Introduction
Tissue engineering bruker prinsippene om biologi og engineering i utviklingen av funksjonelle substitutter for å opprettholde, gjenopprette eller forbedre innfødte vev og. Evnen til å generere tre-dimensjonale biomimetic konstruksjoner ved behov vil lette vitenskapelige og tekniske fremskritt i regenerering av vev, så vel som i cellebaserte sensorer, medikament / toksisitet screening, vev eller tumormodeller, og andre. Den tredimensjonale organisering av vev-konstruert konstruksjoner er en grunnleggende del av fremstillingsmetoden, fordi det må nøye etterligner høyt organisert interaksjonen mellom celler og ekstracellulær matriks i det opprinnelige vev.
Biologisk nedbrytbare og formdannende tredimensjonale stillasene er kritiske faktorer i å generere nye vev-konstruksjoner fordi cellene migrerer for å danne et to-dimensjonalt lag av celler, men mangler evnen til å vokse i begunstiget tredimensjonalt. Stillaset tjener som et midlertidig fundament for cellevedlegg og spredning, så det må være konstruert av materialer med kontrollerbar porøsitet og nedbrytbarhet, og tilstrekkelig mekanisk integrit. Stillaset materialer bør ikke være cytotoksisk eller opprette en negativ respons fra verten. Hydrogeler har vært i vanlig bruk i tissue ingeniørteknikk, og på grunn av sin hydrofilisitet, hydrogeler tillate fluid og gassutveksling gjennom Strukturering. Ved å kombinere ulike hydrogelene, den syntetiserte hydrogel eiendommer er modifiserbare å møte distinkt søknad kravet.
Den konvensjonelle tissue engineering tilnærming innebærer etableringen av acellulære porøse offer stillaser som er seeded med celler post-fabricatio. Mange teknikker er blitt benyttet, slik som fiber-binding, løsningsmiddelstøping, og smeltestøping, men viste seg å være minimalt vellykket for tissue tekniske anvendelser. Fiber bindemetoder gjør at fibrene til å bli innrettet i bestemte former, men de er bare i stand til producing veldig tynn stillaset. Løsemiddelstøpemetoder produsert svært porøse konstruksjoner, men den største produsert membranen var bare 3 mm thic. Derfor skaper tredimensjonale konstruksjoner er ikke mulig ved hjelp av disse teknikkene. Melt støpeteknikker vist seg å være vellykket i fremstilling av tredimensjonale stillasene, men slike høye temperaturer er nødvendig at biologisk materiale ikke kan bli inkorporert i løpet av produksjons forarbeide. Stillaser seeded post-fabrikasjon er begrenset i sin evne til å oppfylle kravene i tissue engineering til å produsere tredimensjonale stillasene med forhåndsdefinerte eller kontrollerbare mikrostrukturer og. Et annet stort problem med solid stillas seeding teknologier er mangel på vaskularisering og dårlig mekanisk.
Bioprinting har siden blitt utvidet til tre dimensjoner, ved bruk av ikke-toksiske, biologisk nedbrytbare, termo-reversible geler for å overvinne ulempene ved konvensjonelle. Et par av de faste freeform fabrikasjon techniques tiden blir benyttet er laser-assistert bioprinting og blekkutskrifter. Laser-assistert bioprinting teknikkene benyttes en pulset laserkilde, en måleplate, og en mottakende substrat for å generere tre-dimensjonale. Imidlertid er denne teknikken er begrenset på grunn av lav gjennomstrømning, lav celleviabilitet, og kan bare fremstille begrensede anordninger av prefabrikkerte konstruksjoner fordi kun photocrosslinkable prepolymerer kan anvendes for å danne en tverrbundet hydrogel. Blekkutskrifter ble utviklet som et ikke-kontakt metodikk som reproduserer digitale bildedata på et substrat ved å deponere pikoliter blekk. Imidlertid blekk utskrift ikke gir en høy oppløsning konstruksjon, konstruerer erfaring hurtig proteindenaturering, og mange av cellene lyseres under avsetningen.
Foreløpig har nye additiv produksjon bioprinting metoder blitt utviklet. I disse systemene celler, proteiner, vekstfaktorer og biomimetic hydrogeler er vanligvis integrert inn i matrisen materials under fabrikasjon prosessen og samtidig avsatt ved hjelp av datastyrte aktuatorer til å generere tredimensjonale stillabaserte celle-laden konstruksjoner som tett etterligner mikroarkitektur av innfødte. Celle-laden hydrogeler utgjør bioink, som kan være heterogene, som består av flere celletyper, eller homogent. Additiv produksjonssystemer innskudd bioink drop-by-slipp eller lag-på-lag via engangssprøyter og tips på en datastyrt scenen i stand til å bevege seg i x-, y- og z-retningene. Gjennom dataprogramvare, kan arkitekturen av trykte stillas lett manipuleres avhengig kravene i søknaden. I motsetning til konvensjonelle teknikker, kan tre-dimensjonale medisinsk teknologi (Magnetic Resonance Imaging, CT) innarbeides i de motiver generering pasient-spesifikke konstruksjon. Disse fremgangsmåter tillater også muligheten for å produsere vaskulariserte erstatninger fordi konstruksjoner blir produsert med et høyere local celletetthet, slik at celle-celle interaksjoner og forbedre sannsynligheten for etter implantasjon surviva.
