Introduction
Tissue engineering bruger principperne for biologi og teknik i udviklingen af funktionelle erstatninger at bevare, genoprette eller forbedre indfødte væv og. Evnen til at generere tredimensionelle biomimetiske konstruktioner på efterspørgslen vil lette den videnskabelige og teknologiske fremskridt inden for tissue engineering samt i cellebaserede sensorer, narkotika / toksicitet screening, væv eller tumor-modeller og andre. Den tredimensionale organisering af væv-manipuleret konstruktioner er et grundlæggende element i fabrikation metode, fordi det skal nøje efterligner den meget organiseret samspil mellem celler og ekstracellulære matrix i native væv.
Biologisk nedbrydelige og form-dannende tredimensionale skeletter er kritiske faktorer ved at skabe nye vævskonstruktioner fordi cellerne migrerer til dannelse af et todimensionalt lag af celler, men mangler evnen til at vokse i begunstigede tredimensionalt. Stilladset fungerer som en midlertidig fundament for cellentilknytning og spredning, så det skal være fremstillet af materialer med kontrollerbar porøsitet og bionedbrydelighed, og tilstrækkelig mekanisk integrit. Stilladset materialer bør ikke være cytotoksiske eller oprette en uheldig reaktion fra værten. Hydrogeler har været almindeligt anvendt i væv teknikker, og på grund af deres hydrofilicitet, hydrogeler tillade væske og gasudveksling hele struktu. Ved at kombinere forskellige hydrogeler, den syntetiserede hydrogelens egenskaber er modificerbare at opfylde særskilt program krav.
Den konventionelle vævsmanipulering tilgang indebærer skabelsen af acellulære porøse offer stilladser, der er podet med celler efter fabricatio. Mange teknikker er blevet anvendt, såsom fiber-binding, støbning opløsningsmiddel og smeltestøbning, men viste sig at være minimalt succes for vævsdyrkningsapplikationer. Fiberbinding metoder tillader fibre skal tilpasses i bestemte former, men de er kun i stand til produktion meget tynde stilladset. Opløsningsmiddel støbemetoder produceret meget porøse konstruktioner, men den største producerede membran var kun 3 mm thic. Derfor skaber tredimensionale konstruktioner ikke er mulig ved hjælp af disse teknikker. Melt støbeteknikker vist sig effektive til at producere tredimensionelle stilladser, men der kræves så høje temperaturer, at biologiske materialer ikke kan indarbejdes i løbet af produktions- proces. Stilladser seedet post-fabrikation er begrænsede i deres evne til at opfylde kravene i tissue engineering til at producere tredimensionelle stilladser med foruddefinerede eller kontrollerbare mikrostrukturer og. Et andet stort problem med solide stillads seeding teknologier er mangel på vaskularisering og dårlig mekanisk.
Bioprinting er siden blevet udvidet til tre dimensioner ved hjælp af ikke-toksiske, bionedbrydelige, termoreversible geler til at overvinde ulemperne ved konventionelle. Et par af de faste freeform fabrikation techniques øjeblikket anvendes, er laser-assisteret bioprinting og inkjet print. Laser-assisteret bioprinting teknikker bruger en pulserende laser kilde, en måltavle, og en modtagende substrat til at generere tre-dimensionelle. Imidlertid er denne teknik begrænset på grund af lav kapacitet, levedygtighed lav celle, og kan kun fremstille begrænsede arrangementer af fabrikerede strukturer, fordi kun fotokrydsbindbare præpolymerer kan anvendes til dannelse af en tværbundet hydrogel. Inkjet print blev udviklet som en berøringsfri metode, der gengiver digitale billeddata på et substrat ved at deponere picoliter blæk. Men inkjet print ikke producere en høj opløsning konstruktion, konstruerer erfaring hurtige proteindenaturering, og mange af cellerne lyseres under afsætningen.
I øjeblikket er der udviklet nye additiv fremstilling bioprinting metoder. I disse systemer celler, proteiner, vækstfaktorer og biomimetiske hydrogeler typisk integreret i matrix materIALS under produktionsprocessen og samtidig afsættes ved hjælp af edb-styrede aktuatorer til at generere tredimensionelle stillads-baserede celle-laden konstruktioner, der nøje efterligner mikroarkitektur af indfødte. Celle-lastet hydrogeler udgør bioink, som kan være heterogen, der består af flere celletyper, eller homogen. Tilsætningsstof fremstillingssystemer deponering bioink drop-by-drop eller lag-på-lag via engangssprøjter og tips på en computerstyret fase stand til at bevæge sig i X, Y og Z-retning. Gennem computersoftware, kan arkitektur trykte stilladser nemt manipuleres afhængigt krav til ansøgningen. I modsætning til konventionelle teknikker, kan tre-dimensionelle medicinske teknologier (magnetisk resonans imaging, computer tomografi) indarbejdes i design, genererer patient-specifikke konstruktion. Disse fremgangsmåder tillader også muligheden for at producere vaskulariserede udskiftninger, fordi konstruktioner produceres med en højere local celletæthed, så celle-celle-interaktioner og forbedre sandsynligheden for post-implantation surviva.
