Introduction
يستخدم هندسة الأنسجة مبادئ علم الأحياء والهندسة في تطوير بدائل وظيفية للحفاظ على، استعادة أو تعزيز النسيج الأم و. القدرة على توليد بنيات المحاكاة البيولوجية ثلاثية الأبعاد عند الطلب من شأنه أن ييسر التقدم العلمي والتكنولوجي في هندسة الأنسجة وكذلك في أجهزة الاستشعار المعتمدة على الخلايا المخدرات / فحص السمية، والأنسجة أو الورم النماذج، وغيرها. المنظمة ثلاثية الأبعاد للبنيات الأنسجة المهندسة هو عنصر أساسي من أسلوب تلفيق لأنه يجب أن تحاكي بشكل وثيق التفاعل المنظم للغاية من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الأصلية.
السقالات ثلاثية الأبعاد القابلة للتحلل والتي تشكل شكل من العوامل الحاسمة في توليد بنيات الأنسجة الجديدة لأن الخلايا تهاجر لتشكيل طبقة ثنائية الأبعاد من الخلايا، ولكنها تفتقر إلى القدرة على النمو في فضل ثلاثي الأبعاد. تخدم سقالة كأساس مؤقت للخليةالمرفقات والانتشار، لذلك يجب أن تبنى من مواد ذات المسامية السيطرة عليها والتحلل البيولوجي، والنزاهه الميكانيكية الكافية. المواد سقالة لا ينبغي أن يكون السامة للخلايا أو إنشاء استجابة سلبية من المضيف. تم الهلاميات المائية التي يشيع استخدامها في تقنيات هندسة الأنسجة، ونظرا لhydrophilicity، وتسمح الهلاميات المائية الصرف السائل والغاز في جميع أنحاء متطوره. من خلال الجمع بين الهلاميات المائية المختلفة، خصائص هيدروجيل تصنيعه هي للتعديل لتلبية متطلبات تطبيق متميز.
نهج هندسة الأنسجة التقليدية ينطوي على إنشاء السقالات الأضاحي التي يسهل اختراقها ديكي التي المصنف مع الخلايا آخر fabricatio. وقد استخدمت العديد من التقنيات، مثل الألياف الرابطة، صب المذيبات، وتذوب الصب، ولكن ثبت أن تكون ناجحة الحد الأدنى للتطبيقات هندسة الأنسجة. طرق الألياف الرابطة تسمح الألياف إلى الانحياز في أشكال محددة، ولكنها ليست سوى قادرة على المواليةducing سقالة رقيقة جدا. طرق الصب المذيبات أنتجت بنيات المسامية العالية، ولكن كان الغشاء أكبر تنتج سوى 3 ملم thic. لذلك، وخلق بنيات ثلاثية الأبعاد من غير الممكن استخدام هذه التقنيات. أثبتت تقنيات صب تذوب الناجحة في إنتاج السقالات ثلاثية الأبعاد، ولكنها تتطلب درجات حرارة عالية أن المواد البيولوجية لا يمكن إدراجها خلال بروسس الإنتاج. المصنفة السقالات بعد تلفيق-محدودة في قدرتها على تلبية متطلبات هندسة الأنسجة لإنتاج السقالات ثلاثية الأبعاد مع المجهرية ومحددة مسبقا أو السيطرة عليها. آخر قضية رئيسية مع التقنيات سقالة البذر الصلبة هي نقص الأوعية الدموية والفقراء الميكانيكية.
ومنذ ذلك الحين تم تمديد Bioprinting إلى ثلاثة أبعاد من خلال استخدام غير سامة، قابلة للتحلل، والمواد الهلامية الحرارية عكسها للتغلب على عيوب التقليدية. وهناك عدد قليل من صلب حر تلفيق رechniques التي يجري استخدامها حاليا هي بمساعدة الليزر bioprinting والنافثة للحبر الطباعة. تقنيات bioprinting بمساعدة الليزر تستخدم مصدر نابض الليزر، لوحة الهدف، وركيزة المتلقي لتوليد ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، هذه التقنية محدودة بسبب الإنتاجية، وانخفاض بقاء الخلية، ويمكن أن تنتج فقط ترتيبات محدودة من الهياكل ملفقة فقط لأن prepolymers photocrosslinkable يمكن استخدامها لتشكيل هيدروجيل crosslinked. وقد وضعت الطباعة النافثة للحبر كمنهجية عدم الاتصال أن يستنسخ بيانات الصور الرقمية على الركيزة عن طريق إيداع الحبر بيكو لتر. ومع ذلك، الطباعة النافثة للحبر لا تنتج عالية الدقة بناء، يبني تجربة السريع تمسخ البروتين، والعديد من الخلايا هي lysed خلال الترسيب.
حاليا، وقد تم تطوير طرق التصنيع المضافة bioprinting جديدة. في هذه الأنظمة يتم دمج الخلايا والبروتينات وعوامل النمو، والهلاميات المائية الجزيئية الحيوية عادة في مصفوفة الأمأمية أثناء عملية التصنيع وأودعت في نفس الوقت باستخدام المحركات الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتوليد خلايا محملة يبني على أساس سقالة ثلاثية الأبعاد التي تحاكي عن كثب المعمارية المصغرة من الأم. الهلاميات المائية خلايا محملة تشكل bioink، التي يمكن أن تكون غير متجانسة، تتكون من أنواع خلايا متعددة، أو متجانسة. المضافات نظم التصنيع إيداع bioink قطرة تلو قطرة أو طبقة تلو طبقة عن طريق المحاقن ونصائح على مرحلة الكمبيوتر التي تسيطر عليها قادرة على التحرك في الاتجاهات X، Y، Z و. من خلال برامج الكمبيوتر، والهندسة المعمارية السقالات المطبوعة يمكن التلاعب بها بسهولة اعتمادا على متطلبات التطبيق. وخلافا للتقنيات التقليدية، ويمكن دمج التكنولوجيات الطبية ثلاثية الأبعاد (التصوير بالرنين المغناطيسي، والتصوير المقطعي الكمبيوتر) في التصاميم، وتوليد بناء المريض محددة. هذه الأساليب تسمح أيضا إمكانية إنتاج بدائل أوعية دموية لأن يتم إنتاج بنيات مع ارتفاع لكثافة الخلية OCAL، مما يسمح التفاعلات خلية خلية وتحسين احتمالات ما بعد الزرع بقاؤه.
