Introduction
Tissue engineering använder principerna om biologi och teknik i utvecklingen av funktionella substitut för att behålla, återställa eller förbättra naturliga vävnaden och. Förmågan att generera tredimensionella biomimetiska konstruktioner på begäran skulle underlätta vetenskapliga och tekniska framsteg inom vävnadsregenerering samt i cellbaserade sensorer, drog / toxicitet screening, vävnad eller tumörmodeller och andra. Den tredimensionella organisationen av vävnadstekniska konstruktioner är en grundläggande del av tillverkningsmetoden eftersom det noga måste efterlikna den mycket organiserade samspelet mellan celler och extracellulär matris i naturliga vävnaden.
Bionedbrytbara och formbildande tredimensionella ställningar är kritiska faktorer vid alstring av nya vävnadskonstrukten eftersom celler migrerar för att bilda en två-dimensionell lager av celler, men saknar förmågan att växa i gynnad tre-dimensionella. Ställningen tjänar som en tillfällig grund för cellenkvarstad och spridning, så det måste vara konstruerad av material med kontrollerbar porositet och nedbrytbarhet och tillräcklig mekanisk integrit. De byggnadsställningsmaterial bör inte vara cytotoxiska eller skapa en ogynnsam respons från värden. Hydrogeler har vanligen används i vävnadsutvecklingstekniker, och på grund av deras hydrofilicitet, hydrogeler tillåta fluid och gasutbyte genom hela strukture. Genom att kombinera olika hydrogeler, den syntetiserade hydrogel egenskaper är modifierbara att uppfylla distinkt applikationskrav.
Den konventionella tissue engineering strategi innebär skapandet av acellulära porösa offer byggnadsställningar som är sådda med celler efter fabricatio. Många tekniker har använts, såsom fiberbindning, lösningsmedelsgjutning, och smältformning, men visade sig vara minimalt framgångsrika för vävnadstekniska tillämpningar. Fiberbindningsmetoder tillåter fibrerna att ligga i linje i specifika former, men de är endast i stånd att prorande av mycket tunna byggnadsställning. Lösningsmedel gjutmetoder produceras mycket porösa konstruktioner, men den största producerade membranet var endast 3 mm thic. Därför skapar tredimensionella konstruktioner inte är möjligt att använda dessa tekniker. Smältformning tekniker visat sig framgångsrik i att producera tredimensionella ställningar, men sådana höga temperaturer erfordras att biologiska material som inte kan införlivas under produktionen proces. Ställningar seedade efter tillverkning är begränsade i sin förmåga att uppfylla kraven i vävnadsteknik för att producera tredimensionella ställningar med fördefinierade eller kontrollerbara mikrostrukturer och. En annan viktig fråga med fasta ställnings sådd teknik är brist på vaskularisering och dålig mekanisk.
Bioprinting har sedan utökats till tre dimensioner genom användning av icke-toxiska, biologiskt nedbrytbara, termoreversibla geler för att övervinna nackdelarna med konventionella. Några av den fasta freeform tillverkning techniques närvarande används är laserassisterad bioprinting och bläckstråleutskrift. Laserassisterad bioprinting tekniker använder en pulsad laserkälla, en måltavla, och en mottagande substratet för att alstra tre-dimensionella. Emellertid är denna teknik begränsad på grund av låg genomströmning, låg cellviabilitet, och kan bara producera begränsade arrangemang av tillverkade strukturer eftersom endast fototvärbindbar prepolymerer kan användas för att bilda en tvärbunden hydrogel. Bläckstråleutskrifter utvecklades som en beröringsfri metod som återger digitala bilddata på ett substrat genom att deponera pikoliter bläck. Emellertid bläckstråleutskrifter inte kan uppvisa en hög upplösning konstruktet, konstruerar erfarenhet snabb proteindenaturering, och många av cellerna lyseras under avsättningen.
För närvarande har nya additiv tillverkning bioprinting metoder utvecklats. I dessa system celler, proteiner, tillväxtfaktorer och biomimetiska hydrogeler typiskt integrerade i matris materIALS under tillverkningsprocessen och samtidigt deponeras med hjälp av datorstyrda ställdon för att generera tredimensionella byggnadsställningar baserade cell lastat konstruktioner som är nära efterliknar mikroarkitektur av infödda. De cell lastad hydrogeler utgör bioink, som kan vara heterogen, som består av flera celltyper, eller homogena. Tillsats tillverkningssystem insättning bioink droppe för droppe eller skikt-vid-skikt via engångssprutor och tips på en datorstyrd stadiet med förmåga att röra sig i x-, y-, och z-riktningarna. Genom datorprogram, kan arkitekturen av tryckta ställningar lätt manipuleras beroende på applikationens krav. Till skillnad från konventionella tekniker, kan tredimensionella medicinteknik (magnetisk resonanstomografi, datortomografi) införlivas i de mönster, generera patientspecifika konstruktionen. Dessa metoder tillåter även möjligheten att producera vaskulariserade utbyten eftersom konstruktioner tillverkas med en högre lOCAL celldensiteten, vilket gör att cell-cell-interaktioner och förbättra sannolikheten för efter implantation surviva.
