Introduction
Hudsykdommer som spenner fra kontakteksem, eksem, psoriasis, cellulitt, soppinfeksjoner og abscesser til ikke-melanom hudkreft ble funnet å være blant de 50 mest utbredte sykdommer over hele verden, og den fjerde ledende global årsak til ikke-dødelige sykdommer i 2010 en. Følgelig er undersøkelse av molekylære og cellulære mekanismer som ligger under forskjellige hud patologier en nødvendig og aktivt forskningsområde. Gnagermodeller har vært bemerkelsesverdig nyttig i forståelsen av inflammatoriske hudsykdommer som atopisk dermatitt 2, psoriasis 3, eller Staphylococcus aureus infeksjon 4. Billige, effektive og enkle protokoller for den enzymatiske fordøyelse av musehud vev kan tilveiebringe preparater av celler som kan brukes for en rekke forskjellige anvendelser nedstrøms for bedre å forstå patofysiologien av hudsykdommer. Her er en enkel og økonomisk metode beskrevet for enzymatisk sammendrag av mus hudvev og isolering av hud infiltrerende leukocytter som kan anvendes for cellekultur, in vivo adoptiv overføring, flowcytometrisk analyse og sortering eller genuttrykkstudier. Det overordnede målet med denne prosedyren er å forberede en enkelt celle suspensjon av hud-infiltrerende leukocytter med høy celleviabilitet samtidig minimere kostnader vanligvis forbundet med tilpassede reagenser og mekaniske dissociators.
Eksisterende huden vev dissosiasjon metoder 5-7 kan føre til lav celle levedyktighet og overflate markør integritet, eller krever tilpassede enzym kits og dyre vev dissosiasjon maskiner 8-11. Mens spaltning av museøre hudvev er rimelig utbredt 12-13, bearbeider sterkt keratiniserte hudvev (for eksempel fra flanken) kan resultere i cellepreparater som er forurenset med store mengder av ikke-cellulært avfall. I en fersk undersøkelse, Zaid og kolleger fordøyd mus flanke huden i 90 minutter i 2,5 mg / ml dispase, folloonsdag etter 45 min i 3 mg / ml kollagenase 7. I en annen studie disse forskerne anvendes flere inkuberinger med en kombinert fordøyelse av 2,5 timer, herunder bruk av trypsin / EDTA, kollagenase III, og dispase 5. Bruken av trypsin er ikke anbefalt for enzymatisk fordøyelse hud, som behandling med trypsin fra forskjellige produsenter har vist seg å målbart påvirke integriteten av celleoverflateproteiner på pattedyrceller 14-15. I tillegg kan dispase ha betydelige effekter på proliferative egenskaper av CD4-T-celler og CD8a og påvirke overflate mengde på minst 20 molekyler, inkludert vanlig T-celleaktivering markører slik som CD62L 16. Andre protokoller bruke RPMI 1640 i fordøyelsen medium 6. Imidlertid kan tilstedeværelsen av Mg2 + og Ca2 + i RPMI forårsake omfattende celle 17 aggregering.
En ideell protokoll for vev dissosiasjon bør satse på høy celle levedyktighet, lavnivåer av celle aggregering, og minimal skade på celleoverflateproteiner. Høy kvalitet lymfeknute stromal cellepreparater har blitt oppnådd med protokoller som bruker kortere enzym inkuberinger, Ca 2+ og Mg 2+ frie medier, og unngå trypsin og dispase 18. Imidlertid protokoller av denne type er ikke blitt fastslått for dissosiasjon av hele musehud.
