Introduction
Тканевая инженерия использует принципы биологии и инженерии в развитии функциональных заменителей для поддержания, восстановления или повышения родной ткани и. Возможность генерации трехмерных биомиметических конструкции по требованию будет способствовать научные и технологические достижения в тканевой инженерии, а также датчики на основе клеток, препарат / скрининга токсичности, ткани или опухоли моделей, и прочее. Трехмерная организация тканевой инженерии конструкций является основным компонентом метода изготовления, потому что она должна точно имитировать высоко организованной взаимодействие клеток и внеклеточного матрикса в нативной ткани.
Биологически и форма формирования трехмерных леса являются важнейшими факторами в создании новых конструкций ткани, потому что клетки мигрируют, чтобы сформировать двумерный слой клеток, но не имеют возможности расти в благоприятствования трехмерным. Леса служит основой для временного клеткипривязанность и оружия, поэтому он должен быть изготовлен из материалов с контролируемой пористостью и биологическому разложению, и достаточной механической IntegrIT. Эшафоте материалы не должны быть цитотоксическое или зарегистрироваться побочной реакции от хоста. Гидрогели были широко используется в тканевой инженерии методов, и из-за их гидрофильности гидрогели позволяют жидкости и газа обмен на протяжении Структур. Комбинируя различные гидрогели, свойства синтезированных гидрогеля являются изменению встретиться отличный требование приложений.
Обычный тканевой инженерии подход предполагает создание бесклеточных пористых жертвенных лесов, которые засевали клетки после fabricatio. Были использованы многие методы, такие как волокна, литье соединения растворителя, и формование расплава, но оказалось успешным для минимально тканевой инженерии. Методы волоконной контактной позволяют волокна должны быть выровнены в конкретные формы, но они способны только проducing очень тонкий каркас. Растворитель методы литья производится очень пористые конструкции, однако по величине производства мембраны только 3 мм thic. Таким образом, создания трехмерных конструкций не представляется возможным с помощью этих методов. Формование расплава оказались успешными в производстве трехмерных каркасов, но такие высокие температуры, что необходимо биологические материалы не могут быть включены в процессе производства предпосе. Строительные леса высевают пост-изготовление ограничены в своей способности удовлетворять требованиям тканевой инженерии для получения трехмерных каркасов с заранее определенными или контролируемых микроструктур и. Еще одним важным вопросом с твердыми технологий эшафот посев дефицит васкуляризации и плохой механической.
Bioprinting была расширена, чтобы трех измерениях путем использования нетоксичных биологически, термообратимый гелей для преодоления недостатков обычных. Некоторые из твердой свободной формы изготовления тechniques настоящее время используемые в лазерной помощь bioprinting и струйной печати. Лазерные методы помощь bioprinting использовать импульсный лазерный источник, а мишень, и приемное субстрат для создания трехмерной. Однако этот метод ограничен из-за низкой пропускной способности, низкой жизнеспособности клеток, и может производить только ограниченные меры по созданных структур, так как только photocrosslinkable форполимеры могут быть использованы для образования сшитого гидрогеля. Струйная печать была разработана в качестве методологии бесконтактного который воспроизводит цифровые данные изображения на подложке путем нанесения пиколитр чернила. Тем не менее, струйная печать не производит с высокой разрешающей способностью конструкции, создает опыт быстрого денатурации белка, и многие из клетки лизируют при осаждении.
В настоящее время новые методы производства добавки bioprinting были разработаны. В этих системах клеток, белки, факторы роста и биомиметические гидрогели, как правило, интегрированы в матрицу оболочкиМОГВ в процессе изготовления и одновременно на хранение использовании приводов с компьютерным управлением для создания трехмерных эшафот основе клеточных нагруженные конструкции, которые тесно имитирующие микроархитектуру родной. Гидрогели клеток нагруженные составляют bioink, который может быть гетерогенным, состоящая из нескольких типов клеток, или однородным. Добавка производственные системы хранения bioink капельный или слой за слоем через одноразовые шприцы и советы на стадии компьютерным управлением, способный двигаться в направлениях X, Y, и Z. Через программное обеспечение, архитектура печатных лесов можно легко манипулировать в зависимости от требований приложения. В отличие от обычных методов, трехмерные медицинские технологии (магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии) могут быть включены в конструкции, создавая конкретного пациента конструкцию. Эти методы позволяют также возможность получения васкуляризированных замены, потому что конструкции изготавливаются с высокой лOCAL плотность клеток, что позволяет межклеточных взаимодействий и повышения вероятности после имплантации SURVIVA.
Принтер Palmetto обычай построен трехмерная система мульти-распределитель, который использует программируемые роботов производственные методы для генерации трехмерных конструкций разнородных тканей (рисунок 1). Это позволяет использовать множество материалов в уникальных комбинаций для получения гетерогенных структур. Инициализация bioprinter является одним из самых важных шагов в bioprinting, потому что это позволяет вам установить различные параметры для оптимизации печатные из bioprinted конструкций.