Palmetto Printer är en specialbyggd tredimensionell flera dispenser som använder programmerbara robot tillverkningsmetoder för att skapa tredimensionella heterogena vävnads konstruktioner (Figur 1). Det möjliggör användning av ett flertal material i unika kombinationer för att producera heterogena strukturer. Initieringen av bioprinter är ett av de viktigaste stegen i bioprinting eftersom det tillåter dig att ställa in en mängd parametrar för att optimera tryckbarhet av bioprinted konstruktionerna.
Den bioprinter innefattar en satsvis process med start, drift och avstängning sekvenser som styrs av en programmerbar logisk styrenhet (PLC), som användaren verkar genom en interaktiv pekskärm kontrollpanel (figur 1, A). För att förhindra kontaminering av biologisktlogiska material den bioprinter är inneslutna i en positivt pressad poly (metylmetakrylat) (PMMA) kammare med ett högeffektivt partikel arrestance (HEPA) filtrerat luftcirkulationssystem (figur 1, B, C). Interiören i skrivaren kan steriliseras med hjälp av den inbyggda ultravioletta ljuskällor (Figur 1, D). Den centrala komponenten i bioprinter är en fullt programmerbar positionerings robot som reproducerbart kan placera en fördelartoppen med en noggrannhet på 10 mikrometer (Figur 1, E). Det finns tre automater, som kan sätta volymerna så små som 230 nl hjälp av en skruv (Figur 1, F). De är oberoende av varandra är programmerbara med användning av separata datorer som styr utskriftsparametrar för varje automaten (figur 1, G). Roterande skruvdispense utnyttjar rotationen hos en motordriven skruv för att förflytta bioink ner en spruta och ut ur sprutspetsen. Dessa automater är monterade på en pneumatiskly kontrollerad Verktygs Nest (figur 2A, B), så att roboten att växla dispensern monteras på Z-axeln robotarm enligt programmerad styrning (fig 1, IH).
XYZ robot får utskriftsinstruktioner från en dator som kör design mjukvara (figur 1, I). Varje program innehåller dispense platser, kalibreringsrutiner och dispenser förändras protokoll. Utformningen av genererade konstruktioner främst består av XYZ-koordinater där varje dispenser kommer att deponera material. Den bioprinter består av två optiska ljussensorer (Figur 2C) som bestämmer XYZ-koordinaterna för sprutspetsen slutet. Dessa sensorer skickar samordna information till roboten, som använder dessa för att beräkna positionerna för dispenser spetsändarna. Det finns ytterligare en förskjutning laser (Figur 2D) som projicerar en 633 nm diod röd laserstråle med punktstorlek 30 x 100 mikrometer för att mäta avstånd med en Accuracy av 0,1 mikrometer. När strålen är mycket fokuserad roboten bestämmer Z avståndet mellan skrivytan. Denna mätning, och den optiska ljussensorer mätning av spetsänden i Z, tillåter beräkning av korrekt Z-koordinater används för att placera fördelartoppen i förhållande till tryckytan. Dispensern spetsar röra sig i sidled och vertikalt genom X-axeln orienterad optiska ljussensorn för att hitta de Y- och Z-centra, och lateralt genom en Y-axelsensor för att hitta mitten av X-axeln. Utskriftsytan avbildas med hjälp av formeln för en plan yta i xyz rymden: ax + by + cz = d för att avgöra där ytan är i förhållande till läget av dispenseringsspetsänden. Skrivarens steget (figur 1, J) håller ett prov petriskål upp till 80 mm i diameter och använder ett recirkulerande vattenbad för att bibehålla den inställda temperaturen (Figur 1, K). Stage Temperaturen kan ställas in inom ett intervall på -20 och förblir stabil inom. Det finns en USB-kamera monteradpå robot Z-armen för att åstadkomma en förstorad bild av tubens spets under tryckningsprocessen (fig 1, L). Det finns en andra kamera monterad mot toppen av kammarens inre som ger en komplett bild av bioprinter under tryckprocessen (fig 1, L).
En datorstödd design ritprogram bestämmer depositionsmönstret och tillåter användaren att generera stegvis fördelade droppar och komplexa strukturer (Figur 3). Tredimensionella banor kan manuellt kodas i skrivaren-kompatibel design mjukvara eller importeras från en separat datorstödd design ritprogram (Figur 4, Tabell 1). Skrivaren-kompatibel programvara tillåter variationer av tryckparametrar såsom deponeringsmetoden (enda droppavsättnings eller kontinuerlig väg avsättning), tredimensionell geometri vägar, avsättningshastighet, avstånd mellan sprutspetsen slutet och substhastighet tryckyta, den mängd tid för att avsätta en enskild droppe, och höjden och hastighet sprutan lyftes mellan avsättningen av dropparna. Varje program innehåller XYZ fördelnings platser, spets kalibreringsrutiner och dispenser förändrande protokoll för att ge en steril miljö, utan operatörsingripande, under tryckning. Den programmerbara logiska styrenheten (PLC) av roboten får instruktioner från datorn kör design mjukvara och styr tidpunkten för händelserna från externa styrenheter (t.ex. automater). För att göra detta, använder PLC en looping mekanism för att kontrollera automater , robotpositioneringsanordning, och miljömässiga faktorer.