Her er en protokoll beskrevet å distansere, isolere og berike hud-infiltrerende leukocytter fra allergen-utfordret mus flanke huden. I korthet spaltet hud er pre-inkubert i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 10% føtalt bovint serum i 1 time for å myke vevet i fordøyelsen og fjerne overflødig død hud eller fettvev. Dette er etterfulgt av en 30 min enzymatisk digereringstrinnet med 0,7 mg / ml kollagenase D. Kollagenase D har minimale virkninger på tettheten av celleoverflatemarkører, og ingen virkning på T-celleformering in vitro 16,18, slik at detsvært godt egnet for anvendelser som involverer karakterisering av overflateproteiner. Etter enzymatisk fordøyelse, ble diskontinuerlig tetthetsgradient sentrifugering brukes til å fjerne epitelceller og rusk fra enkeltcellesuspensjon og anrike for hematopoetiske celler. Viktigere, unngår denne prosedyre kostkolonnebasert magnetisk celleseparasjonsreagenser og vev dissosiasjon maskiner 8-11, og kan utføres med utstyr og materialer som finnes i en grunnleggende laboratorie biomedisinsk forskning. Her denne protokollen ble brukt til å isolere leukocytter fra flanken huden utfordret tre ganger med haptenet oksazolon (Ox) i tidligere sensibilisert ND4 sveitsiske mus (tilpasset fra 19). Celler ble analysert ved hjelp av multi-parametriske flowcytometri. Denne teknikk ga en cellesuspensjon med minimalt avfall og> 95% levedyktigheten av isolerte lymfocytter som ble analysert ved hjelp av multi-parametriske strømningscytometri for å måle infiltrasjon av T-lymfocytter og neutrofiler inn i det berørte ski.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: 8-12 uker gammel kvinnelig ND4 sveitsiske Webster mus, konvensjonelt plassert med fri tilgang til mat og vann, ble brukt for disse studiene Den eksperimentelle protokollen som brukes (B13S1) ble godkjent av Macalester College IACUC..
1. Sensibilisering og Challenge med oksazolon
- Dag 0
- Forbered anestesi kammeret ved å tilsette 3 ml isofluran absorberende håndklær plasseres under mesh på bunnen av en 4 L lokk glasskrukke. For ND4 hunnmus anvendt her, tid i kammeret er 30-60 sekunder inntil emnet er tilstrekkelig bedøvet; optimalisere bedøvelse administrering for musestamme som brukes.
- Barbere hver bedøvet mus rygg og flanke ved hjelp av et dyr hår trimmer.
- Dag 1
- Foreta en 2% løsning av 4-etoksymetylen-2-fenyl-2-oksazolin-5-on (Ox) i absolutt etanol, og inkuber ved 50 ° C i 15 min på en roterende plate i en inkubator.
- I korthet bedøvemus ved bruk isofluran anestesi som beskrevet i 1.1.1 og anvende 100 ul av 2% Ox til det barberte ryggen i flere serielle anvendelser av ca. 20 ul hver. Vent 5-10 sek mellom serie søknader om løsningen til tørk.
- Pass på å unngå å søle 2% Ox løsning på andre enn baksiden regioner, og vente på løsningen til tørk mellom applikasjoner.
- Days 5-7
- Foreta en 1% løsning av (Ox) i absolutt etanol, og inkuber ved 50 ° C i 15 min på en roterende plate i en inkubator.
- Forsiktig, men bestemt immobilisere musen i nakkeskinnet og hale base med buken opp og halsen litt på skrå nedover (ligner på et tak for en intraperitoneal injeksjon) og gjelder 100 ul 1% Ox til barbert flanke i flere serieanvendelser og tar deg tid til å tørke ut huden etterpå som beskrevet ovenfor.
- For kontroll mus, gjelder 100 ul absolutt etanol bilen til barbert puddingenk.
2. Flanke Skin Harvests
- Avlive mus ved bruk av karbondioksid inhalering, og nøye eksisere det ønskede område av flanken huden (~ 25 mm x 25 mm av hud) med 10 cm kirurgiske sakser.
- Ved hjelp av en ren, skarp kirurgisk kniv, skrape vekk overflødig fett og bindevev fra flanken huden.
- Plasser 3 stykker av flanken hud fra 3 mus i et 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml RT HBSS [med fenolrødt, uten kalsium eller magnesium, 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1- piperazinetansulfonsyre (HEPES), og 10% føtalt bovint serum (FBS)].
3. Pre-fordøyelse Tissue Vaske
- Plasser røret som inneholder hud fragmenter på en roterende plate i 30 minutter i et tørt ikke-gasset inkubator holdt ved 37 ° C.
- Vortex kraftig i 10 sekunder ved slutten av inkubasjonsperioden.
- Sil innholdet i røret gjennom en 70 umsil for å forkaste vaskebuffer og samle vev. En enkelt sil kan brukes om igjen under hele prosedyren innen en biologisk behandlingsgruppe.
- Ved hjelp av en pinsett, overføre flanke huden fra silen inn i en ny 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml friskt, RT HBSS medium (inneholdende EDTA, HEPES, og FBS som beskrevet ovenfor).
