Introduction
Tissue engineering gebruikt de principes van de biologie en techniek in de ontwikkeling van functionele substituten te behouden, herstellen of versterken natief weefsel en. Het vermogen van het opwekken van drie-dimensionale biomimetische constructen on demand zou wetenschappelijke en technologische vooruitgang in tissue engineering en in cel-gebaseerde sensoren, geneesmiddel / toxiciteitsscreening, weefsel of tumormodellen en andere vergemakkelijken. De driedimensionale organisatie van weefselengineering constructs is een fundamentele component van de fabricagemethode omdat het nauw de zeer georganiseerde interactie van cellen en extracellulaire matrix in natief weefsel moet nabootsen.
Biologisch afbreekbaar en vorm vormende driedimensionale scaffolds zijn kritische factoren bij het genereren van nieuwe weefselconstructen omdat cellen migreren naar een tweedimensionale laag van cellen vormen, maar missen het vermogen te groeien in ontwikkelde driedimensionale. De steiger dient als tijdelijke basis voor cellgehechtheid en proliferatie, dus het moet worden opgebouwd uit materialen met een controleerbare porositeit en biologische afbreekbaarheid, en voldoende mechanische integrit. De scaffold materialen mogen niet cytotoxisch zijn of tot een negatieve reactie van de gastheer. Hydrogels zijn gewoonlijk in tissue engineering technieken en door hun hydrofiliciteit, hydrogels mogelijk vocht en gasuitwisseling gehele structur. Door het combineren van verschillende hydrogels, de eigenschappen van het gesynthetiseerde hydrogel zijn aanpasbaar aan verschillende applicatie eis te voldoen.
De conventionele tissue engineering aanpak omvat de oprichting van acellulaire poreuze offer steigers die zijn ingezaaid met cellen post-fabricatio. Veel technieken zijn toegepast, zoals vezelbinding, oplosmiddelgieten, en smelt vormen, maar bleek minimaal succesvol tissue engineering toepassingen. Vezelbinding methoden toe vezels worden uitgelijnd in bepaalde vormen, maar zijn alleen in staat producing zeer dun schavot. Oplosmiddelgieten werkwijzen geproduceerd zeer poreuze constructies, maar de grootste geproduceerde membraan bedroeg slechts 3 mm thic. Derhalve creëren driedimensionale constructies niet mogelijk met behulp van deze technieken. Melt giettechnieken succesvol gebleken bij het produceren van drie-dimensionale stellage, maar zulke hoge temperaturen nodig die biologische materialen niet tijdens het productieproces kunnen worden opgenomen. Stellingen geënt postfabricage zijn beperkt in hun vermogen om de eisen van tissue engineering voldoen driedimensionale scaffolds te produceren met vooraf gedefinieerde of microstructuren en controleerbaar. Een ander groot probleem met stevige steiger zaaien technologieën is het tekort aan vascularisatie en slechte mechanische.
Bioprinting is sindsdien uitgebreid tot drie dimensies door middel van niet-toxische, biologisch afbreekbare, thermo-reversibele gels om de nadelen van conventionele overwinnen. Een paar van de vaste freeform fabricage techniques momenteel werkzaam zijn laser-assisted bioprinting en inkjetprinters. Laserinstrumenten bioprinting technieken een gepulste laserbron, een trefplaat, en een ontvangend substraat driedimensionale genereren. Echter, deze techniek beperkt door lage doorvoer, lage levensvatbaarheid van de cellen en kan slechts beperkte regeling van gefabriceerde structuren omdat alleen fotoverknoopbaar prepolymeren kunnen worden gebruikt om een verknoopte hydrogel. Inkjetprinten werd ontwikkeld als een contactloze werkwijze die digitale beelddata reproduceert op een substraat door afzetten picoliter inkt. Echter, inkjet printing produceert geen hoge-resolutie construct, construeert ervaring snelle eiwitdenaturatie, en veel van de cellen worden gelyseerd in de afzetting.
Op dit moment zijn er nieuwe additive manufacturing bioprinting methoden ontwikkeld. In deze systemen cellen, eiwitten, groeifactoren en biomimetische hydrogels worden typisch geïntegreerd in matrix materials tijdens het fabricageproces en gelijktijdig neergeslagen terwijl computergestuurde actuators driedimensionale scaffold-based cell beladen constructen die de microarchitectuur van natieve nauw nabootsen genereren. De cel-beladen hydrogels vormen de bioink, die heterogeen kan zijn, die uit meerdere celtypen of homogeen. Additive productiesystemen deposit bioink druppel voor druppel of layer-by-layer via wegwerpspuiten en tips op een computergestuurde stadium kan bewegen in de x, y en z-richtingen. Door middel van computersoftware, kan de architectuur van afgedrukte scaffolds gemakkelijk worden gemanipuleerd afhankelijk van de vereisten van de toepassing. In tegenstelling tot conventionele technieken, kunnen driedimensionale medische technologieën (magnetische resonantie beeldvorming, computer tomografie) in de ontwerpen worden opgenomen genereren patiëntspecifieke construct. Deze werkwijzen ook de mogelijkheid van het produceren gevasculariseerde vervanging toe omdat constructen worden geproduceerd met een hogere lokale celdichtheid, waardoor cel-cel interacties en verbetering van de waarschijnlijkheid van implantatie Surviva.
