Introduction
Кожные начиная от контактного дерматита, экземы, псориаз, целлюлит, грибковых инфекций и абсцессов к раку кожи немеланомных оказались среди 50 самых распространенных заболеваний во всем мире, и четвертый ведущий мировой причиной несмертельных болезней в 2010 году 1. Соответственно, исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе различных патологий кожи является необходимым и активной областью исследований. Моделях грызунов были чрезвычайно полезны в понимании воспалительных заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз 2 3, или золотистого стафилококка инфекции 4. Недорогие и эффективные, простые и протоколы для ферментативного переваривания ткани кожи мыши может предоставить препараты клеток, которые могут быть использованы для различных последующих применений, чтобы лучше понять патофизиологию заболеваний кожи. Здесь, простым и экономичным описан способ ферментативного гидролизата кожу мышиткани и выделение кожи лейкоцитов, что проникающих могут быть использованы для культивирования клеток, в естественных приемных передачи, анализа проточной цитометрии и сортировки или исследования экспрессии генов. Общая цель этой процедуры заключается в подготовке единой клеточной суспензии кожи инфильтрирующие лейкоцитов с высокой жизнеспособностью клеток при минимальных затратах, как правило, связанные с наборами реагентов на заказ и механических dissociators.
Существующие методы кожной ткани диссоциации 5-7 может привести к низкой жизнеспособности клеток и поверхностных маркеров целостности, или требовать пользовательские наборы ферментов и дорогие ткани диссоциации машины 8-11. В то время как переваривание мыши уха ткани кожи является достаточно распространенным 12-13, переваривая очень ороговевшей ткани кожи (например, с фланга) может привести к подготовке клеток зараженных с большим количеством неклеточным мусора. В недавнем исследовании, Заид и его коллеги усваивается мыши фланговый кожу в течение 90 мин в 2,5 мг / мл диспаза, Folloво главе с 45 мин в 3 мг / мл коллагеназы 7. В другом исследовании, эти исследователи использовали несколько инкубации с комбинированным переваривания 2,5 ч, в том числе использование трипсина / EDTA, коллагеназы III и диспаза 5. Применение трипсина не рекомендуется для ферментативного расщепления кожи, а лечение с помощью трипсина от разных производителей, как было показано заметно влияет на целостность белков клеточной поверхности на клетках млекопитающих 14-15. Кроме того, диспаза может иметь значительное влияние на пролиферативные способностей CD4 и CD8α Т-клеток и влияет на поверхности изобилие, по крайней мере 20 молекул, в том числе маркеров общего Т активации клеток, таких как CD62L 16. Другие протоколы используют RPMI 1640 в среде пищеварения 6. Тем не менее, наличие Mg 2+ и Ca 2+ в среде RPMI может вызвать агрегацию клеток обширные 17.
Идеальный протокол для ткани диссоциации должны стремиться к высокой жизнеспособности клеток, низкаяУровни агрегации клеток и минимальным повреждением клеточной поверхности белки. Высокое качество подготовки лимфатических узлов стромальных клеток были выполнены с протоколами, которые используют короткие инкубации фермента, Ca 2+ и Mg 2+ свободные средства массовой информации, и избежать трипсина и диспазу 18. Тем не менее, протоколы этого типа не были созданы для диссоциации всей кожи мыши.
Вот протокол описан отделить, изолировать и обогатить кожу проникают лейкоциты-от аллергена оспаривается мыши фланга кожи. Вкратце, вырезали кожу предварительно инкубировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 1 часа, чтобы смягчить ткань для пищеварения и удаления избытка кожи или мертвую жировую ткань. Это сопровождается 30 мин ферментативного расщепления шага с 0,7 мг / мл коллагеназы Д. коллагеназы D имеет минимальное воздействие на плотность маркеров клеточной поверхности и не оказывает влияния на пролиферацию Т-клеток в пробирке 16,18, что делает егохорошо подходит для применений, связанных с характеристику поверхностных белков. После ферментативного расщепления, разрывная центрифугирования в градиенте плотности используют для удаления эпителиальных клеток и мусора от одного суспензии клеток и обогащения кроветворных клеток. Важно отметить, что эта процедура позволяет избежать дорогих колонок на основе реагентов разделения магнитного клеток и тканей диссоциации машины 8-11, и может быть выполнена с оборудованием и материалов, находящихся в основной биомедицинской исследовательской лаборатории. Вот этот протокол был использован для выделения лейкоцитов с фланга кожи оспариваемые три раза гаптена оксазолона (Ox) в ранее сенсибилизированных ND4 швейцарских мышей (взято из 19). Клетки анализировали с помощью многопараметрического проточной цитометрии. Эта методика дала клеточной суспензии с минимальной мусора и> 95% жизнеспособности изолированных лимфоцитов, которые были проанализированы с помощью многопараметрического проточной цитометрии для измерения инфильтрацию Т-лимфоцитов и нейтрофилов в пострадавших SKв.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: 8-12 неделе летняя женщина ND4 Swiss Webster мышей, условно размещены в свободном доступе пищи и воды, были использованы для этих исследований экспериментальный протокол используется (B13S1) был утвержден IACUC Macalester колледжа..
