Introduction
Hudlidelser lige fra kontakteksem, eksem, psoriasis, cellulitis, svampeinfektioner og bylder til ikke-melanom hudkræft viste sig at være blandt de 50 mest udbredte sygdomme i hele verden, og den fjerde førende årsag til ikke-dødelige sygdomme i 2010 1. Derfor undersøgelse af molekylære og cellulære mekanismer bag diverse hud patologier er en nødvendig og aktivt forskningsområde. Gnavermodeller har været bemærkelsesværdigt nyttige i forståelsen af inflammatoriske hudtilstande, såsom atopisk dermatitis 2, psoriasis 3 eller Staphylococcus aureus infektion 4. Billige, effektive og simple protokoller for enzymatisk fordøjelse af muse hudvæv kan give præparater af celler, som kan anvendes til en række af downstream-applikationer for bedre at forstå patofysiologien af hudsygdomme. Her er en enkel og økonomisk fremgangsmåde beskrevet for enzymatisk fordøjelse af musehudvæv og isolering af hud infiltrerende leukocytter, som kan anvendes til celledyrkning, in vivo adoptiv overførsel, flowcytometrisk analyse og sortering eller genekspressionsstudier. Det overordnede mål med denne procedure er at forberede en enkelt celle suspension af hud-infiltrerende leukocytter med høj cellelevedygtighed samtidig minimere omkostningerne typisk er forbundet med brugerdefinerede reagenskits og mekaniske dissociators.
Eksisterende hud væv dissociation metoder 5-7 kan resultere i lav levedygtighed og overfladen cellemarkør integritet, eller kræve brugerdefinerede enzym kits og dyre væv dissociation maskiner 8-11. Mens fordøjelsen af museøre hudvæv er rimeligt udbredt 12-13, fordøje meget keratiniseret hudvæv (fx fra flanken) kan resultere i cellepræparationer forurenet med store mængder af ikke-celleaffald. I en nylig undersøgelse, Zaid og kolleger fordøjet mus flanke huden i 90 min i 2,5 mg / ml dispase, følgenwed med 45 minutter i 3 mg / ml collagenase 7. I en anden undersøgelse, disse forskere anvendes flere inkubationer med en samlet fordøjelse af 2,5 timer, herunder anvendelse af trypsin / EDTA, collagenase III og dispase 5. Anvendelsen af trypsin anbefales ikke til enzymatisk fordøjelse hud, som er blevet vist behandling med trypsin fra forskellige producenter til målbart påvirke integriteten af celleoverfladeproteiner på pattedyrceller 14-15. Derudover kan dispase få væsentlig indvirkning på proliferative evner CD4 og CD8a T-celler og påvirke overflade overflod af mindst 20 molekyler, herunder fælles T-celle aktivering markører såsom CD62L 16. Andre protokoller anvender RPMI 1640 i fordøjelsen medium 6. Tilstedeværelsen af Mg2 + og Ca2 + i RPMI, kan imidlertid forårsage omfattende celleaggregering 17.
En ideel protokol for væv dissociation bør sigte efter høj cellelevedygtighed, lavniveauer af celleaggregering og minimal skade på celleoverfladeproteiner. Høj kvalitet lymfeknude stromale celle forberedelser er opnået med protokoller, der bruger kortere enzym inkubationer, Ca 2+ og Mg 2+ frie medier, og undgå trypsin og Dispase 18. Det er imidlertid ikke blevet etableret protokoller af denne type for dissociation af hele musehud.
