Introduction
皮膚接触性皮膚炎、湿疹、乾癬、蜂巣炎、真菌感染症および膿瘍からの非黒色腫皮膚癌が世界50最も一般的な疾患の一つであることが判明した範囲の条件、および2010年1における非致死的疾患の第四世界的なリーディング原因。したがって、多様な皮膚の病変の基礎となる分子・細胞メカニズムの研究は、研究の必要と活性領域です。げっ歯類モデルは、アトピー性皮膚炎2、乾癬3、または黄色ブドウ球菌感染 4のような炎症性皮膚状態の理解に非常に有用でした。マウスの皮膚組織の酵素消化のための、安価で効率的、かつ簡単なプロトコルは、優れた皮膚疾患の病態生理を理解するために、下流の様々な用途に使用することができる細胞の調製物を提供することができます。ここでは、簡単かつ経済的な方法は、マウスの皮膚の酵素消化のために記載されています組織および細胞培養、in vivoでの養子移入のために使用することができる皮膚浸潤白血球の単離は、サイトメトリー分析および選別または遺伝子発現研究を流します。この手順の全体的な目的は、典型的には、カスタムの試薬キットや機械的解離剤に関連するコストを最小限に抑えながら、高い細胞生存率で皮膚浸潤白血球の単一細胞懸濁液を調製することです。
既存の皮膚組織解離方法5-7は、低細胞生存率および表面マーカーの完全性をもたらす、またはカスタム酵素キットや高価な組織解離機8-11が必要な場合があります。マウス耳皮膚組織の消化は、合理的に、12-13流行高度角化皮膚組織を消化し ている間（例えば、サイドから）非細胞破片の大量の汚染された細胞調製物をもたらすことができます。最近の研究では、ザイドらは、2.5 mg / mlのディスパーゼ、follo 90分間マウスの脇腹の皮膚を消化しました3 mg / mlのコラゲナーゼ7で45分までに結婚。別の研究では、これらの研究者は、トリプシン/ EDTA、コラゲナーゼIIIの使用を含む、2.5時間の組み合わせ消化で複数のインキュベーションを使用し、5をディスパーゼ。異なる製造業者からのトリプシン処理は、測定可能な哺乳動物細胞の14-15上の細胞表面タンパク質の完全性に影響を与えることが示されているようにトリプシンの使用は、皮膚の酵素消化には 推奨されません。さらに、ディスパーゼは、CD4およびCD8αT細胞の増殖能力に有意な効果を有しており、例えば、CD62L 16などの一般的なT細胞活性化マーカーを含む少なくとも20の分子の表面の存在量に影響を与えることができます。他のプロトコルは、消化媒体6に RPMI 1640を使用しています。しかし、RPMI中のMg 2+およびCa 2+の存在は、大規模な細胞凝集17を引き起こす可能性があります 。
組織解離のための理想的なプロトコルは、低、高細胞生存率を目指す必要があります細胞凝集、および細胞表面タンパク質への最小限の損傷のレベル。高品質のリンパ節間質細胞調製物は、短い酵素インキュベーション、 の Ca 2+およびMg 2+を含まない培地を使用するプロトコルを用いて達成し、トリプシンを回避し、18をディスパーゼされています。しかし、このタイプのプロトコルは、全マウス皮膚の解離のために確立されていません。
ここでは、プロトコルは、解離分離、およびアレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚から皮膚浸潤白血球を豊かにするために記載されています。簡単に説明すると、切除された皮膚は、消化のために、組織を柔らかくし、余分な死んだ皮膚または脂肪組織を除去するために、1時間、10％ウシ胎児血清を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）中でプレインキュベートします。これは、0.7ミリグラムで30分間酵素消化工程が続く/ mLのコラゲナーゼD.コラゲナーゼDはそれを作る、細胞表面マーカーの密度、 およびインビトロ16,18 における T細胞の増殖に影響を与えずに最小限の効果を有します表面タンパク質の特徴付けを含む用途に非常に適しています。酵素消化の後、不連続密度勾配遠心分離は、単一細胞懸濁液からの上皮細胞及び破片を除去し、造血細胞を富化するために使用しました。重要なことには、この手順は、高価なカラムベースの磁気細胞分離試薬および組織解離機8-11を回避し 、かつ基本的な生物医学研究室で見つけ機材を用いて行うことができます。