Palmetto printer er en specialbygget tredimensionale multi-dispenser system, der bruger programmerbare robot fremstillingsmetoder at generere tredimensionale heterogene vævskonstruktioner (figur 1). Det tillader brugen af en flerhed af materialer i unikke kombinationer til frembringelse af heterogene strukturer. Initialisering af bioprinter er et af de vigtigste skridt i bioprinting fordi det giver dig mulighed for at indstille en række parametre for at optimere trykbarheden af de bioprinted konstruktioner.
Den bioprinter omfatter en batch typen proces med start, drift og nedlukning sekvenser styres af en programmerbar logisk styreenhed (PLC), som brugeren opererer gennem en interaktiv touch screen kontrolpanel (figur 1, A). For at undgå kontaminering af biologiske materialer af bioprinter er indesluttet i et positivt presset poly (methylmethacrylat) (PMMA) kammer med en højeffektiv partikelformet arrestance (HEPA) -filtered luftcirkulation (figur 1, B, C). Det indre af printeren kan steriliseres ved hjælp af de indbyggede ultraviolet lyskilder (figur 1, D). Den centrale del af bioprinter er en fuldt programmerbar positionering robot, der reproducerbart kan placere en dispenser spids med en nøjagtighed på 10 mikrometer (figur 1, E). Der er tre dispensere, som er i stand til at deponere mængder så små som 230 nl anvendelse af en roterende skrue (figur 1, F). De er uafhængigt programmeres ved hjælp af separate computere, der styrer trykning parametre for hver dispenser (figur 1, G). Roterende skrue dispensering udnytter rotationen af en motordrevet skrue til at bevæge sig ned bioink en sprøjte og ud af sprøjten. Disse dispensere er monteret på en pneumatiskly kontrolleret Tool Nest (figur 2A, B), således at robotten at skifte dispenser monteret på Z-aksen robotarm under programmeret styring (figur 1, H).
XYZ robot modtager udskrivningsinstruktioner fra en computer, der kører design software (figur 1, I). Hvert program indeholder dispensering steder, kalibrering rutiner og dispenser skiftende protokoller. Udformningen af genererede konstruktioner består primært af XYZ koordinater hvor hver dispenser vil deponere materialet. Den bioprinter omfatter to optiske lyssensorer (figur 2C), der bestemmer XYZ koordinater af sprøjten spids ende. Disse sensorer sender koordinering af informationer til robotten, der bruger dem til at beregne positionerne for flaskespidsen ender. Der er en ekstra forskydning laser (figur 2D), at projekter en 633 nm diode rød laserstråle af spot størrelse 30 x 100 mikrometer til at måle afstand med en ACCURAcy på 0,1 mikrometer. Når strålen er meget fokuseret robotten bestemmer Z afstand af trykfladen. Denne måling, og den optiske lyssensorer måling af den spidse ende i Z, muliggør beregning af præcise Z-koordinater anvendes til at placere flaskespidsen i forhold til udskrivningen overflade. De dispenserspidser bevæge sig lateralt og vertikalt gennem X-aksen orienteret optisk lysføler at finde de Y- og Z-centre, og sideværts gennem et Y-aksen sensor til at finde midten af X-aksen. Trykfladen er kortlagt ved hjælp af formlen for et fladt plan i xyz plads: ax + by + cz = d for at bestemme, hvor overfladen er i forhold til positionen af dispenser spidsende. Printeren trin (figur 1, J) har en prøve petriskål op til 80 mm i diameter og bruger en recirkulerende vandbad for at opretholde den indstillede temperatur (figur 1, K). Stage Temperaturen kan indstilles inden for et område på -20 og forbliver stabil indenfor. Der er en USB-kamera monteretpå robotten Z-arm for at tilvejebringe en forstørret visning af udleveringsspidsen under trykprocessen (figur 1, L). Der er et andet kamera monteret mod toppen af kammeret interiør, der giver et komplet billede af bioprinter under trykprocessen (figur 1, L).
En computer-aided design tegneprogrammet bestemmer deposition mønster og tillader brugeren at generere trinvist fordelte dråber og komplekse strukturer (figur 3). Tredimensionale veje kan manuelt kodet ind i printeren-kompatible design software eller importeret fra et separat computerstøttet design tegning software (figur 4, tabel 1). Printeren-kompatibel software giver variationer af udskrivning parametre som deposition metoden (enkelt dråbe aflejring eller kontinuerlig sti deposition), tre-dimensionelle geometri veje, deposition sats, afstanden mellem sprøjtens spids ende og substsats trykflade, mængden af tid til at deponere en individuel dråbe, og højden og fremskynde sprøjten løftes mellem aflejring af dråberne. Hvert program indeholder XYZ dispensersystemer steder, tip kalibrering rutiner og dispenser skiftende protokoller til at give et sterilt miljø, uden at operatøren griber ind, under udskrivning. Den programmerbare logiske styreenhed (PLC) af robotten modtager instruktioner fra computeren kører design software og styrer timingen af begivenhederne fra de eksterne controllere (f.eks dispenserne). For at gøre dette, bruger PLC'en en looping mekanisme til at styre dispensere , robot positionering enhed, og miljømæssige faktorer.