Her en protokol beskrevet til at dissociere, isolere, og berige hud-infiltrerende leukocytter fra allergen-udfordrede mus flanke hud. Kort fortalt, udskåret hud er præinkuberet i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 10% føtalt bovint serum i 1 time for at blødgøre væv til fordøjelsen og fjerne overskydende døde hud eller fedtvæv. Dette efterfølges af en 30 min enzymatisk fordøjelse takt med 0,7 mg / ml collagenase D. Collagenase D har minimale virkninger på tætheden af celleoverflademarkører, og ingen virkning på T-celleproliferation in vitro 16,18, hvilket gør detsærdeles velegnet til anvendelser, der involverer karakterisering af overfladeproteiner. Efter enzymatisk nedbrydning blev diskontinuerlig densitetsgradientcentrifugering anvendes til at fjerne epitelceller og rester fra encellede suspension og berige for hæmatopoietiske celler. Det er vigtigt, denne procedure undgår dyre kolonne-baserede magnetiske cellesepareringspræparater reagenser og væv dissociation maskiner 8-11, og kan udføres med udstyr og materialer, der findes i en grundlæggende biomedicinsk forskning laboratorium. Her blev denne protokol, der bruges til at isolere leukocytter fra flanken hud udfordret tre gange med haptenet oxazolon (Ox) i tidligere sensibiliserede ND4 Swiss mus (tilpasset fra 19). Celler blev analyseret ved anvendelse af multi-parametrisk flowcytometri. Denne teknik gav en cellesuspension med minimal snavs og> 95% levedygtighed isolerede lymfocytter, som blev analyseret ved multi-parametrisk flowcytometri til måling af infiltration af T-lymfocytter og neutrofiler i de berørte ski.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: 8-12 uger gamle kvindelige ND4 Swiss Webster mus, konventionelt opstaldet med fri adgang til mad og vand, blev anvendt til disse undersøgelser Den eksperimentelle protokol, der bruges (B13S1) blev godkendt af Macalester akademiets IACUC..
1. sensibilisering og udsættelse for oxazolon
- Dag 0
- Forbered anæstesi kammer ved tilsætning af 3 ml isofluran absorberende håndklæder placeret under mesh nederst på en 4 L låg glaskrukke. For ND4 hunmus anvendes her, tid i kammeret er 30-60 sek før motivet er tilstrækkeligt bedøvet; optimere anæstetikumindgivelse af den anvendte musestamme.
- Barbér bedøvet mus ryg og flanke ved hjælp af en dyrehår trimmer.
- Dag 1
- Foretag en 2% opløsning af 4-ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) i absolut ethanol, og der inkuberes ved 50 ° C i 15 minutter på en roterende plade i en inkubator.
- Kort fortalt bedøvemus under anvendelse isoflurananæstesi som beskrevet i 1.1.1 og anvende 100 pi 2% Ox til det barberede igen flere serielle anvendelser af omkring 20 pi hver. Vent 5-10 sek mellem serielle ansøgninger om løsningen på tørre.
- Sørg for at undgå at spilde 2% Ox løsning på andre end bagsiden regioner, og vente på løsningen til at tørre mellem applikationer.
- Dage 5-7
- Lav en 1% opløsning af (Ox) i absolut ethanol, og der inkuberes ved 50 ° C i 15 minutter på en roterende plade i en inkubator.
- Forsigtigt, men fast immobilisere musen på nakkeskindet og hale base med maven opad og hals lidt på skrå nedad (svarende til et hold for en intraperitoneal injektion) og anvende 100 ul 1% Ox til den barberede flanke i flere serielle applikationer og tage sig tid til at tørre huden bagefter som beskrevet ovenfor.
- Til kontrol mus, gælder 100 ul absolut ethanol køretøjet til barberede flank.
2. flanke Skin Harvest
- Aflive mus ved anvendelse af kuldioxid indånding, og omhyggeligt udskære det ønskede område af flanken huden (~ 25 mm x 25 mm af huden) med 10 cm kirurgiske sakse.
- Ved hjælp af en ren, skarp kirurgisk kniv, skrab overskydende fedt og bindevæv fra fløjen huden.
- Placer 3 stykker af flanke huden fra 3 mus i en 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml RT HBSS [med phenolrødt, uden calcium eller magnesium, 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazinethansulfonsyre (HEPES), og 10% føtalt bovint serum (FBS)].
3. Pre-fordøjelse Tissue Vask
- Sted rør indeholdende hud fragmenter på en roterende plade i 30 minutter i et tørt ikke-gasset inkubator holdt ved 37 ° C.
- Vortex kraftigt i 10 sekunder ved slutningen af inkubationsperioden.
- Si indholdet af rør gennem en 70 umsi for at skille vaskepufferen og indsamle vævet. En enkelt filter kan genbruges under hele proceduren inden for en biologisk behandlingsgruppe.
- Ved hjælp af en pincet, overføre flanken skindet fra si i en ny 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml frisk, RT HBSS medier (indeholdende EDTA, HEPES og FBS som beskrevet ovenfor).