- Med en 12,5 cm par kirurgiske disseksjonssaksen neddykket i røret, hakke hvert stykke flanke huden slik at den gjennomsnittlige stykke vev er ca. 2,2 mm x 2,2 mm i areal.
- Plasser røret som inneholder hud fragmenter på en roterende plate i 30 minutter i et tørt ikke-gasset inkubator holdt ved 37 ° C.
- Vortex kraftig i 10 sekunder ved slutten av inkubasjonen
4. Kollagenase Fordøyelse av Skin
- Sil innholdet i røret gjennom en 70 um sil, samle inn og overføre flanke huden bitene til et nytt 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml fresh, RT HBSS media supplert med 0,7 mg / ml kollagenase D.
- Sted rør inneholdende medium fordøyelse og skinnfragmenter på en roterende plate i 30 minutter i et tørt ikke-gasset inkubator holdt ved 37 ° C.
- Virvel innholdet i røret kraftig i 10 sekunder ved slutten av inkubasjonen.
- Filtrer innholdet i røret gjennom en 70 mikrometer sil inn i en ny 50 ml konisk rør; holde gjennomstrømningsinneholdende spaltet vev og kast silen og flanken hud rusk.
- Vask gjennomstrømnings i 50 ml HBSS media, sentrifuger i 5 minutter ved 350 g, og dekanter supernatanten.
5. densitetsgradientsentrifugering
- Ved hjelp av en serologisk pipette, tilsett 3 ml RT 67% densitetsgradientsentrifugering media i 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) inn i en ny 15 ml konisk rør for hver prøve.
- Cellepelleten suspenderes i 5 ml 44% RT densitetsgradientsentrifugering medier i HBSS med fenol rød.
- Gently lag 5 ml av den 44% densitetsgradientsentrifugering medium inneholdende celler på toppen av 67% densitetsgradientsentrifugering media prøve ved anvendelse av en serologisk pipette. Sørg for å sette pipetten i laveste hastighet, og plasser pipette langs veggen av den koniske rør. Vær forsiktig med å riste, forstyrre, eller invertere gradient.
- Still akselerasjon til laveste innstilling, løsne bremsen, og sentrifuger gradient ved 931 xg i 20 min ved RT å sørge for at sentrifugen er balansert.
- Etter sentrifugering, fjern forsiktig gradienten fra sentrifugen, og forsiktig transportere til laboratoriebenken holder røret oppreist. Ved hjelp av et 5 ml plast-overføring pipette, fjerne cellelaget ved grenseflaten av de 44% og 67% densitetsgradientsentrifugering medier og overføring til et nytt 15 ml konisk rør. Hvis grensesnittet ikke er synlig, er det bare å fjerne omtrent 2 ml flytende på 67% -44% grense.
- Fyll konisk rør som inneholder celler fra interface med 2% FBS i 1 x iskald PBS, sentrifuger cellene i 5 min ved 350 x g, og dekanter supernatanten.
Merk: Dette er første gang at cellene kan kjøles / oppbevares kaldt siden oppslutningstrinn er ved 37 ° C, og fremgangsmåten densitetsgradientsentrifugering medier er ved RT. Celler kan resuspenderes i en 1: 1 fortynning og Trypan blå tellinger og levedyktighet informasjon kan fås ved dette punktet.
6. Blokkering og farging for Flowcytometriske Analysis
- Blokk FcγRII / III-reseptorer på celler for å forhindre ikke-spesifikk antistoff-farging. For forsøkene beskrevet her, gjør antistoff Master Mix i PBS med 2% FBS inneholder 1: 100 fortynning av konjugert antistoff mot CD16 / 32 (2.4G2) til å binde og blokkere FcγRII / III reseptorer.
- Inkuber blokkerte celler med passende mester mikser av antistoffer mot CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53 til 6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), og Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), samt Brilliant Violet 510 levende / død flekken for å identifisere døde celler. Bruk alle antistoffer enten ved fortynning anbefalt av produsenter eller tidligere optimalisert av forskere. For forsøkene beskrevet her, kan du bruke alle antistoffer ved 1: 100 fortynning.
- Vask cellene og resuspender i 50 pl 1 x PBS-buffer farging med 2% FBS. Hold på is inntil fluorescens data kan bli kjøpt på en strømningscytometer.
Merk: Det er viktig å ha kompensasjon parametere pre-optimalisert med en lymfevev og en felles celleoverflateantigen (som CD4 eller CD8) før oppkjøpet av fluorescens data. - For å øke antall celler for nedstrøms strømningscytometri-analyse, innhente data fra hele prøver av fargede celler.