Tredimensionale direkte-write bioprinting anvendelse af en roterende skrue, flydende dispenseringssystem tillader processen med at indsætte celler at være mere effektiv, præcis og nemmere end tidligere metoder. Denne undersøgelse viser specialbygget bioprinter er i stand til at generere cell-laden hydrogel konstruktioner med levedygtighed høj celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af gelatine indeholdende Substrat til tredimensionel Bioprinting af alginathydrogeler
- Forbered calcium / gelatinesubstratet efter fremgangsmåden beskrevet af Pataky et al 11 for at undgå reduceret levedygtighed forbundet med højt indhold af kalk / gelatinesubstrat metode. Calcium / gelatinesubstrat metode er anført nedenfor.
- Kombiner calciumchlorid dihydrat (1,5 vægt%), natriumchlorid (0,9 vægt-%), og porcin gelatine (2 vægt%) i destilleret vand og koges i 2 minutter for at skabe en 100 mM gelatineopløsning.
- Hæld 5 ml af gelatine / calcium opløsningen i 100 mm standard petriskåle, hvirvle løsningen rundt for at gøre en endnu belægning på overfladen, og sted på en flad overflade i køleskabet til gel-O / N (lad det gel mindst 8 hr før brug).
- For at øge opaciteten af substratoverfladen, tilsæt titandioxid (0,3 vægt-%) til gelatine / CaCl2-opløsning. Der omrøres i 10 minutter. Autoclave gelatine / TiO2 løsning på væsker cyklus for 30 min at sterilisere det.
- Tilsæt 3 ml af gelatine / TiO 2-opløsning på overfladen af den tidligere fremstillede gelatine plader. Swirl blandingen for at sikre, at det er spredt jævnt hen over overfladen. Tillad at gelere i 4 ° C køleskab O / N (gør det muligt at gelere mindst 8 timer før brug). De substrater skal anvendes inden for 3 dage.
2. Alginat Oxidation
- Oxidere natriumalginat bioink følge fremgangsmåden for delvist oxideret alginat af Bouhadir et al 30 beskrevet nedenfor.
- For at gøre en 5% oxideret alginatopløsning, opløses 1 g natriumalginat i 100 ml destilleret vand. Tilføj en vandig opløsning af natriumperiodat (0,25 M, 0,25 mmol), oxidationsmidlet, for at fremstille en 5% opløsning oxidation. Der omrøres i 19 timer ved stuetemperatur. Tilsæt 40 ml ethylenglycol til opløsningen efter 24 timer for at afslutte reaktion.
- Opløs 2,5 g natriumchlorid i opløsningen. Tilføj en overskydende mængde af ethylalkohol (2: 1-forhold) til fældning de oxiderede alginater. Centrifugeres opløsningen ved 1000 xg for at indsamle præcipitaterne og re-opløse dem i destilleret vand. Gentag ethanolvask.
- Frysetørre de oxiderede alginat piller og opbevares ved -20 ° C indtil den er klar til brug.
- Bestemme graden af oxidation ved at måle procentdelen af natriumperiodat forbruges, før de bringes til ophør af ethylenglycol.
- Der fremstilles en kaliumiodidopløsning (20% w / v, pH 7,0 natriumphosphatpuffer) og en thyodene opløsning (10% w / v, pH 7,0 natriumphosphatpuffer). Bland de to løsninger med den oxiderede alginat ved RT.
- Gradvist droppe omsættes alginat og natriumperiodat opløsning i blandingen kaliumiodid og theodyne løsninger. Absorbansen af blandingen ved 426 spektrofotometrisk nm. Når den har nået enmaksimum, registrerer den brugte mængde alginat og natriumperiodat opløsning som V 1.
- Reaktionen er
. Mængden af uomsat natriumperiodat er 
- Fratræk mængde uomsat natriumperiodat fra den oprindelige koncentration til bestemmelse af mængden af natriumperiodat forbruges. Brug den tidligere formel, fastlægge den endelige oxidation graden af alginat.
. Mængden af uomsat natriumperiodat er 
3. Alginat peptid Konjugation
- Konjugat ligander med en eksponeret arginin-glycin-aspartat sekvens (peptid) i den tidligere fremstillede oxiderede alginat ved at følge RGD-Alginat konjugering metode Rowley et al 31 beskrevet nedenfor for at fremme cellebinding og spredning.
- Brug vandig carbodiimide kemi med G 4 RGDSPto konjugat 31.
- 1 g 5% oxideret alginat opløses i en 0,1 M 2- (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES), pH = 4. Tilsæt 1-ethyl- (dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC, 0,54 mmol) og N-hydroxysuccinimid ( NHS, 0,27 mmol) ved forholdet 2: 1 til dannelse af amidmellemprodukt.
- Tilføj 0,28 mmol peptid, kobling til rygraden i alginat polymer via terminalen amin. Der omrøres ved stuetemperatur O / N.
