Introduction
Huidaandoeningen, variërend van contact dermatitis, eczeem, psoriasis, cellulitis, schimmelinfecties en abcessen op non-melanoma huidkanker bleken te zijn van de 50 meest voorkomende ziekten in de wereld, en de vierde toonaangevende wereldwijde oorzaak van niet-dodelijke ziekten in 2010 1. Dienovereenkomstig, het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diverse huid pathologieën is een noodzakelijke en actieve gebied van onderzoek. Knaagdiermodellen opmerkelijk bruikbaar zijn bij het begrijpen van inflammatoire huidaandoeningen geweest zoals atopische dermatitis 2, psoriasis 3 of Staphylococcus aureus infectie 4. Goedkoop, efficiënt, eenvoudig en protocollen voor de enzymatische vertering van muizenhuid weefsel van cellen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van downstreamtoepassingen beter begrip van de pathofysiologie van huidziekten verschaffen. Hier wordt een eenvoudige en economische werkwijze beschreven voor enzymatische digestie van muizenhuidweefsel en isoleren van huid-infiltrerende leukocyten die kunnen worden gebruikt voor celkweek, in vivo adoptieve overdracht, flow cytometrische analyse en sortering of gene expression studies. Het algemene doel van deze procedure is om een enkele celsuspensie van huid-infiltrerende leukocyten te bereiden met een hoge levensvatbaarheid van de cel terwijl het minimaliseren van de kosten doorgaans geassocieerd met aangepaste reagens kits en mechanische dissociators.
Bestaande huidweefsel dissociatie methoden 5-7 kan resulteren in lage levensvatbaarheid en oppervlakte celmerker integriteit, of eisen aangepaste enzym kits en dure weefsel dissociatie machines 8-11. Terwijl de vertering van muizenoor huidweefsel redelijk gangbaar 12-13, verteren sterk verhoornde huidweefsel (bijvoorbeeld van de flank) kan resulteren in celpreparaten verontreinigd met grote hoeveelheden niet-cellulair afval. In een recente studie, Zaid en collega verteerd muis flank huid gedurende 90 min in 2,5 mg / ml dispase, followed door 45 min bij 3 mg / ml collagenase 7. In een andere studie, deze onderzoekers gebruikte meervoudige incubaties met een gecombineerde digestie van 2,5 uur, inclusief het gebruik van trypsine / EDTA, collagenase III en dispase 5. Het gebruik van trypsine wordt niet aanbevolen voor de huid enzymatische digestie, zoals behandeling met trypsine van verschillende fabrikanten heeft aangetoond dat meetbaar invloed op de integriteit van celoppervlakeiwitten op zoogdiercellen 14-15. Bovendien kan dispase aanzienlijk proliferatieve vermogen van CD4 en CD8a T cellen en beïnvloeden oppervlakte overvloed van ten minste 20 moleculen met gemeenschappelijke T cel activatie merkers zoals CD62L 16. Andere protocollen RPMI 1640 in digestiemedium 6. Echter, de aanwezigheid van Mg2 + en Ca2 + in RPMI uitgebreide celaggregatie 17 veroorzaken.
Een ideale protocol voor het weefsel dissociatie moeten streven naar een hoge levensvatbaarheid van de cellen, laagniveaus van cel- aggregatie en minimale schade aan oppervlakte-eiwitten cel. Hoge kwaliteit lymfeklier stromale cel voorbereidingen zijn bereikt met protocollen die kortere enzymincubaties, Ca 2+ en Mg 2+ vrije media te gebruiken, en trypsine te vermijden en Dispase 18. Echter protocollen van dit type niet vastgesteld voor de dissociatie van hele muizenhuid.