Tredimensionell direktskriv bioprinting användning av en roterande skruv, vätskedispenseringssystem möjliggör processen för avsättning av celler för att vara mer effektiv, noggrann, och enklare än tidigare metoder. Denna studie visar den specialbyggda bioprinter är i stånd att alstra cell-lastad hydrogel konstruktioner med hög cellviabiliteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av gelatin innehållande substrat för tredimensionell Bioprinting av alginat Hydrogeler
- Förbered kalcium / gelatinsubstrat efter kalcium / gelatinsubstrat metod som beskrivs av Pataky et al 11 för att undvika minskad lönsamhet i samband med hög halt. Kalcium / gelatinsubstratmetod listas nedan.
- Kombinera kalciumklorid DEHYDRERA (1,5 vikt-%), natriumklorid (0,9 vikt-%), och porcint gelatin (2 vikt-%) i destillerat vatten och koka i 2 min för att skapa en 100 mM gelatinlösning.
- Häll 5 ml av gelatin / kalciumlösningen i 100 mm standardpetriskålar, virvla lösningen runt för att göra en jämn beläggning på ytan, och placera på en plan yta i kylen för att gelen O / N (låt gel minst 8 h före användning).
- För att öka opacitet av substratytan, tillsätt titandioxiden (0,3 vikt-%) till gelatin / CaCl2-lösningen. Rör om under 10 minuter. Autoclave gelatin / TiOj 2 lösningen på vätskor cykeln under 30 min för att sterilisera den.
- Tillsätt 3 ml av gelatin / TiOj 2 lösning på ytan av de tidigare framställda gelatinplattor. Snurra blandningen så att den sprids jämnt över ytan. Tillåt gela i 4 ° C kylskåp O / N (låt att gela åtminstone 8 h före användning). Substraten måste användas inom 3 dagar.
2. Alginat Oxidation
- Oxidera natriumalginat bioink följa metoden för delvis oxiderat alginat av Bouhadir m.fl. 30 beskrivs nedan.
- För att göra en 5% oxiderad alginatlösning, lös upp 1 g natriumalginat i 100 ml destillerat vatten. Lägg en vattenhaltig lösning av natriumperjodat (0,25 M, 0,25 mmol), oxidationsmedlet, för framställning av en 5% oxide lösning. Rör om under 19 h vid RT. Tillsätt 40 ml etylenglykol till lösningen efter 24 timmar för att avsluta reaInsatser.
- Lös 2,5 g natriumklorid i lösningen. Lägg till ett överskott av etylalkohol (2: 1-förhållande) för att fälla ut de oxiderade alginater. Centrifugera lösningen vid 1000 x g för att samla upp fällningar och återupplösa dem i destillerat vatten. Upprepa etanoltvätt.
- Frystorka de oxiderade alginat pellets och förvara vid -20 ° C tills produkten ska användas.
- Bestämma graden av oxidation genom mätning av procentandelen av natriumperjodat förbrukas innan de avslutades genom etylenglykol.
- Bered en kaliumjodidlösning (20% vikt / volym, pH 7,0 natriumfosfatbuffert) och en thyodene lösning (10% vikt / volym, pH 7,0 natriumfosfatbuffert). Blanda de två lösningarna med den oxiderade alginat vid RT.
- Gradvis släppa reagerade alginat och natriumperjodatlösning i blandningen av kaliumjodid och theodyne lösningar. Mät absorbansen hos blandningen spektrofotometriskt vid 426 nm. När den har nått enhögst spela den använda volymen av alginat och natriumperjodatlösning som V 1.
- Reaktionen är
. Mängden oreagerad natrium perjodat är 
- Subtrahera mängden oreagerad natrium perjodat från den ursprungliga koncentrationen för att bestämma mängden av natriumperjodat konsumeras. Med hjälp av föregående formel, fastställa det slutliga oxidationsgrad av alginat.
. Mängden oreagerad natrium perjodat är 
3. Alginat Peptid Konjugering
- Konjugerade ligander med en exponerad arginin-glycin-aspartat sekvens (peptid) i den tidigare beredda oxiderade alginat genom att följa RGD-Alginate konjugering metod Rowley et al 31 beskrivs nedan för att främja cellvidhäftning och spridning.
- Använd vattenhaltig carbodiimide kemi med G 4 RGDSPto konjugat 31.
- Upplös 1 g av 5% oxiderade alginat i en 0,1 M 2- (N-morfolino) etansulfonsyra (MES) buffert, pH = 4. Till 1-etyl- (dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC, 0,54 mmol) och N-hydroxisuccinimid ( NHS, 0,27 mmol) vid 2: 1-förhållande för att bilda amid-mellanprodukten.
- Lägg 0,28 mmol peptid, koppling till ryggraden av alginat polymeren via den terminala aminen. Rör om vid RT O / N.