Bioprinter включает процесс периодического типа с запуска, эксплуатации и остановки последовательностей, управляемых программируемым логическим контроллером (PLC), который пользователь работает через интерактивной панели управления с сенсорным экраном (рис 1, а). Для предотвращения загрязнения биологические материалы bioprinter заключена в положительно давление поли (метилметакрилата) (ПММА) камера с частицами задерживаемость высокоэффективной (НЕРА) -filtered систему циркуляции воздуха (фиг.1, В, С). Интерьер принтера можно стерилизовать с помощью встроенных в источники ультрафиолетового излучения (рис 1, D). Центральный компонент bioprinter является полностью программируемым позиционирования робота, который может воспроизводимо разместить наконечник дозатора с точностью до 10 мкм (рис 1, е). Есть три диспенсеры, которые способны внести, объем до 230 NL с использованием винтовых (рис 1, F). Они программируются независимо с помощью отдельных компьютеров, которые управляют параметры печати для каждого дозатора (рисунок 1, G). Роторно-винтовые дозирования использует вращение винта с приводом от двигателя, чтобы переместить вниз bioink шприца и из наконечника шприца. Эти дозаторы смонтированы на пневматическиеLY контролируется Гнездо инструмент (2А, Б), что позволяет роботу переключаться дозатор, установленный на оси Z. манипулятора под программным управлением (рис 1, H).
Ской робот получает инструкции по печати с компьютера под управлением разработки программного обеспечения (Рисунок 1, я). Каждая программа содержит дозирующих местоположения калибровки процедуры, и дозатор с изменением протоколов. Конструкция генерируемых конструкций, прежде всего, состоит из XYZ координат, где каждый распылитель будет вносить материал. Bioprinter включает два оптических датчиков света (рис 2С), которые определяют XYZ координаты конца наконечника шприца. Эти датчики отправить информацию о координатах для робота, который использует их для расчета позиции концах распределитель наконечник. Существует дополнительный лазер смещение (рис 2D), что проецирует 633 нм диодный красный лазерный луч размера пятна 30 х 100 мкм для измерения расстояния с AccuraCY 0,1 микрометров. Когда луч очень сосредоточена робот определяет Z расстояние поверхности печати. Это измерение, и оптический датчики света измерение верхнего конца в Z, позволяет рассчитывать точную Z координат используется для размещения кончика дозатора по отношению к поверхности печати. Советы диспенсер двигаться в сторону и вертикально через ось Х ориентированных оптического датчика света, чтобы найти Y и Z центры, и в поперечном направлении с помощью датчика по оси Y. найти центр X-оси. Поверхность печати отображается с использованием формулы для плоской поверхности в пространстве хуг: Ax + от + сг = D чтобы определить, где поверхность по отношению к положению верхнего конца дозирования. Этап принтер (Рисунок 1, J) имеет образец чашки Петри до 80 мм в диаметре и использует рециркуляции воды ванны для поддержания заданной температуры (рисунок 1, K). Температура Стадия может быть установлен в диапазоне от -20 и остается стабильным в течение. Существует камера USB установленна робота-руку Z, чтобы обеспечить увеличенный вид наконечника раздаточного в процессе печати (фиг.1, L). Существует второй камерой, установленной в направлении верхней части внутренней камеры, что обеспечивает полное представление о bioprinter в процессе печати (фиг.1, L).
Компьютерный дизайн рисунок программное обеспечение определяет характер осаждения и позволяет пользователю создавать постепенно расположенных капель и сложные структуры (рисунок 3). Трехмерные пути могут быть вручную запрограммированы в принтере-совместимый дизайн программного обеспечения или импортировать из отдельного компьютера автоматизированного проектирования программного обеспечения рисования (рисунок 4, таблица 1). Программное обеспечение принтера, совместимый позволяет вариации параметров печати, таких как метод осаждения (один осаждения капель или непрерывного осаждения путь), трехмерной геометрии путей, скорости осаждения, расстояния между концом наконечника шприца и ПодстСкорость печати поверхность, то количество времени для осаждения отдельной капли, и высоты и скорости шприц поднимается между осаждением капель. Каждая программа содержит XYZ дозирующих местоположения калибровки наконечник процедуры, и дозатор с изменением протоколов, чтобы обеспечить стерильную среду, без вмешательства оператора, во время печати. Программируемый логический контроллер (ПЛК) робота получает инструкции от компьютера под управлением проектирования программного обеспечения и контролирует сроки событий от внешних контроллеров (например, диспенсеры). Чтобы сделать это, ПЛК использует циклическую механизм контроля дозаторы роботизированная устройство позиционирования, и экологические факторы.