Hier wordt een protocol beschreven te distantiëren, te isoleren en te verrijken huid-infiltrerende leukocyten uit-allergeen uitgedaagd muis flank huid. In het kort uitgesneden huid gepreïncubeerd in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10% foetaal runderserum gedurende 1 uur aan het weefsel voor de spijsvertering te verzachten en verwijderen van overtollige dode huid en vetweefsel. Dit wordt gevolgd door een 30 min enzymatische digestie stap met 0,7 mg / ml collagenase D. collagenase D heeft minimale effecten op de dichtheid van celoppervlak markers, en geen effect op T-celproliferatie in vitro 16,18, waardoor hetzeer geschikt voor toepassingen in de karakterisering van oppervlakte-eiwitten. Na enzymatische digestie, werd discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie gebruikt epitheelcellen en vuil van de eencellige suspensie te verwijderen en te verrijken voor hematopoïetische cellen. Belangrijk is dat deze procedure vermijdt dure kolommen gebaseerde magnetische celscheiding reagentia en weefsels dissociatie machines 11/08, en kan worden uitgevoerd met apparatuur en materialen die in een fundamenteel biomedisch onderzoekslaboratorium. Hier werd dit protocol dat wordt gebruikt om leukocyten te isoleren van de flank huid uitgedaagd drie keer met het hapteen oxazolon (Ox) in eerder gevoelig ND4 Zwitserse muizen (aangepast van 19). Cellen werden geanalyseerd met behulp van multi-parametrische flowcytometrie. Deze techniek leverde een celsuspensie met minimale puin en> 95% levensvatbaarheid van de geïsoleerde lymfocyten die werden geanalyseerd door multi-parametrische flowcytometrie om de infiltratie van T-lymfocyten en neutrofielen te meten in de getroffen skin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: 8-12 weken oude vrouwelijke ND4 Zwitserse Webster muizen conventioneel gehuisvest met vrije toegang tot voedsel en water, werden gebruikt voor deze studies Het experimentele protocol gebruikt (B13S1) werd goedgekeurd door Macalester College IACUC..
1. Sensibilisering en Challenge met Oxazolon
- Dag 0
- Bereid anesthesie kamer door toevoeging van 3 ml isofluraan absorberende handdoeken geplaatst onder maas onderaan een 4 L deksel glazen pot. Voor de ND4 vrouwelijke muizen die hier gebruikt, de tijd in de kamer is 30-60 seconden totdat het onderwerp voldoende wordt verdoofd; optimaliseren verdoving administratie van de muizenstam gebruikt.
- Shave terug elke verdoofde muis en flankeren met een dier tondeuse.
- Dag 1
- Voeg een oplossing van 4-ethoxymethyleen-2-fenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) in absolute ethanol 2% en incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min op een roterende plaat in een incubator.
- Kort verdovenmuizen, waarbij isofluraan anesthesie zoals beschreven in 1.1.1 en 100 gl 2% Ox toepassing op de geschoren rug in verschillende standaard toepassingen van ongeveer 20 pl elk. Wacht 5-10 seconden tussen seriële applicaties voor de oplossing te drogen.
- Zorg om te voorkomen dat het morsen van de 2% Ox oplossing anders dan de rug regio, en wacht tot de oplossing te drogen tussen applicaties.
- Dagen 5-7
- Voeg een oplossing van 1% (Ox) in absolute ethanol en incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min op een roterende plaat in een incubator.
- Voorzichtig maar stevig immobiliseren van de muis op het nekvel en staartbasis met buik omhoog en hals enigszins naar beneden gekanteld (vergelijkbaar met een greep voor een intraperitoneale injectie) en 100 gl 1% Ox toepassing op de geschoren flank in verschillende standaard toepassingen en de tijd om de huid daarna droog als hierboven beschreven.
- Bij controlemuizen Breng 100 pi absolute ethanol voertuig op de geschoren flank.
2. Flank Skin Harvest
- Euthanaseren muizen met behulp van kooldioxide inademing, en zorgvuldig accijnzen het gewenste gebied van de flank huid (~ 25 mm x 25 mm van de huid) met 10 cm chirurgische schaar.
- Met behulp van een schone, scherp chirurgisch mes, schraap het overtollige vet en bindweefsel van de flank huid.