- Stoppa kopplingsreaktionen genom tillsats av 2,5 g natriumklorid till lösningen. Lägg till ett överskott av etylalkohol (2: 1-förhållande) för att fälla ut de oxiderade alginater. Centrifugera blandningen vid 4000 xg under 5 min för att samla fällningarna. Suga ut mediet i cellkultur huva och åter upplösa fällningen i destillerat vatten. Upprepa etanoltvätt.
- Frystorka fällningarna tills den blir helt torr (visas som en vit i pulverform substans) och förvara i -20 ° C kylskåp för senareanvända.
4. Human fettvävnad stromaceller celler (hADSC s) Cell Culture
- Kultur humant adipos vävnad stromaceller (hADSC s) i 75 cm behandlade cellodlingsflaskor (T75-kolvar), täckt med 15 ml låg glukos DMEM med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamin och 1% antimycin. Ändra media, i cellkultur huva, varannan dag tills de har nått konfluens (80-90%).
- När sammanflytande, överföra T75-kolvar till cellkultur huva och avbryta hADSC s med hjälp av trypsin enzym matsmältningen metod.
- I huven, aspirera alla cellodlingsmedia bort av cellerna. Skölj med 5 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning med kalcium och magnesium (DPBS ++). Aspirera DPBS ++ bort från cellerna.
- Även i huven, göra en lösning av trypsin och DPBS ++ genom att blanda 1 ml trypsin och 4 ml DPBS ++. Varje kolv kräver 5 ml av solution, så gör den lämpliga volymen för antalet sammanflytande kolvar. Tillsätt 5 ml av trypsin / DPBS ++ till varje kolv och placera dem i inkubatorn under 2 minuter.
- Efter 2 minuter, ta bort flaskorna och lätt knacka på sidorna av dem att lossa cellerna från bottnarna. Titta på varje kolv under ett mikroskop för att säkerställa att cellerna är suspenderade. Placera kolvarna tillbaka i cellkultur huva och tillsätt 3 ml lämpligt cellodlingsmedia till varje kolv. Detta avslutar trypsin reaktionen.
- Överför cell lastat media från varje kolv och placerades i en 50 ml konisk. Centrifugera dem vid 1000 xg under 5 min. Cellerna bör uppträda som en liten vit pellet i botten av den koniska. Transfer tillbaka till cellodlings huven och suga ut mediet. Resuspendera cellerna i 2 ml cellodlingsmedia.
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer under mikroskop. När cellerna har räknats, i odlings huva, alikvot mängden media innehållande ~ 1,3 million celler och överföring till en 15 ml konisk. Centrifugera 15 ml koniskt innehållande cellerna igen för 5 minuter vid 1000 x g.
- I odling huva, reseed de återstående cellerna i flera T-75-kolvar, lägga till en koncentration av ~ 350.000 celler till varje kolv. Tillsätt 15 ml av DMEM-medium och återgå till inkubatorn tills konfluenta igen.
- Så snart som centrifugen cykeln är klar, återföra 15 ml koniskt till cellodlingen. Aspirera media från cellpelleten, och suspendera cellerna i vatten alginatlösningen vid en koncentration av 1,3 miljoner celler per milliliter bioink, terteriating lösningen ofta så det finns en homogen fördelning av celler i hela bioink. Ladda cell lastat lösning i en steril skrivare kompatibel 3 ml spruta och skruva på den sterila 22 G plast spets.
5. Bioprinter Setup
- Slå på bioprinter, var och en av dispenser datorer, och recirculating vattenbad.
- Manuellt ställa in recirkulerande vattenbadets temperatur till för gel mekanismen.
- Manuellt ställa utskrifts parametrar för varje dispenser på korrelations dispenser datorn. Ställ in dispenseringsvolymen till 230 nl, antal backsteps till 0, och dispenseringshastigheten till 10 ^ -sek.
- Öppna design mjukvara och program för visning av USB kamerans display på datorn.
- Med hjälp av programvaran, manuellt ange koordinaterna för en 5 x 5 dot array med 2,4 mm avstånd mellan dropparna.
- Ställ in utskriftsparametrar för att vara: avståndet mellan spetsänden och substratytan = 0,1 mm; höjd sprutan lyfts mellan nedfall = 20 mm; hur lång tid per nedfall = 1 sek.
- Spara programmet och skicka den till roboten.
- Placera gelatin / TiO 2-haltiga petriskål på 4 ° C skrivare skede. Stäng och lås kammardörren.
- Använd PLC Initialize de ultravioletta ljuskällor, och sterilisera kammaren för 90 sek.
- När steriliseringen är klar öppnar kammaren och ladda sprutan innehållande hADSC s suspenderad i alginat i Gun 1. Stäng och lås kammardörren.
- Använd PLC för att slå på fläktsystem, vänta 30 sekunder för jämvikts inre tryck.
- På datorn, köra program som innehåller de geometriska vägen och tryckparametrar.
- Under hela tryckprocessen, titta på USB kamerans display på datorn för att bekräfta korrekt och enhetlig utskrift.
- När utskriften är klar, låt konstruktionerna att gela under 40 minuter.