- Med en 12,5 cm par kirurgiske dissekere saks nedsænket i røret, hakkekød hvert stykke flanke huden, så den gennemsnitlige stykke væv er ca. 2,2 mm x 2,2 mm i området.
- Sted rør indeholdende hud fragmenter på en roterende plade i 30 minutter i et tørt ikke-gasset inkubator holdt ved 37 ° C.
- Vortex kraftigt i 10 sekunder ved slutningen af inkubationen
4. collagenasefordøjelse af Skin
- Strain indholdet af røret gennem en 70 um si, indsamle og overføre flanke skindstykkerne i en ny 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml fresh, RT HBSS medium suppleret med 0,7 mg / ml collagenase D.
- Sted rør indeholdende fordøjelse medium og hud fragmenter på en roterende plade i 30 minutter i et tørt ikke-gasset inkubator holdt ved 37 ° C.
- Vortex indholdet af røret kraftigt i 10 sekunder ved slutningen af inkubationen.
- Filter indholdet af rør gennem en 70 um si i en ny 50 ml konisk rør; holde gennemstrømning indeholder den fordøjede væv og kassér si og flanke hud vragrester.
- Vask gennemløbet i 50 ml HBSS medier, centrifugeres i 5 minutter ved 350 g, og dekanter supernatanten.
5. densitetsgradientcentrifugering
- Ved hjælp af en serologisk pipette, tilsættes 3 ml RT 67% densitetsgradientcentrifugering medier i 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) i en ny 15 ml konisk rør for hver prøve.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml RT 44% densitetsgradientcentrifugering medier i HBSS med phenolrødt.
- Gently lag 5 ml af 44% densitetsgradientcentrifugering medier indeholdende cellerne på toppen af 67% densitetsgradientcentrifugering medier prøve under anvendelse af en serologisk pipette. Sørg for at indstille pipette til den langsomste hastighed, og placere pipetten langs væggen af det koniske rør. Vær forsigtig med ikke at ryste, forstyrre eller invertere gradient.
- Indstil acceleration til den laveste indstilling, frigøre bremsen, og centrifuger gradient ved 931 xg i 20 minutter ved stuetemperatur at sikre, at centrifugen er afbalanceret.
- Efter centrifugering forsigtigt fjerne gradient fra centrifugen, og forsigtigt transportere til laboratoriet bænken holder røret oprejst. Ved hjælp af en 5 ml plastik overførsel pipette til at fjerne cellelaget på grænsefladen af de 44% og 67% densitetsgradientcentrifugering medier og overførsel til en ny 15 ml konisk rør. Hvis grænsefladen ikke er synlig, skal du blot fjerne omkring 2 ml væske på 67% -44% grænse.
- Fyld koniske rør indeholdende celler fra interface med 2% FBS i 1X iskold PBS, centrifugeres cellerne i 5 minutter ved 350 xg, og dekanter supernatanten.
Bemærk: Det er første gang, at der kan køles cellerne / holdes koldt, da fordøjelse trin er ved 37 ° C og densitetsgradientcentrifugering medier trin er ved stuetemperatur. Celler kan resuspenderes i en 1: 1 Trypanblåt fortynding og tæller og levedygtighed oplysninger kan fås på dette tidspunkt.
6. Blokering og farvning for flowcytometrisk analyse
- Block FcyRII / III-receptorer på celler for at forhindre ikke-specifik antistof-farvning. For de her beskrevne forsøg, at antistof masterblandinger i PBS med 2% FBS indeholdende 1: 100 fortynding af ukonjugeret antistof mod CD16 / 32 (2.4G2) til at binde og blokere FcyRII / III-receptorer.
- Inkuber blokerede celler med passende master-blandinger af antistoffer mod CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11 (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), og Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), samt Brilliant Violet 510 levende / døde plet at identificere døde celler. Brug alle antistoffer enten på fortynding anbefales af fabrikanter eller tidligere optimeret af forskere. For de her beskrevne forsøg, bruge alle antistoffer ved 1: 100 fortynding.
- Vask cellerne og resuspenderes i 50 pi 1X PBS farvning buffer med 2% FBS. Hold på is indtil fluorescens data kan erhverves på et flowcytometer.
Bemærk: Det er vigtigt at have kompensation parametre præoptimerede med en lymfevæv og en fælles celleoverfladeantigen (ligesom CD4 eller CD8), før købet af fluorescensdata. - For at øge antallet af celler for downstream flowcytometrianalyse erhverve data fra hele prøver af farvede celler.