- Plaats 3 stukken flank huid 3 muizen in een 50 ml conische buis met 10 ml HBSS RT [met fenolrood, zonder calcium of magnesium, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 10% foetaal runderserum (FBS)].
3. Pre-vergisting Tissue Wassen
- Plaats buis met huidfragmenten op een roterende plaat voor 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C.
- Vortex krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatieperiode.
- Zeef de inhoud van de buis door een 70 umzeef om de wasbuffer weggooien en het verzamelen van het weefsel. Eén zeef kan gedurende de gehele procedure opnieuw worden gebruikt bij een biologische behandelgroep.
- Met behulp van een pincet, overdracht van de flank huid van de zeef in een nieuwe 50 ml conische buis met 10 ml vers, RT HBSS medium (bevattende EDTA, HEPES en FBS zoals hierboven beschreven).
- Met een 12,5 cm paar chirurgische schaar ontleden ondergedompeld in de buis, blad voor elk stuk huid flank zodat de gemiddelde stukje weefsel is ongeveer 2,2 mm x 2,2 mm gebied.
- Plaats buis met huidfragmenten op een roterende plaat voor 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C.
- Vortex krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie
4. Collagenase Spijsvertering van de Huid
- Zeef de inhoud van de buis door een 70 urn zeef, opnemen en overbrengen flank huid stukjes in een nieuwe 50 ml conische buis met 10 ml fresh, RT HBSS medium aangevuld met 0,7 mg / ml collagenase D.
- Plaats buis met digestiemedium en huidfragmenten op een roterende plaat 30 minuten in een droge niet-vergaste incubator gehandhaafd bij 37 ° C.
- Vortex inhoud van de buis krachtig gedurende 10 seconden aan het einde van de incubatie.
- Inhoud filter van de buis door een 70 urn zeef in een nieuwe 50 ml conische buis; houdt de doorstroom met het gedigereerde weefsel en de zeef en gooi flankeren huid vuil.
- Was de doorstroom in 50 ml HBSS media gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 350 g en decanteer het supernatant.
5. dichtheidsgradiëntcentrifugatie
- Met behulp van een serologische pipet 3 ml RT 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een nieuwe 15 ml conische buis voor elk monster.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml 44% RT dichtheidsgradiëntcentrifugatie media in HBSS met fenolrood.
- Gently laag 5 ml van de 44% dichtheidsgradiënt centrifugatie medium dat de cellen bovenop de 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie mediavoorbeeld behulp van een serologische pipet. Zorg ervoor dat u de pipet op de laagste snelheid in te stellen, en zet de pipet langs de wand van de conische buis. Wees voorzichtig niet te schudden, verstoren, of omkeren het verloop.
- Stel versnelling naar de laagste stand, los van de rem, en centrifuge de helling bij 931 xg gedurende 20 min bij RT ervoor te zorgen dat de centrifuge in balans is.
- Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig de gradiënt van de centrifuge, en voorzichtig te vervoeren naar het lab bank houden de buis rechtop. Met behulp van een 5 ml plastic transferpipet, verwijder de cellaag op het grensvlak van de 44% en 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media overgebracht in een nieuwe 15 ml conische buis. Als de interface niet zichtbaar is, verwijdert u ongeveer 2 ml vloeistof bij de 67% -44% grens.
- Vul het conische buis met cellen van de intece met 2% FBS in 1X ijskoude PBS, centrifuge cellen gedurende 5 min bij 350 xg en decanteer het supernatant.
Opmerking: Dit is de eerste keer dat de cellen kunnen worden gekoeld / bewaard koud omdat digestie stappen bij 37 ° C en dichtheidgradiëntcentrifugatie media stappen bij KT. Cellen kunnen worden gesuspendeerd in een 1: 1 trypaanblauw verdunning en telt en de levensvatbaarheid van inlichtingen zijn te verkrijgen op dit punt.
