또한 기계의 최적 범위 세포 함유 하이드로 겔 매트릭스를 생산 개발 큰 수요가있다. 인쇄 공정 전에, 세포 함유 하이드로 겔 bioink는 셀의 저하, 시간의 양에 대해 주사기에 저장되어야한다. 인쇄 공정 동안에, 압출 동안 세포에 의한 전단 응력은 또한에 유해 할 수있다. bioprinter 따라서 I의 문제를 극복하는, 매우 실용적 (> 90 %) 구조를 제조 할 수있다nitial 세포 죽음. 혈관은 전송 지원, 또는 bioprinted의 생체 모방 기능을 유지에 중요한 역할을한다. 산소의 확산이 m이고; 따라서 큰에서 저산소증이있다 구축 bioprinted. 종래의 기술은 크게 제조 가능한 비계의 크기 제한, 매립 맥관 구축 제조 불가능하다. bioprinter의 세포 생존 평가 8 일 동안 인쇄 된 구조물에 상당한 세포 증식을 나타내었다. 따라서,이 기술은 세포 성장, 통신 및 네트워크의 형성, 혈관의 요구를 허용 골격을 생성하는 능력을 증명한다.
bioprinter 신속히 특정 패턴으로 세포 함유 하이드로 겔을 증착하기 위해 다양한 재료를 사용하는 능력을 제공한다. 이 기술은 가변 특성을 갖는 이종 구조물을 생산하고 있지만, 동시 증착 및 반응성 혼합이 불가능하다. 어떤 생체 재료의 경우,이 증착 충족HOD는 겔화 메커니즘을 강화하고 골격 블라우스 시간을 단축 할 것이다. 멀티 주사기 디스펜서의 추가 biofabrication 기술에 대한 생체 재료의 넓은 범위를 허용 할 수 있습니다. 하이드로 겔의 특성, 셀 네트워크 형성 및 혈관의 구조에 대한 자세한 정보를 제공하는 것보다 긴 시간에 걸쳐 bioprinted 구조물은 세포 활성의 조사.
설명 bioprinter의 성막 방법은, 상기 로봇의 위치와 이전에 소정의 패턴으로 증착 된 물질의 상부에 생체 물질을 증착하는 다수의 세 디스펜서 구동 포함 할 수있다. 이 단계는 입체 장기 또는 조직이 생성 될 때까지 상승하는 패턴을 사용하여 반복 될 수있다. 따라서, 팔메 프린터 확실 혈관계 및 높은 세포 생존을 유지시킬 수있는 입체 구조를 만들기 위해 세포 함유 하이드로 겔 분배에 적합하고 있었던조직 공학 용도에 사용된다.
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Acknowledgments
이 작품은 그랜트 번호 EPS-0903795 국립 과학 재단 (National Science Foundation), NIH NIDCR R01 - DE019355 (MJY PI), 그랜트 8P20 GM103444 (YM PI)에 의해 수여 아래 정부 지원에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
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