Трехмерная bioprinting прямой записи с использованием роторно-винтовой, жидкости системы дозирования позволяет процесс осаждения клеток, чтобы быть более эффективным, точным и легче, чем предыдущие методы. Это исследование показывает, обычай построен bioprinter способен генерировать сеLL-Ладена гидрогелевые конструкции с высокой жизнеспособности клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка желатина субстратом для трехмерной Bioprinting альгината гидрогелей
- Подготовка кальция / желатиновый субстрат, следуя кальция / желатина методом подложки, описанной Патаки и др 11, чтобы избежать пониженной жизнеспособности, связанной с высоким содержанием. Способ субстрат кальций / желатин перечислены ниже.
- Смешайте хлорида кальция обезвоживают (1,5 мас%), хлорид натрия (0,9 мас%), и свиной желатин (2 мас%) в дистиллированной воде и кипятят в течение 2 мин, чтобы создать решение желатин 100 мм.
- Налейте 5 мл раствора желатина / кальция в 100 мм стандартные чашки Петри, вихревой решение вокруг, чтобы равномерного покрытия на поверхности, и место на плоской поверхности в холодильнике, чтобы гель O / N (позволяют гель по меньшей мере, 8 ч перед использованием).
- Чтобы увеличить непрозрачность поверхности подложки, добавить диоксид титана (0,3 мас%) в желатиновой / CaCl 2 раствора. Перемешивают в течение 10 мин. Autoclave желатиновых / TiO 2 решение о цикле жидкостей в течение 30 мин, чтобы стерилизовать его.
- Добавьте 3 мл желатина / TiO 2 растворе на поверхность полученного ранее желатиновых пластин. Вихревой смесь, чтобы обеспечить его равномерно по всей поверхности. Разрешить гель в 4 ° C холодильник O / N (разрешить гель, по крайней мере 8 ч перед использованием). Основание должно быть использовано в течение 3 дней.
2. Окисление альгинат
- Окислить альгинат натрия bioink следующую способе частично окисленного альгината по Bouhadir др 30, описанном ниже.
- Чтобы сделать 5% раствор окисленного альгинат, растворить 1 г альгината натрия в 100 мл дистиллированной воды. Добавить водный раствор периодата натрия (0,25 М, 0,25 ммоль), окислитель, чтобы произвести 5% раствора окисления. Перемешивают в течение 19 ч при комнатной температуре. Добавить 40 мл этиленгликоль в растворе после 24 часов, чтобы закончить Reaие.
- Растворить 2,5 г хлорида натрия в растворе. Добавить избыточного количества этиловом спирте (2: 1 отношение), чтобы осадить окисленные альгинаты. Центрифуга решение при 1000 х г для сбора выделений, и повторно растворить их в дистиллированной воде. Повторите этанола мыть.
- Мораторий не сушить окисленных окатышей и альгината хранить при температуре -20 ° С до готовности к использованию.
- Определить степень окисления путем измерения процентного содержания периодат натрия потребляется до того, прекращено этиленгликоля.
- Готовят раствор йодида калия (20% вес / объем, рН 7,0 фосфатного буфера натрия) и раствор thyodene (10% вес / объем, рН 7,0 фосфатного буфера натрия). Смешайте два решения с окисленной альгината при комнатной температуре.
- Постепенно падение реагирует альгината натрия и перйодата решение в смеси йодида калия и theodyne решений. Измеряют поглощение смеси при 426 спектрофотометрически нм. Когда он достигмаксимум, записывать использованный объем альгината натрия и раствора периодата как V 1.
- Реакция
, Количество непрореагировавшего периодата натрия 
- Вычесть количество непрореагировавшего периодата натрия с его первоначальной концентрацией, чтобы определить количество потребляемой периодат натрия. Используя предыдущий формулу, определить окончательный степень окисления альгината.
, Количество непрореагировавшего периодата натрия 
3. Альгинат пептида Сопряжение
- Сопряженные лиганды с открытой последовательности аргинин-глицин-аспартат (пептид) в предварительно подготовленную окисленного альгината, следуя РГД-альгинат метод сопряжения Роули и др 31, описанный ниже, чтобы способствовать прикрепление клеток и распространение.
- Используйте водный carbodiimide химия с G 4 RGDSPto конъюгата 31.
- Растворить 1 г 5% окисленного альгината в 0,1 М 2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) буфере, рН = 4. Добавьте 1-этил- (диметиламинопропил) карбодиимид (EDC, 0,54 ммоль) и N-гидроксисукцинимид ( NHS, 0,27 ммоль) при соотношении 2: 1 с образованием амида промежуточного продукта.
- Добавить 0,28 ммоль пептида, сцепление с основной цепью полимера альгината через концевым амином. Перемешиваться при комнатной температуре O / N.
- Остановка реакции сочетания путем добавления 2,5 г хлорида натрия в растворе. Добавить избыточного количества этиловом спирте (2: 1 отношение), чтобы осадить окисленные альгинаты. Центрифуга смеси при 4000 х г в течение 5 мин, чтобы собрать осадок. Аспирируйте СМИ в капот культуре клеток и повторно растворяют осадок в дистиллированной воде. Повторите этанола мыть.