6. blokkeren en kleuring voor Flowcytometrische Analyse
- Blok FcyRII / III receptoren op cellen die niet-specifiek antilichaam kleuring te voorkomen. Voor de hier beschreven experimenten, maak mastermengsels antilichaam in PBS met 2% FBS met 1: 100 verdunning van het ongeconjugeerde antilichaam tegen CD16 / 32 (2.4G2) te binden en blokkeren FcyRII / III-receptoren.
- Incubate geblokkeerd cellen met geschikte mastermengsels van antilichamen tegen CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) en Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) en Brilliant Violet 510 levende / dode vlek dode cellen te identificeren. Gebruik alle antilichamen, hetzij op de verdunning aanbevolen door de fabrikanten of eerder geoptimaliseerd door onderzoekers. Voor de hier beschreven experimenten, gebruik maken van alle antilichamen bij 1: 100 verdunning.
- Was de cellen en resuspendeer in 50 pl 1X PBS kleuring buffer met 2% FBS. Houd op ijs tot fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen op een flowcytometer.
Opmerking: Het is belangrijk om schadevergoeding parameters vooraf geoptimaliseerd met een lymfoïde weefsels en een gemeenschappelijke celoppervlak antigen (zoals CD4 of CD8) vóór verkrijging van fluorescentiegegevens. - Om het aantal cellen te verhogen voor downstream flowcytometrieanalyse, data verwerven van volledige monsters van gekleurde cellen.
7. Analyseer Flowcytometrie gegevens met behulp van standaard methoden om de onderstaande stappen Accomplish
- Ten eerste poort op de lymfocyt regio de voorwaartse verstrooiing(gebied) by side scatter (gebied) plot.
- Selecteer vervolgens enkele cellen met behulp van de voorwaartse verstrooiing (breedte) by side scatter (breedte), om te voorkomen dat het analyseren van wambuizen. Dit kan ook worden bereikt met een voorwaartse verstrooiing hoogte by side scatter hoogte plot.
- Vervolgens poort aan afstamming (CD 11 b, CD 11 c en CD45R / B220) -negatieve en CD3-positieve gebeurtenissen uit te sluiten macrofagen, dendritische cellen en B-cellen, respectievelijk, en confine analyses de T-cel compartiment, als het doel is, als hier te beoordelen infiltrerende T-cellen.
- Vervolgens poort op levende cellen die de live / dead vlek te sluiten.
- Tot slot, poort aan de cel bevolking van belang (zie representatieve resultaten sectie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Collagenase D behandelde miltcellen vertonen gelijkaardige niveaus van CD4 en CD8 α op T-cellen in vergelijking met media-behandelde controles
Ten eerste, de mogelijke gevolgen van collagenase D van de frequentie en oppervlakte overvloed aan afstamming en activatie merkers op T-cel subsets werden beoordeeld met behulp van secundaire lymfoïde weefsel als controle. Een suspensie van splenocyten verkregen uit ND4 muizen en gewassen 1 uur met HBSS media. Vervolgens wordt de helft van de cellen blootgesteld aan 0,7 mg / ml collagenase D (zoals beschreven in paragraaf 4 hierboven). De resterende cellen werden opnieuw gesuspendeerd in HBSS control medium. Vervolgens werden zowel splenocyten fracties verwerkt met een dichtheid gradiënt centrifugeren zoals beschreven in paragraaf 5 hierboven. De cellen werden daarna gekleurd met antilichamen tegen CD4 en CD8a oppervlak en op de flowcytometer geanalyseerd. Enkel, leef, CD45 +, niet-T afkomst - (B220 - CD11b -CD 11 c -) werden CD3ɛ + cellen gated voor analyse, B-cellen, macrofagen, dendritische cellen uitsluiten. CD4 en CD8a eiwitten werden eveneens gedetecteerd op het oppervlak van splenocyten die waren blootgesteld aan D digestie collagenase en die niet waren blootgesteld aan enzym met ongeveer 60% CD4 + CD8a - cellen en 30% CD4 - CD8a + cellen gedetecteerd met beide behandelingen ( Figuur 1A). Bijgevolg heeft collagenase digestie D laat de relatieve frequentie van CD4 en CD8a. De intensiteit van de oppervlakte CD4 en CD8a geometrisch gemiddelde fluorescentie-eenheden (gMFI) in de volgende subgroepen waren ook vergelijkbaar tussen de twee behandelingen; gMFI waarden voor CD4 waren respectievelijk 2271-enzymen behandelde en 2243 voor de controle splenocyten en gMFI waarden CD8a werden 536 voor met enzym behandelde en 520 voor de controle splenocyten. Enzymatische behandeling had ook geen effect op de oppervlaktedichtheid van T-cel activatie merkers CD44 of CD62L op CD4 + T-cellen (Figuur 1B). Geometrisch gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarden voor CD44 werden 669 voor enzym behandelde en 654 voor de controle splenocyten; gMFI waarden CD62L was 1523 voor enzym behandelde en 1517 de controle splenocyten. Zoals Collagenase D spijsvertering behoudt de integriteit van oppervlakte-eiwitten op geïsoleerde cellen, kunnen de hier beschreven protocol worden gebruikt met vertrouwen voor downstream flowcytometrieanalyse.