Bedömning 6. Cellviabiliteten
- Täck konstruktionerna som inte kommer att avbildas direkt efter tryckning i DMEM och lagra i inkubatorn förrän vid avbildning.
- För att kvantifiera lönsamhet konstruktionerna, färga dem med en fluorescensbaserade lönsamhet / cytotoxicitetsanalysen, ennd bild med hjälp av konfokalmikroskopi.
- Efter de kit instruktioner, förbereda en färgningslösning innehållande calcein AM och etidium homodimer-1. För att göra 10 ml färgningslösning, tillsätt 20 | il av den etidium homodimer-1 och 5 | il av kalcein am till 10 ml steril, vävnadsodlingskvalitet Dulbeccos fosfatbuffrad salin (+ magnesium + kalcium; DPBS ++).
- Doppa bioprinted Konstruktionerna i fläcken lösning för 15 minuter i mörker.
- Bild de färgade konstruktioner med hjälp av en konfokalmikroskop system vid dag 0 och 8. Ta flera bilder på varje bioprinted konstruktion, med hjälp av Z-stack parametrar för 30 optiska skivor över en 300 pm djup, och manuellt räkna cellerna. Om celler verkar gult eller grönt räkna dem som lever, och om rött, räkna dem som död.
- Beräkna cellviabiliteten procentsats som antalet levande celler dividerat med det totala antalet celler i konstruktionen; Cellviabilitet = antallevande celler (grön + gul) / antal totala celler (grön + gul + röd) x 100%.
- Beräkna mängden av cellproliferation för varje prov som cellen antalet dag 8 dividerat med cellantalet på dag 0; Cell Proliferation = levande celler på dag 8 / levande cell räkna med dag 0 x 100%.
7. RGD peptid Konjugering analys
- För att analysera framgången för RGD-peptid konjugering på alginat, jämför RGD-konjugerad alginat och icke-konjugerad alginat. För att göra detta, avbildar de tryckta konstruktioner med hjälp av (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, Dihydrochloride) (DAPI) och phalloidin fläckar.
- Gör phalloidins arbetslösning genom att späda 5 pl av den metanolutgångslösningen med 200 fil av DPBS ++. Förvara vid -20 ° C tills användning.
- Gör en 300 pM stamlösning av DAPI-infärgning följande ekvationen: (0,10509 g / I) / (350,3 g / mol) = 3 x 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mm = 300 pM. Gör the DAPI arbetslösning genom att späda stamlösningen 1: 100 i DPBS ++ för erhållande 3 pM lösning. Förvara vid -20 ° C tills användning.
- Helt dränka provet i 4% paraformaldehyd. Inkubera i en timme vid RT. Tvätta tre gånger med DPBS ++, låta lösningen stå under 5 minuter varje tvätt. Överför prov gel från brunnen till en glasskiva, vända gelén över i processen. Doppa gelén i 0,1% Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) i DPBS ++ för 10 minuter. Tvätta tre gånger med DPBS ++, vilket möjliggör 5 min för varje tvätt.
- Fläck de tryckta konstruktioner med falloidin genom nedsänkning dem i den verksamma lösningen. Täck med folie och inkubera i 4 timmar. Ta bort phalloidin fläcken och tvätta tre gånger med DPBS ++. Den första tvätten ska vara snabb, de sistnämnda tvättar bör sitta i 5 minuter vardera.
- Färga tryckta konstruktioner med DAPI genom nedsänkning dem i DAPI arbetslösning. Täck med folie och inkubera vid RT i 30 min. Tvättatre gånger med DPBS ++, vilket gör varje tvätt stå under 5 minuter. Observera och bild proverna på ett konfokalmikroskop systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten visar bioprinter är i stånd att deponera cell lastad hydrogeler i specifika tredimensionella platser exakt och konsekvent använda datorstödd programvara. Dessa programvaror bestämmer placeringen av varje droppe och styra många av parametrarna för dispensering (figur 3,4). Repeterbarheten av bioprinter att på lämpligt sätt sätta biomaterial är grundläggande för dess framgång i vävnadstekniska tillämpningar.
Cellviabilitet, ett av kraven för en framgångsrik bioprinting teknik, analyserades 1 timme och 8 dagar efter utskrift. Hög cellviabilitet är nödvändig för tillverkning av biomimetiska konstruktioner och är en direkt representation av en adekvat bioink. RGD-peptid konjugering förbättrar cellviabiliteten under långa tidsperioder genom att främja cellspridning. Fluorescensmikroskopi användes för att kvantifiera cellviabilitet i konstruktioner efter tryckprocessen. Alginat bioink med en concentrtion av 15% och oxidation av 5% hade en dag 0 livskraft 98%, dag 4 av 96%, och dag 8 av 95% (figur 5). Dessa resultat indikerar deponeringstekniken enligt direktskriv bioprinter extruderar celler försiktigt nog att producera konstruktioner som förblir livsdugliga under och efter tryckningsprocessen (figur 1, 2). Den höga cellviabiliteten visar 5% oxidation och 15% koncentration alginat bioink var en lämplig vehikel för cellavsättning och gav en lämplig miljö för cellöverlevnad. Liknande celltal i vart och ett av de områden som visade en homogen cellfördelning i alginat bioink, en grundläggande aspekt av utskriftsupplösning.