7. Analyser flowcytometri data ved hjælp af Standard Metoder til at udføre nedenstående trin
- Først gate på lymfocytområdet af forward scatter(område) ved sidespredning (område) plot.
- Vælg derefter enkelte celler under anvendelse af forward scatter (bredde) ved sidespredning (bredde), for at undgå at analysere dubletter. Dette kan også opnås med en forward scatter højde ved sidespredning højde plot.
- Derefter gate på afstamning (CD11, CD11 og CD45R / B220) -negativ og CD3-positive begivenheder, at udelukke makrofager, dendritiske celler og B-celler, henholdsvis og indskrænke analyser til T-celle-rum, hvis målet er, som det er her, at vurdere infiltrerende T-celler.
- Dernæst gate på levende celler, der udelukker den levende / døde plet.
- Endelig porten på den celle populationen af interesse (se repræsentativt resultat afsnit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Collagenase D behandlede splenocytter viser lignende niveauer af CD4 og CD8 α på T-celler i forhold til medierne-behandlede kontroller
Først blev den eventuelle påvirkning af collagenase D om hyppigheden og overflade overflod af afstamning og aktivering markører på T-celle delmængder vurderet ved hjælp sekundær lymfoide væv som kontrol. En suspension af splenocytter blev opnået fra ND4 mus og vasket i 1 time med HBSS medier. Dernæst halvdelen af cellerne udsat for 0,7 mg / ml Collagenase D (som beskrevet i afsnit 4 ovenfor). De resterende celler blev resuspenderet i HBSS kontrol medium. Næste blev begge splenocyt fraktioner behandles ved hjælp af en densitetscentrifugering gradient som beskrevet i afsnit 5 ovenfor. Celler blev derefter farvet med antistoffer mod overfladen CD4 og CD8a, og analyseret på flowcytometeret. Enkelt, levende, CD45 +, ikke-T afstamning - (B220 - CD11b -CD11 -), blev CD3ɛ + -celler gated for analyse, for at udelukke B-celler, makrofager, dendritiske celler. CD4 og CD8a proteiner blev ligeledes detekteret på overfladen af splenocytter, der var blevet udsat for collagenase D fordøjelse og de ikke var blevet udsat for enzym med ca. 60% CD4 + CD8a - celler og 30% CD4 - CD8a + celler påvist med enten behandling ( Figur 1A). Derfor gjorde collagenase D digest ikke påvirke den relative hyppighed af CD4 og CD8a. Intensiteten af overflade CD4 og CD8a geometriske middelværdier fluorescensenheder (gMFI) på disse delmængder også var sammenlignelige mellem de to behandlinger; gMFI værdier for CD4 var 2271 for enzym-behandlede og 2243 for kontrol splenocytter henholdsvis og gMFI værdier for CD8a var 536 for enzym-behandlede og 520 til kontrol splenocytter. Enzymatisk behandling også havde ingen virkning på overfladen af T-densitet celleaktiveringsmarkører CD44 eller CD62L på CD4 + T-celler (Figur 1B). Geometriske middelværdier fluorescens intensitet værdier for CD44 var 669 for enzym-behandlede og 654 til kontrol splenocytter; gMFI værdier for CD62L var 1523 for enzym-behandlede og 1517 for kontrol splenocytter. Som Collagenase D fordøjelse bevarer integriteten af overfladeproteiner på isolerede celler, kan protokollen beskrevet her bruges med tillid til nedstrøms flowcytometri analyse.
Enzymfordøjelse og gradient rensning af flanken hudceller resultater i høj cellulær levedygtighed
Celleudbytte og procent levedygtighed cellesuspension opnået ovenfor blev vurderet med eksklusion med trypanblåt farvestof 20. Denne fordøjelse og gradient separation protokol gav omkring 250 levedygtige celler pr immune mm2 flanke væv i Ox-udfordrede mus og omkring 4 levedygtige immunceller pr mm 2 af væv i vehikel-udfordrede musder tidligere var sensibiliseret med Ox (tabel 1).