1. Сенсибилизация и вызов с оксазолоном
- День 0
- Подготовка анестезии камеру добавлением 3 мл изофлуран к абсорбирующим полотенца, размещенных под сеткой в нижней части 4 л с крышкой стеклянную банку. Для самок мышей ND4 используемой здесь, время в камере 30-60 сек, пока объект не будет надлежащим образом под наркозом; оптимизировать обезболивающий администрацию за штамм мыши используется.
- Бритье спине каждого под наркозом мыши и обрамляют с помощью волос животных триммер.
- 1 день
- Делают 2% -ный раствор 4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она (Ox) в абсолютном этаноле, и инкубируют при 50 ° С в течение 15 мин на вращающейся пластины в инкубаторе.
- Кратко обезболитьмышей с помощью ИФ анестезии, как описано в 1.1.1 и применить 100 мкл 2% Быка, чтобы бритая назад в нескольких последовательных приложений около 20 мкл каждый. Подождите 5-10 сек между последовательными приложениями для решения для просушки.
- Позаботьтесь, чтобы избежать проливания 2% раствор Ох на других, чем сзади регионах, и ждать решения, чтобы высохнуть между приложениями.
- Дни 5-7
- Выполнить 1% -ный раствор (Ox) в абсолютном этаноле, и инкубируют при 50 ° С в течение 15 мин на вращающейся пластины в инкубаторе.
- Осторожно, но твердо иммобилизации мыши в загривок и основания хвоста с живота вверх и шеи слегка наклонена вниз (по аналогии с удержания для внутрибрюшинного введения) и применять 100 мкл 1% Быка на бритой фланге в нескольких последовательных приложений и нашли время, чтобы высушить кожу после, как описано выше.
- Для контрольных мышей, применяются 100 мкл абсолютного этанола транспортного средства к выбритой пирогк.
2. Пашина кожи Урожай
- Эвтаназии мышей, используя углерода вдыхания углекислого и осторожно вырезать нужный участок флангового кожи (~ 25 мм х 25 мм кожи) с 10 см хирургическими ножницами.
- Используя чистую, острым хирургическим скальпелем, соскрести излишки жира и соединительной ткани от кожи фланга.
- Поместите 3 части боковой поверхности кожи из 3 мышей из в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл HBSS RT [с фенолового красного, без кальция или магния, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1- пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS)].
3. Предварительно пищеварения ткани Стиральная
- Место трубки, содержащей фрагменты кожи на вращающейся пластины в течение 30 мин в сухом, не газированной инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Вортексе в течение 10 сек в конце инкубационного периода.
- Штамм содержимое трубки через 70 мкмфильтр для отмены промывочный буфер и собирать ткань. Один фильтр может быть повторно использован на протяжении всей процедуры в биологической группе лечения.
- Используя пару щипцов, передача фланг кожу от сетчатого фильтра в новый 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл свежего HBSS, РТ сред (содержащие ЭДТА, HEPES и FBS, как описано выше).
- С 12,5 см пары хирургических ножниц, погруженных рассекающих в трубку, пропустить через мясорубку каждый кусок флангового кожи, так что средняя часть ткани примерно 2,2 мм х 2,2 мм в области.