Enzymdigestie en gradiënt zuivering van flank huidcellen resulteert in hoge cellulaire levensvatbaarheid
Celopbrengst en percentage levensvatbaarheid van de celsuspensie hierboven verkregen werden bepaald met Trypan Blue kleurstofuitsluiting 20. Dit spijsvertering en gradiënt scheiding protocol leverde ongeveer 250 levensvatbare immuuncellen per mm 2 van de flank weefsel in Ox-uitgedaagd muizen en ongeveer 4 levensvatbare immuuncellen per mm 2 van het weefsel in het voertuig uitgedaagd muizendie eerder werden gesensibiliseerd met Ox (tabel 1).
Enzymdigestie en gradiënt zuivering van flank huidcellen resulteert in een krachtig herstel van immuuncellen
Vervolgens wordt de mate van immune infiltratie in de huid werd bepaald door analyse van de overvloed aan CD45 oppervlakte-eiwitten op cellen geïsoleerd uit de flank van Ox-uitgedaagd en controlemuizen tot herstel van huid-infiltrerende immuuncellen volgens de hieronder beschreven werkwijzen beoordeeld. CD45 is een pan-hematopoietische afkomst marker 21. 95% van de lage voorwaartse en zijwaartse verstrooiing, enkele cellen (gating niet getoond) Ox-uitgedaagd muizen en 71% van deze cellen in voertuigen uitgedaagd controles levende CD45 + cellen (Figuur 2). A ~ 67-voudige toename van CD45 + infiltrerende immuuncellen werd gedetecteerd in de flank huid na dag 3 Ox uitdagingen toepassing van de hierin beschreven werkwijze (Tabel 1).
Drie flank Ox uitdagingen leiden tot een uitgesproken infiltratie van T-cellen en neutrofielen
Onze techniek leverde een celpopulatie uit afleverde huid die kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid van myeloïde en lymfoïde cel subsets te detecteren zoals Gr-1 + neutrofielen 22, CD4 T-cellen en T-cellen CD8a. We waargenomen ~ 6-voudig, ~ 7-voudig, en ~ 73-voudige toename in neutrofielen, CD4 T-cellen en T-cellen CD8a respectievelijk na 3 dagelijkse Ox uitdagingen (tabel 1). We berekenden deze verhogingen door het totale aantal levensvatbare cellen verkregen vermenigvuldigen (geteld met behulp van trypan blauw uitsluiting) van het percentage van de opgegeven immuuncel fragment uit de levensvatbare cellen poort tijdens flowcytometrische analyse. We gedeeld het totale aantal levensvatbare immuuncellen, Gr-1 +, CD4 + of CD8a + cellen in Ox-behandelde muizen door corresponderende nummers voor voertuig controle muizen, gaf onsvoudige toename van lymfocyten. Gr-1 + neutrofielen goed voor 42% van de enkelvoudige, levende CD45 + B220 - CD11b - CD11c - cellen in Ox-behandelde muizen en 10% van deze populatie in EtOH behandelde muizen (Figuur 2B). In Ox-behandelde muizen, ~ 52% gated CD3 + T-cellen werden CD8a + en ~ 34% was CD4 +, terwijl controles voertuig ~ 9% T-cellen waren CD8a + en 57% werden CD4 + (figuur 2C) . Daarom is met de techniek beschreven, allergische en niet-allergische flank huid kan worden verwerkt tot enkele cel suspensies geschikt voor hoge-resolutie flowcytometrische karakterisatie van infiltrerende immuuncelsubklassen opleveren.