Enzymfordøjelse og gradient rensning af flanken hudceller resulterer i robust opsving af immunceller
Dernæst blev omfanget af immune infiltration i huden bestemmes ved at analysere overflod af CD45 overfladeproteiner på celler isoleret fra flanken af Ox-udfordrede mus og kontrolmus at vurdere genvinding af hud-infiltrerende immunceller ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet her. CD45 er et pan-hæmatopoietisk afstamning markør 21. 95% af lav frem og side-scatter, enkelte celler (gating ikke vist) i Ox-udfordrede mus og 71% af disse celler i vehikel-udfordrede kontroller var levende CD45 + celler (figur 2). A ~ 67-fold stigning i infiltrerende CD45 + immunceller blev påvist i flanken huden efter 3 daglige Ox udfordringer anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri procedure (tabel 1).
Tre flanke Ox udfordringer medfører udtalt infiltration af T-celler og neutrofiler
Vor teknik gav en cellepopulation fra flanken hud, der kunne anvendes til at påvise en række myeloide og lymfoide celledelmængder såsom Gr-1 + neutrofiler 22, CD4 T-celler og T-celler CD8a. Vi observerede ~ 6-fold, ~ 7-fold, og ~ 73-fold stigning i neutrofiler, CD4 T-celler og T-celler CD8a henholdsvis efter 3 daglige Ox udfordringer (tabel 1). Vi beregnede disse stigninger ved at multiplicere det samlede antal levedygtige celler opnået (talt under anvendelse af Trypan-blå-udelukkelse) ved procent af den givne immuncelle fragment ud af levedygtige celler porten under flowcytometrisk analyse. Vi derefter delt med antallet af levedygtige celler totale immune, Gr-1 +, CD4 +, eller CD8a + -celler i Ox-behandlede mus med de tilsvarende tal for køretøjet kontrolmus, giver osfold stigninger i lymfocytundersæt. Gr-1 + neutrofiler udgjorde 42% af enkelt, levende CD45 + B220 - CD11b - CD11c - celler i Ox-behandlede mus og 10% af denne population i EtOH-behandlede mus (Figur 2B). I Ox-behandlede mus, ~ 52% af gated CD3 + T-celler CD8a + og ~ 34% var CD4 +, mens der i vehikelkontroller, ~ 9% af T-celler blev CD8a + og 57% var CD4 + (Figur 2C) . Derfor, med teknikken beskrevet her, allergisk og ikke-allergisk flanke hud kan behandles til opnåelse af enkeltcelle-suspensioner, der er egnede til høj opløsning flowcytometrisk karakterisering af infiltrerende immuncelleundergrupper.
| Cells delmængder fra muse flanke huden | Ox / Ox (3) | Ox / EtOH (3) | Fold Ekspansion (Ox / Ethanol) |
| pr mm2 væv | |||
| Totale antal celler | 262,7 | 5.3 | 49.3 |
| CD45 + immunceller | 250,7 | 3.8 | 66,7 |
| CD4 + CD8 - celler | 6.5 | 0,9 | 7.2 |
| CD4 - CD8 + -celler | 10.6 | 0.1 | 72.9 |
| Neutrofiler | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
Tabel 1. Cell udbytter fra allergisk flanke hud i ND4 hunmus. Levedygtige celler isoleret fra flanken huden blev talt under anvendelse af Trypan Blå eksklusion og normaliseret til celler / mm2 væv baseret på det hudområde, isoleret, og antallet af mus pooles pr tissue forberedelse. Vi beregnede totale immuncelle udbytte baseret på påvisning af hæmatopoietiske CD45 antigen på celleoverfladen og lymfocytdelmængde udbytter baseret på afstamning-specifikke overflademarkører. Vi derefter delt med antallet af celler i Ox-behandlede mus med tallene for køretøjet kontrolmus, giver os fold stigninger i lymfocytundersæt. De viste data repræsenterer poolede data 2-3 mus per behandling, og er repræsentative for to uafhængige forsøg.