7. Analyser flowcytometrisystemer data ved hjelp av standardmetoder for å oppnå stegene skissert nedenfor
- Først gate på lymfocytt-regionen i den fremre sprednings(område) ved side scatter (område) plot.
- Deretter velger du enkeltceller ved hjelp av fremover scatter (bredde) ved side scatter (bredde), for å unngå å analysere dubletter. Dette kan også gjøres med en skrå scatter høyde ved side scatter høyde plott.
- Deretter gate på avstamning (CD11b, CD11c, og CD45R / B220) -negative og CD3-positive hendelser, for å utelukke makrofager, dendrittiske celler og B-celler, henholdsvis, og begrens analyser til T-celle, hvis målet er, som det er her, for å vurdere infiltrerende T-celler.
- Deretter gate på levende celler som utelukker levende / døde flekken.
- Endelig gate på cellepopulasjon av interesse (se representative resultater avsnitt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kollagenase D behandlet splenocytter viser tilsvarende nivåer av CD4 og CD8 T-celler på α i forhold til medie-behandlede kontroller
Først ble en eventuell skadelig virkning av kollagenase D på frekvens og overflate overflod av avstamning og aktivisering markører på T-celle undergrupper vurdert ved hjelp av sekundær lymfevev som kontroll. En suspensjon av splenocytter ble oppnådd fra ND4 mus og vasket i 1 time med HBSS media. Deretter halvparten av cellene utsatt for 0,7 mg / ml Collagenase D (som beskrevet i punkt 4 ovenfor). De gjenværende celler ble resuspendert i HBSS kontrollmediet. Deretter ble begge splenocytt fraksjoner behandles ved hjelp av en densitetssentrifugering gradient som beskrevet i punkt 5 ovenfor. Cellene ble deretter farget med antistoffer mot overflate CD4 og CD8a, og analysert på strømningscytometer. Singel, live, CD45 +, non-T avstamning - (B220 - CD11b -CD11c -), ble CD3ɛ + -celler gated for analyse, for å utelukke B-celler, makrofager, dendrittiske celler. CD4 og CD8a proteiner ble like detektert på overflaten av splenocytter som var blitt utsatt for kollagenase D fordøyelse og de som ikke hadde blitt utsatt for enzym med ca 60% CD4 + CD8a - celler og 30% CD4 - CD8a + celler påvist med enten behandling ( figur 1A). Derfor gjorde kollagenase D sammendrag ikke påvirke den relative hyppigheten av CD4 og CD8a. Intensiteter av overflaten CD4 og CD8a geometrisk gjennomsnitt fluorescensenheter (gMFI) på følgende undergrupper var også sammenlignbar mellom de to behandlinger; gMFI verdier for CD4 var 2271 for enzymbehandlet og 2243 for henholdsvis kontroll-splenocytter og gMFI verdier for CD8a var 536 for enzymbehandlet og 520 for kontroll splenocytter. Enzymatisk behandling hadde heller ingen effekt på overflaten tettheten av T-celleaktivering markører CD44 eller CD62L på CD4 + T-celler (figur 1B). Geometriske gjennomsnitts fluorescens intensitetsverdiene for CD44 var 669 for enzymbehandlet og 654 for kontroll splenocytes; gMFI verdier for CD62L var 1523 for enzymbehandlet og 1517 for kontroll splenocytes. Som Kollagenase D fordøyelsen beholder integriteten av overflateproteiner på isolerte celler, kan protokollen beskrevet her brukes med tillit for nedstrøms flowcytometri analyse.
Enzym fordøyelsen og gradient rensing av flanke hudceller gir høy cellular levedyktighet
Celleutbyttet og prosent levedyktigheten av cellesuspensjonen oppnådd ovenfor, ble vurdert ved hjelp av Trypan blå fargestoff utelukkelse 20. Dette fordøyelsen og gradientseparasjon protokoll ga ca 250 levedyktige immunceller per mm 2 av flanke vev i Ox-utfordret mus og ca 4 levedyktige immunceller per mm 2 av vev i kjøretøy utfordret mussom tidligere var sensibilisert med Ox (tabell 1).