De flesta vävnader har komplexa kombinationer och gradienter av extracellulära matrixkomponenter, var och en med specifika biologiska och mekanisk påverkan. Ett biomaterial bör vara biomimetiska av naturliga miljö och underlätta cellulära funktioner. Den höga porositeten hos alginat ställningen tillåtercellerna att kommunicera och nätverka med varandra, och kan också underlätta flödet av näringsämnen och metaboliter mellan ställningen och dess omgivande miljö. Celladhesion till den extracellulära matrisen är en inledande fas av vävnadsbildning som händer före celltillväxt och organisationen av extracellulära matrixmolekyler till funktionell vävnad. Proliferationen av celler spelar en viktig roll vid sårläkning och vävnadstillväxt, och är därför en mycket viktig faktor när man analyserar bioprinted konstruktioner för vävnadstekniska tillämpningar. RGD-konjugerat alginat förbättrad fäst cell i tryckta konstruktioner, vilket leder till förbättrad cellspridning och spridning. Proliferationen av celler i de tryckta ställningar kvantifierades genom räkning tre separata områden på dag 0 och 8 (figur 6). Den totala cellproliferation befanns vara 219,674% efter 8 dagars odling. Dessa resultat betyder ställningen har tillräcklig biokompatibilitet för att användas ensa syntetisk extracellulär matris för att leverera celler för att reparera skadade eller icke-funktionell vävnad.
För att analysera framgången för RGD-peptid konjugering på alginat bioink gjordes en jämförelse experiment med cell-lastat, RGD-konjugerade 15% koncentration, 5% oxidation alginat bioink och cell laden, icke-konjugerad 15% koncentration, 5% oxidation alginat bioink. DAPI-färgning för kärnor och phalloidin färgning för aktin användes för att analysera cellspridning i tryckta konstruktioner på dag 8. Bilder av varje prov (minst tre slumpmässiga bilder per prov) ägde med användning av ett konfokalt mikroskopsystem med användning av Z-stack parametrar 30 optiska skivor över en 300 djup (Figur 7). Cellen spridning visas i provet med RGD-konjugerat alginat bevisar framgångsrikt införande av peptiden på alginat. Cell migration är ett viktigt steg i vävnadsutveckling; Därför konjugering av RGD-peptider på alginat förbättrar likelihood av in vivo program som använder denna bioink.
Figur 1. Palmetto skrivare. Programmable Logic Controller samordnar åtgärderna för alla skrivarfunktioner (A). En lufttät inneslutningskammare (B) med filtrerad intag (C) och avgas (C) bibehåller en reglerad inre övertryck för att minska risken för kontaminering. Dubbla UV-ljus (D) monterade i kammaren taket kan programmeras att arbeta med säkra mellanrum. En Janome 2300N XYZ robot (E) är programmerad och styrd av en integrerad dator (I). Tre dispenser styrenheter (G) är programmerade för att reglera utmatningen från dispenserpistoler (F) som är tillgängliga för att lastas på robotens Z-axelarmen (H) under datorstyrning. Temperaturen hos robotprovhållaren (J) är inställd mellan 4 och 40 ° C genom ett vattenbad styrenhet (K). Dubbla digitalkameror (L) finns t o övervaka skrivare aktivitet och provbildning. En kamera är monterad på robotens Z-axeln arm och ger en förstorad bild av dispensern spets laddat vapen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Verktyg Nest, Optic Sensors och Förskjutning Laser i Bioprinter. A. Obelastad verktygs boet framifrån. B. Loaded verktygs boet framifrån. C. Optic Sensors mäta doseringsspetsänden i det tredimensionella rummet. D. Avstånd laser mäta Z-koordinat tryckytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Visual PathBuilder Software. Foto av datorstödd design ritprogram som används för att utforma extern arkitektur bioprinted konstruktioner. Detta program ger möjlighet att generera stegvis fördelade droppar och komplexa geometrier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. JR-C Points Software. Skärmdump på utskrifts kompatibel design mjukvara. Det här programmet gör det möjligt för användaren att styra deponeringsmetoden (dvs enda droppe deponering eller kontinuerlig väg avsättning), avsättnings hastighet, avstånd mellan sprutspetsen ände och utskrift SU bstrate yta, den tilldelade tiden för deponering av varje droppe och tredimensionella placering av droppar (se tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Fluorescerande bild av målat hADSCs Post-utskrift. Cellviabilitet / cytotoxicitet fluorescerande bilder av hADSC talet i bioprinted konstruktion tagits med ett konfokalmikroskop systemet (Z-stack