- Место трубки, содержащей фрагменты кожи на вращающейся пластины в течение 30 мин в сухом, не газированной инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Вортексе в течение 10 сек в конце инкубации
4. Коллагеназа Переваривание кожи
- Штамм содержимое трубки через 70 мкм сито, собирают и передают части задней поверхности кожи в новый 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл FRESH, РТ HBSS, дополненной 0,7 мг / мл коллагеназы D.
- Место трубку, содержащую среду пищеварение и фрагменты кожи на вращающейся пластины в течение 30 мин в сухом, не газированной инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Вихревые содержимое трубки энергично в течение 10 сек в конце инкубации.
- Фильтровать содержимое трубки через 70 мкм фильтр в новой 50 мл коническую трубку; держать проточные, содержащий переваренной ткани и отбросить фильтр и обрамляют мусора кожи.
- Вымойте проточный в 50 мл HBSS СМИ, центрифуги в течение 5 мин при 350 г, и переливать супернатант.
5. центрифугирования в градиенте плотности
- Использование серологических пипетки внести 3 мл 67% RT центрифугированием в градиенте плотности сред в 1X фосфатным буферным раствором (PBS) в новый 15 мл коническую пробирку для каждого образца.
- Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл РТ 44% центрифугирования в градиенте плотности информации в HBSS с фенолом красным.
- ДжентльменСлой лы 5 мл 44% центрифугированием в градиенте плотности среды, содержащей клетки в верхней части 67% центрифугированием в градиенте плотности образца с помощью средств массовой информации серологическое пипетки. Убедитесь, что для установки дозаторов к медленной скорости, и место пипеткой вдоль стены конической трубе. Будьте осторожны, чтобы не трясти, нарушить или инвертировать градиент.
- Установите разгон до самой низкой обстановке, отключить тормоз, и центрифуга градиент на 931 мкг в течение 20 мин при комнатной температуре, убедившись, что центрифуги сбалансированы.
- После центрифугирования, тщательно удалить градиент из центрифуги и осторожно транспортировать в лабораторию скамейке проведение трубки в вертикальном положении. Использование 5 мл пластиковые пипетки передачи, снимите слой клеток на поверхности раздела 44% и 67% центрифугирования в градиенте плотности информации и переход к новой 15 мл коническую трубку. Если интерфейс не отображается, просто удалить около 2 мл жидкости на 67% -44% границы.
- Заполните коническую трубку, содержащую клетки из интеrface с 2% FBS в 1X ледяной PBS, центрифугируют клетки течение 5 мин при 350 х г, и декантируют супернатант.
Примечание: Это первый случай, когда эти клетки могут быть охлаждены / держать в холоде, так как шаги пищеварения при 37 ° С и центрифугированием в градиенте плотности носителей шаги при комнатной температуре. Клетки могут быть повторно суспендируют в соотношении 1: 1 трипановым синим и подсчета разбавления и информации жизнеспособности могут быть получены в этой точке.
6. Блокировка и окрашивание для анализа потока цитометрии
- Блок FcγRII / рецепторы III на клетки, чтобы предотвратить неспецифическую окрашивание антител. Для экспериментов, описанных здесь, чтобы мастер-антитела в смеси PBS с 2% FBS, содержащей 1: 100 разбавление неконъюгированного антитела против CD16 / 32 (2.4G2) связывать и блокируют рецепторы FcγRII / III.
- Выдержите заблокированные ячейки с соответствующими мастер смесей антител против CD3ɛ (145-2С11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (М1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) и Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), а также Brilliant Violet 510 живой / мертвый пятно, чтобы идентифицировать мертвые клетки. Используйте все антитела либо при разведении рекомендованных производителями или ранее оптимизированной исследователями. Для экспериментов, описанных здесь, используют все антитела в разведении 1: 100.
- Промыть клетки и ресуспендируют в 50 мкл 1X PBS буфера окрашивания с 2% FBS. Держать на льду пока данные не флуоресценции могут быть приобретены на проточном цитометре.
Примечание: Важно, чтобы параметры компенсации заранее оптимизирована с лимфоидной ткани и общей поверхности антигена клеточной (например, CD4 или CD8) до получения данных флуоресценции. - Для увеличения количества клеток для последующего анализа методом проточной цитометрии, получать данные из целых образцов окрашенных клеток.
7. Анализ проточной цитометрии данных с помощью стандартных методов для выполнения шагов, описанных ниже
- Во-первых, ворота на области лимфоцитов переднего разброса(область) с боковой разброс (область) участка.