Enzym fordøyelsen og gradient rensing av flanke hudceller resultater i robust utvinning av immunceller
Deretter ble graden av immun infiltrasjon i huden bestemmes ved å analysere overflod av CD45 overflateproteiner i celler isolert fra flanken av Ox-utfordret og kontrollmus å vurdere utvinning av hud-infiltrerende immunceller ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet her. CD45 er et pan-blodkreft avstamning markør 21. 95% av lave forover og side scatter, enkeltceller (gating ikke vist) i Ox-mus utfordret og 71% av disse cellene i kjøretøy utfordret kontroller var levende CD45 + celler (figur 2). A ~ 67 ganger økning i infiltrere CD45 + immunceller ble oppdaget i flanken huden etter 3 daglige Ox utfordringer ved bruk av prosedyren er beskrevet her (tabell 1).
Tre flanke Ox utfordringer medføre uttalt infiltrasjon av T-celler og nøytrofile
Vår teknikk ga en cellepopulasjon fra kanten hud som kan brukes til å detektere en rekke myeloid og lymfoide celleundergrupper som Gr-1 + nøytrofiler 22, CD4 T-celler og T-celler CD8a. Vi har observert ~ 6-fold, ~ 7-fold, og ~ 73-gangers økninger i neutrofiler, CD4 T-celler, og CD8a T-celler, henholdsvis, etter 3 daglige Ox utfordringer (tabell 1). Vi beregnet disse økningene ved å multiplisere det totale antall levedyktige celler ble oppnådd (telt ved bruk av trypanblått eksklusjon) ved den prosent av den gitte immunceller fragment ut av levedyktige celler porten under flowcytometrisk analyse. Vi deretter delt antall levedyktige totale immunceller, Gr-1 +, CD4 +, eller CD8a + -celler i Ox-behandlede mus ved de tilsvarende tall for kjøretøy kontrollmusene, noe som gir ossfold økning i lymfocytt undergrupper. Gr-1 + nøytrofile stod for 42% av singel, live CD45 + B220 - CD11b - CD11c - celler i Ox-behandlede mus og 10% av denne befolkningen i EtOH-behandlede mus (Figur 2B). I Ox-behandlede mus, ~ 52% av gated CD3 + T-celler var CD8a + og ~ 34% ble CD4 +, mens det i bærerkontroller, ~ 9% av T-cellene ble CD8a + og 57% var CD4 + (figur 2C) . Derfor, med den teknikk som er beskrevet her, allergisk og ikke-allergisk flanke hud kan behandles for å gi enkeltcellesuspensjoner egnet for høy oppløsning strømningscytometrisk karakterisering av infiltrerende immuncelleundergrupper.
| Celler undergrupper fra mus flanke hud | Ox / Ox (3) | Ox / EtOH (3) | Brett Expansion (Ox / Ethanol) |
| per mm 2 vev | |||
| Totalt antall celler | 262,7 | 5.3 | 49.3 |
| CD45 + immunceller | 250,7 | 3.8 | 66,7 |
| CD4 + CD8 - celler | 6.5 | 0.9 | 7.2 |
| CD4 - CD8 + celler | 10.6 | 0.1 | 72.9 |
| Nøytrofile | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
Tabell 1. Celle utbytter fra allergisk flanke huden i ND4 hunnmus. Levedyktige celler isolert fra kanten hud ble telt ved bruk av trypanblått eksklusjon, og normalisert til celler / mm 2 vevet basert på det området av huden isolert og antall mus slått sammen pr tissaksøke forberedelse. Vi beregnet total immunceller utbytte basert på deteksjon av det hematopoetiske antigen CD45 på celleoverflaten, og lymfocytt-undergruppe utbytter basert på avstamning-spesifikke overflatemarkører. Vi deretter delt med antall celler i Ox-behandlede mus ved tallene for kjøretøy kontrollmusene, noe som gir oss fold økning i lymfocytt-delmengdene. Viste data representerer sammenslåtte data 2-3 mus per behandling, og er representative for to uavhengige eksperimenter.