- Мораторий высушить осадок до тех пор, пока становится полностью сушат (появится в виде белого порошка вещества) и хранения в -20 ° C холодильник на потомиспользовать.
4. жировой ткани человека Стромальные Клетки клеточной культуры (hADSC в)
- Культура жировой ткани человека стромальные клетки (hADSC в) в 75 см, обработанных клеток культуральных колбах (Т75 колбы), покрытых 15 мл низкой DMEM глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина, 1% глутамина и 1% антимицина. Изменение средств массовой информации, в капот культуре клеток, каждые два дня, пока они не достигли слияния (80-90%).
- После того, как сливной, передать T75 колбы с капот культуре клеток и приостановить hADSC, используя метод трипсина ферментом.
- В капот, аспирация все клеточной культуральной среде от клеток. Промыть 5 мл Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором с кальцием и магнием (DPBS ++). Аспирируйте DPBS ++ от клеток.
- В то время как в капот, чтобы раствор трипсина и ДЗФР ++ путем смешивания 1 мл трипсина и 4 мл DPBS ++. Каждую колбу требует 5 мл Solutион, поэтому убедитесь, соответствующий объем для числа сливающихся колбах. Добавьте 5 мл трипсина / DPBS ++ в каждую колбу и поместить их в инкубатор на 2 мин.
- Через 2 мин, удалить колбы и слегка нажмите сторонах их ослабить клетки от днища. Посмотрите на каждую колбу под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки суспендируют. Поместите фляги обратно в капот культуре клеток и добавить 3 мл соответствующей среды для культивирования клеток в каждую колбу. На этом заканчивается реакцию трипсина.
- Трансфер СМИ клеток-Ладена из каждой колбы и поставить в 50 мл конической. Центрифуга их при 1000 х г в течение 5 мин. Клетки должны выглядеть как маленький белый осадок в нижней части конической. Трансфер в капот культуре клеток и аспирации средства массовой информации. Ресуспендируют клеток в 2 мл среды для культивирования клеток.
- Граф клеток использованием гемоцитометра под микроскопом. Как только клетки были подсчитаны, в капот культуры, аликвоту количество средах, содержащих ~ 1.3 millioп клетки и трансфер в 15 мл коническую. Центрифуга коническая 15 мл, содержащую клетки снова в течение 5 мин при 1000 х г в.
- В капот культуры, повторное заполнение оставшихся клеток в нескольких Т-75 колбы, добавляя концентрацию ~ 350000 клеток в каждую колбу. Добавьте 15 мл DMEM СМИ и не вернуться в инкубатор, пока сливной снова.
- Когда цикл центрифуги завершена, возвращают 15 мл коническую к клеточной культуре. Аспирируйте носитель из клеточного осадка, а клетки вновь суспендируют в водном растворе альгината при концентрации 1,3 млн клеток на миллилитр bioink, terteriating решение часто так что однородное распределение клеток по всему bioink. Загрузите клеток-Ладена раствора в стерильной принтера, совместимый 3 мл шприц и винт на стерильной 22 G пластиковым наконечником.
5. Настройка Bioprinter
- Включите bioprinter, каждый из дозатора компьютеров, и recirculatING водяную баню.
- Вручную установить рециркуляции температуры водяной бани, чтобы для механизма гелеобразования.
- Вручную настроить параметры печати для каждого дозатора на корреляцию ценовым компьютером. Установите громкость дозирования до 230 нл, количество backsteps 0, и скорость дозирования до 10 мкл втор.
- Откройте разработки программного обеспечения и программы для просмотра дисплей камеры USB на компьютере.
- Использование программного обеспечения, вручную ввести координаты для точек массива 5 х 5 мм с 2,4 расстояния между каплями.
- Установите параметры печати, чтобы быть: расстояние между концом зонда и поверхности подложки = 0,1 мм; высота шприц поднимается между отложениями = 20 мм; количество времени на осаждении = 1 сек.
- Сохраните программу и отправить его в робота.
- Поместите желатин / TiO 2 -содержащих Петри блюдо на 4 ° С этапе принтера. Закрыть и запереть дверь камеры.
- Используйте ПЛК INItialize источники ультрафиолетового света, и стерилизовать камеру в течение 90 сек.
- После стерилизации будет завершена, откройте камеру и загрузить шприц, содержащий hADSC приостановила в альгината в Gun 1. Закройте и заблокируйте дверь камеры.
- Используйте PLC для включения вентилятора системы, подождите 30 сек для равновесия внутреннего давления.
- На компьютере, запустите программу, содержащую геометрические пути и печать параметров.
- На протяжении всего процесса печати, смотреть дисплей камеры USB на компьютере, чтобы подтвердить точное и равномерное печать.
- После завершения печати, позволяют конструкции гель в течение 40 мин.
Оценка жизнеспособности клеток 6.
- Обложка конструкции, которые не собираются быть отображены немедленно послепечатной в DMEM и магазин в инкубаторе до времени визуализации.