الطابعة بالميتو هي ثلاثية الأبعاد نظام تعدد موزع خصيصا بنيت يستخدم أساليب التصنيع الروبوتية قابلة للبرمجة لتوليد ثلاثية الأبعاد بنيات الأنسجة غير المتجانسة (الشكل 1). لأنها تتيح استخدام عدد وافر من المواد في مجموعات فريدة من نوعها لإنتاج هياكل غير المتجانسة. التهيئة للbioprinter هي واحدة من أهم الخطوات في bioprinting لأنه يسمح لك لتعيين مجموعة متنوعة من المعلمات لتحسين القابلية للبنيات bioprinted.
تضم bioprinter عملية من النوع المتقطع مع تسلسل بدء التشغيل، التشغيل والاغلاق التي تسيطر عليها وحدة تحكم منطق برمجة (PLC)، التي تعمل على المستخدم من خلال لوحة تحكم تعمل باللمس التفاعلية (الشكل 1، A). لمنع التلوث الحيويالمواد منطقية ومرفق طيه وbioprinter في بولي إيجابيا لضغوط (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) غرفة مع الجسيمات arrestance عالية الكفاءة (HEPA) -filtered نظام دوران الهواء (الشكل 1، B، C). داخل الطابعة يمكن تعقيمها باستخدام مصادر الأشعة فوق البنفسجية المدمج في (الشكل 1، D). المكون الرئيسي للbioprinter هو الروبوت تحديد المواقع للبرمجة بشكل كامل يمكن أن تضع بتكاثر طرف موزع مع دقة 10 ميكرومتر (الشكل 1، E). هناك ثلاثة موزعات، والتي هي قادرة على أن تودع أحجام صغيرة مثل 230 NL باستخدام الدوارة (الشكل 1، F). هم برمجة بشكل مستقل باستخدام أجهزة كمبيوتر منفصلة التي تحكم المعلمات الطباعة لكل موزع (الشكل 1، G). دوار المسمار الاستغناء يستخدم دوران المسمار بالمحركات لنقل bioink أسفل حقنة ويخرجون من طرف الحقنة. هي التي شنت هذه موزعات على لpneumaticalأداة عش تسيطر لاي (الشكل 2A، B)، والسماح للروبوت للتبديل موزع شنت على الذراع الروبوتية Z المحور تحت السيطرة المبرمجة (الشكل 1، H).
يتلقى روبوت XYZ تعليمات الطباعة من جهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برامج التصميم (الشكل 1، I). يحتوي كل برنامج مواقع صرفها، وإجراءات المعايرة، والبروتوكولات المتغيرة موزع. تصميم بنيات ولدت تتكون أساسا من XYZ ينسق حيث كل موزع ستودع المواد. تضم bioprinter اثنين من أجهزة الاستشعار البصرية ضوء (الشكل 2C) التي تحدد إحداثيات XYZ من نهاية حقنة طرف. هذه المجسات ترسل تنسيق المعلومات لالروبوت، والذي يستخدم هذه لحساب مواقف طرفي موزع طرف. هناك ليزر النزوح إضافية (الشكل 2D) التي تتوقع 633 نانومتر الصمام الثنائي الأحمر شعاع ليزر من حجم البقعة 30 × 100 ميكرومتر لقياس المسافة مع ACCURAقبرصي من 0.1 ميكرومتر. عندما تركز بشدة شعاع الروبوت يحدد المسافة Z من سطح الطباعة. هذا القياس، وقياس البصرية وأجهزة الاستشعار ضوء في نهاية طرف في Z، يسمح حساب Z دقة الإحداثيات المستخدمة لوضع طرف موزع فيما يتعلق سطح الطباعة. نصائح موزع تتحرك أفقيا وعموديا من خلال X-محور الموجهة ضوء استشعار بصري للعثور على مراكز Y و Z، وأفقيا من خلال جهاز استشعار العمودي للعثور على مركز للمحور X. تم تعيين سطح الطباعة باستخدام صيغة لمنبسط في الفضاء XYZ: الفأس + من قبل + تشيكوسلوفاكيا = د لتحديد مكان السطح هو نسبي لموقف نهاية الاستغناء طرف. المرحلة الطابعة (الشكل 1، J) يحمل طبق بتري عينة تصل إلى 80 مم في القطر، ويستخدم حمام مائي إعادة تدوير للحفاظ على درجة الحرارة المحددة (الشكل 1، K). يمكن ضبط درجة الحرارة المرحلة ضمن مجموعة من -20 و لا تزال مستقرة في الداخل. هناك كاميرا USB محمولةعلى الروبوت Z-الذراع لتقديم وجهة نظر تضخيم من طرف الاستغناء أثناء عملية الطباعة (الشكل 1، L). هناك كاميرا ثانية شنت نحو الجزء العلوي من الداخل غرفة التي توفر رؤية متكاملة للbioprinter أثناء عملية الطباعة (الشكل 1، L).
وهناك برامج التصميم الرسم بمساعدة الكمبيوتر يحدد نمط ترسب ويسمح للمستخدم لتوليد قطرات متباعدة تدريجيا والهياكل المعقدة (الشكل 3). مسارات ثلاثي الأبعاد يمكن تلوينها يدويا في تصميم البرمجيات طابعة متوافقة أو استيرادها من برنامج منفصل التصميم بمساعدة الكمبيوتر الرسم (الشكل 4، الجدول 1). يسمح البرنامج للطابعة متوافقة الاختلافات المعلمات الطباعة مثل طريقة الترسيب (ترسب قطرة واحدة أو ترسب مسار مستمر)، والهندسة ثلاثية الأبعاد من المسارات، ومعدل الترسيب، والمسافة بين نهاية حقنة طرف وSUBSTيتم رفع معدل سطح الطباعة، وكمية من الوقت لإيداع انخفاضا الفردي، وارتفاع وسرعة الحقنة بين ترسب قطرات. يحتوي كل برنامج XYZ مواقع صرفها، والروتين طرف المعايرة، والبروتوكولات المتغيرة موزع لتوفير بيئة معقمة، دون تدخل المشغل، أثناء الطباعة. وحدة تحكم منطق برمجة (PLC) للروبوت يتلقى تعليمات من جهاز كمبيوتر يستخدم في تصميم البرمجيات ويتحكم في توقيت الأحداث من وحدات تحكم خارجية (على سبيل المثال، موزعات). للقيام بذلك، يستخدم PLC آلية تنفيذ الحلقات للسيطرة على موزعات ، جهاز تحديد المواقع الروبوتية، والعوامل البيئية.