Figur 1. Enzym fordøyelse og gradient rensing av splenocytter bevare lymfocytt undergrupper og celleaktiveringsmarkører. Splenocytter ble vasket i 1 time med HBSS medier, inkubert med enten D eller kollagenase HBSS media alene og renset ved hjelp av en densitetsgradient for å fjerne rusk og røde blodceller. T-celler ble identifisert som levende, CD45 +, avstamning (B220, CD11b, CD11c) <sup> - og CD3ɛ +. Hyppigheten av CD4 og CD8a T-celler ble ikke endret etter enzymatisk fordøyelse (A). Overflatetetthet av CD44 og CD62L på CD4 + T-celler forandret seg ikke etter enzymatisk fordøyelse (B). Viste data representerer samlet data 2-3 mus per behandling fra et enkelt eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Enzym fordøyelse og gradient rensing av hudceller avdekke distinkte immun infiltrasjon i kontroll vs. allergen-utfordret mus flanke huden. Tre flanke Ox utfordringer produsere en ~ 67 ganger økning i hud-infiltrerende immunceller i tidligere sensibilisert ND4 sveitsiske mus ( A). Tre Ox utfordringer også provoked en ~ 6-dobling i Gr-1 + nøytrofile (B), og ~ 73- og ~ 7-dobling av CD8a + og CD4 + T-celler, henholdsvis (C). Live-CD45 + immunceller er gated fra enkle, lave fremover og sidespredningsceller; nøytrofile granulocytter og T-celler gated fra B220 - CD11b - CD11c - levende enkeltceller. Tellinger ble utført ved anvendelse av en 1: 1 fortynning trypanblått følgende gradient tetthet separasjon. Viste data representerer samlet data 2-3 mus i hver behandlingsgruppe, og er representative for to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakteriserende endringer i hud-resident leukocytter i gnagermodeller av hudsykdommer slik som atopisk dermatitt eller psoriasis er viktig for å forstå mekaniske forbindelser mellom inflammatorisk celleinnstrømning og sykdomspatologien. Her beskriver vi en økonomisk teknikk for å isolere leukocytter fra hudvev med grunnleggende utstyr som finnes i de fleste biomedisinske forskningslaboratorier. Denne relativt raske teknikken unngår bruk av dyre vev dissosiasjon maskiner og tilpassede rør og reagenser, bidrar til å spare ressurser samtidig som hands-on tid på lab benken. Lett enzymatisk digest og diskontinuerlig gradient separasjon fjerne flertallet av epitelceller og rusk, og de isolerte celler kan brukes til en rekke ulike bruksområder, inkludert nedstrøms flowcytometrisk analyse, cellesortering, overføring, cellekultur og in vitro stimuleringsanalyser. Enzymatisk digest med Collagenase D har ingen virkning på T-celleoverflatemarkør integritet, og preserves celle levedyktighet. Denne protokollen kan enkelt endres til å behandle hud fra andre enn flanken regioner.
De mest kritiske trinn i denne prosedyren er 1) grundig fjerne eventuelle fettvev og bindevev mens høsting av huden, 2) håndtering og behandling vev raskt å maksimere infiltrere celleutbytte samtidig som celledød, 3) forsiktig lagvis gradient, og 4) forsiktig utpakking grensesnittet på graderingen. Før du starter et storstilt eksperiment er det viktig å øve densitetsgradientsentrifugering media lagdeling og grensesnitt fjerning. Man kan øve høsting celler fra en diskontinuerlig densitetsgradient ved knusing av en hel murin milt gjennom et 70 um sil inn i 1X PBS farging buffer og utfører densitetsgradienten som beskrevet ovenfor i trinn 5. Det er mye lettere å se og trekke grensesnittet mellom 44% densitetsgradientsentrifugering media og 67% densitetsgradientsentrifugering medier med splenocytes, på grunn av det store antallet av immunceller til stede.
Når du arbeider med tetthetsgradienter, bør bobler unngås mens pipettering, og gradient forstyrrelser bør minimaliseres. Den koniske rør som inneholder gradienten skal håndteres forsiktig og i vertikal stilling til enhver tid. Tetthetsgradient-sentrifugering medier løsninger bør alltid være ved romtemperatur, serologiske pipetter satt til den lavest mulige aktiveringshastigheten, sentrifugen opprettholdt ved romtemperatur, satt til lav akselerasjon med bremse frikoblet, og nøye balansert før spinning. Når du arbeider med hud preparater som gir små tall fra infiltrere leukocytter, celler er ikke alltid synlig på gradient grensesnittet. Derfor er det viktig å gjøre det 44% densitetsgradientsentrifugering medier med HBSS som inneholdt fenolrødt, slik at grensesnittet kan lett visualiseres selv når et lag av celler som ikke kan skjelnes. I tillegg er det viktig å være forsiktig, men hurtig ved ekstraksjon, vaskingog behandling av hudvev for å unngå celledød før huden er plassert i HBSS media.