Palmetto Printer er en tilpasset bygget tredimensjonale multi-dispenser system som bruker programmerbare robot produksjonsmetoder for å generere tredimensjonale heterogene vev konstruksjoner (figur 1). Det tillater bruk av en flerhet av materialer i unike kombinasjoner for å fremstille heterogene strukturer. Initialisering av bioprinter er en av de viktigste trinnene i bioprinting fordi det tillater deg å stille en rekke parametere for å optimalisere trykkbarheten av bioprinted konstruksjoner.
Den bioprinter består av en batch typen prosess med oppstart, drift og avslutning sekvenser som kontrolleres av en programmerbar logisk styring (PLS), der brukeren opererer gjennom en interaktiv berøringsskjerm kontrollpanel (figur 1, A). For å hindre forurensning av biologiske materialer bioprinter er innelukket i et positivt presset poly (metylmetakrylat) (PMMA) kammer med en høy effektivitet partikkel arrestance (HEPA) -filtrerte luftsirkulasjonssystem (figur 1, B, C). Interiøret i skriveren kan steriliseres ved hjelp av de innebygde ultrafiolette lyskilder (figur 1, D). Den sentrale komponenten i bioprinter er en fullt programmerbar posisjonering robot som kan reproduserbart plassere en dispenser spissen med en nøyaktighet på 10 mikrometer (Figur 1, E). Det er tre dispensere, som er i stand til å sette volumene så små som 230 nl ved hjelp av en skrue (Figur 1, F). De er uavhengig programmerbare bruke separate datamaskiner som styrer trykkparametrene for hver dispenser (figur 1, G). Roterende skrue dispense benytter rotasjon av en motordrevet skrue for å bevege bioink ned en sprøyte og ut av sprøytespissen. Disse dispensere er montert på en pneumatically kontrollert Tool Nest (figur 2A, B), slik at roboten for å slå dispenseren montert på Z-aksen robotarm i henhold til programmert kontroll (figur 1, H).
XYZ robot mottar utskriftsinstruksjoner fra en datamaskin som kjører design software (figur 1, I). Hvert program inneholder dispenserer steder, kalibreringsrutiner, og dispenser skiftende protokoller. Utformingen av genererte konstruksjoner består i hovedsak av XYZ koordinater, hvor hver dispenser vil avsette materiale. Den bioprinter består av to optiske lyssensorer (Figur 2C) som bestemmer XYZ koordinater av spissen sprøyte slutt. Disse sensorene sender koordinat informasjon til roboten, som bruker disse til å beregne posisjonene av dispenserspissen ender. Det er en ekstra forskyvning laser (figur 2D) som projiserer en 633 nm diode rød laserstråle fra spot størrelse 30 x 100 mikrometer for å måle avstanden med en Accuracy på 0,1 mikrometer. Når strålen er sterkt fokusert roboten bestemmer Z avstand på trykkeflaten. Denne målingen, og den optiske lyssensorer måling av spissenden i Z, muliggjør nøyaktig beregning av Z-koordinater som brukes til å plassere dispenserspissen i forhold til trykkeflaten. Den dispenserspisser bevege seg sideveis og vertikalt gjennom X-aksen orientert optisk sensor for å finne de Y- og Z-sentre, og sideveis gjennom en Y-akse-sensor for å finne midten av X-aksen. Den trykkende overflate avbildes ved hjelp av formelen for et flatt plan i xyz plass: ax + by + cz = d for å bestemme hvor overflaten er i forhold til posisjonen til dispenseringsspissen ende. Skriveren trinn (figur 1, J) innehar en prøve petriskål opp til 80 mm i diameter og bruker et resirkulerende vannbad for å opprettholde den innstilte temperatur (figur 1, K). Stage temperaturen kan stilles innenfor et område på -20 og forblir stabil innenfor. Det er et USB-kamera montertpå robot Z-arm for å gi et forstørret bilde av dispenseringsspissen under trykkeprosessen (figur 1, L). Det er et annet kamera montert mot toppen av kammeret interiør som gir en fullstendig oversikt over bioprinter under trykkeprosessen (figur 1, L).
En dataassistert konstruksjon tegning programvare bestemmer deponering mønster og tillater brukeren å generere trinnvis fordelte dråper og komplekse strukturer (figur 3). Tredimensjonale trasé kan manuelt kodet inn i skriveren-kompatibel design software eller importert fra en egen dataassistert konstruksjon tegning programvare (figur 4, tabell 1). Skriveren-kompatibel programvare lar varianter av utskrift parametere som avsetning metode (enkel dråpe deponering eller kontinuerlig sti deponering), tredimensjonal geometri trasé, avsetningshastighet, avstand mellom spissen sprøyte enden og substsats trykkende overflate, hvor lang tid for å avsette en enkelt måling, og høyde og fart sprøyten løftes mellom avsetningen av dråpene. Hvert program inneholder XYZ dispenserer steder, rutiner tips kalibrering og dispenser skiftende protokoller for å gi et sterilt miljø, uten operatør intervensjon, under utskrift. Programmerbar logisk styring (PLS) av roboten mottar instruksjoner fra datamaskinen kjører design software og kontroll over tidspunktet for hendelser fra de eksterne kontrollere (f.eks dispensere). For å gjøre dette, bruker PLC en looping mekanisme for å kontrollere dispensere , robot posisjonering enhet, og miljøfaktorer.