ثلاثي الأبعاد الكتابة المباشر bioprinting الاستفادة من دوار المسمار، نظام صرف السائل يسمح للعملية إيداع الخلايا لتكون أكثر كفاءة ودقة، وأسهل من الطرق السابقة. وتظهر هذه الدراسة bioprinter عرف بني قادر على توليد مبنيات هيدروجيل ليرة لبنانية محملة بقاء الخلية عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الجيلاتين تحتوي على الركيزة لBioprinting ثلاثي الأبعاد من الجينات الهلاميات المائية
- إعداد الركيزة الكالسيوم / الجيلاتين وفقا للطريقة الركيزة الكالسيوم / الجيلاتين التي وصفها Pataky وآخرون 11 لتجنب انخفاض الجدوى المرتبطة نسبة عالية. يتم سرد طريقة الركيزة الكالسيوم / الجيلاتين أدناه.
- الجمع بين يذوى كلوريد الكالسيوم (1.5٪ بالوزن)، كلوريد الصوديوم (0.9٪ بالوزن)، والجيلاتين الخنزيري (2٪ بالوزن) في الماء المقطر، ويغلي لمدة 2 دقيقة لإيجاد حل الجيلاتين 100 ملم.
- صب 5 مل من محلول الجيلاتين / الكالسيوم إلى 100 ملم أطباق بتري القياسية، دوامة الحل في جميع أنحاء لجعل حتى الطلاء على السطح، ومكان على سطح مستو في الثلاجة لهلام O / N (السماح لهلام لا يقل عن 8 ساعة قبل الاستخدام).
- لزيادة التعتيم على سطح الركيزة، إضافة ثاني أكسيد التيتانيوم (0.3٪ بالوزن) لالجيلاتين / CaCl 2 الحل. يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة. AUToclave الحل الجيلاتين / تيو 2 على دورة السوائل لمدة 30 دقيقة لتعقيمها.
- إضافة 3 مل من الجيلاتين / تيو 2 حل للسطح لوحات الجيلاتين أعدت مسبقا. دوامة الخليط لضمان ينتشر بالتساوي على السطح. السماح لهلام في 4 ° C الثلاجة O / N (السماح لهلام لا يقل عن 8 ساعة قبل الاستخدام). يجب استخدام ركائز خلال 3 أيام.
2. الجيني الأكسدة
- أكسدة bioink الجينات الصوديوم وفقا للطريقة لالجينات تتأكسد جزئيا Bouhadir وآخرون 30 هو موضح أدناه.
- لجعل 5٪ حل الجينات أكسدة، ويحل 1 غرام من الجينات الصوديوم في 100 مل من الماء المقطر. إضافة محلول مائي من بريودات الصوديوم (0.25 M، 0.25 ملمول)، عامل مؤكسد، لإنتاج حل الأكسدة 5٪. يحرك المزيج لمدة 19 ساعة على RT. إضافة 40 مل جلايكول الإثيلين إلى حل بعد 24 ساعة لإنهاء الجرميةction.
- حل 2.5 غرام من كلوريد الصوديوم في الحل. إضافة كميات زائدة من الكحول الإيثيلي (2: 1 نسبة) لترسيب أملاح الجينيه أكسدة. أجهزة الطرد المركزي الحل في 1000 x ج لجمع الرواسب وإعادة بحل-في الماء المقطر. تكرار غسل الايثانول.
- تجميد تجفيف الكريات الجينات أكسدة وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
- تحديد درجة أكسدة عن طريق قياس نسبة الصوديوم بريودات المستهلكة قبل أن يتم إنهاؤها من قبل جلايكول الإثيلين.
- إعداد محلول يوديد البوتاسيوم (20٪ ث / ت، ودرجة الحموضة عازلة فوسفات الصوديوم 7.0) وحل thyodene (10٪ ث / ت، ودرجة الحموضة 7.0 الصوديوم العازلة الفوسفات). مزيج من الحلين مع الجينات أكسدة في RT.
- إسقاط تدريجيا رد فعل الجينات والصوديوم حل بريودات في مزيج من يوديد البوتاسيوم وtheodyne الحلول. قياس الامتصاصية من خليط طيفيا في 426 نانومتر. عندما وصلت عليهالحد الأقصى، تسجيل الصوت المستخدمة من الجينات الصوديوم وحل بريودات كما V 1.
- رد فعل
. كمية غير المتفاعل بريودات الصوديوم 
- طرح كمية غير المتفاعل بريودات الصوديوم من التركيز الأصلي لتحديد كمية الصوديوم المستهلكة بريودات. باستخدام الصيغة السابقة، وتحديد درجة أكسدة الأخيرة من الجينات.
. كمية غير المتفاعل بريودات الصوديوم 
3. الجيني الببتيد الإقتران
- بروابط المترافقة مع يتعرض تسلسل أرجينين-الجلايسين اسبارتاتي (الببتيد) في الجينات أكسدة معدة مسبقا وذلك باتباع طريقة الاقتران RGD-ملح الجيني بواسطة رولي وآخرون 31 المبينة أدناه إلى تعزيز مرفق الخلية والانتشار.
- استخدام carbod مائيالكيمياء iimide مع G 4 RGDSPto المترافقة 31.
- حل 1 غرام من 5٪ الجينات أكسدة في 0.1 M 2- (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES) العازلة، ودرجة الحموضة = 4. إضافة 1-ethyl- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC، 0.54 ملمول) وN-Hydroxysuccinimide ( NHS، 0.27 ملمول) في 2: 1 نسبة إلى تشكيل أميد المتوسط.
- إضافة 0،28 مليمول الببتيد، اقتران العمود الفقري للبوليمر الجينات عبر أمين المحطة. إثارة في RT O / N.