De Palmetto printer is een maat gebouwde driedimensionale meerdere dispensersysteem programmeerbare robot productiemethoden gebruikt om driedimensionale heterogeen weefselconstructen (figuur 1) te genereren. Het maakt gebruik van een veelheid van materialen in unieke combinaties heterogene structuren te produceren. De initialisatie van de bioprinter is één van de belangrijkste stappen in bioprinting, omdat het stelt u in staat om een verscheidenheid van parameters instellen om de bedrukbaarheid van de bioprinted constructies te optimaliseren.
De bioprinter bestaat uit een batch soort proces opstarten, bediening en afsluiten sequenties gecontroleerd door een Programmable Logic Controller (PLC), die de gebruiker werkt door middel van een interactieve touch-screen bedieningspaneel (figuur 1, A). Om besmetting van bio voorkomenlogische materialen het bioprinter is ingesloten in een positieve-druk poly (methylmethacrylaat) (PMMA) kamer met een hoog rendement deeltjes arrestance (HEPA) -filtered luchtcirculatiesysteem (Figuur 1, B, C). De binnenkant van de printer kan worden gesteriliseerd met behulp van het ingebouwde ultraviolet lichtbronnen (Figuur 1 D). De centrale component van de bioprinter een volledig programmeerbaar positionering robot die reproduceerbaar kan plaats een druppelaar met een nauwkeurigheid van 10 micrometer (Figuur 1 E). Er zijn drie dispensers, die in staat zijn de volumes zo klein 230 nl met behulp van een roterende schroef (figuur 1, F) stort zijn. Ze zijn onafhankelijk programmeerbaar via aparte computers die afdrukparameters bepalen voor elke inrichting (figuur 1 G). Rotary-schroef uitgifte maakt gebruik van de rotatie van een motor aangedreven schroef bioink beneden een spuit en uit de spuit te verplaatsen. Deze dispensers zijn gemonteerd op een pneumatischly gecontroleerde Tool Nest (Figuur 2A, B), zodat de robot dispenser gemonteerd op de Z-as robotarm onder geprogrammeerde controle (Figuur 1, H) schakelaar.
De XYZ robot instructies afdrukken ontvangt vanaf een computer met design software (figuur 1 I). Elk programma bevat doseren locaties, kalibratie routines en-dispenser veranderende protocollen. Het ontwerp van de gegenereerde constructies voornamelijk bestaat uit de XYZ-coördinaten waar elke dispenser materiaal zal storten. De bioprinter bestaat uit twee optische lichtsensoren (figuur 2C) die bepalen de XYZ-coördinaten van de spuit end. Deze sensoren zenden coördinaatgegevens de robot, die deze gebruikt om posities van de dispenser punteinden berekenen. Er is een extra verplaatsing laser (figuur 2D) die een 633 nm diode rode laserstraal van vlekgrootte projecteert 30 x 100 micrometer om afstand te meten met een Accuracy van 0,1 micrometer. Wanneer de bundel sterk gericht de robot bepaalt de Z-afstand van het printoppervlak. Deze meting en de optische lichtsensoren meten van het uiteinde in Z, maakt berekening van accurate Z coördinaten gebruikt om de dispenser tip plaatsen ten opzichte van het afdrukoppervlak. De dispensertips bewegen lateraal en verticaal door de X-as gerichte optische lichtsensor aan de Y- en Z centra, en lateraal door een Y-as sensor naar het midden van de X-as zijn. Het drukoppervlak wordt toegewezen met de formule voor een plat vlak in xyz ruimte: ax + by + cz = d te bepalen waar het oppervlak ten opzichte van de positie van het afgifte-uiteinde. De fase printer (Figuur 1, J) houdt een monster petrischaal tot 80 mm in diameter en gebruikt een recirculerende waterbad tot de ingestelde temperatuur (Figuur 1, K) te handhaven. Stage temperatuur kan worden ingesteld binnen een bereik van -20 en stabiel blijft binnen. Er is een USB camera gemonteerdop de robot Z-arm een vergrote weergave van het afgifte-uiteinde tijdens het drukproces (figuur 1, L) leveren. Er is een tweede camera gemonteerd aan de bovenkant van de kamer interieur dat een compleet beeld van het bioprinter geeft tijdens het drukproces (figuur 1, L).
Een computer-aided design tekening software bepaalt de depositiepatroon en kan de gebruiker stapsgewijs afstand druppels en complexe structuren (figuur 3) genereren. Driedimensionale paden kan handmatig worden gecodeerd in de printer-compatibele design software of een aparte computer-aided design tekensoftware (Figuur 4, tabel 1) geïmporteerd. De printer-compatibele software kunnen variaties van druk parameters zoals de afzetting methode (enkele druppel depositie of continu traject afzetting), driedimensionale geometrie van de paden, depositiesnelheid, afstand tussen de spuit uiteinde en substrate afdrukoppervlak, de tijd aan een individu vallen, en de hoogte storten en snelheid van de spuit wordt opgeheven tussen afzetting van de druppels. Elk programma bevat XYZ doseren locaties, tip kalibratieroutines en-dispenser veranderende protocollen om een steriele omgeving te bieden, zonder tussenkomst van een operator, tijdens het afdrukken. De Programmable Logic Controller (PLC) van de robot ontvangt instructies van de computer waarop het ontwerp-software en controleert de timing van gebeurtenissen uit de externe controllers (bijv, de dispensers). Om dit te doen, de PLC maakt gebruik van een looping mechanisme om de automaten te controleren , robotachtige positionering apparaat, en omgevingsfactoren.