| Cellen subsets van de muis flank huid | Os / ox (3) | Os / EtOH (3) | Vouw Uitbreiding (Ox / Ethanol) |
| per mm 2 weefsel | |||
| Totaal aantal cellen | 262,7 | 5.3 | 49.3 |
| CD45 + immuuncellen | 250,7 | 3.8 | 66.7 |
| CD4 + CD8 - cellen | 6.5 | 0.9 | 7.2 |
| CD4 - CD8 + cellen | 10.6 | 0.1 | 72.9 |
| Neutrofielen | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
Tabel 1. Cel opbrengst van allergische flank huid ND4 vrouwelijke muizen. Levensvatbare cellen geïsoleerd uit flank huid werden geteld met behulp van trypan blauw uitsluiting, en genormaliseerd tot cellen / mm 2 weefselgebaseerde op het gebied van geïsoleerde huid en het aantal muizen samengevoegd per tisaanklagen voorbereiding. We berekenden totale immuuncel opbrengst op basis van detectie van het hematopoietische antigen CD45 op het celoppervlak en lymfocyten subgroep rendementen op basis van afstammings-specifieke oppervlakte merkers. Vervolgens verdeelde het aantal cellen in Ox-behandelde muizen door de nummers voor voertuig controle muizen gaf ons toename in lymfocyten vouwen. De getoonde gegevens vertegenwoordigen samengevoegde gegevens 2-3 muizen per behandeling, en zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten.
Figuur 1. enzymdigestie gradiënt zuivering van splenocyten behouden lymfocyt subsets en celactivering markers. Splenocyten gewassen gedurende 1 uur met HBSS media, geïncubeerd met hetzij collagenase D of HBSS media alleen en gezuiverd met een dichtheidsgradiënt om vuil en rode bloedcellen te verwijderen. T-cellen werden geïdentificeerd als levend, CD45 +, geslacht (B220, CD11b, CD11c) <sup> - en CD3ɛ +. Frequentie van CD4 en CD8a T cellen niet veranderen na enzymatische digestie (A). Oppervlaktedichtheid van CD44 en CD62L op CD4 + T-cellen veranderde niet na enzymatische digestie (B). De getoonde gegevens vertegenwoordigen samengevoegde gegevens 2-3 muizen per behandeling van een enkel experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. enzymdigestie gradiënt zuivering van huidcellen onthullen duidelijke infiltratie immune controle vs. allergeen uitgedaagd muis flank skin. Drie flank Ox uitdagingen produceren ~ 67-voudige toename van huid-infiltrerende immuuncellen in vooraf gesensibiliseerde ND4 Swiss-muizen ( A). Drie Ox uitdagingen ook provoked a ~ 6-voudige toename van Gr-1 + neutrofielen (B) en 73- ~ en ~ 7-voudige toename van CD8a + en CD4 + T-cellen, respectievelijk (C). Live-CD45 + immuuncellen zijn gated uit enkele, lage voorwaartse en zijwaartse verstrooiing cellen; neutrofielen en T-cellen gated van B220 - CD 11 - CD 11 c - één levende cellen. Tellingen werden uitgevoerd met een 1: 1 trypan blauw verdunning volgende dichtheidsgradiënt scheiding. De getoonde gegevens vertegenwoordigt samengevoegde gegevens 2-3 muizen in elke behandelingsgroep en zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het karakteriseren van veranderingen in de huid-ingezeten leukocyten in knaagdiermodellen van huidziekten, zoals atopische dermatitis of psoriasis is van belang voor het begrijpen van mechanistische verbindingen tussen inflammatoire cel instroom en de ziekte pathologie. Hier beschrijven we een voordelige techniek om leukocyten uit huidweefsel te isoleren met basisuitrusting gevonden in de meeste biomedisch onderzoek labs. Deze relatief snelle techniek vermijdt het gebruik van dure weefsel dissociatie machines en aangepaste buizen en reagentia, helpen om hulpbronnen te beschermen terwijl het minimaliseren van hands-on tijd op de labtafel. Gentle enzymatisch digest en discontinue gradiëntscheiding verwijdert de meeste epitheliale cellen en afval, en de geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen zoals flowcytometrische analyse, celsortering, overdracht, celcultuur en in vitro stimulatie assays. Enzymatische digestie met collagenase D geen effect op T celoppervlaktemarker integriteit en preserves cellevensvatbaarheid. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om de huid uit andere dan de flank gebieden verwerken.