ここでは、このプロトコルは、脇腹皮膚から白血球を分離するために使用された（19から適応）以前に増感ND4のスイスマウスにハプテンオキサゾロン（OX）で3回挑戦しました。細胞を、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いて分析しました。この技術は、最小限の破片と、影響を受けたSKにTリンパ球および好中球の浸潤を測定するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって分析された、単離されたリンパ球の> 95％の生存率と細胞懸濁液が得られましたに。
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Protocol
注：8-12週齢の雌ND4 Swiss Websterマウスは、従来から食料と水に自由にアクセスさせて飼育、これらの研究のために使用した（B13S1）使用される実験プロトコルは、マカレスター大学のIACUCによって承認されました。
オキサゾロン1.感作とチャレンジ
- 0日目
- 4 L蓋付きガラス瓶の底にメッシュの下に配置された吸収性タオルに3ミリリットルイソフルランを追加することによって、麻酔室を準備します。被写体が十分に麻酔されるまで、ここで使用ND4雌マウスでは、チャンバー内の時間は30〜60秒です。使用しているマウス株のための麻酔管理を最適化します。
- 動物の毛のトリマーを使用して、各麻酔したマウスの背中や脇腹を剃ります。
- 1日目
- 無水エタノール中の4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オン（OX）の2％溶液を作製し、インキュベーター内で回転板上で15分間、50℃でインキュベートします。
- 簡単に言うと麻酔1.1.1に記載されており、約20μlの各いくつかのシリアル・アプリケーションに戻って剃っに2％牛の100μLを適用するようイソフルラン麻酔を使用してマウス。乾燥するためのソリューションのためのシリアル・アプリケーションとの間に5〜10秒待ってください。
- バック以外の領域に2％牛液をこぼすないように注意してください、とアプリケーションの間に乾燥するためのソリューションを待ちます。
- 日5-7
- 無水エタノール（牛）の1％溶液を作製し、インキュベーター内で回転板上で15分間、50℃でインキュベートします。
- 静かにしっかりと（腹腔内注射のために保留に類似）を上向きと首がやや下向きに傾いた腹部と首と尾ベースの首筋にマウスを固定化し、いくつかのシリアル・アプリケーションで剃っ脇腹に1％牛の100μLを適用そして上記のように、その後、皮膚を乾燥させるために時間をかけ。
- 対照マウスでは、剃ったフランに無水エタノール車の100μLを適用K。
2.フランクスキン収穫
- 二酸化炭素吸入を使用して、マウスを安楽死させる、と慎重に10センチメートル手術用ハサミで脇腹の皮膚の所望の領域（皮膚の〜25ミリメートル×25 mm）を切り出します。
- きれいな、鋭い外科用メスを使用して、脇腹の皮膚から余分な脂肪および結合組織を削り取ります。
- カルシウムまたはマグネシウムを含まないフェノールレッド、5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて[10 mlのRT HBSSを含む50 mlのコニカルチューブに3匹のマウスの側腹部皮膚の3枚を配置し、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、および10％ウシ胎児血清（FBS）]。
3.事前消化組織洗濯
- 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーター中で30分間回転板上の皮膚断片を含む場所チューブ。
- インキュベーション期間の終わりに10秒間激しくボルテックス。
- 70ミクロンを介してチューブの内容ひずみストレーナーを洗浄緩衝液を廃棄し、組織を収集します。単一ストレーナーは、生物学的治療群内で手順全体を通して再利用することができます。