- وقف رد فعل اقتران عن طريق إضافة 2.5 غرام كلوريد الصوديوم إلى الحل. إضافة كميات زائدة من الكحول الإيثيلي (2: 1 نسبة) لترسيب أملاح الجينيه أكسدة. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 4000 x ج لمدة 5 دقائق لجمع الرواسب. نضح في وسائل الإعلام في الخلية هود الثقافة وإعادة بحل-يترسب في الماء المقطر. تكرار غسل الايثانول.
- تجميد تجفيف الرواسب حتى يصبح جفت تماما (سوف تظهر مسحوقا أبيض) وتخزينها في -20 درجة مئوية الثلاجة لوقت لاحقاستخدام.
4. الدهنية لجسم الإنسان خلايا الأنسجة اللحمية خلية الثقافة (hADSC ل)
- ثقافة الدهنية لجسم الإنسان خلايا انسجة الأنسجة (hADSC ل) في 75 سم تعامل قوارير ثقافة خلية (قوارير T75)، مع تغطية 15 مل منخفض DMEM الجلوكوز مع 10٪ مصل الجنين البقري و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين، 1٪ الجلوتامين، و 1٪ antimycin. تغيير وسائل الإعلام، في الخلية هود الثقافة، كل يومين حتى وصلت confluency (80-90٪).
- مرة واحدة متموجة، ونقل قوارير T75 إلى الخلية هود الثقافة وتعليق لhADSC باستخدام طريقة التربسين انزيم الهضم.
- في غطاء محرك السيارة، ونضح كل وسائل الإعلام خلية ثقافة الخروج من الخلايا. شطف مع 5 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS ++). نضح DPBS ++ الخروج من الخلايا.
- بينما في غطاء محرك السيارة، وجعل حل التربسين وDPBS ++ عن طريق خلط 1 مل التربسين و 4 مل DPBS ++. كل قارورة تتطلب 5 مل من solutأيون، لذلك جعل حجم مناسب لعدد من قوارير متموجة. إضافة 5 مل من التربسين / DPBS ++ إلى كل قارورة ووضعها في الحاضنة لمدة 2 دقيقة.
- بعد 2 دقيقة، وإزالة قوارير وبخفة الجانبين منهم لتخفيف الخلايا من القيعان. ننظر في كل قارورة تحت المجهر لضمان وقف التنفيذ الخلايا. وضع قوارير مرة أخرى في الخلية هود الثقافة وإضافة 3 مل من المناسب سائل الإعلام والثقافة الخلية إلى كل قارورة. ينتهي هذا رد فعل التربسين.
- نقل وسائل الإعلام الخلايا المحملة من كل قارورة وضعت في مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج منهم لمدة 5 دقائق. يجب أن تظهر الخلايا كما هو بيليه الأبيض الصغير في أسفل المخروطية. نقل مرة أخرى إلى الخلية هود الثقافة ونضح وسائل الإعلام. resuspend الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات تحت المجهر. مرة واحدة وقد تم عد الخلايا، في غطاء محرك السيارة والثقافة، وقسامة كمية من وسائل الإعلام التي تحتوي على ~ 1.3 millioن الخلايا ونقل إلى المخروطية 15 مل. الطرد المركزي المخروطية 15 مل تحتوي على خلايا مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 1000 ز س.
- في الثقافة هود، RESEED الخلايا المتبقية في عدة T-75 قوارير، إضافة تركيز ~ 350000 خلايا لكل قارورة. إضافة 15 مل من وسائل الاعلام DMEM والعودة إلى الحاضنة حتى متموجة مرة أخرى.
- مرة واحدة في دورة الطرد المركزي هي كاملة، وعودة المخروطية 15 مل للثقافة الخلية. نضح وسائل الإعلام من بيليه الخلية، وresuspend الخلايا في محلول مائي الجينات عند تركيز 1.3 مليون خلية لكل مليلتر من bioink، terteriating الحل في كثير من الأحيان حتى لا يكون هناك توزيع متجانس من الخلايا في جميع أنحاء bioink. تحميل حل الخلية محملة إلى طابعة متوافقة معقمة 3 مل حقنة والمسمار على العقيمة 22 G غيض من البلاستيك.
5. إعداد Bioprinter
- بدوره على bioprinter، كل من أجهزة الكمبيوتر موزع، وrecirculatجي حمام الماء.
- يدويا تعيين إعادة تدوير درجة حرارة حمام الماء للآلية دبق.
- تعيين معلمات يدويا الطباعة لكل موزع على الكمبيوتر ربط موزع. تعيين حجم الاستغناء إلى 230 NL، عدد من تراجعات إلى 0، ومعدل الاستغناء عن ل10μl -sec.
- فتح تصميم البرمجيات وبرنامج لمشاهدة عرض الكاميرا USB على جهاز الكمبيوتر.
- باستخدام البرنامج، يدويا إدخال إحداثيات نقطة مجموعة 5 × 5 مع 2.4 ملم تباعد بين قطرات.
- تعيين المعلمات الطباعة لتكون: المسافة بين نهاية طرف وسطح الركيزة = 0.1 مم؛ ورفعت ارتفاع حقنة بين ترسبات = 20 مم؛ مقدار الوقت في ترسب = 1 ثانية.
- حفظ البرنامج وإرسالها إلى الروبوت.
- وضع طبق بتري الجيلاتين / تيو 2 التي تحتوي على 4 ° C مرحلة الطابعة. إغلاق وقفل باب الغرفة.
- استخدام PLC لINItialize مصادر الأشعة فوق البنفسجية، وتعقيم الغرفة لمدة 90 ثانية.
- مرة واحدة التعقيم كاملة، فتح الغرفة وتحميل حقنة تحتوي hADSC وعلقت في الجينات إلى بندقية 1. إغلاق وقفل باب الغرفة.
- استخدام PLC لتشغيل نظام المروحة، انتظر 30 ثانية لتوازن الضغط الداخلي.
- على الكمبيوتر، قم بتشغيل البرنامج الذي يحتوي على مسار الهندسية والطباعة المعلمات.
- في جميع مراحل عملية الطباعة، ومشاهدة عرض الكاميرا USB على جهاز الكمبيوتر لتأكيد الطباعة دقيقة وموحدة.