Driedimensionale direct-write bioprinting gebruikmaking van een roterende schroef, vloeistof doseersysteem maakt het proces van het afzetten van cellen efficiënter, nauwkeuriger en eenvoudiger dan eerdere methoden zijn. Deze studie toont de maat gebouwde bioprinter kan genereren cell beladen hydrogel constructies met levensvatbaarheid hoge cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Gelatine bevattend substraat voor driedimensionale Bioprinting alginaat Hydrogels
- Bereid de calcium / gelatine substraat volgens de calcium / gelatine substraat beschreven door Pataky et al 11 tot verminderde levensvatbaarheid geassocieerd met een hoog gehalte voorkomen. De calcium / gelatine substraat methode hieronder.
- Combineer calciumchloride dehydraat (1,5 gew%), natriumchloride (0,9 gew%) en varkensgelatine (2 gew%) in gedestilleerd water en kook 2 min een 100 mM gelatine-oplossing te creëren.
- Giet 5 ml gelatine / calciumoplossing in 100 mm standaard petrischalen, zwenk de oplossing rond om een gelijkmatige laag op het oppervlak en op een plat oppervlak in de koelkast gel O / N (laten geleren ten minste 8 hr voor gebruik).
- Om de dichtheid van het substraatoppervlak te verhogen, voeg titanium dioxide (0,3 gew%) aan de gelatine / CaCl 2-oplossing. Roer gedurende 10 min. Autoclave de gelatine / TiO 2 oplossing vloeistoffen cyclus gedurende 30 min te steriliseren.
- Voeg 3 ml van de gelatine / TiO 2-oplossing aan het oppervlak van de eerder bereide gelatine platen. Zwenk het mengsel om te verzekeren dat wordt gelijkmatig verdeeld over het oppervlak. Laat gel in het 4 ° C koelkast O / N (laat minstens 8 uur vóór gebruik geleren). De ondergrond moet binnen 3 dagen.
2. Alginaat Oxidatie
- Oxideert natriumalginaat bioink volgens de methode voor het gedeeltelijk geoxideerd alginaat door Bouhadir et al 30 hieronder beschreven.
- Een 5% geoxideerd alginaatoplossing maken, los op in 100 ml gedestilleerd water 1 g natriumalginaat. Voeg een waterige oplossing van natriumperjodaat (0,25 M, 0,25 mmol), het oxidatiemiddel, een 5% oplossing leidt oxidatie. Roer gedurende 19 uur bij KT. Voeg 40 ml ethyleenglycol aan de oplossing na 24 uur het einde reactie.
- Los 2,5 g natriumchloride in de oplossing. Voeg een overmaat ethanol (2: 1 verhouding) tot de geoxideerde alginaten precipiteren. Centrifugeer de oplossing bij 1000 xg om het neerslag te verzamelen en opnieuw te lossen in gedestilleerd water. Herhaal de ethanol wassen.
- Vriesdrogen geoxideerde alginaat pellets en bewaar bij -20 ° C tot aan gebruik.
- Bepaal de mate van oxidatie door de procentuele natriumperjodaat verbruikt voordat eindigt op ethyleenglycol.
- Bereid een kaliumjodide-oplossing (20% w / v, pH 7,0 natriumfosfaatbuffer) en een thyodene oplossing (10% w / v, pH 7,0 natriumfosfaatbuffer). Meng de twee oplossingen met de geoxideerde alginaat bij KT.
- Successievelijk de gereageerde alginaat en natriumperjodaat oplossing in het mengsel van kaliumjodide en theodyne oplossingen. Meet de absorptie van het mengsel spectrofotometrisch bij 426 nm. Wanneer deze tot eenmaximum Noteer de gebruikte hoeveelheid alginaat en natriumperjodaat oplossing V 1.
- De reactie is
. De hoeveelheid ongereageerde natriumperjodaat is 
- Trek de hoeveelheid ongereageerd natriumperjodaat van de oorspronkelijke concentratie de hoeveelheid natriumperjodaat verbruikte bepalen. Met de voorgaande formule, bepalen de uiteindelijke oxidatiegraad van het alginaat.
. De hoeveelheid ongereageerde natriumperjodaat is 
3. Alginaat Peptide Conjugation
- Conjugaat liganden met een blootgestelde arginine-glycine-aspartaat sequentie (peptide) in de vooraf bereide geoxideerde alginaat door de RGD-Alginaat conjugatie methode Rowley et al 31 hieronder beschreven celhechting en spreiding bevorderen.
- Gebruik waterige carbodiimide chemie met G 4 RGDSPto conjugaat 31.
- Los 1 g 5% geoxideerd alginaat in een 0,1 M 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) buffer, pH = 4. Voeg 1-ethyl- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 0,54 mmol) en N-hydroxysuccinimide ( NHS, 0,27 mmol) in 2: 1 verhouding amide tussenproduct te vormen.
- Voeg 0,28 mmol peptide koppeling met de ruggengraat van het polymeer alginaat via de terminal amine. Roer bij kamertemperatuur O / N.