- ピンセットを使用して、（上記のようにEDTA、HEPES、およびFBSを含む）新鮮な、RT HBSS培地の10 mlを含む新しい50 mlのコニカルチューブにストレーナーから脇腹の皮膚を転送します。
- 組織の平均ピースが面積約2.2ミリメートルX 2.2ミリメートルになるようにチューブに浸漬し、外科的解剖ハサミ12.5センチペアで、脇腹の皮膚の各部分をミンチ。
- 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーター中で30分間回転板上の皮膚断片を含む場所チューブ。
- インキュベーションの終わりに10秒間激しくボルテックス
肌の4.コラゲナーゼ消化
- 70μmのストレーナーを介してチューブの内容をひずみ、10ミリリットルFREを含む新しい50mlコニカルチューブに脇腹の皮膚片を収集し、転送SH、RT HBSSメディアは、0.7 mg / mlのコラゲナーゼDに補足しました
- 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーターで30分間、回転板上で消化培地および皮膚断片を含む場所チューブ。
- インキュベーションの終わりに勢いよく10秒間チューブの渦内容。
- 新しい50mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを通してチューブのフィルタの内容。消化された組織を含むフロースルーを維持し、ストレーナを破棄し、皮膚の破片に隣接しています。
- 350×gで5分間、HBSS培地、遠心分離機50mlにフロースルー洗浄し、上清をデカントします。
5.密度勾配遠心
- 血清学的ピペットを使用して、各サンプルについての新しい15 mlのコニカルチューブに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3 mlのRT 67％密度勾配遠心分離媒体を加えます。
- 5ミリリットルフェノールレッドとHBSS中のRT 44％の密度勾配遠心分離培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- ヘント血清学的ピペットを使用して67％の密度勾配遠心分離媒体試料の上に細胞を含む44％の密度勾配遠心分離媒体のLY層5 mlです。最も遅い速度にピペッターを設定し、円錐管の壁に沿ってピペットを配置することを確認します。 、振る崩壊させる、またはグラデーションの色を反転しないように注意してください。
- 最も低い設定に設定し、加速、ブレーキを解除し、遠心分離器がバランスであることを確認し、室温で20分間、931×gで勾配を遠心します。
- 遠心分離した後、慎重に遠心分離機からグラデーションを削除して、静かに直立管を保持する実験台に運びます。 5 mlのプラスチック製トランスファーピペットを用いて、新しい15 mlのコニカルチューブに44％および67％密度勾配遠心分離媒体および転写の界面で細胞層を除去します。インターフェイスが表示されない場合は、単純に67％-44％の境界で液体の約2mlを削除します。
- INTEから細胞を含むコニカルチューブを埋めます2％1X氷冷PBSでFBS、350×gで5分間遠心分離細胞、上清をデカントでrface。
注：消化工程は37℃であり、密度勾配遠心分離媒体のステップは室温であるので、これは、セルを冷却することができることが初めてでは、/コールド保ちます。細胞を1に再懸濁することができる：1トリパンブルーに希釈し、計数し、生存率情報は、この時点で得ることができます。
フローサイトメトリー分析のための6ブロッキングと染色
- ブロックのFcγRII/ IIIは、非特異的な抗体染色を防ぐために、細胞上の受容体。非コンジュゲートと結合するCD16 / 32（2.4G2）に対する抗体とブロックのFcγRII/ III受容体の100倍希釈：ここで説明する実験のために、1を含む2％FBSを含むPBS中の抗体のマスターミックスを作ります。