- Для количественной оценки жизнеспособности конструкций, окрашивают их с помощью флуоресцентной основе жизнеспособности / цитотоксичности, Ай образ с помощью конфокальной микроскопии.
- Следуя инструкциям комплект, подготовить окраски раствора, содержащего кальцеина AM и этидия гомодимер-1. Для того, чтобы 10 мл окрашивающего раствора, добавить 20 мкл этидий гомодимера-1 и 5 мкл кальцеина утра до 10 мл стерильной культуры тканей-Grade Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (+ магния + кальция; DPBS ++).
- Погружают bioprinted конструкции в пятне раствора в течение 15 мин в темноте.
- Изображение окрашенные конструкции с использованием конфокального микроскопа систему в дни 0 и 8. Возьмем несколько изображений каждого bioprinted конструкции, используя параметры Z-Стек 30 оптических срезов на глубину 300 мкм, и вручную рассчитывать клетки. Если клетки появляются желтые или зеленые считать их живыми, и если красный, рассчитывать им, как мертвый.
- Рассчитывают процент жизнеспособности клеток, как количество живых клеток, деленное на общее число клеток в конструкции; Жизнеспособность клеток = количествоЖивые клетки (зеленый + желтый) / общее количество клеток (зеленый + желтый + красный) х 100%.
- Рассчитать количество клеточной пролиферации для каждого образца, как число клеток день 8, разделенной на число клеток в день 0; Клеточной пролиферации = живой подсчет клеток на день 8 / живой клетке рассчитывать на день 0 х 100%.
7. РГД пептида Сопряжение Анализ
- Для анализа успеха RGD пептида сопряжения на альгината, сравнить РГД-сопряженную альгинат и несопряженный альгинат. Чтобы сделать это, изображение печатные конструкции, используя (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) (DAPI) и фаллоидином пятна.
- Сделайте phalloidins рабочего раствора путем разбавления 5 мкл метанольного раствора с 200 мкл DPBS ++. Хранить при -20 ° С до использования.
- Выполнить 300 мкм маточного раствора красителя DAPI следующую уравнением: (0,10509 г / л) / (350,3 г / моль) = 3 × 10 -4 М = 0,0003 М = 0,300 мм = 300 мкм. Сделайте йе DAPI рабочего раствора путем разбавления исходного раствора 1: 100 в DPBS ++, чтобы получить раствор 3 мкм. Хранить при -20 ° С до использования.
- Полностью погрузите образец в 4% параформальдегида. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте три раза DPBS ++, позволяя решение сидеть в течение 5 мин каждого мытья. Передача образца геля из скважины на предметное стекло, щелкая геля на в процессе. Опустить гель в 0,1% Triton X-100 (0,1 г / 100 мл) в DPBS ++ в течение 10 мин. Вымойте три раза DPBS ++, что позволяет за 5 минут для каждого мытья.
- Пятно печатные конструкции с фаллоидином погружением их в рабочем растворе. Накрыть фольгой и инкубировать в течение 4 часов. Снимите фаллоидином пятно и промыть три раза DPBS ++. Первое мытье должно быть быстрым, последний моет должен сидеть в течение 5 минут каждый.
- Пятно печатные конструкции с DAPI погружением их в раствор DAPI рабочего. Накрыть фольгой и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Мытьтри раза DPBS ++, позволяющие каждому мытье сидеть в течение 5 мин. Наблюдайте и изображения образцов на конфокальной системы микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты демонстрируют bioprinter способен хранение клеток-Ладена гидрогелей в конкретных трехмерных местоположений точно и последовательно, используя компьютерное программное обеспечение. Эти программные определить размещение каждой капли и контролировать многие параметры для дозирования (рис 3,4). Повторяемость в bioprinter надлежащим депозит биоматериалов является основополагающим для успеха в тканевой инженерии.
Жизнеспособность клеток, одна из требований успешного техники bioprinting, анализировали через 1 час и 8 дней после печати. Высокое жизнеспособность клеток является существенным для изготовления конструкции и схожим с биологическими является прямым представлением адекватной bioink. РГД пептид сопряжения улучшает жизнеспособность клеток в течение длительных периодов времени путем содействия ячейку распространения. Флуоресцентная микроскопия была использована для количественного жизнеспособности клеток в конструкциях после процесса печати. Альгинат bioink с Концвания 15% и окисления 5% имели день 0 жизнеспособность 98%, 4-й день 96%, и на 8 день 95% (рис 5). Эти результаты показывают, техника осаждения bioprinter прямой записи выдавливает клетки достаточно мягко, чтобы произвести конструкции, которые остаются жизнеспособными в течение и после процесса печати (рис 1, 2). Высокая жизнеспособность клеток показывает 5% к окислению и 15% концентрации альгината bioink был подходящим средством для осаждения клеток и при условии адекватной среды для клеток-выживания. Подобные количества клеток в каждой из областей, показали однородное распределение клеток в альгината bioink, фундаментальным аспектом разрешение печати.