parametrar för 30 optiska skivor över en djup) efter 0 (A) och 8 ( B) dagar. Den hADSC s märktes efter utskrift med en däggdjurs cellviabilitet / cytotoxicitetsanalysen. Levande celler färgas grön, och döda celler färgas röd.3156fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kvantifierad viabilitet av Bioprinted Constructs. Antalet levande och döda celler kvantifieras med hjälp av en lönsamhets / cytotoxicitetsanalys. Den levande / döda celltal för dag 0 visas i (A), och de räknas för Dag 8 i (B). Antalet levande celler räknas för varje område på dagarna 0 och 8 visas i (C) och användes för att kvantifiera celltillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Jämförelse av Cell-Laden, Non-konjugerat och RGD-konjugerad Alginater. Fluorescerande bilder av bioprinted hADSC talet i icke-konjugerad (A), och i RGD-konjugerad (B) 15% koncentration 5% oxidation alginat bioink tagits med ett konfokalmikroskop systemet (Z-stack parametrar 30 optiska skivor över en djup). Den hADSC s färgades med phalloidin och DAPI fläckar att analysera cellspridning i vart och ett av konstruktionerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell över kommandon | |
| Kommando | Robot Response |
| PTP Point | Robotarm flyttar till angivna posiiton i X, Y, Z utrymme |
| Find_Base_Z | Använder SICK laser för att mäta than skrivytan av substratet; Avståndet mellan sprutspetsen ände och substratytan ställs in manuellt. |
| Arbete Adj. Nej (Work Justering Number) | Kommandon robot att använda SICK laser (för bestämning av substratytan), Gun 1, Gun 2 eller Gun 3. |
| Get_1 | Kommandon robot ot hämta och ladda Gun 1 |
| Find_Tip1_YZ | Roboten finner spetsänden av vapnet 1 i Y och Z-riktning |
| Find_Tip1_X | Roboten finner spetsänden av vapnet 1 i X-riktningen |
| Point Dispense | Roboten kommer dispensera en liten droppe av bioink i den bestämda X, Y, Z-position |
| Pall Nej (Pallte Number) | Innefattar en manuellt kodad design för tryckning, t ex, en array. |
| Dispensera Tid | Är den tid som avsatts för deponering av varje enskild droppe. </ td> |
| Store_1 | Beordrar roboten att återvända Gun 1 till toolnest och återgå till utgångsläget: (0,0,0). |
Tabell 1. Programmerbara Computer programvarukommandon. Detta diagram beskriver de programmerbara datorprogramvarukommandon, som används för att styra robotarmen och optimera tryckbarhet parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det primära fokus för tissue engineering är att överbrygga klyftan mellan organbrist och transplantationsbehov genom att utveckla biologiska substitut som kan återställa, bibehålla eller förbättra naturliga vävnaden funge. Detta har lett till den direkta framställningen av byggnadsställningar med en komplex, anatomiskt korrekt extern geometri och exakt kontroll över den interna geometr. Tredimensionell bioprinting är en metod som används för att alstra tre-dimensionella konstruktioner av olika storlekar och former från en digital modell med hjälp av ett skikt-vid-skikt approac. Tillverkningen av tredimensionella biomimetiska konstruktioner spelar en viktig roll i utvecklingen av vävnadsteknik.
Det finns kritiska aspekter av designprocessen som påverkar den genererade konstruktionen är biomimetisk funktio. Förmågan att styra temperaturen hos biomaterialet och substratet är viktigt för det gelande mekanismen hos hydrogelerna och upprätthållande av deras migniska egenskaper, därför påverkar cellfördelning, proliferation och differentiering inom hydrogelen. Organ består av många celltyper, så de multipla automater är kritiska för framställning av heterogena, vävnadsliknande strukturer. Den datorstödd design av den yttre arkitekturen möjliggör framställning av anpassade vävnads substitut för olika sår eller vävnader. Detta är viktigt för utvecklingen av patientspecifika ersättare. Den interna arkitekturen är lika viktigt eftersom det påverkar cell-cell relationer inom strukturen genom att placera de lämpliga cellerna i intim kontakt med varandra och så att de kan bilda in vivo -liknande cell-cell-korsningar. Exakt placering av celler avgör hur celler kommunicerar och nätverk med varandra för att bilda vaskulära nätverk och härma deras bioaktivitet i naturliga vävnader. Tredimensionell bioprinting ger homogent dispergerade celler inom bioink, samt utmärkt precision på rumslig placement av cellerna. Genererade ställningar har också höga lokala celldensiteter, vilket är avgörande för celldifferentiering och utformningen av extracellulära matrisen.