De meest kritische stappen bij deze werkwijze 1) grondig verwijderen van vet en bindweefsel tijdens het oogsten van de huid 2) behandeling en verwerking weefsel snel nauwkeurig maximaliseren infiltrerende celopbrengst terwijl het minimaliseren van celdood, 3) voorzichtig gelaagdheid het verloop en 4) extraheren van het grensvlak van de gradiënt. Alvorens te beginnen met een grootschalig experiment is het belangrijk om dichtheidsgradiëntcentrifugatie media gelaagdheid en de interface verwijdering oefenen. Men kan oogsten van cellen uit een discontinue dichtheidsgradiënt uitoefenen door het breken van een gehele murine milt door een 70 urn zeef in 1X PBS kleurbuffer en uitvoeren van de dichtheidsgradiënt zoals beschreven in stap 5 Het is veel gemakkelijker te zien en extraheer het raakvlak tussen de 44% dichtheidsgradiënt centrifugatie media en 67% dichtheidsgradiënt centrifugatie media met splenocytes, vanwege het grote aantal immuuncellen aanwezig.
Bij het werken met dichtheidsgradiënten moet bellen worden vermeden, terwijl pipetteren en helling storingen worden geminimaliseerd. De conische buis met het verloop moet voorzichtig worden behandeld en verticaal houden allen tijde. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie media oplossingen moet altijd bij RT, serologische pipetten op de laagste mogelijke vrijlating snelheid, de centrifuge gehandhaafd op RT, ingesteld op lage versnelling met de rem ontkoppeld, en zorgvuldig evenwicht vóór het spinnen. Bij het werken met de huid preparaten die kleine aantallen opbrengst van infiltrerende leukocyten, cellen zijn niet altijd zichtbaar op de helling interface. Het is dus belangrijk om de 44% dichtheidsgradiëntcentrifugatie media met HBSS dat fenolrood zodat de interface gemakkelijk kan worden gevisualiseerd, zelfs wanneer een laag van cellen niet kunnen worden onderscheiden. Daarnaast is het belangrijk om zachte maar snel bij het uitpakken, wassen wordenen verwerken huidweefsel om celdood te voorkomen voordat de huid wordt geplaatst in de HBSS media.