- Затем выберите отдельные клетки, используя вперед разброс (ширина) по стороне рассеяния (ширина), чтобы избежать анализа дублеты. Это также может быть достигнуто с передней высоте рассеяния бок высота разброс участка.
- Затем ворота на линии (CD11b, CD11c, CD45R и / B220) -отрицательное и CD3-позитивных событий, чтобы исключить макрофаги, дендритные клетки, В-клетки и, соответственно, и ограничить анализ на клеточный компартмент T, если целью является, как здесь, чтобы оценить проникновение Т-клеток.
- Далее, ворота на живые клетки, которые исключают живое / мертвое пятно.
- Наконец, ворота на популяции клеток интерес (см репрезентативные результаты раздел).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Коллагеназа D лечение спленоцитов показывают, что аналогичные уровни CD4 и CD8 альфа на Т-клеток по сравнению с медиа-лечение управления
Во-первых, любые потенциальные последствия коллагеназы D от частоты и поверхностной обилие происхождение и активации маркеров на Т-клеток подмножеств были оценены с использованием вторичных лимфоидных тканей в качестве контроля. Суспензию спленоцитов были получены от мышей ND4 и промывают в течение 1 ч с HBSS сред. Далее, половина клетки подвергают 0,7 мг / мл коллагеназы D (как описано выше в разделе 4). Остальные клетки ресуспендировали в HBSS управления средой. Далее, оба спленоцитов фракции обрабатывались с помощью центрифугирования градиент плотности, как описано в разделе 5 выше. Затем клетки окрашивали антителами против CD4 поверхностной и CD8α и анализировали на проточном цитометре. Одноместный, жить, CD45 +, не-Т Lineage - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + клетки закрытого для анализа, чтобы исключить В-клеток, макрофаги, дендритные клетки. CD4 и CD8α белки одинаково обнаружен на поверхности спленоцитов, которые были подвергнуты коллагеназы D пищеварение и те не были подвержены фермента с примерно 60% CD4 + CD8α - клеток и 30% CD4 - CD8α + клетки обнаружены либо лечения ( 1А). Таким образом, коллагеназы D дайджест не влияет на относительную частоту CD4 и CD8α. Интенсивность поверхности CD4 и CD8α среднее геометрическое флуоресценции единиц (gMFI) на этих подмножеств также сопоставимы между двумя группами лечения; Значения gMFI для CD4 были 2271 для обработанную ферментом и 2 243 для управления спленоцитов, соответственно, и значения gMFI для CD8α были 536 для обработанную ферментом и 520 для управления спленоцитов. Ферментативная обработка также не имели никакого эффекта на поверхностной плотности активации Т-клеток маркеры CD44 или CD62L на CD4 + Т-клеток (рис 1B). Геометрические средние значения интенсивности флуоресценции для CD44 были 669 фермент-лечение и 654 для управления спленоцитов; Значения gMFI для CD62L были 1523 для обработанную ферментом и 1 517 для управления спленоцитов. В коллагеназы D пищеварения сохраняет целостность поверхностных белков клеток на изолированных, протокол, описанный здесь, может быть использован с уверенностью для нисходящего проточной цитометрии.
Фермент пищеварение и градиент очистка кожи фланг клеток приводит к высокой жизнеспособности клеток
Выход клеток и процента жизнеспособности клеточной суспензии полученного выше были оценены с использованием трипанового синего красителя исключение 20. Этот протокол разделения пищеварение и градиент дали около 250 жизнеспособных клеток на иммунный мм 2 фланговых ткани в Ох-зараженных мышей и около 4 жизнеспособных клеток на иммунный мм 2 ткани на транспортных оспаривается мышейкоторые были ранее сенсибилизированных Ox (таблица 1).
Фермент пищеварение и градиент очистка фланг клетки кожи приводит быстрое восстановление иммунных клеток
Далее, степень иммунной инфильтрации в коже определяли путем анализа обилие CD45 поверхностных белков на клетках, выделенных из фланге Бык-вызов и контрольных мышей, чтобы оценить восстановление кожи инфильтрирующие иммунных клеток, используя методы, описанные здесь. CD45 является пан-гемопоэтических линия маркера 21. 95% низкого вперед и боковой разброс, отдельные клетки (стробирования не показан) в Ох-зараженных мышей и 71% этих клеток в транспортных средствах вызов управления были живы CD45 + клетки (фигура 2). А ~ 67-кратное увеличение CD45 +, проникающих иммунных клеток было обнаружено в бок кожи Эти 3 ежедневные проблемы Ох используя процедуру, описанную в данном документе (Таблица 1).