- Stop koblingsreaktionen ved tilsætning af 2,5 g natriumchlorid til opløsningen. Tilføj en overskydende mængde af ethylalkohol (2: 1-forhold) til fældning de oxiderede alginater. Centrifugeres blandingen ved 4000 xg i 5 minutter at indsamle præcipitaterne. Aspireres mediet i cellekultur hætte og genopløse præcipitaterne i destilleret vand. Gentag ethanolvask.
- Frysetørre bundfald, indtil det bliver helt tørret (vises som et hvidt pulverformigt stof) og gemme i -20 ° C køleskab til senerebruge.
4. Humant fedtvæv stromacellers (hADSC s) Cellekultur
- Kultur human fedtvæv stromaceller (hADSC s) i 75 cm behandlet celledyrkningskolber (T75 kolber), dækket med 15 ml lav glucose DMEM med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamin og 1% antimycin. Ændre mediet, i cellekultur hætte, hver to dage, indtil de har nået konfluens (80-90%).
- Når sammenflydende, overføre T75 kolber til cellekultur hætte og suspenderer hADSC s ved hjælp af trypsin enzym fordøjelsen metode.
- I hætten, opsug alle celledyrkningsmediet ud af cellerne. Skyl med 5 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand med calcium og magnesium (DPBS ++). Aspirer DPBS ++ ud af cellerne.
- Mens i hætten, gør en opløsning af trypsin og DPBS ++ ved at blande 1 ml trypsin og 4 ml DPBS ++. Hver kolbe kræver 5 ml af solution, så få det passende volumen for antallet af sammenflydende kolber. Der tilsættes 5 ml trypsin / DPBS ++ til hver kolbe og sætte dem i inkubatoren i 2 min.
- Efter 2 minutter, fjerne kolberne og let trykke siderne af dem til at løsne cellerne fra bunden. Se på hver kolbe under et mikroskop for at sikre, suspenderes cellerne. Kolberne anbringes tilbage i cellekultur hætte og tilsættes 3 ml passende celledyrkningsmedier til hver kolbe. Dette afslutter trypsin reaktion.
- Overfør celle-laden medier fra hver kolbe og sat i en 50 ml konisk. Centrifuger dem ved 1000 x g i 5 min. Cellerne skal vises som en lille hvid pellet i bunden af den koniske. Transfer tilbage til cellekulturen hætte og aspireres medierne. Resuspender cellerne i 2 ml cellekulturmedier.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer under mikroskopet. Når cellerne er blevet talt, i kulturen hætte, aliquot mængden af medier indeholdende ~ 1,3 million celler og overførsel til en 15 ml konisk. Centrifuger 15 ml konisk indeholdende cellerne igen i 5 minutter ved 1.000 x g.
- I kulturen hætte, reseeder de resterende celler i flere T-75 kolber, tilføjer en koncentration på ~ 350.000 celler til hver kolbe. Der tilsættes 15 ml DMEM-medium og vende tilbage til inkubatoren, indtil sammenflydende igen.
- Når centrifugen cyklus er færdig, returnere 15 ml konisk til cellekulturen. Aspirer mediet fra cellepelleten, og cellerne resuspenderes i vandig alginatopløsning ved en koncentration på 1,3 million celler pr milliliter bioink, terteriating opløsningen ofte så der er en homogen fordeling af celler i hele bioink. Indlæse celle-belæsset løsning i en steril printer-kompatible 3 ml sprøjte og skru den sterile 22 G plastik tip.
5. Bioprinter opsætning
- Tænd bioprinter, hver af dispenseren computere, og recirculating vandbad.
- Manuelt indstille recirkulerende vandbad temperatur til for gelering mekanisme.
- Manuelt indstille trykning parametre for hver dispenser på korrelerende dispenser computer. Indstil dispenseringsvolumen til 230 nl, antal backsteps til 0, og afgivelseshastighed at 10 pi -sec.
- Åbn design software og programmet til visning af USB kameraets display på computeren.
- Brug af softwaren, manuelt indtaste koordinaterne for en 5 x 5 dot array med 2,4 mm afstand mellem dråber.
- Indstil udskrivning parametre til at være: Afstanden mellem spids ende og substrat overflade = 0,1 mm; højde sprøjte løftes mellem deposition = 20 mm; mængden af tid pr deposition = 1 sek.
- Gemme programmet og sende den til robotten.
- Placer gelatine / TiO2-holdig petriskål på 4 ° C printer scenen. Luk og lås kammeret døren.
- Brug PLC initialize de ultraviolette lyskilder og sterilisere kammeret til 90 sek.
- Når sterilisation er færdig, skal du åbne kammeret og indlæse sprøjte indeholdende hADSC s suspenderet i alginat i Gun 1. Luk og lås kammeret døren.
- Brug PLC for at tænde for blæseren systemet, vent 30 sek til ligevægt indre tryk.
- På computeren, køre programmet indeholder de geometriske pathway og udskrivning af parametre.
- Under hele udskrivningsprocessen, se USB kameraets skærm på computeren for at bekræfte nøjagtig og ensartet print.
- Når udskrivningen er afsluttet, tillade konstruktionerne at gel i 40 minutter.
6. Cell Levedygtighed Vurdering
- Dæk konstruktioner, der ikke kommer til at blive afbildet umiddelbart efter udskrivning i DMEM og butik i inkubatoren, indtil tidspunktet for billeddannelse.