Tredimensjonal direkte-skrive bioprinting benytte en roterende skrue, væskedoseringssystem tillater utbetalingen av celler for å være mer effektiv, nøyaktig og enklere enn tidligere metoder. Denne studien viser at tilpasset bygget bioprinter er i stand til å generere cell-laden hydrogel konstruksjoner med høy celle levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Gelatin holdig substrat for tredimensjonal Bioprinting alginat Hydrogeler
- Klargjør kalsium / gelatin substrat ved å følge kalsium / gelatin-substrat-metoden beskrevet av Pataky et al 11 for å unngå redusert levedyktighet forbundet med høyt innhold. Kalsium / gelatin underlaget metoden er listet opp nedenfor.
- Kombiner kalsiumklorid dehydrate (1,5 vekt-%), natriumklorid (0,9 vekt%), og porcint gelatin (2 vekt%) i destillert vann og koke i 2 min for å lage en 100 mM gelatinoppløsning.
- Hell 5 ml av gelatin / kalsium løsning i 100 mm standard petriskåler, virvle løsningen rundt for å gjøre en enda belegg på overflaten, og legg det på et flatt underlag i kjøleskapet til gel O / N (tillate å gel minst 8 time før bruk).
- For å øke tettheten av underlaget overflaten, legge titandioksid (0,3 vekt%) til gelatin / CaCI2 løsning. Omrør i 10 min. Autoclave gelatinen / TiO2 løsning på væsker syklus i 30 min å sterilisere den.
- Tilsett 3 ml av gelatin / TiO 2-løsning til overflaten av det tidligere fremstilte gelatinplater. Virvle blandingen å sikre at det er spredt jevnt over overflaten. Tillat å gel i 4 ° C kjøleskap O / N (la til gel på minst 8 timer før bruk). Underlaget må brukes i løpet av 3 dager.
2. Alginat Oksidasjon
- Oksydere natriumalginat bioink å følge metoden for delvis oksidert alginat ved Bouhadir et al 30 beskrevet nedenfor.
- For å gjøre en 5% oksydert alginatoppløsning, oppløse 1 g natriumalginat i 100 ml destillert vann. Legg til en vandig løsning av natriumperjodat (0,25 M, 0,25 mmol), oksidasjonsmidlet, for å frembringe en 5% løsning oksydasjon. Omrør i 19 timer ved RT. Legg 40 ml etylenglykol til løsningen etter 24 timer for å avslutte reaDette skjer.
- Oppløs 2,5 g natriumklorid i oppløsningen. Legg til en overskuddsmengde av etanol (2: 1) for å utfelle de oksyderte alginater. Sentrifuger oppløsningen ved 1000 x g for å samle bunnfallet og gjen oppløse dem i destillert vann. Gjenta etanol vask.
- Fryse-tørke de oksiderte alginat pellets og butikken ved -20 ° C til den er klar til bruk.
- Bestemme graden av oksydasjon ved å måle prosentandelen av natriumperjodat forbrukes før den avsluttes av etylenglykol.
- Tilbered en kaliumjodid-løsning (20% vekt / volum, pH 7,0 natriumfosfatbuffer) og en thyodene løsning (10% vekt / volum, pH 7,0 natriumfosfatbuffer). Bland de to løsningene med oksidert alginat ved RT.
- Gradvis slippe reagert alginat og natriumperiodat løsning i en blanding av kaliumjodid og theodyne løsninger. Mål absorbansen av blandingen spektrofotometrisk ved 426 nm. Når den har nådd enmaksimum, registrere brukte volumet av alginat og natriumperjodat løsning som V 1.
- Reaksjonen er
. Mengden av ureagert natriumperjodat er 
- Trekk fra mengden av ureagert natriumperjodat fra den opprinnelige konsentrasjon for å bestemme mengden av natrium-perjodat forbrukes. Bruke den tidligere formel, bestemme den endelige oksidasjonsgrad av alginat.
. Mengden av ureagert natriumperjodat er 
3. Alginat Peptide Bøyning
- Konjugerte ligander med en eksponert arginin-glysin-aspartat-sekvensen (peptid) inn i den tidligere fremstilte oksyderte alginat ved å følge den RGD-Alginat konjugeringsmetoden av Rowley et al 31 som er beskrevet nedenfor for å fremme celleadhesjon og spredning.
- Bruk vandig carbodiimide kjemi med G 4 RGDSPto konjugat 31.
- Oppløs 1 g av 5% alginat oksydert i en 0,1 M 2- (N-morfolino) etansulfonsyre (MES) buffer, pH = 4. Tilsett 1-etyl (dimetylaminopropyl) -karbodiimid (EDC, 0,54 mmol) og N-hydroksysuccinimid ( NHS, 0,27 mmol) i 2: 1-forhold for dannelse av amid-mellomprodukt.
- Legg 0,28 mmol peptid kobling til ryggraden av alginat polymer via terminalen amin. Røre ved RT O / N.