"1"> Три вызовы фланг Ox привести к выраженной инфильтрацией Т-клеток и нейтрофилов
Наша методика дала популяции клеток от боковой поверхности кожи, которые могут быть использованы для обнаружения различных миелоидных и лимфоидных клеток подмножеств, таких как GR-1 + нейтрофилов 22, лимфоцитов CD4 и CD8α Т-клеток. Мы наблюдали ~ 6 раз, ~ 7 раз, а ~ 73-кратное увеличение нейтрофилов, лимфоцитов CD4 и CD8α Т-клетки, соответственно, после 3 ежедневные проблемы OX (таблица 1). Мы рассчитали эти увеличения умножением общего количества жизнеспособных клеток, полученных (подсчитывали с использованием трипанового синего) на процент данного фрагмента иммунной клетки из ворот жизнеспособных клеток во время анализа проточной цитометрии. Затем разделить количество жизнеспособных клеток общего, иммунных GR-1 +, CD4 +, или CD8α + клеток в Ox-обработанных мышей соответствующими номерами для контрольных мышей транспортного средства, дает намкратное повышение лимфоцитов подмножеств. GR-1 + нейтрофилы составили 42% от единого живого CD45 + B220 - CD11b - CD11c - клеток в Ох-мышей и 10% этого населения в этанол-мышей (2В). В Ox-мышей, ~ 52% закрытых CD3 + Т-клеток были CD8α + и ~ 34% CD4 +, в то время как в контрольной группе транспортных средств, ~ 9% Т-клеток были CD8α + 57% были CD4 + (рис 2С) , Таким образом, при использовании метода описано здесь, аллергический и неаллергический кожи фланг могут быть обработаны с получением суспензии одноклеточные, пригодные для высокого разрешения проточной цитометрии характеристики проникновения подмножества иммунных клеток.
| Клетки подмножества из кожи мыши фланга | Ох / Бык (3) | Ох / этанол (3) | Сложите Расширение (Ох / Ethanol) |
| на мм 2 ткани | |||
| Общее количество клеток | 262,7 | 5.3 | 49,3 |
| CD45 + клетки иммунной | 250,7 | 3.8 | 66,7 |
| CD4 + CD8 - клетки | 6.5 | 0.9 | 7.2 |
| CD4 - CD8 + клетки | 10.6 | 0,1 | 72,9 |
| Нейтрофилы | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
Таблица 1. Сотовые урожайность аллергической кожи фланга в самок мышей ND4. Жизнеспособные клетки, выделенные из боковой поверхности кожи подсчитывали с использованием трипанового синего, и нормализовали к клеткам / мм 2 ткани на основе площади кожи изолированы и количество мышей объединяли в TISподать в суд на подготовку. Мы рассчитали общий выход иммунных клеток, основанный на обнаружении антигена кроветворной CD45 на поверхности клетки, и лимфоцитов урожайности на основе подмножества клона конкретных поверхностных маркеров. Затем разделить число клеток в Ох-обработанных мышей по номерам для контрольных мышей транспортного средства, что дает нам кратное повышение субпопуляций лимфоцитов. Данные, приведенные представляют объединенные данные из 2-3 мышей на лечение, и представитель двух независимых экспериментов.