- Stop de koppelingsreactie door toevoeging van 2,5 g natriumchloride aan de oplossing. Voeg een overmaat ethanol (2: 1 verhouding) tot de geoxideerde alginaten precipiteren. Centrifugeer het mengsel bij 4000 xg gedurende 5 min naar de precipitaten te verzamelen. Zuigen de media in de celkweek kap en opnieuw ontbinding van de neerslag in gedestilleerd water. Herhaal de ethanol wassen.
- Vriesdrogen de precipitaten totdat het volledig wordt gedroogd (weergegeven als een witte poederachtige substantie) en bewaar in de koelkast -20 ° C voor latergebruiken.
4. Human VetWeefsel stromale cellen (hADSC's) Cell Culture
- Culture menselijk vetweefsel stromacellen (hADSC's) in 75 cm behandelde celkweekkolven (T75 kolven), bedekt met 15 ml lage glucose DMEM met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine, 1% glutamine en 1% antimycin. Wijzig de media, in de celkweek kap, om de twee dagen, totdat zij confluentie (80-90%) hebben bereikt.
- Eenmaal samenvloeiing, de overdracht van de T75 flessen om de celkweek kap en schorten de hADSC met behulp van de trypsine enzymdigestie methode.
- In de kap, zuigen al het celkweekmedium uit de cellen. Spoelen met 5 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (DPBS ++). Zuig het DPBS ++ off van de cellen.
- Terwijl in de afzuigkap moeten een oplossing van trypsine en DPBS ++ door het mengen van 1 ml trypsine en 4 ml DPBS ++. Elke kolf vereist 5 ml van de solution, dus maak er het juiste volume voor het aantal confluente flessen. Voeg 5 ml van het trypsine / DPBS ++ aan elke kolf en zet ze in de incubator gedurende 2 minuten.
- Na 2 minuten, verwijder de kolven en licht tik op de zijkanten van hen om de cellen los te maken van de bodems. Bekijk elke kolf onder een microscoop te zorgen voor de cellen gesuspendeerd. Plaats de kolven terug in de celkweek kap en voeg 3 ml van de juiste media voor celkweek aan elke kolf. Dit beëindigt de trypsine reactie.
- Breng de cel beladen media uit elke kolf en in een 50 ml conische. Centrifugeer bij 1000 xg ze gedurende 5 min. De cellen moeten verschijnen als kleine witte pellet op de bodem van de conische. Transfer terug naar de celkweek kap en zuig de media. Resuspendeer de cellen in 2 ml celkweekmedium.
- Tel de cellen met een hemocytometer onder de microscoop. Nadat de cellen werden geteld, in de cultuur kap, aliquot de hoeveelheid media die ~ 1,3 million cellen en overdracht aan een 15 ml conische. Centrifugeer de 15 ml conische met de cellen opnieuw gedurende 5 min bij 1000 x g.
- In de kweek kap, reseed de overige cellen in meerdere T-75 kolven, het toevoegen van een concentratie van ~ 350.000 cellen per kolf. Voeg 15 ml DMEM media en opnieuw in de incubator tot samenvloeiing.
- Zodra de centrifuge is voltooid, keren de 15 ml conische aan de celkweek. Zuig het medium van de cel pellet en resuspendeer de cellen in waterige alginaatoplossing in een concentratie van 1,3 miljoen cellen per milliliter bioink, terteriating de oplossing vaak zodat er een homogene verdeling van cellen in de bioink. Laad de cel-beladen oplossing in een steriele printer-compatibele 3 ml spuit en schroef op de steriele 22 G plastic tip.
5. Bioprinter Setup
- Zet de bioprinter elk van de dispenser computers en de recirculating waterbad.
- Handmatig de recirculerende waterbad temperatuur voor de geleringsmechanisme.
- Handmatig afdrukparameters per dispenser op het correleren dispenser computer. Stel het afzien volume tot 230 nl, het aantal backsteps naar 0, en het afzien tarief -sec 10 pl.
- Open de ontwerpsoftware en het programma voor het bekijken van het scherm van de USB camera op de computer.
- Met behulp van de software handmatig invoeren van de coördinaten voor een 5 x 5 dot array met 2,4 mm afstand tussen de druppels.
- Stel de grafische parameters zijn: afstand tussen uiteinde en substraatoppervlak = 0,1 mm; hoogte spuit wordt opgeheven tussen de afzettingen = 20 mm; de tijd per afzetting = 1 sec.
- Sla het programma en stuur het naar de robot.
- Plaats de gelatine / TiO 2 bevattende petrischaal op het podium 4 ° C printer. Sluit en vergrendel de kamerdeur.
- Gebruik de PLC om initialize het ultraviolette lichtbronnen, en steriliseer de kamer voor 90 sec.
- Zodra sterilisatie is voltooid, opent u de kamer en laad de spuit met hADSC opgeschort in alginaat in Gun 1. Sluit en vergrendel de kamerdeur.
- Gebruik de PLC aan te zetten de ventilator systeem, wacht 30 seconden voor evenwicht interne druk.
- Op de computer, start het programma met de geometrische route en druk parameters.
- Gedurende het drukproces, kijken naar het scherm van de USB-camera's op de computer om nauwkeurige en uniforme afdrukken te bevestigen.
- Zodra het afdrukken is voltooid, kan de constructies om gel voor 40 min.
6. Cel levensvatbaarheid Assessment
- Bedek de constructies die niet zullen worden afgebeeld onmiddellijk na het afdrukken in DMEM en op te slaan in de incubator op het moment van beeldvorming.