- Stoppe koblingsreaksjonen ved tilsetning av 2,5 g natriumklorid til løsningen. Legg til en overskuddsmengde av etanol (2: 1) for å utfelle de oksyderte alginater. Sentrifuger blandingen ved 4000 xg i 5 minutter for å samle bunnfallet. Aspirer media i panseret cellekultur og re-oppløse utfellinger i destillert vann. Gjenta etanol vask.
- Fryse-tørke utfellinger før det blir helt tørt (vises som en hvit pulveraktig stoff) og oppbevar i -20 ° C kjøleskapet for senerebruke.
4. humant fettvev stromaceller (hADSC s) Cell Culture
- Kultur human adipose vev stromale celler (hADSC s) i 75 cm behandlede cellekulturer kolber (T75-kolber), dekket med 15 ml lav glukose DMEM med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamin og 1% antimycin. Endre media, i panseret cellekultur, hver to dager før de har nådd konfluens (80-90%).
- Når konfluent, overføre T75 kolber til panseret cellekultur og suspendere hADSC sin ved hjelp av trypsin enzymet fordøyelsen metoden.
- I panseret, aspirere alle cellekulturmedium ut av cellene. Skyll med 5 ml Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline med kalsium og magnesium (DPBS ++). Aspirer DPBS ++ ut av cellene.
- Mens i panseret, lage en løsning av trypsin og DPBS ++ ved å blande 1 ml trypsin og 4 ml DPBS ++. Hver kolbe krever 5 ml av solution, så gjøre de nødvendige volumet for antall sammenflytende kolber. Tilsett 5 ml av trypsin / DPBS ++ til hver kolbe og sette dem i inkubatoren i 2 min.
- Etter 2 min, fjerne kolber og lett trykk på sidene av dem til å løsne cellene fra bunnen. Se på hver kolbe under et mikroskop for å sikre at cellene er suspendert. Plasser flaskene tilbake i panseret cellekultur og tilsett 3 ml passende celledyrkningsmedier til hver kolbe. Dette avslutter trypsin reaksjonen.
- Overfør celle-laden media fra hver kolbe og satt i en 50 ml konisk. Sentrifuger ved 1000 xg dem i 5 minutter. Cellene skal vises som en liten hvit pellet i bunnen av den koniske. Overføre tilbake til panseret cellekultur og aspirer media. Suspender cellene i 2 ml av cellekulturmedier.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer under mikroskopet. Når cellene er blitt telt, i hetten kultur, aliquot mengden av medium inneholdende ~ 1,3 million celler og overføring til et 15 ml konisk. Sentrifuger 15 ml konisk inneholdende cellene på nytt i 5 min ved 1000 x g.
- I hetten kulturen, reseed de gjenværende cellene i flere T-75 kolber, og legger en konsentrasjon på ~ 350.000 celler til hver kolbe. Tilsett 15 ml DMEM media og gå tilbake til inkubatoren inntil sammenflytende på nytt.
- Når sentrifugen syklusen er fullført, returnerer 15 ml konisk til cellekulturen. Aspirere mediet fra cellepelleten, og resuspender cellene i vandig alginatoppløsning med en konsentrasjon på 1,3 millioner celler pr milliliter bioink, terteriating løsningen ofte slik at det er en homogen fordeling av cellene i hele bioink. Laste celle-laden løsning i en steril skriver-kompatibel 3 ml sprøyte og skru på steril 22 G plastspiss.
5. Bioprinter Setup
- Slå på bioprinter, hver av dispenser datamaskiner, og recirculating vannbad.
- Manuelt sette det resirkulerende vannbad temperaturen til for geleringsmekanismen.
- Manuelt sette utskrift parametere for hver dispenser på samkjøre dispenseren datamaskinen. Sett dispenseringsvolumet til 230 nl, antall backsteps til 0, og dispenserhastigheten til 10 ul -sec.
- Åpne design software og programmet for visning av USB-kameraets skjerm på datamaskinen.
- Ved hjelp av programvaren manuelt angi koordinatene for en 5 x 5 dot array med 2,4 mm avstand mellom dråpene.
- Angi utskrifts parametere for å være: Avstanden mellom spiss ende og substratoverflate = 0,1 mm; høyde sprøyte løftes mellom avsetninger = 20 mm; hvor mye tid per deponering = 1 sek.
- Lagre programmet og sende den til roboten.
- Plasser gelatin / TiO2 holdig petriskål på 4 ° C skriver scenen. Lukk og lås kammeret døren.
- Bruk PLC til initialize de ultrafiolette lyskildene, og sterilisere kammeret for 90 sek.
- Når sterilisering er fullført, åpne kammeret og legg sprøyten inneholder hADSC er suspendert i alginat inn Gun 1. Lukk og lås kammeret døren.
- Bruk PLC å slå på viftesystem, vente 30 sekunder for likevekt innvendig trykk.
- På datamaskinen, kjøre programmet inneholder de geometriske parametre sti og utskrift.
- Gjennom hele trykkeprosessen, se USB-kamera skjermen på datamaskinen for å bekrefte nøyaktig og jevn utskrift.
- Når utskriften er ferdig, la de konstruerer til gel for 40 min.