- For at kvantificere levedygtigheden af konstruktionerne, bejdse dem ved hjælp af en fluorescerende-baseret levedygtighed / cytotoksicitet assay ennd billedet ved hjælp af konfokal mikroskopi.
- Efter kit instruktioner, forberede en farvning opløsning indeholdende calcein AM og ethidiumhomodimer-1. For at gøre 10 ml farveopløsning, tilsættes 20 pi af ethidiumhomodimer-1 og 5 pi af calcein am til 10 ml sterilt, vævskultur-grade Dulbeccos phosphatbufret saltvand (+ magnesium, + calcium; DPBS ++).
- Fordybe bioprinted konstruktioner i pletten opløsningen i 15 minutter i mørke.
- Billede de farvede konstruktioner ved hjælp af et konfokalt mikroskop system på dag 0 og 8. Tag flere billeder af hver bioprinted konstruktion, ved hjælp af Z-stack parametre for 30 optiske skiver over en 300 um dybde, og manuelt tælle cellerne. Hvis celler forekommer gul eller grøn tælle dem som levende, og hvis rød, tælle dem som død.
- Beregn cellelevedygtigheden procentsats som antallet af levende celler divideret med det samlede antal celler i konstruktionen; Cellelevedygtighed = antallevende celler (grøn + gul) / samlede antal celler (grøn + gul + rød) x 100%.
- Beregne mængden af celleproliferation for hver prøve som celletallet i dag 8 divideret med celletallet på dag 0; Celledeling = levende celletal på dag 8 / levende celletal på dag 0 x 100%.
7. RGD peptid Konjugation Analyse
- For at analysere succes RGD peptid konjugation på alginat, sammenlign RGD-konjugeret alginat og ikke-konjugeret alginat. For at gøre dette, billede de trykte konstruktioner ved brug (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol, Dihydrochloride) (DAPI), og phalloidin pletter.
- Gøre phalloidins arbejdsopløsning ved at fortynde 5 pi af methanolopløsningen stamopløsning blandes med 200 pi DPBS ++. Opbevar ved -20 ° C indtil brug.
- Foretag en 300 uM stamopløsning af DAPI-farvet efter ligningen: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 x 10 -4 M = 0,0003 M = 0.300 mM = 300 uM. Foretag the DAPI arbejdsopløsning ved at fortynde stamopløsningen 1: 100 i DPBS ++ til opnåelse af 3 uM opløsning. Opbevar ved -20 ° C indtil brug.
- Helt nedsænkes prøven i 4% paraformaldehyd. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Der vaskes tre gange med DPBS ++, tillade opløsningen at sidde i 5 minutter hver vask. Gelen prøven overføres fra brønden til et objektglas, spejlvende gel over i processen. Fordybe gelen i 0,1% Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) i DPBS ++ i 10 minutter. Vask tre gange med DPBS ++, så 5 min til hver vask.
- Farv de trykte konstruktioner med phalloidin ved at nedsænke dem i arbejdsmiljøet løsning. Dæk med folie og inkuberes i 4 timer. Fjern phalloidin pletten og vask tre gange med DPBS ++. Den første vask skal være hurtigt, de sidstnævnte vaske skal sidde i 5 minutter hver.
- Farv de trykte konstruktioner med DAPI ved at nedsænke dem i DAPI brugsopløsning. Dæk med folie og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Vasketre gange med DPBS ++, så hver vask for at sidde i 5 min. Observere og billede prøverne på en konfokal mikroskop system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne viser bioprinter er i stand til at afsætte celle-lastet hydrogeler i specifikke tredimensionale steder præcist og konsekvent anvendelse af computerstøttet software. Disse programmel bestemme placeringen af hver dråbe og styre mange af parametrene til afgivelse (figur 3,4). Repeterbarhed bioprinter på passende deponere biomaterialer er afgørende for dens succes i vævsdyrkningsapplikationer.
Cellelevedygtighed, et af kravene til en vellykket bioprinting teknik, blev analyseret 1 time og 8 dage post-trykning. Høj cellelevedygtighed er afgørende for fremstilling af biomimetiske konstruktioner og er en direkte repræsentation af en passende bioink. RGD peptid konjugation forbedrer cellernes levedygtighed i længere tid ved at fremme celle sprede sig. Fluorescerende mikroskopi blev brugt til at kvantificere levedygtighed celle i konstruktioner efter trykprocessen. Alginat bioink med en concentration på 15% og oxidation af 5% havde en dag 0 levedygtighed på 98%, dag 4 i 96%, og dag 8 i 95% (figur 5). Disse resultater indikerer Afsætningsteknikken af den direkte-write bioprinter ekstruderer celler forsigtigt nok til at producere konstruktioner, der forbliver levedygtige under og efter trykprocessen (figur 1, 2). Den høje celleviabilitet viser 5% oxidation og 15% koncentration alginat bioink var en egnet køretøj for celle aflejring og forudsat et passende miljø for celle-overlevelse. Lignende celletal i hvert af de områder, viste en homogen celle fordeling i alginat bioink, et grundlæggende aspekt af udskriftsopløsningen.