- Om de levensvatbaarheid van de constructen kwantificeren vlekken ze met behulp van een fluorescentie-gebaseerde levensvatbaarheid / cytotoxiciteit assay, eennd beeld met behulp van confocale microscopie.
- De instructies te volgen kit, bereiden een kleuring oplossing met calceïne AM en ethidiumhomodimeer-1. Aan 10 ml kleuroplossing, voeg 20 ul van de ethidium homodimeer-1 en 5 pl van de calceïne am tot 10 ml steriel, weefselkweek-grade Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (+ magnesium + calcium; DPBS ++).
- Dompel de bioprinted constructen in de kleuroplossing gedurende 15 min in het donker.
- Afbeelding de gekleurde constructies met behulp van een confocale microscoop systeem op dag 0 en 8. Neem meerdere foto's van elke bioprinted constructie, met behulp van Z-stack parameters van 30 optische schijfjes over een 300 micrometer diep, en handmatig de cellen te tellen. Als cellen blijken geel of groen ze tellen als in leven, en als rode, tel ze als dood.
- Bereken het percentage cellevensvatbaarheid het aantal levende cellen gedeeld door het totale aantal cellen in het construct; Cel levensvatbaarheid = aantallevende cellen (groen + geel) / totaal aantal cellen (groen + geel + rood) x 100%.
- Bereken de hoeveelheid celproliferatie voor elk monster als het aantal cellen van dag 8 gedeeld door het aantal cellen op dag 0; Celproliferatie = levend celgetal op dag 8 / levende cellen rekenen op dag 0 x 100%.
7. RGD Peptide Conjugation Analyse
- Om het succes van RGD peptide conjugatie aan het alginaat te analyseren, vergelijk RGD-alginaat geconjugeerde en niet-geconjugeerde alginaat. Om dit beeld de gedrukte constructies doen met behulp van (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, Dihydrochloride) (DAPI) en phalloidin vlekken.
- Maak de phalloidins werkende oplossing door het verdunnen van 5 ui van de methanol voorraad oplossing met 200 ul van DPBS ++. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
- Voeg een 300 uM voorraadoplossing van de DAPI kleuring volgens de vergelijking: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 x 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mM = 300 pM. Maak the DAPI werkoplossing door verdunning van de voorraad oplossing 1: 100 in DPBS ++ tot 3 uM oplossing te verkrijgen. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
- Volledig onderdompelen van het monster in 4% paraformaldehyde. Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was drie keer met DPBS ++, waardoor de oplossing te zitten gedurende 5 min per wasbeurt. Breng de gel monster uit de put tot een glasplaatje, wegknippen van de gel over het proces. Dompel de gel in 0,1% Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) in DPBS ++ gedurende 10 min. Was drie keer met DPBS ++, waardoor 5 min voor elke wasbeurt.
- Vlekken op de afgedrukte constructies met phalloidin door ze onder te dompelen in de werkende oplossing. Dek af met folie en incubeer gedurende 4 uur. Verwijder de phalloidin vlek en was drie keer met DPBS ++. De eerste wasbeurt moet snel zijn, de laatste wast dient te zitten voor 5 minuten elk.
- Vlekken op de afgedrukte constructies met DAPI door ze onder te dompelen in de DAPI werkende oplossing. Dek af met folie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Wassendrie keer met DPBS ++, waarbij elke wasbeurt zitten gedurende 5 min. Observeren en het beeld van de monsters op een confocale microscoop systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten tonen de bioprinter kan afzetten cellen beladen hydrogels in bepaalde driedimensionale locaties nauwkeurig en consistent gebruik van computerondersteunde software. Deze software bepaalt de plaatsing van elke druppel en controleren vele van de parameters voor het afgeven (figuur 3,4). De herhaalbaarheid van de bioprinter om adequaat biomaterialen storten is van fundamenteel belang voor het succes ervan in tissue engineering-toepassingen.
Levensvatbaarheid van de cellen, een van de eisen van een succesvolle bioprinting techniek geanalyseerd 1 uur en 8 dagen na het printen. Hoge cellevensvatbaarheid essentieel voor het fabriceren biomimetische constructen en is een directe weergave van voldoende bioink. RGD peptide vervoeging verbetert de levensvatbaarheid van de cellen gedurende langere tijd door het bevorderen van de cel verspreiden. Fluorescentie microscopie werd gebruikt om cellevensvatbaarheid kwantificeren constructen na het drukproces. Alginaat bioink met een concentratie van 15% en oxidatie van 5% had dag 0 levensvatbaarheid van 98%, 4 dagen van 96% en dag 8 van 95% (figuur 5). Deze resultaten geven aan depositietechniek van het direct-write bioprinter extrudeert cellen voorzichtig genoeg om constructen die levensvatbaar blijven tijdens en na het drukproces te produceren (Figuur 1, 2). De hoge levensvatbaarheid van de cellen wordt de 5% oxidatie en 15% concentratie alginaat bioink was een geschikt vehikel voor cel depositie en voorzien van een passende omgeving voor de cel-overleving. Soortgelijke celtellingen in elk van de gebieden vertoonden een homogene verdeling in de cel alginaat bioink een fundamenteel aspect van de afdrukresolutie.