6. Cell Livskraftig Assessment
- Dekk til konstruksjoner som ikke kommer til å bli fotografert umiddelbart etter utskrift i DMEM og butikk i inkubatoren til tidspunktet for avbildning.
- For å kvantifisere levedyktighet av konstruksjoner, beis dem ved hjelp av et fluorescerende basert levedyktighet / cytotoksisitet analyse, ennd bildet ved hjelp konfokalmikroskopi.
- Følge kit instruksjoner, utarbeide en fargeløsning som inneholder calcein AM og ethidium homodimer-en. For å lage 10 ml fargeløsning, tilsett 20 ul av ethidium homodimer-1 og 5 ul av calcein AM til 10 ml sterilt, vevskultur-grade Dulbeccos fosfatbuffret saltoppløsning (+ magnesium, + kalsium; DPBS ++).
- Senk bioprinted konstruksjoner i flekken løsning for 15 min i mørket.
- Bilde farget konstruksjoner ved hjelp av en konfokalmikroskop system på dag 0 og 8. Ta flere bilder av hver bioprinted konstruere, ved hjelp av Z-stack parametere av 30 optiske skiver over en 300 mikrometer dybde, og manuelt telle cellene. Hvis cellene vises gul eller grønn telle dem som levende, og hvis rødt, telle dem som døde.
- Beregn cellelevedyktighetsprosent som antall levende celler dividert med det totale antall celler i konstruksjonen; Cellelevedyktigheten = antalllevende celler (grønn + gul) / totalt antall celler (grønn + gul + rød) x 100%.
- Beregne mengden av celleproliferasjon for hver prøve som celletall på dag 8 dividert med antallet celler på dag 0; Celleproliferasjon = levende celletall på dag 8 / live legemer på dag 0 x 100%.
7. RGD Peptide Bøyning Analyse
- For å analysere suksessen av RGD peptidet konjugering på alginat, sammenlign RGD-konjugert alginat og ikke-konjugert alginat. For å gjøre dette, image de utskrevne konstruerer hjelp (4 ', 6-diamidino-to-phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) og phalloidin flekker.
- Gjør phalloidins arbeider løsning ved å fortynne 5 mL av metanolstamløsning med 200 ul DPBS ++. Oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
- Lage en 300 mM stamløsning av DAPI flekken følgende ligningen: (0,10509 g / l) / (350,3 g / mol) = 3 x 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mm = 300 uM. Gjør the DAPI arbeidsløsning ved å fortynne stamløsning 1: 100 i DPBS ++ for å oppnå 3 uM løsning. Oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
- Helt senk prøven i 4% paraformaldehyde. Inkuber i 1 time ved RT. Vask tre ganger med DPBS ++, at oppløsningen stå i 5 min hver vask. Overfør gelen prøven fra brønnen til et objektglass, bla gelen enn i prosessen. Dyppe gelen i 0,1% Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) i DPBS ++ i 10 min. Vask tre ganger med DPBS ++, slik at 5 min for hver vask.
- Flekk de utskrevne konstruksjoner med phalloidin ved å dyppe dem i arbeidsoppløsningen. Dekk med folie og inkuberes i 4 timer. Fjerne phalloidin flekken og vask tre ganger med DPBS ++. Den første vask skal være rask, de sistnevnte vasker bør sitte i 5 min hver.
- Flekk de utskrevne konstruksjoner med DAPI ved å dyppe dem i DAPI arbeidsløsning. Dekk med folie og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Vasktre ganger med DPBS ++, slik at hver vask for å sitte i 5 min. Observere og bilde prøvene på en konfokalmikroskop system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene viser at bioprinter er i stand til å deponere celle-laden hydrogelene i bestemte tredimensjonale steder nøyaktig og konsekvent bruker dataassistert programvare. Disse programvare bestemmer plasseringen av hver dråpe og styre mange av parameterne for dispensering (figur 3,4). Den repeterbarhet av bioprinter å riktig sette biomaterialer er grunnleggende for sin suksess i tissue engineering applikasjoner.
Celle levedyktighet, en av kravene til en vellykket bioprinting teknikk, ble analysert 1 time og 8 dager etter utskrift. Høy celleviabilitet er avgjørende for fremstilling biomimetic konstruksjoner, og er en direkte representasjon av en tilstrekkelig bioink. RGD peptid konjugering forbedrer celle levedyktighet over lengre tid ved å fremme cellespredning. Fluorescerende mikroskopi ble brukt til å kvantifisere celleviabilitet i konstruksjoner etter trykkeprosessen. Alginat bioink med konsentrasjonerasjon på 15% og oksydasjon av 5% hadde en dag 0 levedyktighet på 98%, dag 4 til 96%, og dag 8 av 95% (figur 5). Disse resultatene indikerer at deponeringsteknikk av den direkte-skrive bioprinter ekstruderer celler forsiktig nok til å produsere konstruksjoner som forblir levedyktige under og etter trykkeprosessen (figur 1, 2). Den høye celleviabilitet viser 5% oksidasjon og 15% konsentrasjon alginat bioink var en egnet bærer for celle avsetning og gitt en tilstrekkelig miljø for celle-overlevelse. Lignende celletall i hvert av områdene viste en homogen cellefordeling i alginat bioink, en grunnleggende del av utskriftsoppløsning.