Большинство тканей имеют сложные комбинации и градиенты внеклеточного матрикса компонентов, каждый с конкретными биологическими и механических воздействий. Биоматериала должно быть биомиметических родной среды и содействия клеточных функций. Высокое пористость альгината помост позволяетКлетки для связи и сети друг с другом, а также может облегчить поток питательных веществ и метаболитов между каркасом и окружающей его среды. Клеточная адгезия к внеклеточной матрицы является предварительный этап формирования ткани, что происходит, прежде чем клеточной пролиферации и организации внеклеточного матрикса в молекул функциональной ткани. Пролиферации клеток играет важную роль в заживлении ран и тканей роста, и, следовательно, является очень важным фактором при анализе bioprinted конструкции для тканевой инженерии. Альгинат усиливается привязанность клеток РГД-сопряженных в печатных конструкций, что приводит к улучшению распространения клеток и пролиферации. Распространение клеток в печатных лесов количественно путем подсчета три отдельных областей в дни 0 и 8 (рисунок 6). Распространение в целом клеток было установлено, что 219.674% после 8 дней культивирования. Эти результаты означают, подмости имеет достаточную биосовместимость, чтобы быть использованаса синтетический внеклеточный матрикс для доставки клеток для восстановления поврежденных или нефункциональных ткани.
Для анализа успеха RGD пептида сопряжения на альгината bioink, эксперимент сравнение проводили с использованием клеток-Ладена, РГД-сопряженную концентрации 15%, 5% окисления альгинат bioink и клетка-Ладена, несопряженный концентрации 15%, 5% окисление альгинат bioink. DAPI окрашивание ядер и фаллоидином окрашивания актина были использованы для анализа ячейку распространения в печатных конструкций на 8 день изображений каждого образца (по крайней мере, три случайные картинки на образец), принимавшие помощью конфокальной микроскопии системы с помощью параметров Z-стек 30 оптические срезы на глубину 300 (Рисунок 7). Ячейка растекания показано на образце с RGD-конъюгированные альгината доказывает успешного включения пептида на альгината. Миграция клеток является важным шагом в развитии тканей; Поэтому сопряжение RGD пептидов на альгината улучшает Лиkelihood применения в естественных условиях, используя эту bioink.
Рисунок 1. Palmetto печати. Программируемый логический контроллер координирует действия всех функций принтера (A). Герметичном сдерживания камера (В) с фильтрованной приема (C) и выхлопных газов (С) поддерживает внутренний регулируемый положительное давление, чтобы уменьшить вероятность загрязнения. Двойные УФ-света (D), установленных в камере потолка может быть запрограммирован для работы в безопасных интервалах. Janome 2300N XYZ робот (Е) запрограммирован и управляется встроенным компьютером (I). Три диспенсер контроллеров (G) запрограммированы, чтобы регулировать выход диспенсер пушек (F), доступных для загрузки на робота оси Z. рычага (H) под управлением компьютера. Температура держателя образца робота (J) находится между 4 и 40 ° С с помощью контроллера водяной бане (K). Двойные цифровые камеры (L) имеются т О контролировать деятельность принтера и образование образец. Одна камера установлена на робота Z-оси рычага и обеспечивает увеличенное изображение раздаточного наконечника заряженным пистолетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Инструмент Гнездо, оптические датчики, и смещение Лазерное Bioprinter. А. выгружаются вид инструмент гнездо с фронта. Б. Загружено вид инструмент гнездо с фронта. С.-оптические датчики измерения конец наконечника дозирования в трехмерном пространстве. Д. Расстояние лазерные измерительные координата Z. поверхности печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Визуальный PathBuilder программного обеспечения. Изображение компьютерного автоматизированного проектирования рисунок программного обеспечения, используемого для проектирования внешнего архитектуру bioprinted конструкций. Эта программа предоставляет возможность генерировать постепенно расположенных капель и сложной геометрией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. JR-С Точки программного обеспечения. Скриншот принтера, совместимый разработки программного обеспечения. Эта программа позволяет пользователю контролировать метод осаждения (т.е., один осаждения капли или непрерывный осаждения путь), скорость осаждения, расстояние между конце наконечника шприца и печати су bstrate поверхность, за отведенное время для нанесения каждой капли, и трехмерной размещения капель (см таблицу 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. флуоресцентное изображение Витраж hADSCs после печать. Жизнеспособность клеток / цитотоксичности флуоресцентные изображения hADSC годов в bioprinted конструкции, выполненного с использованием конфокальной системы микроскопа (параметры Z-стек 30 оптических срезов на глубину) после 0 (а) и 8 ( B) дней. HADSC были помечены пост-печати с использованием клеток млекопитающих жизнеспособность / цитотоксичности. Живые клетки окрашивали зеленым, а мертвые клетки окрашиваются красным.3156fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