Рисунок 1. ферментативного расщепления и градиент очистка спленоцитов сохранить субпопуляций лимфоцитов и клеток маркеров активации. Спленоциты промывали в течение 1 ч с HBSS информации, инкубировали либо с коллагеназой D или только HBSS сред и очищали с использованием градиента плотности для удаления мусора и эритроциты. Т-клетки были идентифицированы как жить, CD45 +, линии (В220, CD11b, CD11c) <SUP> -, и CD3ɛ +. Частота CD4 и CD8α Т-клеток не изменяется после ферментативного расщепления (A). Поверхностная плотность CD44 и CD62L на CD4 + Т-клеток не изменить следующие ферментативного расщепления (B). Данные, приведенные представляют объединенные данные 2-3 мышей на лечение из одного эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фермент пищеварение и градиент очистка клеток кожи выявить явное проникновение в иммунную контроля против аллергена оспаривается мыши фланга кожи. Три проблемы фланг Ox произвести ~ 67-кратное увеличение кожи инфильтрирующие иммунных клеток в ранее сенсибилизированных ND4 швейцарских мышей ( А). Три Ox проблемы также провОКЭД на ~ 6-кратное увеличение GR-1 + нейтрофилов (В), и ~ 73- и 7 ~-кратное увеличение клеток CD8α + и CD4 + Т-соответственно (С). Живая CD45 + иммунные клетки закрытого одно-, низких вперед и боковых клеток рассеяния; нейтрофилы и Т-клетки закрытых от B220 - CD11b - CD11c - живые клетки. одиночные Графы проводили с использованием 1: 1 трипановым синим разбавление после отделения в градиенте плотности. Данные, приведенные представляет объединенные данные 2-3 мышей в каждой группе, и представитель двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Характеризующий изменение кожных резидентные лейкоцитов в моделях грызунов кожных заболеваний, таких как атопический дерматит и псориаз важно для понимания механистических связей между притоком воспалительных клеток и патологии болезни. Здесь мы опишем экономичный метод, чтобы изолировать лейкоциты из ткани кожи с основным оборудованием найдены в большинстве биомедицинских исследовательских лабораторий. Это относительно быстрый метод позволяет избежать использования дорогостоящих тканей диссоциации машин и пользовательских труб и реагентов, помогая экономить ресурсы при минимизации практический время на лабораторном столе. Нежный ферментативная переварить и прерывистым разделение градиент удалить большинство эпителиальных клеток и мусора, и изолированных клеток могут быть использованы для различных применений, включая вниз по течению анализа проточной цитометрии, сортировки клеток, передача, культуры клеток и в пробирке стимуляции анализов. Ферментативный дайджест с коллагеназы D не имеет никакого влияния на Т клеточной поверхности маркера целостности и preserVES Жизнеспособность клеток. Этот протокол может быть легко изменен для обработки кожи от других, чем фланкирующие участки.
Наиболее важные шаги в этой процедуре являются: 1) тщательно удаляя жировой и соединительной ткани при уборке кожу, 2) обработка и переработка ткани быстро увеличить проникновение выход клеток при минимизации гибели клеток, 3) осторожно слоев градиент, и 4) тщательно извлечение интерфейса градиента. Перед началом масштабный эксперимент важно практиковать градиент плотности центрифугирования СМИ наслоение и удаление интерфейса. Можно практиковать сбора клеток из градиента плотности дисперсной путем дробления весь селезенки мыши через 70 мкм сито в 1X PBS буфера и окрашивания выполнения градиент плотности, как описано выше в пункте 5. Это гораздо легче увидеть и извлечь интерфейс между 44% градиент плотности центрифугирования СМИ и 67% градиент плотности центрифугирования СМИ, использующие зрlenocytes, из-за большого количества иммунных клеток, присутствующих.
При работе с градиентов плотности, пузырьки следует избегать наконечник пипетки при, и градиент нарушения должно быть минимизировано. Конической трубе, содержащий градиент должны быть обработаны мягко и в вертикальном во все времена. Центрифугирования в градиенте плотности мультимедийных решений всегда должна быть при комнатной температуре, серологические пипетки, установленные на самой медленной скорости высвобождения возможной, центрифуги, поддерживаемой при комнатной температуре, установленной с низким ускорением с тормозом в нейтральном положении, и тщательно сбалансированы перед формованием. При работе с препаратами кожи, которые дают небольшие цифры от проникающих лейкоцитов, клеток не всегда видны на поверхности градиента. Таким образом, важно, чтобы сделать 44% центрифугирования в градиенте плотности среды с HBSS, содержащего фенол красный, так что интерфейс может быть легко визуализировать даже когда слой клеток не может различить. Кроме того, важно, чтобы быть нежным, но быстры при извлечении, стиральнаяи обработки ткани кожи, чтобы избежать гибели клеток, прежде чем кожа находится в средствах массовой информации HBSS.