De fleste vev har komplekse kombinasjoner og graderinger av ekstracellulære matrise bestanddeler, hver med spesifikke biologiske og mekaniske påvirkninger. En biomateriale bør være biomimetisk av opprinnelige miljø og legge til rette for cellulære funksjoner. Den høye porøsitet av alginat stillaset tillatercellene til å kommunisere og bygge nettverk med hverandre, og kan også lette fluks av næringsstoffer og metabolitter mellom stillaset og dens omkringliggende miljø. Celle adhesjon til ekstracellulær matriks er en innledende fase av vev dannelse som skjer før celleproliferasjon og organisering av ekstracellulære matriks-molekyler til funksjonelt vev. Spredning av celler spiller en viktig rolle i sårheling og vev vekst, og er derfor en svært viktig faktor når analysere bioprinted konstruksjoner for tissue engineering applikasjoner. RGD-konjugert alginat forbedret celle vedlegg i trykte konstruksjoner, som fører til forbedret celle spredning og spredning. Proliferasjonen av celler i de trykte stillasene ble kvantifisert ved å telle tre separate områder på dag 0 og 8 (figur 6). Den totale celleformering ble funnet å være 219,674% etter 8 dagers dyrking. Disse resultatene betegne stillaset har tilstrekkelig biokompatibilitet til å bli bruktsa syntetisk ekstracellulære matrise for å levere cellene til å reparere skadet eller ikke-fungerende vev.
Å analysere suksess for RGD peptid konjugering på alginat bioink, ble en sammenligning eksperiment utført ved hjelp av mobiltelefon-laden, RGD-konjugert 15% konsentrasjon, 5% oksidasjon alginat bioink og celle-laden, ikke-konjugert 15% konsentrasjon, 5% oksidasjon alginat bioink. DAPI farging for kjerner og phalloidin farging for aktin ble benyttet for å analysere cellespredning med trykte konstruksjonene på dag 8. bilder av hver prøve (minst tre tilfeldige bilder per prøve) ble tatt ved hjelp av et konfokalt mikroskop system ved hjelp av Z-stack parametre for 30 optiske skiver i løpet av en 300 dybde (figur 7). Cellen sprer vist i prøven med RGD-konjugert alginat viser seg vellykket inkorporering av peptidet i alginat. Celle migrasjon er et viktig skritt i vev utvikling; derfor konjugering av RGD peptider på alginat forbedrer likelihood av in vivo program som bruker denne bioink.
Figur 1. Palmetto skriver. Programmable Logic Controller koordinerer handlingene til alle skriverfunksjonene (A). Et lufttett inneslutning kammer (B) med filtrert inntak (C) og avtrekk (C) opprettholder en regulert indre overtrykk for å redusere muligheten for forurensning. Doble UV-lys (D) som er montert i kammertaket kan programmeres til å operere på trygge intervaller. En Janome 2300N XYZ Robot (E) er programmert og styrt av en integrert datamaskin (I). Tre dispkontrollere (G) er programmert for å regulere utgangen fra disp våpen (F) som er tilgjengelige for å bli lastet på roboten Z-aksen arm (H) under datamaskinstyring. Temperaturen av roboten prøveholderen (J) ligger mellom 4 og 40 ° C med et vannbad kontrolleren (K). To digitale kameraer (L) er tilgjengelig t o overvåke skriver aktivitet og prøve formasjonen. Ett kamera er montert på roboten Z-aksen arm og gir et forstørret bilde av dispenseren tuppen av ladd pistol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tool Nest, Optiske sensorer og Displacement Laser av Bioprinter. A. Ulastet verktøy reir Utsikten fra forsiden. B. Lastet verktøy reir Utsikten fra forsiden. C. Optiske sensorer som måler dispenseringsspissen ende i et tredimensjonalt rom. D. Avstand laser måle Z koordinat for utskrift overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Visual PathBuilder Software. Bilde av dataassistert konstruksjon tegning programvare som brukes for å designe den eksterne arkitekturen bioprinted konstruksjoner. Dette programmet gir muligheten til å generere trinnvis fordelte dråper og komplekse geometrier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. JR-C Points Software. Skjermbilde av skriveren-kompatibel design software. Dette programmet lar brukeren kontrollere deponering metode (dvs. eneste dråpe deponering eller kontinuerlig sti deponering), avsetning hastighet, avstand mellom spiss sprøyte slutten og utskrift su bstrate overflaten, den avsatte tiden for deponering av hver dråpe, og den tredimensjonale plassering av dråpene (se tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Fluorescent Bilde av Stained hADSCs Post-utskrift. Celleviabilitet / cytotoksisitet fluorescerende bilder av hADSC er i bioprinted konstruere tatt med et