De meeste weefsels complexe combinaties en gradiënten van extracellulaire matrix componenten, elk met specifieke biologische en mechanische invloeden. Een biomateriaal moet biomimetische van het natieve milieu en cellulaire functies te vergemakkelijken. De hoge porositeit van het alginaat kan de scaffoldcellen te communiceren en netwerken met elkaar, en mag de flux van voedingsstoffen en metabolieten tussen het skelet en zijn omgeving te vergemakkelijken. Cel adhesie aan de extracellulaire matrix een voorfase van weefselvorming dat gebeurt vóór celproliferatie en de organisatie van de extracellulaire matrix moleculen in functionele weefsel. De proliferatie van cellen speelt een cruciale rol bij wondgenezing en weefselgroei en is daarom een belangrijke factor bij de analyse bioprinted constructen voor tissue engineering toepassingen. De RGD-geconjugeerde alginaat verhoogde celhechting in gedrukte constructies, wat leidt tot een verbeterde cel spreiding en proliferatie. De proliferatie van cellen in de gedrukte steigers werd gekwantificeerd door het tellen van drie afzonderlijke gebieden op dagen 0 en 8 (figuur 6). De totale celproliferatie werd gevonden 219,674% te zijn na 8 dagen kweken. Deze resultaten duiden op de steiger over voldoende biocompatibiliteit te gebruiken eensa synthetische extracellulaire matrix voor het afleveren van cellen om beschadigde of niet-functionele weefsel te herstellen.
Om het succes van RGD peptide conjugatie aan het alginaat bioink analyseren, werd een vergelijking experiment uitgevoerd met behulp van mobiele beladen, RGD-geconjugeerd 15% concentratie 5% oxidatie alginaat bioink en cellen beladen, niet-geconjugeerde 15% concentratie 5% oxidatie alginaat bioink. DAPI kleuring van kernen en phalloidin kleuring voor actine werd gebruikt om de cellen te analyseren spreiding in gedrukte constructen op dag 8. Beelden van elk monster (ten minste drie willekeurige beelden per monster) werden met behulp van een confocale microscoop systeem met Z-stack parameters van 30 optische schijfjes over een 300 diepte (Figuur 7). De celspreiding getoond in het monster met RGD-geconjugeerde alginaat bewijst de succesvolle integratie van het peptide op het alginaat. Cel migratie is een belangrijke stap in het weefsel ontwikkeling; dus de vervoeging van RGD peptiden op alginaat verbetert de likelihood van in vivo toepassing met behulp van deze bioink.
Figuur 1. Palmetto Printer. Programmable Logic Controller coördineert de acties van alle printer functies (A). Een luchtdichte begrenzingkamer (B) met gefilterd inname (C) en uitlaat (C) onderhoudt een geregelde inwendige positieve druk om de kans op verontreiniging te verminderen. Dual UV lampen (D) gemonteerd in de kamer plafond kan worden geprogrammeerd om op een veilige intervallen. Een Janome 2300N XYZ Robot (E) wordt geprogrammeerd en bestuurd door een geïntegreerde computer (I). Drie dispenser controllers (G) zijn geprogrammeerd om de uitvoer van afgifte pistolen (F) beschikbaar regelen op de Z-as robot arm (H) onder computerbesturing worden geladen. De temperatuur van de robot monsterhouder (J) ligt tussen 4 en 40 ° C door een waterbad controller (K). Twee digitale camera's (L) zijn beschikbaar t o bewaken activiteit van de printer en de vorming van het monster. Een camera is gemonteerd op de robot Z-as arm en geeft een vergroot beeld van de dispenser topje van de geladen pistool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Tool Nest, optische sensoren en Laser Verplaatsing van Bioprinter. A. Onbelaste hulpmiddel nest uitzicht vanaf de voorkant. B. Geladen hulpmiddel nest uitzicht vanaf de voorkant. C. optische sensoren meten van de doseertip einde in de driedimensionale ruimte. D. Afstand laser meten van de Z-coördinaat van de drukkerij oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Visuele PathBuilder Software. Afbeelding van computer-aided design tekening software die wordt gebruikt voor het ontwerpen van de externe architectuur van bioprinted constructies. Dit programma biedt de mogelijkheid om stapsgewijs afstand druppels en complexe geometrieën te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. JR-C Points Software. Screenshot van de printer-compatibele design software. Dit programma kan de gebruiker om de afzetting methode bedienen (dat wil zeggen, enkele druppel afzetting of doorlopende route depositie), depositie snelheid, afstand tussen de spuit end en printing su bstrate oppervlak, de toegewezen tijd voor de afzetting van elke druppel, en de drie-dimensionale plaatsing van druppeltjes (zie tabel 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Fluorescent Image van Stained hADSCs na afdrukken. Cellevensvatbaarheid / cytotoxiciteit fluorescerende beelden van hADSC in bioprinted construct na 0 (A) genomen met een confocale