De fleste væv har komplekse kombinationer og gradienter af ekstracellulære matrix bestanddele, hver med specifikke biologiske og mekaniske påvirkninger. Et biomateriale skal være biomimetiske af den native miljø og fremme cellulære funktioner. Den høje porøsitet af alginat stillads tilladerceller til at kommunikere og netværk med hinanden, og kan også lette strømningen af næringsstoffer og metabolitter mellem stilladset og dets omgivende miljø. Celleadhæsion til den ekstracellulære matrix er en indledende fase af væv dannelse, der sker før celledeling og organiseringen af ekstracellulære matrix molekyler i funktionel væv. Proliferationen af celler spiller en afgørende rolle i sårheling og vævsvækst og er derfor en meget vigtig faktor, når man analyserer bioprinted konstruktioner til vævsdyrkningsapplikationer. RGD-konjugeret alginat forbedret cellebinding i trykte konstruktioner, hvilket fører til forbedret cellespredning og proliferation. Proliferationen af celler i den trykte stilladser blev kvantificeret ved at tælle tre separate områder på dag 0 og 8 (figur 6). Den samlede celleproliferation blev fundet at være 219,674% efter 8 dages dyrkning. Disse resultater tilkendegiver stilladset har tilstrækkelig biokompatibilitet skal anvendes ensa syntetiske ekstracellulære matrix til levering af celler til at reparere beskadigede eller ikke-funktionelt væv.
For at analysere den succes RGD peptid konjugation på alginat bioink blev en sammenligning eksperiment udføres ved hjælp af celle-lastet, RGD-konjugeret koncentration 15%, 5% oxidation alginat bioink og celle-lastet, ikke-konjugeret koncentration 15%, 5% oxidation alginat bioink. DAPI-farvning for kerner og phalloidin farvning for actin blev anvendt til at analysere cellespredning i trykte konstruktioner på dag 8. Billeder af hver prøve (mindst tre tilfældige billeder per prøve) blev under anvendelse af et konfokalt mikroskop, der anvender Z-stack parametre 30 optiske skiver over en 300 dybde (figur 7). Den Cellespredning vist i prøven med RGD-konjugeret alginat beviser vellykket inkorporering af peptidet på alginat. Celle migration er et vigtigt skridt i væv udvikling; Derfor konjugeringen af RGD-peptider på alginat forbedrer likelihood af in vivo-program ved hjælp af denne bioink.
Figur 1. Palmetto printer. Programmable Logic Controller koordinerer handlinger alle printerfunktioner (A). En lufttæt indeslutning kammer (B) med filtreret indtagelse (C) og udstødning (C) opretholder en reguleret indre overtryk for at reducere risikoen for forurening. Dobbelte UV lys (D) monteret i loftet kammeret kan programmeres til at operere på sikker intervaller. En Janome 2300N XYZ Robot (E) er programmeret og styret af et integreret computer (I). Tre dispenser controllere (G) er programmeret til at regulere produktionen af dispenser kanoner (F) klar til at blive lastet på robotten Z-aksen arm (H) under computerstyring. Temperaturen af robot prøveholderen (J) er indstillet mellem 4 og 40 ° C ved et vandbad controller (K). Dobbelte digitale kameraer (L) er til rådighed t o overvåge printeraktivitet og prøve formation. Et kamera er monteret på robotten Z-aksen arm og giver et forstørret billede af dispenseren spidsen af ladt pistol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Værktøj Nest, Optic sensorer og Displacement Laser af Bioprinter. A. Ubelastet værktøj reden udsigt fra fronten. B. Loaded værktøj reden udsigt fra fronten. C. Optic Sensorer måle dispensering spids ende i tre-dimensionelle rum. D. Afstand laser måle Z-koordinat trykning overflade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Visuel PathBuilder Software. Billede af computerstøttet design tegning software, der bruges til at designe den ydre arkitektur bioprinted konstruktioner. Dette program giver mulighed for at generere trinvist fordelte dråber og komplekse geometrier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. JR-C Points Software. Skærmbillede af printeren-kompatible design software. Dette program giver brugeren mulighed for at styre deposition metoden (dvs. enkelt dråbe deposition eller kontinuerlig sti deposition), deposition hastighed, distance mellem sprøjte spids ende og udskrivning su bstrate overflade, den tildelte tid til aflejring af hver dråbe, og den tredimensionelle placering af dråber (se tabel 1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Fluorescerende Billede af Stained hADSCs Post-udskrivning. Cellelevedygtighed / cytotoksicitet fluorescerende billeder af hADSC er i bioprinted konstruktion taget efter 0 (A) ved hjælp af et