konfokal mikroskop system (Z-stack parametere av 30 optiske skiver enn en dybde) etter 0 (A) og 8 ( B) dager. Den hADSC tallet ble merket post-utskrift via en pattedyrcelle levedyktighet / cytotoksisitet analysen. Levende celler er farget grønt, og døde celler er farget rødt.3156fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. kvantifiserte viabilities av Bioprinted konstruksjoner. Antallet levende og døde celler ble kvantifisert ved hjelp av en levedyktighet / cytotoksisitet analysen. Det levende / døde celletall for dag 0 er vist i (A), og de teller Dag 8 i (B). Antall levende celler telles for hvert område på dag 0 og 8 er vist i (C), og ble brukt til å kvantifisere celleproliferasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Sammenligning av Cell-Laden, Npå-konjugerte og RGD-konjugert Alginater. Fluorescerende bilder av bioprinted hADSC er i ikke-konjugert (A), og i RGD-konjugert (B) 15% konsentrasjon 5% oksydasjon alginat bioink tatt ved hjelp av et konfokalt mikroskop system (Z-stack parametere av 30 optiske skiver enn en dybde). Den hADSC tallet ble farget med phalloidin og DAPI flekker å analysere celle sprer seg i hver av konstruksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tabell over kommandoer | |
| Command | Robot Response |
| PTP Point | Robotarm flytter til angitte posiiton i X, Y, Z plass |
| Find_Base_Z | Bruker SICK laser til å måle tHan skriver ut overflaten av substratet; Avstanden mellom spissen sprøyten ende og substratoverflaten manuelt innstilt. |
| Arbeid Adj. Nei (Work Adjustment Number) | Kommandoer robot til å bruke SICK laser (for å bestemme substratoverflate), Gun 1, Gun 2, eller Gun 3. |
| Get_1 | Kommandoer robot ot hente og laste Gun 1 |
| Find_Tip1_YZ | Roboten finner spissen slutten av Gun 1 i Y og Z |
| Find_Tip1_X | Roboten finner spissenden av en pistol i X-retningen |
| Point fordelings | Roboten vil påføre en dråpe bioink i fast bestemt på X, Y, Z posisjon |
| Palle Nei (Pallte Number) | Inkorporerer en manuelt kodet design for utskrift, for eksempel, en matrise. |
| Dispense Tid | Er den avsatte tiden for deponering av hver enkelt dråpe. </ td> |
| Store_1 | Kommandoer roboten til å returnere Gun 1 til toolnest, og gå tilbake til startposisjon: (0,0,0). |
Tabell 1. Programmerbare dataprogrammer kommandoer. Denne figuren skisserer de programmerbare dataprogrammer kommandoer, som brukes til å styre robotarmen og optimalisere trykkbarhets parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det primære fokus for tissue engineering er å bygge bro mellom knapphet orgel og transplantasjons behov ved å utvikle biologiske substitutter som kan gjenopprette, vedlikeholde eller forbedre innfødte vev functio. Dette har ført til direkte fabrikasjon av stillas med en kompleks, anatomisk korrekt ekstern geometri, og nøyaktig kontroll over den interne geometr. Tredimensjonal bioprinting er en metode som brukes for å generere tredimensjonale konstruksjoner av forskjellige størrelser og former fra en digital modell ved anvendelse av en lag-for-lag approac. Fabrikasjon av tredimensjonale biomimetic konstruksjoner spiller en avgjørende rolle i fremme av tissue engineering.
Det er viktige aspekter av designprosessen som påvirker den genererte konstruere sin biomimetisk functio. Evnen til å kontrollere temperaturen av biomateriale og substratet er vesentlig for geleringsmekanisme av hydrogeler og opprettholdelse av deres megmekaniske egenskaper, derfor påvirke cellefordeling, proliferasjon og differensiering i hydrogelen. Organer består av mange celletyper, slik at de flere dispensere er kritiske for fremstilling av heterogene, vev-lignende strukturer. Dataassistert design av ytre arkitekturen tillater produksjon av tilpassede vev erstatter tydelige sår eller vev. Dette er viktig for utviklingen av pasientspesifikke erstatninger. Den interne arkitekturen er like viktig fordi den påvirker celle-celle-forhold i strukturen ved å plassere de riktige celler i intim kontakt med hverandre og slik at de kan danne in vivo-lignende celle-celle kryss. Presis plassering av celler som bestemmer hvordan cellene kommuniserer og nettverk med hverandre for å danne vaskulære nettverk og etterligner deres bioaktivitet i native vev. Tredimensjonal bioprinting gir homogent dispergerte celler i bioink, så vel som utmerket presisjon på romlig placement av cellene. Generert stillasene har også en høy lokal celletetthet, noe som er essensielt for celledifferensiering og formulering av ekstracellulær matriks.