6. Количественные Viabilities из Bioprinted конструкций. Количество живых и мертвых клеток измеряют, используя жизнеспособности / цитотоксичности. Живые / мертвые количество клеток для день 0 показаны на (А), и рассчитывает на 8-й день в (б). Количество живых клеток, подсчитанных для каждой области в дни 0 и 8 показаны в (С) и были использованы для количественной оценки пролиферации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 7. Сравнение Cell-Ладена, Nна конъюгированного с и RGD-конъюгированные альгинаты. флуоресцентных изображений bioprinted hADSC х в неконъюгированной (A), так и в RGD-конъюгированного (B) 15% -ной концентрации 5% окисления альгинат bioink сделан с использованием конфокальной системы микроскопа (параметры Z-Стек 30 оптических ломтиками над глубиной). HADSC были окрашены фаллоидином и DAPI пятна проанализировать ячейку распространения в каждой из конструкций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Таблица команд | |
| Команда | Робот Ответ |
| PTP от точки | Роботизированная рука движется к указанной posiiton в X, Y, Z пространство |
| Find_Base_Z | Использует SICK лазер для измерения тОн печати поверхность подложки; Расстояние между концом наконечника шприца и поверхности подложки вручную. |
| Работа Adj. Нет. (Работа Регулировка номер) | Команды роботу использовать SICK лазер (для определения поверхности подложки), пистолет, пистолет 1 2 3 или пистолет. |
| Get_1 | Команды робот OT извлечения и загрузки пистолет 1 |
| Find_Tip1_YZ | Робот находит конец наконечника пистолета-распылителя 1 в Y и Z направлениях |
| Find_Tip1_X | Робот находит конец наконечника пистолета-распылителя 1 в направлении X |
| Точка Внесите | Робот обойтись одной капли bioink в определенном X, Y, Z положение |
| Гидравлическая Количество (Pallte номер) | Включает вручную закодированный дизайн для печати, например, массив. |
| Внесите Время | Это время, отведенное для нанесения каждого падения. </ TD> |
| Store_1 | Команды роботу вернуться Gun 1 к toolnest, и вернуться в исходное положение: (0,0,0). |
Таблица 1. Программируемые Компьютерные программные команды. Эта диаграмма описывает программируемые команды программное обеспечение, которые используются для управления роботом-манипулятором и оптимизировать параметры пригодности для печати.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основное внимание в тканевой инженерии является преодоление разрыва между нехваткой органов и потребностей трансплантации, развивая биологические заменители, способные восстановления, поддержания или улучшения родной ткани ФУНКЦИИ. Это привело к прямому изготовления каркасов с комплексом, анатомически правильную внешнюю геометрии, и точный контроль над внутренней геометр. Трехмерная bioprinting методология используется для генерации трехмерных конструкций различных размеров и форм с помощью цифровой модели с использованием слой за слоем approac. Изготовление трехмерных конструкций биомиметических играет важную роль в продвижении тканевой инженерии.
Есть критические аспекты процесса проектирования, которые влияют биомиметические ФУНКЦИИ генерируемого построить в. Возможность контролировать температуру биоматериала и подложки имеет важное значение для гелеобразования механизма гидрогелей и поддержание их мненическое свойства, поэтому, влияющие на распределение клеток, пролиферации и дифференциации внутри гидрогеля. Органы состоят из многих типах клеток, таким образом, несколько дозаторы являются критическими для получения разнородных тканей, как структуры. Компьютер автоматизированного проектирования внешнего архитектуры позволяет производить пользовательских заменителей тканей для различных ран или тканей. Это очень важно для развития замен конкретного пациента. Внутренняя архитектура в равной степени важно, потому что это влияет на межклеточные связи внутри структуры, помещая соответствующие клетки в тесном контакте друг с другом и дают им возможность сформировать в естественных -подобных межклеточных соединений. Точное размещение клеток определяет, как клетки общаются и сетевой друг с другом с образованием сосудистых сетей и имитировать их биологическую активность в нативных тканях. Трехмерная bioprinting обеспечивает однородно распределенных клеток в bioink, а также превосходную точность пространственной р оlacement клеток. Созданные леса также высоких плотностей местных ячеек, которая необходима для дифференцировки клеток и выработки внеклеточного матрикса.