konfokalt mikroskop-system (Z-stack parametre for 30 optiske skiver over en dybde) og 8 ( B) dage. Den hADSC s blev mærket efter udskrivning med en pattedyrscelle levedygtighed / cytotoksicitetsassay. Levende celler farves grøn, og døde celler farves rød.3156fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Kvantificeret levedygtigheder af Bioprinted konstruktioner. Antallet af levende og døde celler blev kvantificeret ved hjælp af en levedygtighed / cytotoksicitetsanalyse. De levende / døde celletal for dag 0 er vist i (A), og de tæller for Dag 8 i (B). Vises antallet af levende celler talt for hvert område på dag 0 og 8 i (C) og blev brugt til at kvantificere celleproliferation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Sammenligning af Cell-Laden, Non-konjugeret og RGD-konjugeret Alginater. Fluorescerende billeder af bioprinted hADSC er i ikke-konjugeret (A), og i RGD-konjugeret (B) 15% koncentration 5% oxidation alginat bioink taget under anvendelse af et konfokalt mikroskopsystem (Z-stack parametre 30 optiske skiver over en dybde). Den hADSC s blev farvet med phalloidin og DAPI pletter at analysere cellespredning i hver af konstruktionerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel over kommandoer | |
| Kommando | Robot Reaktion |
| PTP Punkt | Robotarm flytter til angivne posiiton i X, Y, Z plads |
| Find_Base_Z | Bruger SICK laser til at måle than trykning overflade af substratet; Afstanden mellem sprøjtespidsen ende og substratoverfladen indstilles manuelt. |
| Arbejde Adj. Nej. (Work Justering Number) | Kommandoer robot til at bruge SICK laser (til bestemmelse af substrat overflade), Gun 1, Gun 2 eller pistol 3. |
| Get_1 | Kommandoer robot ot hente og indlæse Gun 1 |
| Find_Tip1_YZ | Robotten finder spidsenden af Gun 1 i Y og Z-retning |
| Find_Tip1_X | Robotten finder spidsenden af Gun 1 i X-retningen |
| Punkt Dispense | Robotten vil dispensere en dråbe bioink i den bestemte X, Y, Z position |
| Palle Nej (Pallte Number) | Indeholder en manuelt kodet design til trykning, fx et array. |
| Dispense Time | Er den tid afsat til aflejring af hver enkelt dråbe. </ td> |
| Store_1 | Kommandoer robotten til at vende tilbage Gun 1 til toolnest, og vende tilbage til udgangspositionen: (0,0,0). |
Tabel 1. Programmerbare computersoftware kommandoer. Dette diagram skitserer de programmerbare computer software kommandoer, der bruges til at styre robotarmen og optimere trykbarhedsegenskaber parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det primære fokus for tissue engineering er at bygge bro mellem mangel orgel og transplantationscentre behov ved at udvikle biologiske erstatninger i stand til at genoprette, vedligeholde eller forbedre indfødte væv functio. Dette har ført til den direkte fremstilling af stilladser med en kompleks, anatomisk korrekte eksterne geometri og præcis kontrol over den interne geometr. Tredimensionale bioprinting er en metode, der anvendes til at frembringe tredimensionale konstruktioner i forskellige størrelser og former fra en digital model ved hjælp af en lag-på-lag approac. Fremstilling af tredimensionelle biomimetiske konstruktioner spiller en væsentlig rolle i udvikling af væv engineering.
Der er kritiske aspekter af designprocessen, der påvirker den genererede konstruktion s biomimetisk functio. Evnen til at styre temperaturen af biomaterialet og substrat er afgørende for geldannende mekanisme af hydrogeler og vedligeholdelse af migniske egenskaber, således påvirker cellefordelingen, proliferation og differentiering inden hydrogelen. Organer består af mange celletyper, så de multiple dispensere er afgørende for fremstilling af heterogene, vævs-lignende strukturer. Computerstøttet design af eksterne arkitektur tillader produktion af brugerdefinerede væv erstatninger for forskellige sår eller væv. Dette er vigtigt for udviklingen af patient-specifikke udskiftninger. Den interne arkitektur er lige så vigtig, fordi den påvirker celle-celle relationer i struktur ved at placere de korrekte celler i intim kontakt med hinanden og tillader dem at danne in vivo-lignende celle-celle kryds. Præcis placering af celler bestemmer, hvordan cellerne kommunikerer og netværk med hinanden for at danne vaskulære netværk og efterligne deres bioaktivitet i native væv. Tre-dimensionel bioprinting giver homogent spredte celler i bioink, samt fremragende præcision om fysisk placement af cellerne. Genereret stilladser har også høje lokale celledensiteter, hvilket er afgørende for celledifferentiering og formuleringen af ekstracellulære matrix.