microscoop systeem (Z-stack parameters van 30 optische schijfjes over een diepte) en 8 ( B) dagen. De hADSC werden bestempeld post-printen met behulp van een zoogdiercel levensvatbaarheid / cytotoxiciteitstest. Levende cellen zijn groen gekleurd, en dode cellen worden rood gekleurd.3156fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. gekwantificeerde levensvatbaarheid van Bioprinted constructen. Het aantal levende en dode cellen werd gekwantificeerd met behulp van een levensvatbaarheid / cytotoxiciteitsbepaling. De live / dode cel telt voor dag 0 worden getoond in (A), en het telt voor Dag 8 in (B). Het aantal levende cellen geteld voor elk gebied op dag 0 en 8 worden getoond in (C) en werden gebruikt om de celproliferatie te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Vergelijking van de Cell-Laden, Non-geconjugeerde en RGD-geconjugeerde Alginaten. Fluorescentie afbeeldingen bioprinted hADSC in niet-geconjugeerde (A), en RGD-geconjugeerde (B) 15% concentratie van 5% oxidatie alginaat bioink genomen met een confocale microscoop systeem (Z-stack parameters van 30 optische schijfjes over een diepte). De hADSC's werden gekleurd met phalloidin en DAPI vlekken aan de cel verspreiden in elk van de constructies te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tabel van de opdrachten | |
| Bevel | Robot Response |
| PTP Point | Robotarm verhuist naar opgegeven positie bevinden in X, Y, Z ruimte |
| Find_Base_Z | Maakt gebruik van de SICK laser om t te metenHij bedrukt oppervlak van het substraat; De afstand tussen de spuit uiteinde en substraatoppervlak is ingesteld. |
| Werken Adj. Nee (Werk Aanpassing Number) | Commando robot om SICK laser gebruiken (voor het bepalen van het substraat oppervlak), Gun 1, Gun 2 of 3 Gun. |
| Get_1 | Commando robot ot halen en te laden Gun 1 |
| Find_Tip1_YZ | De robot vindt het puntje einde van Gun 1 in de Y en Z-richting |
| Find_Tip1_X | De robot vindt het uiteinde van het kanon 1 in de X-richting |
| Punt Dispense | De robot zal een druppel bioink afgeven in de bepaalde X, Y, Z-positie |
| Pallet No. (Pallte Number) | Bevat een handmatig gecodeerd ontwerp te drukken, bijvoorbeeld een matrix. |
| Doseer Tijd | Is de tijd voor het afzetten van elke afzonderlijke druppel. </ td> |
| Store_1 | Beveelt de robot Gun 1 terug te keren naar de toolnest, en keer terug naar uitgangspositie: (0,0,0). |
Tabel 1. Programmeerbare Computer Software Commando. Dit geeft een overzicht van de programmeerbare computer software commando's, die worden gebruikt om de robotarm besturen en optimaliseren van bedrukbaarheid parameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De primaire focus van tissue engineering is om de kloof tussen de tekorten orgel en transplantatie behoeften te overbruggen door het ontwikkelen van biologische substituten te kunnen herstellen, handhaven of verbeteren van inheemse weefsel functio. Dit heeft geleid tot de directe vervaardiging van steigers met een complex anatomisch juiste externe geometrie en nauwkeurige controle over de interne geometr. Driedimensionale bioprinting is een methode voor het genereren van driedimensionale constructies van verschillende maten en vormen van een digitaal model met een laag-voor-laag approac. De fabricage van driedimensionale biomimetische constructen speelt een essentiële rol bij de vooruitgang van tissue engineering.
Er zijn kritische aspecten van het ontwerp proces dat van invloed biomimetische ctie de gegenereerde construct's. De mogelijkheid om de temperatuur van het biomateriaal en het substraat controle essentieel voor het geleren mechanisme van de hydrogels en onderhoud van hun mechanische eigenschappen derhalve invloed celverdeling, proliferatie en differentiatie in de hydrogel. Organen bestaan uit vele celtypen, zodat de meervoudige dispensers cruciaal zijn voor het produceren van heterogene, weefselachtige structuren. De computer-aided design van de externe architectuur maakt de productie van aangepaste weefsel vervangt verschillende wonden of weefsels. Dit is essentieel voor de ontwikkeling van patiëntspecifieke vervangingen. De interne architectuur is ook belangrijk omdat het invloed op de cel-cel verhoudingen binnen de structuur door het plaatsen van de juiste cellen in innig contact met elkaar en hen te vormen in vivo-achtige cel-celverbindingen. Nauwkeurige plaatsing van de cellen wordt bepaald hoe de cellen communiceren en netwerken met elkaar om vasculaire netwerken te vormen en na te bootsen hun bioactiviteit in cellen. Driedimensionale bioprinting biedt homogeen gedispergeerde cellen in de bioink, evenals uitstekende precisie ruimtelijke placement van de cellen. Gegenereerde steigers hebben ook een hoge locale celdichtheden, die essentieel voor celdifferentiatie en de formulering van extracellulaire matrix.