Если жизнеспособность клеток или чистота низка, короче (~ 20 мин) раз пищеварения, слегка более низкие концентрации коллагеназы D (~ 0,5 мг / мл), или мясорубки ткани более точно может быть полезным. Потому что более-пищеварения и деградации ткани может способствовать гибели клеток, исследователи должны оптимизировать минимальное время пищеварения, который обеспечивает достаточно большой размер выборки клеток 17. Процесс, скорее всего, потребуется несколько раундов оптимизации в руках отдельных исследователей стандартизировать технику. Коллагеназа D уровень активности также может меняться между производственными партиями и корректировки времени пищеварения должны быть сделаны для каждой партии фермента, используемого. В процессе оптимизации, важно клеточных суспензий опорных пятен (например селезенки), очищенный с и без ферментативной переварить шаг с надежного живой / мертвой пятна, а также иммунных клеток LinEAGE маркеры (например, CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, и т.д.), чтобы убедиться, что клеточные популяции и поверхностные маркеры интерес сохраняется в процессе пищеварения ткани. Если возможно, было бы полезно, чтобы выполнить оптимизацию на поток цитометр, который может измерять вперед и ширина боковой разброс или высота, а также площадь, чтобы исключить клеточных агрегатов. Наконец, клеточные суспензии должны быть рассмотрены в световом микроскопе для визуальной оценки жизнеспособности и общего клеточной морфологии. Клетки можно пересчитать вручную с помощью 0,4% красителя исключение трипанового синего под световым микроскопом или на проточном цитометре с помощью подсчета шарики. Для исследований, которые требуют более строгой количественной оценки конкретных типов клеток в вырезанной ткани, исследователи могут весить или измерить объем фрагментов ткани до и после варки, и использовать степень переваривания, чтобы более точно оценить количество клеток подмножеств, присутствующей в ткани существа проанализированы.
Одним из ограничений этогоПротокол является то, что специально приспособлено к очистке иммунных клеток. Если кто-то заинтересован в изоляции, очистки и анализа другого клеточной популяции (например, кожи эпителиальных клеток), градиент плотности настройки и ферментативная переварить протокол и, скорее всего, должны быть изменены и оптимизированы, чтобы наилучшим образом изолировать клетки интерес. Тем не менее, этот протокол позволяет выделения и очистки обеих лимфоидных и миелоидных клеток подмножеств и, таким образом, быть адаптирована к наиболее иммунологических применений. Другим ограничением является то, что этот протокол не может быть использован для различения клеточных популяций, проникающих в дерму по сравнению с эпидермиса кожи. Для достижения этого уровня дифференциации, этот протокол должен быть дополнительно приспособлен дополнительные шаги, чтобы отделить ферментативно дермы и эпидермиса до или вместо шаги, описанные здесь. Здесь образцы объединяли с ~ 3 мышей, чтобы облегчить многопараметрический анализ проточной цитометрии что затрудняетобнаружить изменчивость между биологических повторяет. Тем не менее, в зависимости от выходной применения выбора, этот протокол может быть легко изменен, чтобы получить образцы и использовать из отдельных предметов. Наконец, протокол, представленные здесь молодой, самок мышей ND4 возможно, должны быть изменены для мышей разных возрастов, пола или штаммов в соответствии с потребностями исследователей.
В целом, эта комбинация нежной ферментативных переварить и прерывистым разделение градиент обеспечивает простой, эффективный и экономичный способ очистки иммунные клетки от воспалительных поражений кожи у мышей. Он может быть использован и адаптирован в целом по разнообразных грызунов моделей патологий кожи в качестве удобного инструмента для оценки иммунной инфильтрации и изолировать чистый, жизнеспособной популяции лейкоцитов ниже по течению приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких финансовых или других интересов раскрывать.
Acknowledgments
Национальные институты здоровья (NIH R15 NS067536-01A1 для постоянного тока), Национальный Вульводиния ассоциация (награда, округ Колумбия), и Macalester колледж поддерживает эту работу. ЦБ получил стипендию от колледжа Макалестер Beckman Ученые программы, финансируемой Арнольд и Мейбл Beckman Foundation. БТФ и ТМ поддерживаются JDRF 2-2011-662. Мы благодарим доктора Джейсона Schenkel и д-р Юлиана Льюис за технической консультацией, и все нынешние и бывшие члены лаборатории Chatterjea за помощь и поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