Представленные здесь является 3D робот bioprinter, что надежно и стабильно дозирует однородных капель отдельных клеток или клеток, смешанных с биомиметического гидрогеля. Похожие bioprinters использовали технологию предварительного синтеза. В соответствии с дифференциальной адгезии гипотезы, отдельные клетки при размещении в формы или аналогичного устройства, сольются и организовать на основе концентрации и распределения молекул адгезии на клеточной Surfac. Эти устройства создают заранее слиты стержни или другие геометрические формы, которые затем загружают в дозатор и помещают в непосредственной близости от других предварительно конденсированные или готовых стержней, которые затем сливаются в большей геометрической фор. Конечные геометрии ограничены тем, что могут быть построены из этих готовых лиц. Bioprinter здесь реализована включает уникальную температурыконтролируемую среду, в которой клетки и клеточные-гидрогель смеси не ограничены необходимостью предварительного синтеза. В этих условиях, то bioprinter является не только зависит от дифференциального адгезии гипотезы. Включение гидрогеля материалов могут помочь распределение клеток и позволяют клеткам сливаться, или нет, в зависимости от желаемых свойств для конкретного эксперимента. Выбор биомиметических гидрогелей для инкапсуляции клеток-также имеет глубокое влияние на фенотип клеток. Материалы, как известно, оказывают влияние на прикрепление клеток, а также клеток и размера morpholog. Реологические характеристики, такие как вязкость, гидрогелей диктовать их влияние на клеточном microenvironmen. Родной альгинат инертен и не легко взаимодействовать с клетками, участвующими в контроле фенотипа. Тем не менее, с помощью альгинаты, которые химически модифицированные с помощью пептидной сопряжения окисления и, в результате конструкции отобразить управляемые разложению и увеличение ячейкипривязанность, миграция и proliferatio. Изменение физико-химических свойств биоматериала могут влиять ткани РАЗВИТИЕ.
Трехмерная bioprinting использованием струйной дозирующей, прямой записи Машина ограничена степенью разрешения печатных конструкций, наличие гидрогелевых материалов, начальной клеточной смерти после печати, а также возможность vascularize в биомиметические. Важной особенностью в bioprinting является его разрешение. Каждый метод печати определяется размером нижней технический предел мельчайших деталей достижимых. Существует динамичная связь между минимальный размер и достижимый масштаб печатной конструкции: чем выше разрешение мельчайших деталей, тем меньше максимальная конструкция. Bioprinter способен хранение, объем до 230 NL в строго определенных и организованных шаблонов, давая ему высокое разрешение, чем аналогичные машины. Гидрогели были широко используется в bioprinting из-за ихгидрофильность, биосовместимость, структурное сходство с внеклеточным матриксом, и простота modificatio. Высокое содержание воды гидрогели улучшает их биосовместимость, но значительно снижает их механическую прочность и. Существует нехватка оптимальных гидрогели с соответствующими механическими свойствами для подачи жидкости во время биодобавка-производственного экструзии. Таким образом, существует большая потребность в разработке гидрогели, которые иммунологически инертным, имеющие cytocompatible механизмы гелеобразования, которые могут быть успешно экструдируют с использованием подачи жидкости, а также производят клетки нагруженные матрицу с оптимального диапазона механических. Перед процессом печати, клетка-Ладена гидрогель bioink должны храниться в шприцах для количества времени, ущерба клетки. В процессе печати, напряжение сдвига индуцированных клеток на процессе экструзии также может быть вредной для их. Bioprinter способен производить весьма жизнеспособные (> 90%) конструкций, поэтому преодоление вопрос Initial гибель клеток. Васкуляризация играет важную роль в передаче, поддерживая, или сохранение биомиметические функцию bioprinted. Диффузия кислорода м; Поэтому в больших bioprinted строит гипоксия является. Традиционные методы не способны производить конструкции со встроенным сосудистой, значительно ограничивая размер производимых строительных лесов. Оценка жизнеспособности клеток в bioprinter показали значительное пролиферацию клеток в печатных конструкций более 8 дней. Таким образом, методика доказала свою способность генерировать подмости, которые позволяют рост клеток, связи и формирование сетей, требования васкуляризации.
Bioprinter обеспечивает возможность использования различных материалов, чтобы быстро вносить клеточные нагруженные гидрогели в конкретных шаблонов. Хотя этот метод производит неоднородные конструкции с перестраиваемой свойствами, он не способен одновременного осаждения и реактивной смешивания. Для некоторых биоматериалов, это отложение встретилсяХод повысит механизм гелеобразования и сократить время на эшафот костюмно. Добавление нескольких шприца дозатора в может позволить более широкий спектр биоматериалов для техники biofabrication. Исследование активности клеток в bioprinted конструкций в течение более длительного периода времени обеспечит дополнительную информацию о характеристиках гидрогелевых, формирование сети клеток и васкуляризации конструкций.
Способ осаждения В bioprinter в описано может включать робота позиционируют и вождение три дозаторы для нанесения множества биологических материалов поверх осажденных материалов, ранее по заданной схеме. Этот шаг может быть повторен с использованием шаблонов возрастанию до трехмерный орган или ткань не производится. Таким образом, принтер Палметто подходит для дозирования надежно клеток нагруженные гидрогели, чтобы создать трехмерную конструкцию, которая способна удерживать сосудистую и высокую жизнеспособность клеток, и можетиспользовать в тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана государственной поддержки при грант № САЭ-0903795 награжденных Национального научного фонда, NIH NIDCR R01-DE019355 (мЯн PI), и Грант 8P20 GM103444 (Ю.М. PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al.
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F.
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