Presenteres her er et 3D robot bioprinter som pålitelig og konsekvent utleverer homogene dråper individuelle celler eller celler blandet med biomimetisk hydrogel. Lignende bioprinters har brukt en pre-fusion teknologi. I samsvar med differensial adhesjon hypotese, individuelle celler når den plasseres i en støpeform eller lignende, vil smelte sammen og organisere på grunnlag av konsentrasjonen og fordelingen av adhesjonsmolekyler på celle overfl. Disse enhetene skaper forhåndssmeltet stenger eller andre geometriske figurer som deretter lastes inn i dispenseren, og plassert i nær tilknytning til andre forhåndssmeltet eller pre-laget stenger, som deretter sikringen i et større geometrisk shap. Ende geometrier er begrenset av hva som kan være konstruert av disse forhåndslaget enheter. Den bioprinter implementert her består av en unik temperaturkontrollert miljø i hvilket cellene og celle-hydrogel-blandinger er ikke begrenset av nødvendigheten av pre-fusjon. Under disse betingelser er det bioprinter ikke bare avhengige av differensial adhesjon hypotesen. Inkludering av hydrogel materialer kan bidra til å lede cellefordeling og la cellene til å smelte, eller ikke, avhengig av egenskapene som er ønsket for spesifikke eksperimentering. Valg av biomimetic hydrogeler for celle-innkapsling har også en dyp effekt på cellefenotype. Materialer som er kjent for å ha en effekt på celleadhesjon, samt cellestørrelsen og morpholog. De reologiske egenskaper, for eksempel viskositet, av hydrogeler diktere deres innflytelse på de cellulære microenvironmen. Native alginat er inert og ikke lett kommuniserer med celler som deltar i kontrollen av fenotype. Men ved hjelp av alginater som er kjemisk modifisert via peptid konjugering og oksidering, vise resulterende konstruksjoner kontrollert nedbrytbarhet og økt cellevedlegg, migrasjon, og proliferatio. Endre fysio egenskapene til en biomateriale kan påvirke vev developmen.
Tredimensjonal bioprinting ved hjelp av en fluid-dispensering, er direkte skrivemaskinen begrenset av graden av oppløsning av trykte konstruksjoner, tilgjengeligheten av hydrogel materiale, innledende celledød etter trykking, og evnen til å vascularize biomimetic. Et viktig trekk ved bioprinting er dens oppløsning. Hver trykkmetode er definert av den nedre teknisk grense størrelsen av de minste oppnåelige detaljer. Det er et dynamisk forhold mellom den nedre grensen størrelse og oppnåelige omfanget av den trykte konstruere: jo høyere oppløsning på de små detaljer, jo mindre maksimal konstruere. Den bioprinter er i stand til å deponere volumene så små som 230 nl i svært spesifikke og organiserte mønstre, gir det en høyere oppløsning enn tilsvarende maskiner. Hydrogeler har vært vanlig i bioprinting på grunn av sinhydrofilitet, biokompatibilitet, strukturell likhet med ekstracellulære matrise, og enkel modificatio. Det høye vanninnhold av hydrogeler forbedrer deres biokompatibilitet, men i stor grad reduserer deres mekaniske styrke og. Det er en mangel på optimale hydrogelene med de riktige mekaniske egenskaper for væske levering i løpet bioadditive-produksjon ekstrudering. Derfor er det et stort behov for å utvikle hydrogeler som er immunologisk inert, har cytocompatible geleringsmekanismer som kan med hell ekstrudert ved hjelp av væskestrømmen, og også frembringer et celle-matriks nedtynget med et optimalt område av mekanisk. Før trykkeprosessen, må cellen-laden hydrogel bioink lagres i sprøytene for en tid, at det går cellens. Under utskrift kan skjærspenningen indusert på celler under ekstrudering også være skadelig for deres. Den bioprinter er i stand til å produsere levedyktige høyt (> 90%) konstrukter derfor å overvinne problemet med jegnitial celledød. Vaskularisering spiller en viktig rolle i overføring, støtte, eller bevare biomimetic funksjon bioprinted. Diffusjon av oksygen er m; derfor i større bioprinted konstruerer hypoksi er en. Konvensjonelle teknikker som er i stand til å produsere konstruksjoner med innlagt vaskulatur, i stor grad begrense størrelsen av produserbare stillaser. Den celleviabilitet vurderingen av bioprinter viste signifikant celledeling i de trykte konstruksjonene mer enn 8 dager. Derfor viser teknikken dens evne til å generere stillaser som tillater cellevekst, kommunikasjon, og dannelse av nettverk, krav til vaskularisering.
Den bioprinter gir mulighet for å bruke en rekke forskjellige materialer for raskt å sette celle-laden hydrogeler i bestemte mønstre. Selv om denne teknikken gir heterogene konstruksjoner med avstembare egenskaper, er det ute av stand til samtidig avsetning og reaktiv blanding. For noen biomaterialer, dette deponering møttehod ville forbedre geleringsmekanisme og forkorte tiden for stillaset bluser. Tillegg av en multi-sprøyte dispenser kan tillate et bredere spekter av biomaterialer for biofabrication teknikk. Gransking av celleaktivitet i bioprinted konstruksjoner over lengre tid vil gi mer informasjon om hydrogel egenskaper, cellenettverk dannelse, og vaskularisering av konstruksjonene.
Den bioprinter s deponering beskrevne metode kan videre omfatte robot posisjonering og drive de tre dispensere for å sette en flerhet av biologisk materiale på toppen av tidligere avsatt materiale i et forhåndsbestemt mønster. Dette trinnet kan gjentas med stigende mønster til et tredimensjonalt organ eller vev blir produsert. Derfor er Palmetto Skriver som passer for dispensering av en pålitelig celle laden hydrogeler for å skape en tredimensjonal konstruksjon som er i stand til å holde på vaskulaturen og høy cellelevedyktighet, og kunnebrukes i vev tekniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av regjeringen Support henhold Grant No. EPS-0903795 tildelt av National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), og Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al.
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F.
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