Hier gepresenteerd is een 3D-robot bioprinter die betrouwbaar en consistent doseert homogene druppels van individuele cellen of cellen gemengd met biomimetische hydrogel. Vergelijkbare bioprinters hebben een pre-fusie gebruikte technologie. Overeenkomstig de differentiële hechting hypothese afzonderlijke cellen bij plaatsing in een matrijs of soortgelijke inrichting, zal fuseren en organiseren op basis van de concentratie en verdeling van adhesiemoleculen op de mobiele surfac. Deze apparaten maken pre-gefuseerde staven of andere geometrische vormen die vervolgens in de automaat zijn geladen en geplaatst in de nabijheid van andere vooraf samengesmolten of pre staafjes, welke vervolgens zekering in een grotere geometrische shap. Eind geometrieën worden beperkt door wat kan worden gemaakt van deze pre-gemaakte entiteiten. De hier geïmplementeerd bioprinter bestaat uit een unieke temperatuurgecontroleerde omgeving waarin de cellen en cel-hydrogel mengsels worden niet beperkt door de noodzaak van pre-fusie. Onder deze omstandigheden is de bioprinter is niet alleen afhankelijk van het differentieel hechting hypothese. De opname van hydrogel materialen kan helpen de celverdeling en laat de cellen fuseren of niet, afhankelijk van de gewenste eigenschappen voor specifieke experimenten. De keuze van biomimetische hydrogels voor cel-inkapseling heeft een diepgaand effect op celfenotype. Materialen zijn bekend aan een effect op celhechting, alsmede celgrootte en morpholog hebben. De rheologische eigenschappen, zoals viscositeit, van hydrogels dicteren hun invloed op de cellulaire microenvironmen. Inheemse alginaat inert en niet gemakkelijk communiceren met cellen die aan de controle van fenotype. Echter, met behulp alginaten die chemisch zijn gemodificeerd via peptide conjugatie en oxidatie, de resulterende constructen vertoning gecontroleerde afbraak en verhoogde celgehechtheid, migratie en proliferatio. Het veranderen van de fysisch-chemische eigenschappen van een biomateriaal kan weefsel developmen beïnvloeden.
Driedimensionale bioprinting met een vloeistof-afgifte wordt direct-write machine beperkt door de mate van resolutie van afgedrukte constructen, de beschikbaarheid van hydrogel materialen, aanvankelijk celdood na-afdrukken, en de mogelijkheid om de biomimetische vasculariseren. Een belangrijk kenmerk van de bioprinting is de resolutie. Elke afdrukken methode wordt bepaald door de lagere technische limiet grootte van de kleinste haalbare details. Er is een dynamische relatie tussen de ondergrens grootte en haalbare omvang van de afgedrukte construct: hoe hoger de resolutie van de kleinste details, hoe kleiner maximum construct. De bioprinter kan afzetten hoeveelheden zo klein als 230 nl in zeer specifieke en georganiseerde patronen, waardoor het een hogere resolutie dan vergelijkbare machines. Hydrogels zijn vaak gebruikt vanwege hun bioprintinghydrofiliciteit, biocompatibiliteit, structurele gelijkenis met de extracellulaire matrix, en het gemak van WIJZIGI. Het hoge watergehalte van hydrogels verbetert hun biocompatibiliteit, maar vermindert hun mechanische sterkte en. Er is een gebrek aan optimale hydrogels met de geschikte mechanische eigenschappen voor vloeistofafgifte in bioadditive-productie extrusie. Daarom is er een grote vraag naar de ontwikkeling hydrogels die immunologisch inert hebben cytocompatible gelering mechanismen die met succes kunnen worden geëxtrudeerd onder toepassing vloeistofafgifte en produceren ook een cel-beladen matrix met een optimaal bereik van mechanische. Vóór het drukproces, moet de cel-beladen hydrogel bioink in het spuiten worden opgeslagen voor een bedrag van tijd, ten koste gaat van de cel. Tijdens het drukproces, kan de shear stress veroorzaakte op cellen tijdens de extrusie ook schadelijk is voor hun zijn. De bioprinter kan zeer rendabel (> 90%) constructen derhalve overwinnen het probleem van initial celdood. Vascularisatie speelt een vitale rol in het overbrengen, het ondersteunen van of het behoud van de functie van bioprinted biomimetic. De diffusie van zuurstof m; derhalve grotere bioprinted construeert hypoxie is. Gebruikelijke technieken zijn niet in staat de productie van constructen met ingebedde vaatstelsel, sterk beperken van de grootte winbare steigers. De cellevensvatbaarheid beoordeling van de bioprinter significante celproliferatie in de gedrukte constructen dan 8 dagen. Daarom heeft de techniek bewijst zijn vermogen scaffolds die celgroei, communicatie en netwerkvorming eisen van vascularisatie laten genereren.
De bioprinter biedt de mogelijkheid van het gebruik van een verscheidenheid van materialen voor cel-beladen hydrogels in specifieke vormen snel deponeren. Hoewel deze techniek produceert heterogene constructen met instelbare eigenschappen, het is niet in staat om gelijktijdig depositie en reactief mengen. Voor sommige biomaterialen Deze afzetting voldaanHod zou geleringsmechanisme verbeteren en verkorten van de tijd voor het schavot productio. De toevoeging van een multi-injectiespuit dispenser kan een breder scala van biomaterialen voor biofabrication techniek toe. Onderzoek celactiviteit in bioprinted constructen gedurende een langere periode zou informatie over hydrogel kenmerken vorming celnetwerk en vascularisatie van de constructen.
Depositiewerkwijze De bioprinter beschreven kan verder omvatten robot positioneren en besturen van de drie dispensers een veelheid van biologisch materiaal afzetten bovenop voordien neergeslagen materiaal in een vooraf bepaald patroon. Deze stap kan worden herhaald met oplopende patronen tot een driedimensionaal orgaan of weefsel wordt geproduceerd. Daarom is de Palmetto printer geschikt voor het betrouwbaar afgeven van cellen beladen hydrogels een driedimensionale construct dat kan vasthouden vasculatuur en hoge cellevensvatbaarheid maken en konworden gebruikt in tissue engineering toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de regering steun onder Grant No. EPS-0903795 toegekend door de National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI) en Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al.
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F.
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