Presenteras här är en 3D robot bioprinter som tillförlitligt och konsekvent doserar homogena droppar av enskilda celler eller celler blandade med biomimetisk hydrogel. Liknande bioprinters har använt en pre-fusionsteknik. I enlighet med den differentiella vidhäftnings hypotesen, enskilda celler när den placeras i en form eller liknande anordning, kommer säkring och ordna baserat på koncentrationen och fördelningen av adhesionsmolekyler på cell surfac. Dessa enheter skapar pre-smält stavar eller andra geometriska former som sedan laddas in i dispensern och placeras i nära anslutning till andra färdig smält eller färdiga stavar, som sedan säkringen i en större geometrisk shap. Slut geometrier begränsas av vad som kan konstrueras från dessa färdiga enheter. Den bioprinter förs här innefattar en unik temperaturkontrollerad miljö där cellerna och cell hydrogel blandningar inte begränsas av behovet av pre-fusion. Under dessa betingelser är bioprinter inte enbart beroende av den differentiella vidhäftningen hypotesen. Införlivandet av hydrogelmaterial kan vägleda cellfördelningen och tillåta cellerna att smälta, eller inte, beroende på de egenskaper som önskas för specifika experiment. Valet av biomimetiska hydrogeler för cellinkapsling har också en stor inverkan på cellfenotypen. Material är kända för att ha en effekt på cellbindning, samt cellstorlek och morpholog. De reologiska egenskaper, såsom viskositet, av hydrogeler diktera sitt inflytande på de cellulära microenvironmen. Nativt alginat är inert och ej lätt kommunicera med celler som deltar i kontrollen av fenotypen. Men med hjälp av alginat som är kemiskt modifierade via peptid konjugering och oxidering, displayen resulterande konstruktionerna kontrollerad nedbrytbarhet och ökad cellkvarstad, migration och proliferatio. Förändra fysikalisk-kemiska egenskaperna hos ett biomaterial kan påverka vävnads UTVECKLING.
Tredimensionell bioprinting med hjälp av en vätskedispense är direktskrivmaskinen begränsas av graden av upplösning av tryckta konstruktioner, tillgången till hydrogelmaterial, initialt celldöd efter utskrift, och förmågan att vascularize den biomimetiskt. Ett viktigt särdrag hos den bioprinting är dess upplösning. Varje utskrift metod definieras av den lägre tekniska gränsen storleken av de minsta uppnåe detaljer. Det är en dynamisk relation mellan den nedre gränsen storlek och uppnåeliga omfattningen av tryckt konstruktionen: ju högre upplösning av de små detaljerna, desto mindre maximal konstruktionen. Den bioprinter är i stånd att deponera volymer så små som 230 nl i mycket specifika och organiserade mönster, vilket ger en högre upplösning än liknande maskiner. Hydrogeler har vanligen används i bioprinting på grund av derashydrofilicitet, biokompatibilitet, strukturell likhet med den extracellulära matrisen, och enkel modificatio. Hög halt av hydrogeler vattnet förbättrar deras biokompatibilitet, men i hög grad minskar deras mekaniska styrka och. Det finns en brist på optimala hydrogeler med lämpliga mekaniska egenskaper för vätskeleverans under bioadditive tillverkning extrudering. Det finns därför en stor efterfrågan på utveckling av hydrogeler som är immunologiskt inerta, har cytocompatible gelningsproblem mekanismer som med framgång kan extruderas med användning av fluidtillförsel, och även framställer en cell-lastat matris med ett optimalt område av mekanisk. Innan tryckprocessen, måste cell lastat hydrogel bioink lagras i sprutorna för en tid, äventyra cellens. Vid utskrift, kan skjuvspänningen induceras på celler under extrudering också vara skadligt för deras. Den bioprinter kan producera mycket livskraftiga (> 90%) konstruktioner, därför övervinna frågan om jagnitial celldöd. Vaskularisering spelar en viktig roll när det gäller överföring, stödja eller bevara biomimetisk funktion bioprinted. Spridningen av syre är m; därför större bioprinted konstruerar hypoxi är en. Konventionella tekniker är oförmögna att producera konstruktioner med inbäddad vaskulatur, kraftigt begränsa storleken på producer byggnadsställningar. Bedömningen cellviabilitet av bioprinter visade signifikant celltillväxt i de tryckta konstruktioner under 8 dagar. Därför visar tekniken dess förmåga att generera byggnadsställningar som tillåter celltillväxt, kommunikation, och bildandet av nätverk, krav på vaskularisering.
Den bioprinter ger möjlighet att använda en mängd olika material för att snabbt sätta in cell-lastad hydrogeler i ett specifikt mönster. Även om denna teknik ger heterogena konstruktioner med avstämbara egenskaper, är den oförmögen att samtidig avsättning och reaktiv blandning. För vissa biomaterial, träffade den här nedfallhod skulle förbättra gelningen mekanismen och förkorta tiden för byggnadsställning productio. Tillsatsen av en multi-spruta dispenser möjliggör ett bredare spektrum av biomaterial för biofabrication tekniken. Undersökning av cellaktivitet i bioprinted konstruktioner under en längre tid skulle ge mer information om hydrogel egenskaper, cellnätverksbildning, och vaskularisering av konstruktionerna.
Den bioprinter s deponerings beskrivna metoden kan vidare innebära robot positionering och driver tre automater för att sätta in ett flertal biologiska material ovanpå tidigare deponerade materialet i ett förutbestämt mönster. Detta steg kan upprepas med användning av stigande mönster tills en tre-dimensionell organ eller vävnad produceras. Därför är Palmetto skrivare som lämpar sig för ett tillförlitligt dispensecellladdade hydrogeler för att skapa en tredimensionell konstruktion som är i stånd att kvarhålla vaskulatur och hög cellviabilitet, och kundeanvändas i vävnadstekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av statligt stöd enligt Grant Nr EPS-0903795 tilldelas av National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), och Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al.
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F.
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