Hvis celleviabilitet eller renhet er lav, er kortere (~ 20 min) fordøyelse ganger, noe lavere konsentrasjoner av kollagenase D (~ 0,5 mg / ml), eller hakke vevet mer fint kan være nyttig. Fordi over-fordøyelse og nedbrytning av vev, kan bidra til celledød, vil søkere trenger for å optimalisere den minimale koketiden som gir et tilstrekkelig stort celleprøvestørrelse 17. Prosessen vil trolig kreve flere runder med optimalisering i hendene på private etterforskere for å standardisere teknikken. Kollagenase D aktivitetsnivå kan også variere mellom produksjons masse og justeringer i fordøyelsen tid vil måtte gjøres for hvert parti av enzym som brukes. Under optimalisering, er det viktig å flekk referansecellesuspensjoner (f.eks milt) renset med og uten en enzymatisk digest trinn med en pålitelig levende / døde flekker, så vel som immunceller linEAGE markører (f.eks CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.) for å sørge for at cellepopulasjoner og overflatemarkører av interesse er bevart gjennom vevet fordøyelsen. Hvis det er mulig, er det nyttig å utføre optimaliseringer på et strømningscytometer som kan måle fremover og sidespredning bredde og høyde, samt området, for å utelukke celleaggregater. Endelig bør cellesuspensjoner som skal undersøkes under lysmikroskop for visuell vurdering av levedyktighet og generell cellulær morfologi. Cellene kan telles manuelt med 0,4% trypanblått eksklusjon fargestoff under et lysmikroskop eller på et strømningscytometer ved bruk av telle perler. For undersøkelser som krever strengere kvantifisering av spesifikke celletyper i det utskåret vev, kan forskere veie eller måle volumet av vevfragmenter før og etter fordøyelse, og bruk graden av fordøyelse for mer nøyaktig å beregne antall celleundergrupper som er tilstede i vevet blir analysert.
En begrensning av denneprotokollen er at den er spesielt tilpasset til rensing av immunceller. Hvis man er interessert i isolasjon, rensing, og analyse av en annen mobil befolkningen (f.eks hud epitelceller), densitetsgradienten oppsett og den enzymatiske fordøye protokollen vil begge trolig behov for å bli modifisert og optimalisert til beste isolere cellene av interesse. Imidlertid gir denne protokollen for isolering og rensing av både lymfoide og myeloide celleundergrupper og kan således tilpasses de fleste immunologiske anvendelser. En annen begrensning er at denne protokollen ikke kan brukes til å skille mellom cellepopulasjoner infiltrerende dermis vs. epidermis av huden. For å oppnå dette nivået av differensiering, ville denne protokollen må videre tilpasses med ytterligere tiltak for å enzymatisk skille dermis og epidermis før eller i stedet for de trinnene som beskrevet her. Her blir prøver samlet fra ~ 3 mus for å lette multi-parameter flowcytometrisk analyse gjør det vanskelig åoppdage variasjon mellom biologiske replikater. Men avhengig av nedstrøms anvendelsen av valget, denne protokollen kan enkelt endres for å gi og bruke eksempler fra enkeltemne. Endelig protokollen presenteres her for ung, kan ND4 hunnmus må endres for mus i ulike aldre, kjønn eller stammer henhold til behovene til forskere.
Som en oppsummering av denne kombinasjonen av milde enzymatiske fordøyelse og diskontinuerlig gradient separasjon tilveiebringer en enkel, effektiv og økonomisk metode for å rense immunceller fra inflammatoriske lesjoner i huden hos mus. Den kan brukes og tilpasses bredt over et variert utvalg av gnagermodeller av hud sykdommer som et praktisk verktøy for å vurdere immun infiltrasjon og isolere en ren, levedyktig bestand av leukocytter for nedstrøms applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske eller andre interesser å avsløre.
Acknowledgments
The National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 til DC), National vulvodynia Association (prisen til DC), og Macalester College støttet dette arbeidet. CB mottatt et fellesskap fra Macalester College Beckman Scholars Program, finansiert av Arnold og Mabel Beckman Foundation. BTF og TM støttes av JDRF 2-2011-662. Vi takker Dr. Jason Schenkel og Dr. Juliana Lewis for teknisk rådgivning, og alle nåværende og tidligere medlemmer av Chatterjea lab for deres hjelp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