Præsenteret her er et 3D robot bioprinter der pålideligt og konsekvent dispenserer homogene dråber af individuelle celler eller celler blandet med biomimetisk hydrogel. Tilsvarende bioprinters har brugt en pre-fusionsteknologi. I overensstemmelse med forskellen vedhæftning hypotesen, når enkelte celler anbragt i en form eller en lignende anordning, vil smelte og organisere baseret på koncentrationen og fordelingen af adhæsionsmolekyler på cellens overflad. Disse enheder skaber forudsætninger-kondenserede stænger eller andre geometriske former, der derefter indlæst i dispenseren og placeres i umiddelbar nærhed af andre præ-kondenserede eller pre-made stænger, som derefter sikringen i en større geometrisk shap. End geometrier er begrænset af, hvad der kan konstrueres ud fra disse pre-made enheder. Den bioprinter implementeret her omfatter en unik temperaturkontrolleret miljø, hvor cellerne og celle-hydrogel blandinger er ikke begrænset af nødvendigheden af præ-fusion. Under disse betingelser, at bioprinter ikke alene afhængige af forskellen vedhæftning hypotese. Inddragelsen af hydrogelmaterialer kan vejlede cellen distributionen og sikrer cellerne til at fusionere, eller ej, afhængigt af de egenskaber, der ønskes til specifikke eksperimenter. Udvælgelsen af biomimetiske hydrogeler til celle-indkapsling har også en dybtgående indvirkning på cellefænotype. Materialer er kendt for at have en virkning på cellevedhæftning, samt cellestørrelse og morpholog. De reologiske egenskaber, såsom viskositet, af hydrogeler diktere deres indflydelse på de cellulære microenvironmen. Native alginat er inert og ikke let kommunikere med celler, der deltager i kontrollen af fænotype. Men ved hjælp af alginater, der er kemisk modificerede via peptid konjugation og oxidation, vise den resulterende konstruktioner styret nedbrydelighed og øget cellevedhæftet fil, migration og proliferatio. Ændring af de fysisk-kemiske egenskaber af et biomateriale kan påvirke væv UDVIKLINGS.
Tredimensionale bioprinting anvendelse af en fluid-dispensering direkte-write maskine begrænset af graden af opløsning af trykte konstruktioner, tilgængeligheden af hydrogelmaterialer, indledende celledød efter udskrivning, og evnen til at vaskularisere den biomimetiske. Et vigtigt træk af bioprinting er dens opløsning. Hver udskrivning metode er defineret af den nedre tekniske grænse størrelsen af de mindste opnåelige detaljer. Der er en dynamisk relation mellem den nedre grænse størrelse og opnåelige omfanget af den trykte konstruktion: jo højere opløsning af små detaljer, jo mindre maksimal konstruktion. Den bioprinter er i stand til at deponere mængder så små som 230 nl i meget specifikke og organiserede mønstre, giver det en højere opløsning end lignende maskiner. Hydrogeler har været almindeligt anvendt i bioprinting på grund af dereshydrofilicitet, biokompatibilitet, strukturel lighed med den ekstracellulære matrix og lette modificatio. Det høje indhold af hydrogeler vand forbedrer deres biokompatibilitet, men i høj grad reducerer deres mekaniske styrke og. Der er en mangel på optimale hydrogeler med passende mekaniske egenskaber for væske levering i løbet bioadditive-produktion ekstrudering. Der er derfor et stort behov for at udvikle hydrogeler, som er immunologisk inert, har cytocompatible geleringsegenskaber mekanismer, der med held kan ekstruderes ved hjælp af fluid levering og også fremstiller en celle-laden matrix med et optimalt område af mekanisk. Før udskrivningen, skal cellen-laden hydrogel bioink opbevares i sprøjterne til et beløb på tid, det går ud over cellens. Under udskrivningsprocessen kan forskydningsspændingen induceret på celler under ekstrudering også være skadeligt for deres. Den bioprinter er i stand til at producere meget rentable (> 90%) konstruktioner, således at overvinde problemet med initial celledød. Vaskularisering spiller en afgørende rolle i transmission, støtte eller bevare biomimetiske funktion bioprinted. Diffusion af ilt er m; derfor større bioprinted konstruerer hypoxi er en. Konventionelle teknikker er i stand til at producere konstruktioner med indbygget vaskulatur, i høj grad begrænser størrelsen af producerbare stilladser. Cellelevedygtigheden vurdering af bioprinter viste signifikant celleproliferation i de trykte konstruktioner over 8 dage. Derfor teknikken viser sin evne til at generere stilladser, der tillader cellevækst, kommunikation, og dannelsen af netværk, krav vaskularisering.
Den bioprinter giver mulighed for at anvende en række forskellige materialer til hurtigt at deponere celle-laden hydrogeler i specifikke mønstre. Mens denne teknik producerer heterogene konstruktioner med afstemmelige egenskaber, er det ude af stand til samtidig aflejring og reaktiv blanding. For nogle biomaterialer denne deposition opfyldthod ville øge geleringen mekanisme og forkorte tiden til stilladset Productio. Tilsætningen af en multi-sprøjte dispenser kan give en bredere vifte af biomaterialer til biofabrication teknik. Undersøgelse af celle aktivitet i bioprinted konstruktioner over en længere periode ville give mere information om hydrogel egenskaber, celle netværksdannelse og vaskularisering af konstruktionerne.
Den bioprinter er beskrevet deposition metode kan yderligere involvere robot positionering og køre de tre dispensere til at deponere en flerhed af biologiske materialer på toppen af tidligere deponerede materialer i et forudbestemt mønster. Dette trin kan gentages med stigende mønstre, indtil en tredimensional organ eller væv produceres. Derfor Palmetto Printeren er egnet til pålideligt at afgive celle-laden hydrogeler til at skabe en tredimensionel konstruktion, der er i stand til at fastholde vaskulatur og høj cellelevedygtighed, og kunneanvendes i vævsdyrkningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af regeringen Støtte under Grant nr EPS-0903795 udstedt af National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), og Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al.
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F.
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