- بمجرد الانتهاء من الطباعة، والسماح للبنيات إلى هلام لمدة 40 دقيقة.
تقييم الجدوى 6. خلية
- تغطية التركيبات التي لا تسير على أن تصويرها على الفور ما بعد الطباعة في DMEM وتخزينها في الحاضنة حتى وقت التصوير.
- لتحديد الجدوى من يبني، وصمة عار لهم باستخدام استنادا فلوري الجدوى / السمسة مقايسة، وهوالثانية الصورة باستخدام متحد البؤر المجهري.
- اتباع الإرشادات عدة، يعد حل تلطيخ تحتوي على calcein AM وإيثيديوم homodimer-1. لجعل 10 مل من محلول التلوين، إضافة 20 ميكرولتر من إيثيديوم homodimer-1 و 5 ميكرولتر من calcein صباحا إلى 10 مل من عقيم، زراعة الأنسجة الصف Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (+ المغنيسيوم، + الكالسيوم، DPBS ++).
- تزج بنيات bioprinted في الحل وصمة عار لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- صورة بنيات الملون باستخدام نظام المجهر متحد البؤر في أيام 0 و8. يمكنك التقاط صور متعددة من كل بناء bioprinted، وذلك باستخدام المعلمات Z-كومة من 30 شرائح الضوئية على عمق 300 ميكرون، ويدويا عد الخلايا. في حالة ظهور خلايا صفراء أو خضراء نعدهم كما على قيد الحياة، وإذا أحمر، نعدهم الموتى كما.
- حساب النسبة المئوية بقاء الخلية حيث وصل عدد الخلايا الحية مقسوما على العدد الكلي للخلايا في بناء؛ بقاء الخلية = عددالخلايا الحية (أخضر + أصفر) / العدد الإجمالي للخلايا (أخضر + أصفر + أحمر) × 100٪.
- حساب كمية من تكاثر الخلايا لكل عينة حيث وصل عدد الخلايا من يوم 8 مقسوما على عدد الخلايا في يوم 0؛ انتشار الخلايا = عدد الخلايا الحية في يوم 8 / خلية حية تعتمد على اليوم 0 × 100٪.
7. RGD الببتيد الإقتران تحليل
- لتحليل نجاح RGD الببتيد اقتران على الجينات، مقارنة الجينات RGD-مترافق والجينات غير مترافق. للقيام بذلك، صورة بنيات المطبوعة باستخدام (4، 6-Diamidino-2-Phenylindole، هيدروكلوريد) (دابي) وphalloidin البقع.
- جعل phalloidins حل العمل عن طريق تمييع 5 ميكرولتر من محلول المخزون المثيلي مع 200 ميكرولتر من DPBS ++. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- جعل 300 ميكرومتر حل الأسهم وصمة عار دابي التالية المعادلة: (0.10509 جم / L) / (350.3 جم / مول) = 3 × 10 -4 M = 0.0003 M = 0.300 ملي = 300 ميكرومتر. جعل عشرالحل ه دابي العمل عن طريق تمييع الحل الأوراق المالية 1: 100 في DPBS ++ للحصول على 3 ميكرومتر الحل. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تماما غمر العينة في 4٪ امتصاص العرق. احتضان لمدة 1 ساعة على RT. يغسل ثلاث مرات مع DPBS ++، مما يتيح الحل على الجلوس لمدة 5 دقائق كل غسل. نقل العينة جل من البئر إلى شريحة زجاجية، التقليب هلام في أكثر من عملية. تزج هلام في 0.1٪ تريتون X-100 (0.1 غرام / 100 مل) في DPBS ++ لمدة 10 دقيقة. يغسل ثلاث مرات مع DPBS ++، مما يسمح لل5 دقائق لكل يغسل.
- وصمة عار على بنيات المطبوعة مع phalloidin عن طريق غمر لهم في حل العاملة. مع تغطية احباط واحتضان لمدة 4 ساعات. إزالة وصمة عار phalloidin ويغسل ثلاث مرات مع DPBS ++. يجب أن تكون أول غسل سريع، ينبغي أن يغسل الأخيرة الجلوس لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- وصمة عار على بنيات المطبوعة مع دابي عن طريق غمر لهم في حل العمل دابي. مع تغطية احباط واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة. غسلثلاث مرات مع DPBS ++، مما يسمح كل غسل للجلوس لمدة 5 دقائق. مراقبة وصورة العينات على نظام المجهر متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتبين النتائج أن bioprinter قادر على إيداع الهلاميات المائية خلية لادن في المواقع الثلاثة الأبعاد محددة بدقة وباستمرار باستخدام البرمجيات بمساعدة الكمبيوتر. هذه البرمجيات تحدد وضع كل قطرة ومراقبة العديد من المعلمات للاستغناء عن (الشكل 3،4). والتكرار من bioprinter أن تودع بشكل مناسب الحيوية هو أمر أساسي لنجاحها في تطبيقات هندسة الأنسجة.
بقاء الخلية، واحدة من متطلبات تقنية bioprinting ناجحة، تم تحليل 1 ساعة و 8 أيام ما بعد الطباعة. بقاء الخلية عالية ضرورية لتصنيع التركيبات الجزيئية الحيوية وهي التمثيل المباشر لbioink كاف. RGD الببتيد اقتران يحسن بقاء الخلية على مدى فترات طويلة من الوقت عن طريق تعزيز خلية الانتشار. تم استخدام المجهر الفلورسنت لتحديد بقاء الخلية في بنيات بعد عملية الطباعة. bioink الجينات مع concentrكان أوجه من 15٪ والأكسدة من 5٪ يوميا 0 بقاء 98٪، يوم 4 من 96٪، ويوم 8 من 95٪ (الشكل 5). هذه النتائج تشير إلى تقنية ترسيب من bioprinter الكتابة المباشر يقذف الخلايا برفق بما فيه الكفاية لإنتاج بنيات التي لا تزال قابلة للحياة أثناء وبعد عملية الطباعة (الشكل 1 و 2). وتبين بقاء الخلية عالية كان 5٪ الأكسدة و 15٪ تركيز الجينات bioink وسيلة مناسبة لترسب الخلايا وتوفير بيئة مناسبة لخلايا البقاء على قيد الحياة. وأظهرت تعداد خلايا مماثلة في كل مجال من مجالات توزيع خلية متجانسة في bioink الجينات، جانبا أساسيا من القرار الطباعة.