Figur 1. Enzym fordøjelse og gradient rensning af splenocytter bevare lymfocytundergrupper og celleaktiveringsmarkører. Splenocytter vaskes i 1 time med HBSS medier, inkuberet med enten collagenase D eller HBSS medier alene og oprenset ved anvendelse af en densitetsgradient til at fjerne snavs og røde blodlegemer. T-celler blev identificeret som levende, CD45 +, slægt (B220, CD11b, CD11c) <sup> - og CD3ɛ +. Hyppighed af CD4 og CD8a T-celler ikke ændre sig efter enzymatisk fordøjelse (A). Overfladekoncentrationen af CD44 og CD62L på CD4 + -T-celler ændredes ikke efter enzymatisk fordøjelse (B). De viste data repræsenterer samlet data 2-3 mus per behandling fra en enkelt eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Enzym fordøjelse og gradient oprensning af hudceller afslører særskilte immune infiltration i kontrol vs. allergen-udfordrede mus flanke huden. Tre flanke Ox udfordringer producere en ~ 67-fold stigning i hudens-infiltrerende immunceller i tidligere sensibiliserede ND4 Swiss-mus ( A). Tre Ox udfordringer også provOKed en ~ 6 gange stigning i Gr-1 + neutrofiler (B), og ~ 73- og ~ 7-dobling af CD8a + og CD4 + T-celler, henholdsvis (C). Live-CD45 + immunceller er gated fra enkelt, lave frem og side scatter celler; neutrofiler og T-celler gated fra B220 - CD11b - CD11c - levende enkeltceller. Tællinger blev udført under anvendelse af en 1: 1 Trypanblåt fortynding følgende gradient densitet separation. Viste data repræsenterer samlet data 2-3 mus i hver behandlingsgruppe, og er repræsentative for to uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering forandringer i hud-resident leukocytter i gnavermodeller for hudsygdomme, såsom atopisk dermatitis eller psoriasis er vigtige for forståelsen af mekanistiske forbindelser mellem inflammatorisk celleindstrømning og sygdom patologi. Her beskriver vi en økonomisk teknik til at isolere leukocytter fra hud væv med basisudstyr findes i de fleste biomedicinske forskningslaboratorier. Denne relativt hurtige teknik undgår brugen af dyre væv dissociation maskiner og brugerdefinerede rør og reagenser, hjælpe med at spare på ressourcerne og samtidig minimere hands-on tid på laboratoriet bænken. Let enzymatisk fordøje og diskontinuerlig gradient separation fjerne hovedparten af epitelceller og snavs, og det isolerede celler kan anvendes til en lang række applikationer, herunder downstream flow cytometrisk analyse, cellesortering, overførsel, cellekultur og in vitro stimulation assays. Enzymatisk fordøjelse med collagenase D har ingen effekt på T celleoverflademarkør integritet og preserves cellelevedygtighed. Denne protokol kan let modificeres til at behandle huden fra andre kilder end flanken regioner.
De mest kritiske trin i denne procedure er 1) grundigt fjerne enhver fedt og bindevæv, mens høst huden, 2) håndtering og forarbejdning væv hurtigt at maksimere infiltrere celle udbytte samtidig minimere celledød, 3) forsigtigt lagdeling gradienten, og 4) omhyggeligt ekstraktion grænsefladen af gradienten. Før du starter et storstilet forsøg, er det vigtigt at øve densitetsgradientcentrifugering medier lagdeling og grænseflade fjernelse. Man kan praktisere høst celler fra en diskontinuerlig densitetsgradient ved at knuse en hel murine milt gennem en 70 um si i 1X PBS-puffer farvning og udførelse densitetsgradienten som beskrevet ovenfor i trin 5. Det er meget nemmere at se og udtrække grænsefladen mellem 44% densitetsgradientcentrifugering medier og de 67% densitetsgradientcentrifugering medier ved hjælp splenocytes, på grund af det store antal af immunceller til stede.
Når du arbejder med densitetsgradienter bør bobler undgås mens pipettering, og gradient forstyrrelser bør minimeres. Den koniske rør indeholdende gradienten skal håndteres forsigtigt, der holdes lodret på alle tidspunkter. Densitetsgradientcentrifugering medieløsninger bør altid være ved RT, serologiske pipetter indstillet til den langsomste mulige frigivelse hastighed, centrifugen opretholdes ved RT, indstillet til lav acceleration med bremsen frakoblet, og omhyggeligt afbalanceret før spinding. Når man arbejder med hudpræparater, der giver et lille antal af infiltrerende leukocytter, er ikke altid synlige på gradientgrænseflade celler. Det er således vigtigt at gøre 44% densitetsgradientcentrifugering medier med HBSS indeholdende phenolrødt, således at grænsefladen let kan visualiseres selv når et lag af celler ikke kan skelnes. Derudover er det vigtigt at være blid, men hurtige når udvinding, vaskningog behandling af hudvæv at undgå celledød inden huden placeres i HBSS medier.