Indien levensvatbaarheid of de zuiverheid cel laag, korter (~ 20 min) digestietijden, iets lagere concentraties collagenase D (~ 0,5 mg / ml) of hakken weefsel fijner kunnen nuttig. Omdat over-de spijsvertering en de afbraak van het weefsel kan bijdragen tot celdood, zullen onderzoekers moeten de minimale spijsvertering keer dat een groot genoeg cel steekproefomvang 17 biedt optimaliseren. Het proces zal waarschijnlijk verscheidene ronden van optimalisatie in de handen van individuele onderzoekers nodig om de techniek te standaardiseren. Collagenase D activiteit kan ook variëren tussen de productie veel en aanpassingen om de spijsvertering tijd zullen moeten worden gemaakt voor elke partij enzym gebruikt. Tijdens het optimaliseren is het belangrijk om vlek referentiecel suspensies (bijvoorbeeld milt) gezuiverd met en zonder een enzymatisch digest stap een betrouwbare levende / dode vlekken en immuuncellen lineage markers (bv CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, enz.) om ervoor te zorgen dat de cel bevolking en oppervlakte markers van belang zijn bewaard gebleven door het weefsel verteringsproces. Indien mogelijk, is het nuttig om optimalisaties uitvoeren op een flowcytometer die verder kunnen meten en zijwaartse verstrooiing breedte of hoogte en ruimte om celaggregaten sluiten. Ten slotte moet de cel schorsingen onder de lichtmicroscoop voor visuele beoordeling van de levensvatbaarheid en de algemene cellulaire morfologie worden onderzocht. De cellen kunnen handmatig worden geteld met behulp van 0,4% Trypan Blue kleurstofuitsluiting onder een lichtmicroscoop of een flowcytometer behulp tellen van kralen. Voor studies die strenger kwantificering van specifieke celtypen in het weggesneden weefsel vereisen, kunnen onderzoekers wegen of het volume weefsel fragmenten te meten vóór en na digestie en gebruik de mate van vertering nauwkeuriger schatting aantallen cel subsets in het weefsel aanwezig wezen geanalyseerd.
Een beperking van dezeprotocol is dat het specifiek is ingericht voor het zuiveren van immune cellen. Indien men geïnteresseerd afzonderlijk, zuivering en analyse van een celpopulatie (bijvoorbeeld huid epitheelcellen), de dichtheidsgradiënt opzet en enzymatisch digest protocol zal het waarschijnlijk moeten worden aangepast en geoptimaliseerd om het best isoleren van de cellen van belang. Maar dit protocol maakt isolatie en zuivering van zowel lymfoïde en myeloïde cel subsets en kan dus worden aangepast aan de meeste immunologische toepassingen. Een andere beperking is dat het protocol kan worden gebruikt om onderscheid tussen celpopulaties infiltreren in de dermis opzichte van de epidermis van de huid. Om dit niveau van differentiatie bewerkstelligen, zou dit protocol moeten verder worden aangepast met extra maatregelen om enzymatisch scheiden de dermis en epidermis voorafgaand aan of in plaats van de hier geschetste stappen. Hier, worden monsters verzameld uit ~ 3 muizen voor multi-parameter stroming cytometrische analyse te vergemakkelijken waardoor het moeilijkdetecteren variabiliteit tussen biologische repliceert. Afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing van keuze, dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om opbrengst en gebruik samples uit één onderwerpen. Tenslotte, het protocol hier gepresenteerde jonge, moet ND4 vrouwtjesmuizen worden aangepast voor muizen van verschillende leeftijden, geslacht of stammen volgens de behoeften van onderzoekers.
Samengevat, deze combinatie van zachte enzymatische vertering en discontinue gradiëntscheiding een eenvoudige, effectieve en economische methode voor het zuiveren van immune cellen van inflammatoire huidbeschadigingen bij muizen. Het kan worden gebruikt en in grote lijnen aangepast op een brede waaier van knaagdieren modellen van de huid pathologieën als een handig hulpmiddel om het immuunsysteem infiltratie beoordelen en isoleren van een zuivere, levensvatbare populatie van leukocyten voor downstream-toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële of andere belangen te onthullen.
Acknowledgments
De National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 naar DC), de Nationale Vulvodynia Association (award naar DC) en Macalester College dit werk ondersteund. CB kreeg een beurs van de Macalester College Beckman Leerlingen Program, gefinancierd door de Arnold en Mabel Beckman Stichting. BTF en TM worden ondersteund door JDRF 2-2011-662. Wij danken Dr. Jason Schenkel en Dr. Juliana Lewis voor technisch advies, en alle huidige en voormalige leden van de Chatterjea lab voor hun hulp en steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