معظم الأنسجة لديهم تركيبات معقدة والتدرجات من مكونات المصفوفة خارج الخلية، مع كل التأثيرات البيولوجية والميكانيكية محددة. وينبغي أن يكون مادة بيولوجية بيوميمتيك من البيئة المحلية وتسهيل الوظائف الخلوية. مسامية عالية من السقالة الجينات تسمح للالخلايا على التواصل والتشبيك مع بعضها البعض، وأيضا قد تسهل تدفق المواد الغذائية ونواتج الأيض بين السقالة والبيئة المحيطة بها. التصاق الخلية إلى المصفوفة خارج الخلية هو المرحلة الأولية لتكوين الأنسجة التي يحدث قبل تكاثر الخلايا وتنظيم جزيئات المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة وظيفية. انتشار الخلايا تلعب دورا حيويا في التئام الجروح والأنسجة النمو، وبالتالي فهو عامل مهم جدا عند تحليل بنيات bioprinted لتطبيقات هندسة الأنسجة. والجينات المحسنة مرفق الخلية-RGD مترافق في بنيات المطبوعة، مما يؤدي إلى تحسين خلية نشر والانتشار. وكان كميا انتشار الخلايا في السقالات المطبوعة عن طريق عد ثلاث مناطق متفرقة في الأيام 0 و 8 (الشكل 6). تم العثور على تكاثر الخلايا العام ليكون 219،674٪ بعد 8 أيام من الثقافة. هذه النتائج دلالة على سقالة لديه توافق مع الحياة الملائم لاستخدامها لسا المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية لإيصال الخلايا لإصلاح الأنسجة التالفة أو غير وظيفي.
لتحليل نجاح RGD الببتيد اقتران على bioink الجينات، تم إجراء تجربة مقارنة باستخدام خلية لادن، RGD-مترافق تركيز 15٪، 5٪ bioink الأكسدة الجينات والخلايا لادن، غير مترافق تركيز 15٪، 5٪ الأكسدة bioink الجينات. واستخدمت دابي تلطيخ للنوى وتلطيخ phalloidin لأكتين لتحليل الخلايا تنتشر في بنيات المطبوعة في يوم 8. صور من كل عينة (ثلاثة على الأقل الصور العشوائية في العينة) كانوا يأخذون باستخدام نظام المجهر متحد البؤر باستخدام معلمات Z-كومة من 30 شرائح الضوئية على عمق 300 (الشكل 7). الخلية نشر هو مبين في العينة مع RGD مترافق الجينات يثبت التأسيس الناجح لالببتيد على الجينات. هجرة الخلايا هي خطوة مهمة في تطوير أنسجة؛ وبالتالي فإن الاقتران من الببتيدات RGD على الجينات يحسن لىkelihood من الجسم الحي في التطبيق باستخدام هذا bioink.
الشكل 1. بالميتو الطابعة. برمجة المنطق المراقب تنسق أعمال جميع وظائف الطابعة (A). دائرة الاحتواء محكم (B) مع كمية تصفيتها (C) والعادم (C) يحافظ على الضغط الايجابي الداخلي المنظم لتقليل فرصة التلوث. أضواء الأشعة فوق البنفسجية المزدوجة (D) التي تقام في سقف الغرفة يمكن برمجتها لتعمل على فترات آمنة. A JANOME 2300N XYZ روبوت (E) مبرمجة والتي يسيطر عليها جهاز كمبيوتر متكامل (I). مبرمجة ثلاث وحدات تحكم موزع (G) لتنظيم إخراج المدافع موزع (F) متوفرة ليتم تحميلها على ذراع الروبوت Z-محور (H) تحت السيطرة على جهاز الكمبيوتر. يتم تعيين درجة حرارة صاحب العينة الروبوت (J) بين 4 و 40 ° C بواسطة وحدة تحكم حمام مائي (K). الكاميرات الرقمية المزدوجة (L) متوفرة ر س مراقبة نشاط الطابعة وتشكيل العينة. هي التي شنت واحدة الكاميرا على الروبوت الذراع Z المحور، ويقدم صورة مكبرة من طرف موزع البندقية تحميل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. أداة عش، البصرية وأجهزة الاستشعار، والليزر نزوح Bioprinter. A. تفريغها عرض أداة عش من الجبهة. B. المحملة عرض أداة عش من الجبهة. C. البصرية مجسات قياس نهاية الاستغناء طرف في الفضاء ثلاثي الأبعاد. D. بعد الليزر قياس Z تنسيق من سطح الطباعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. البصرية PathBuilder البرمجيات. صورة من التصميم بمساعدة الكمبيوتر برامج الرسم المستخدمة لتصميم الهيكل الخارجي للبنيات bioprinted. ويوفر هذا البرنامج القدرة على توليد قطرات متباعدة تدريجيا وهندستها معقدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. JR-C نقاط البرمجيات. لقطة من تصميم البرمجيات طابعة متوافقة. هذا البرنامج يتيح للمستخدم للسيطرة على طريقة الترسيب (أي الترسب واحد قطرة أو ترسب مسار مستمر)، سرعة الترسيب، والمسافة بين نهاية حقنة طرف والطباعة سو سطح bstrate، والوقت المخصص للترسب كل قطرة، ووضع ثلاثي الأبعاد من قطرات (راجع الجدول 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. صورة الفلورسنت من الزجاج الملون hADSCs ما بعد الطباعة. بقاء الخلية / السمسة الصور الفلورسنت في hADSC في بناء bioprinted التي يتم التقاطها