Hvis levedygtighed eller renhed cellen er lav, kortere (~ 20 min) fordøjelse gange kan lidt lavere koncentrationer af collagenase D (~ 0,5 mg / ml), eller hakkes vævet finere være nyttig. Fordi over-fordøjelse og nedbrydning af væv kan bidrage til celledød, vil undersøgere nødt til at optimere den minimale fordøjelse tid, som giver en tilstrækkelig stor celleprøve størrelse 17. Processen vil sandsynligvis kræve flere runder af optimering i hænderne på enkelte forskere til at standardisere teknikken. Collagenase D aktivitetsniveau kan også variere mellem fremstillings masser og justeringer fordøjelsen tid skal foretages for hvert parti enzym anvendes. Under optimeringen, er det vigtigt at pletten referencenumre cellesuspensioner (f.eks milt) oprenset med og uden en enzymatisk fordøje trin med en pålidelig levende / døde plet samt immuncelle linEAGE markører (f.eks CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c osv) for at sikre, at cellepopulationer og overflademarkører af interesse bevares gennem vævet fordøjelsesprocessen. Hvis det er muligt, er det nyttigt at foretage optimeringer på et flowcytometer, der kan måle sig frem og sidespredning bredde eller højde samt område, for at udelukke celleaggregater. Endelig bør cellesuspensionerne undersøges under lysmikroskop til visuel vurdering af levedygtighed og generelle cellulære morfologi. Cellerne kan tælles manuelt ved hjælp af 0,4% eksklusion med trypanblåt farvestof under et lysmikroskop eller på et flowcytometer ved hjælp af optælling perler. For forsøg, der skal strengere kvantificering af specifikke celletyper i udskårne væv, kan forskerne veje eller måle mængden af vævsfragmenter før og efter fordøjelse, og bruge omfanget af nedbrydning til mere præcist estimat af celledelmængder stede i det væv, der analyseret.
En begrænsning af denneer, at den er specifikt tilpasset til rensning af immunceller. Hvis man er interesseret i isolation, rensning og analyse af en anden cellulær befolkning (f.eks hud epitelceller), tætheden gradient opsætning og den enzymatiske fordøje protokol vil både sandsynligvis behov for at blive ændret og optimeret til at bedst at isolere cellerne af interesse. Men denne protokol giver mulighed for isolering og oprensning af både lymfoide og myeloide celledelmængder og kan således tilpasses til de fleste immunologiske anvendelser. En anden begrænsning er, at denne protokol ikke kan anvendes til at skelne mellem cellepopulationer infiltrerer dermis vs. epidermis af huden. For at opnå dette niveau af differentiering, ville denne protokol skulle tilpasses yderligere med yderligere skridt til enzymatisk adskille dermis og epidermis før eller i stedet for trinene her. Her prøver puljet fra ~ 3 mus for at lette multi-parameter flowcytometrisk analyse gør det vanskeligt atpåvise variation mellem biologiske gentagelser. Men afhængigt af den nedstrøms anvendelse af valg, denne protokol kan let ændres til opnåelse betjene prøver fra enkelte individer. Endelig protokollen præsenteres her for unge, kan være nødvendigt at blive ændret for mus i forskellige aldre, køn eller stammer i henhold til de behov, som forskerne ND4 hunmus.
Sammenfattende denne kombination af blide enzymatisk, fordøje og diskontinuerlig gradient separation giver en enkel, effektiv og økonomisk metode til oprensning af immunceller fra inflammatoriske hudlæsioner hos mus. Det kan bruges og tilpasses bredt på tværs af en bred vifte af gnavere modeller af huden patologier som et praktisk værktøj til at vurdere immun infiltration og isolere en ren, levedygtig bestand af leukocytter for downstream-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske eller andre interesser at afsløre.
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 til DC), National Vulvodynia Association (pris til DC), og Macalester College støttet dette arbejde. CB modtog et stipendium fra Macalester College Beckman Scholars Program, finansieret af Arnold og Mabel Beckman Foundation. BTF og TM understøttes af JDRF 2-2011-662. Vi takker Dr. Jason Schenkel og Dr. Juliana Lewis for teknisk rådgivning, og alle nuværende og tidligere medlemmer af Chatterjea laboratorium for deres hjælp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