باستخدام نظام المجهر متحد البؤر (معلمات Z-كومة من 30 شرائح البصرية على مدى عمق) بعد 0 (A) و 8 ( B) يوما. وصفت ال hADSC ما بعد الطباعة باستخدام الثدييات خلية الجدوى / السمسة مقايسة. هي ملطخة الخلايا الحية الخضراء، وهي ملطخة الخلايا الميتة الأحمر.3156fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. الكمية لViabilities من Bioprinted التركيبات. وكان كميا عدد الخلايا الحية والميتة باستخدام فحص الجدوى / السمية الخلوية. وتظهر حية / عدد الخلايا الميتة ليوم 0 في (A)، والتهم ليوم 8 في (B). يظهر عدد من الخلايا الحية تحسب لكل منطقة في الأيام 0 و 8 في (C) واستخدمت لقياس انتشار الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. مقارنة خلية لادن، Nعلى مترافق وRGD-مترافق أملاح الجينيه. الصور الفلورسنت من لhADSC bioprinted في غير مترافق (A)، وRGD-مترافق (B) 15٪ تركيز 5٪ الأكسدة الجينات bioink اتخذت باستخدام نظام المجهر متحد البؤر (معلمات Z-كومة من 30 شرائح الضوئية على عمق). كانت ملطخة ال hADSC مع phalloidin ودابي البقع على تحليل الخلية تنتشر في كل من يبني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| جدول أوامر | |
| أمر | رد الروبوت |
| PTP نقطة | تحركات الذراع الروبوتية لposiiton مبين في X، Y، Z الفضاء |
| Find_Base_Z | يستخدم الليزر المرضى إلى قياس رانه طباعة سطح الركيزة. تم تعيين يدويا المسافة بين نهاية حقنة طرف وسطح الركيزة. |
| العمل الصفة. رقم (العمل تعديل عدد) | أوامر الروبوت لاستخدام الليزر المرضية (لتحديد سطح الركيزة)، بندقية 1، 2 بندقية، أو بندقية 3. |
| Get_1 | أوامر الروبوت استرداد بعد التمديد وتحميل بندقية 1 |
| Find_Tip1_YZ | الروبوت يجد نهاية غيض من بندقية 1 في Y Z والاتجاهات |
| Find_Tip1_X | الروبوت يجد نهاية غيض من بندقية 1 في اتجاه X |
| نقطة الاستغناء | الروبوت سوف تستغني قطرة واحدة من bioink في X العزم، Y، Z موقف |
| البليت رقم (Pallte عدد) | يشتمل على تصميم مشفرة يدويا للطباعة، على سبيل المثال، صفيف. |
| الاستغناء الوقت | هو الوقت المخصص لترسب كل قطرة الفردية. </ td> |
| Store_1 | أوامر الروبوت للعودة بندقية 1 إلى toolnest، والعودة إلى موقف البيت: (0،0،0). |
الجدول 1. برمجة الحاسوب أوامر البرمجيات. ويبين هذا الرسم البياني للبرمجة الأوامر برامج الكمبيوتر، والتي تستخدم للتحكم في ذراع آلية وتحسين المعلمات القابليه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التركيز الرئيسي لهندسة الأنسجة هو سد الفجوة بين نقص الأعضاء واحتياجات زرع من خلال تطوير بدائل بيولوجية قادرة على استعادة والحفاظ على، أو تحسين functio أنسجة الأم. وقد أدى هذا إلى تلفيق المباشر السقالات مع مجمع، هندسة الخارجية الصحيحة تشريحيا، ومراقبة دقيقة على مدى geometr الداخلية. bioprinting ثلاثي الأبعاد هو المنهجية المستخدمة لتوليد بنيات ثلاثية الأبعاد من مختلف الأحجام والأشكال من نموذج رقمي باستخدام approac طبقة تلو طبقة. تصنيع التركيبات الجزيئية الحيوية ثلاثية الأبعاد يلعب دورا أساسيا في النهوض هندسة الأنسجة.
هناك جوانب هامة من عملية التصميم التي تؤثر functio الجزيئية الحيوية في بناء ولدت في. القدرة على التحكم في درجة حرارة مادة بيولوجية والركيزة ضرورية لآلية التبلور من الهلاميات المائية والحفاظ مني بهاخصائص chanical، وبالتالي التأثير على توزيع الخلية، والانتشار، والتمايز داخل هيدروجيل. تتكون أجهزة العديد من أنواع الخلايا، وبالتالي فإن موزعات متعددة بالغة الأهمية لإنتاج هياكل الأنسجة مثل غير المتجانسة. تصميم بمساعدة الكمبيوتر الهيكل الخارجي يسمح للإنتاج بدائل الأنسجة المخصصة للجروح أو أنسجة متميزة. وهذا أمر ضروري لتطوير بدائل المريض محددة. العمارة الداخلية هي نفس القدر من الأهمية لأنه يؤثر على العلاقات خلية خلية داخل الهيكل عن طريق وضع الخلايا السليمة في اتصال حميم مع بعضها البعض والسماح لهم بتشكيل المجراة تشبه تقاطعات خلية خلية. وضع دقيق للخلايا يحدد كيفية اتصال الخلايا والشبكات مع بعضها البعض لتشكل شبكات الأوعية الدموية وتحاكي النشاط الحيوي في أنسجة الأم. يوفر bioprinting ثلاثي الأبعاد الخلايا المتفرقة متجانس داخل bioink، فضلا عن دقة ممتازة في ص المكانيlacement من الخلايا. يكون السقالات ولدت أيضا كثافة خلية محلية عالية، وهو أمر ضروري لتمايز الخلايا وصياغة المصفوفة خارج الخلية.
المقدمة هنا هي bioprinter الروبوتية 3D التي وبشكل متواصل الاستغناء قطرات متجانسة من الخلايا الفردية أو خلايا مختلطة مع هيدروجيل بيوميمتيك. وقد استخدمت bioprinters مماثلة تكنولوجيا ما قبل الاندماج. وفقا الفرق التصاق الفرضية، الخلايا الفردية عند وضعها في قالب أو ما شابه ذلك الجهاز، والصمامات وتنظيم بناء على تركيز وتوزيع جزيئات الالتصاق على surfac الخلية. هذه الأجهزة خلق قضبان تنصهر قبل أو الأشكال الهندسية الأخرى التي يتم بعد ذلك تحميلها في موزع وضعت على مقربة من قضبان قبل تنصهر أو مسبقة الصنع الأخرى، والتي ثم الصمامات في حالات العسر الشديد الهندسي أكبر. هندستها نهاية تقتصر بما يمكن بناؤها من هذه الكيانات مسبقة الصنع. وbioprinter تنفيذها هنا تضم درجة حرارة فريدة من نوعهابيئة تسيطر فيها الخلايا ومخاليط خلايا هيدروجيل لا تقتصر من قبل على ضرورة ما قبل الاندماج. في ظل هذه الظروف، وbioprinter ليس الاعتماد فقط على فرضية الفرق التصاق. إدراج مواد هيدروجيل يمكن أن تساعد في توجيه توزيع الخلايا وتسمح للخلايا لتلتحم، أو لا، وهذا يتوقف على الخصائص المطلوبة للتجريب محددة. اختيار الهلاميات المائية المحاكاة البيولوجية للخلية التغليف لديها أيضا تأثير عميق على النمط الظاهري الخلية. ومن المعروف أن المواد التي يكون لها تأثير على مرفق الخلية، وكذلك حجم الخلية وmorpholog. خصائص الانسيابية، مثل اللزوجة، من الهلاميات المائية تملي تأثيرها على microenvironmen الخلوية. الجينات الأصلية هو خامل ولا التواصل بسهولة مع الخلايا المشاركة في الرقابة على النمط الظاهري. ومع ذلك، باستخدام أملاح الجينيه التي يتم تعديلها كيميائيا عن طريق الاقتران الببتيد والأكسدة، ويبني الناتجة عرضه التحكم التحلل وزيادة الخلاياالمرفق، والهجرة، وproliferatio. يمكن تغيير خصائص الفيزيائية للمادة بيولوجية تؤثر التن الأنسجة.
bioprinting ثلاثي الأبعاد باستخدام-صرف السوائل، آلة الكتابة المباشر يقتصر من قبل على درجة من حل البنى المطبوعة، وتوافر المواد هيدروجيل، الأولية موت الخلايا ما بعد الطباعة، والقدرة على يوعي والمحاكاة البيولوجية. سمة هامة من bioprinting هي قرارها. ويعرف كل طريقة الطباعة من انخفاض حجم الحد من التقنية من أصغر التفاصيل للتحقيق. هناك علاقة دينامية بين انخفاض حجم الحد وعلى نطاق ممكن للبناء المطبوعة: وارتفاع القرار من التفاصيل الدقيقة، وأقصى بناء أصغر. وbioprinter قادر على إيداع كميات صغيرة مثل 230 NL في أنماط محددة للغاية ومنظم، ويعطيها دقة أعلى من آلات مماثلة. تم الهلاميات المائية التي يشيع استخدامها في bioprinting بسبب بهمhydrophilicity، توافق مع الحياة، التشابه الهيكلي لالمصفوفة خارج الخلية، وسهولة modificatio. محتوى المياه عالية من الهلاميات المائية يحسن توافق مع الحياة، ولكن يقلل بدرجة كبيرة من القوة الميكانيكية و. هناك نقص في الهلاميات المائية الأمثل مع الخصائص الميكانيكية مناسبة لتقديم السوائل خلال bioadditive تصنيع قذف. لذلك، هناك طلب كبير على تطوير الهلاميات المائية التي هي خاملة مناعيا، لديها آليات دبق cytocompatible التي يمكن مقذوف بنجاح باستخدام تسليم السائل، وأيضا إنتاج مصفوفة الخلية محملة مجموعة الأمثل الميكانيكية. قبل عملية الطباعة، يجب أن يتم تخزين الخلايا المحملة هيدروجيل bioink في الحقن لفترة من الوقت، المساس الخلية. أثناء عملية الطباعة، وإجهاد القص التي يسببها على الخلايا خلال قذف ويمكن أيضا أن تكون ضارة بهم. وbioprinter هي قادرة على انتاج قابلة للحياة عالية (> 90٪) يبني، وبالتالي التغلب على مشكلة طموت الخلايا nitial. الأوعية الدموية تلعب دورا حيويا في نقل، ودعم، والحفاظ على وظيفة المحاكاة البيولوجية من bioprinted. نشر الأكسجين م؛ ولذلك في أكبر bioprinted يبني نقص الأكسجين هو. التقنيات التقليدية غير قادرة على إنتاج بنيات مع الأوعية الدموية جزءا لا يتجزأ، والحد بشكل كبير من حجم السقالات producible. وأظهر التقييم بقاء الخلية من bioprinter تكاثر الخلايا كبيرا في البنى المطبوعة أكثر من 8 أيام. ولذلك، فإن تقنية تثبت قدرتها على توليد السقالات التي تسمح نمو الخلايا، والاتصالات، وتشكيل الشبكات، ومتطلبات الأوعية الدموية.
يوفر bioprinter القدرة على استخدام مجموعة متنوعة من المواد لإيداع بسرعة الهلاميات المائية خلية لادن في أنماط محددة. في حين أن هذا الأسلوب تنتج بنيات غير المتجانسة مع خصائص الانضباطي، فإنه غير قادر على ترسيب المتزامنة وخلط رد الفعل. بالنسبة لبعض المواد الحيوية، التقى هذا ترسبسوف هود تعزيز آلية دبق واختصار الوقت للسقالة إنتج. إضافة موزع متعددة حقنة قد يسمح مجموعة واسعة من المواد الحيوية لتقنية biofabrication. التحقيق في نشاط الخلايا في بنيات bioprinted على مدى فترة أطول من الوقت من شأنه أن يوفر المزيد من المعلومات حول خصائص هيدروجيل، وتشكيل شبكة الخليوي، والأوعية الدموية من بنيات.
طريقة ترسب في bioprinter في وصف يمكن أن تزيد من يعمل على وضع آليا والقيادة موزعات ثلاث لإيداع عدد وافر من المواد البيولوجية على رأس المواد المودعة سابقا في نمط محدد سلفا. هذه الخطوة يمكن تكرار استخدام أنماط تصاعدي حتى يتم إنتاج جهاز ثلاثي الأبعاد أو الأنسجة. ولذلك، فإن الطابعة بالميتو هي مناسبة للاستغناء موثوق الهلاميات المائية الخلايا المحملة لخلق بناء ثلاثي الأبعاد قادر على الاحتفاظ الأوعية الدموية وبقاء الخلية عالية، ويمكنيمكن استخدامها في تطبيقات هندسة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الدعم الحكومي بموجب منحة رقم EPS-0903795 تمنحها المؤسسة الوطنية للعلوم، NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI)، ومنح 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al.
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F.
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