- CD3ɛ（145-2C11）、CD4（RM4-5）、CD8α（53-6.7）、のCD11b（M1 / 70）、のCD11c（N418）、CD44（IM7）、CD45（に対する抗体の適切なマスターミックスでブロックされた細胞をインキュベート30-F11）、CD45R（RA3-6B2）、CD62L（MEL-14）、およびLY-6G / LY-6C（GR-1）（RB6-8C5）と同様に、ブリリアントバイオレット死んだ細胞を同定するために510生/死染色。希釈メーカーが推奨する、または以前の研究者によって最適化ですべての抗体のいずれかを使用してください。 100希釈：ここで説明する実験のために、1ですべての抗体を使用しています。
- 2％FBSを含む50μlの1×PBSの染色緩衝液中で細胞を再懸濁を洗ってください。蛍光データは、フローサイトメーターで取得できるようになるまで氷上で保管してください。
注：これは、蛍光データの取得の前にリンパ組織および（CD4またはCD8のような）一般的な細胞表面抗原で事前に最適化された補償パラメータを有することが重要です。 - 下流のフローサイトメトリー分析のために細胞の数を増加させるために、染色された細胞の全サンプルからデータを取得します。
7.以下の手順を解決するための標準的な方法を用いて、フローサイトメトリーデータの分析
- 前方散乱のリンパ球領域上にまず、ゲート側方散乱（面積）のプロットにより（面積）。
- 次に、二重の分析を避けるために、側方散乱（幅）によって前方散乱（幅）を使用して単一のセルを選択します。これはまた、側方散乱高プロットによって前方散乱の高さを用いて達成することができます。
- 目標がある場合はその後、それぞれマクロファージ、樹状細胞、およびB細胞を排除する系統のゲート（のCD11b、CD11cの、およびCD45R / B220）陰性およびCD3陽性のイベント、および閉じ込めるは、T細胞区画に分析しますそれがここにあるように、T細胞の浸潤を評価します。
- 次に、生/死染色を排除し、生細胞上のゲート。
- 最後に、目的の細胞集団上にゲート（代表的な結果を参照）。
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Representative Results
コラゲナーゼDは 媒体処置対照と比較した場合、 脾臓細胞は、T 細胞上の CD4及びCD8αの同様のレベルを示して扱わ
まず、T細胞サブセット上の系統及び活性化マーカーの頻度及び表面豊富にコラゲナーゼDの任意の潜在的な影響は、対照としての二次リンパ組織を使用して評価しました。脾臓細胞の懸濁液を、ND4マウスから得て、HBSS培地で1時間洗浄しました。次に、細胞の半分は0.7 mg / mlのコラゲナーゼD（上記のセクション4で説明したように）を行いました。残りの細胞は、コントロールHBSS培地中に再懸濁しました。次に、両方の脾細胞画分は、上記セクション5に記載されるように密度遠心分離勾配を用いて処理しました。次いで、細胞を表面にCD4およびCD8αに対する抗体で染色し、フローサイトメーターで分析しました。シングル、ライブ、CD45 +、非T細胞系譜- （B220 -のCD11b -CD11c - ）は、CD3ɛ+細胞は、B細胞、マクロファージ、樹状細胞を排除するために、分析のためにゲートしました。細胞を、30％のCD4 - -治療のいずれかを用いて検出CD8α+細胞（CD4およびCD8αタンパク質が等しくコラゲナーゼD消化に供された、それらが約60％CD4 +CD8αを有する酵素に暴露されていない脾細胞の表面上で検出されました図1A）。したがって、コラゲナーゼDダイジェストは、CD4およびCD8αの相対頻度に影響を与えませんでした。これらのサブセットの表面CD4およびCD8α幾何平均蛍光単位（GMFI）の強度は、2つの治療間で同等でした。 CD4のためのGMFI値は、それぞれ制御脾細胞のための酵素処理および2243のために2271年だった、とCD8αためGMFI値は、酵素処理および対照脾細胞のための520のために536でした。酵素処理は、また、T細胞活性化マーカーCの表面密度に影響を及ぼさありませんでしたCD4 + T細胞（ 図1B）でD44またはCD62L。 CD44のための幾何平均蛍光強度値は、酵素処理および制御のために、脾細胞654のために669でした。 CD62LのためGMFI値は、制御脾細胞のための酵素処理および1517のために1523年でした。コラゲナーゼD消化は、単離された細胞上の表面タンパク質の完全性を保持するように、ここで説明するプロトコルは、下流のフローサイトメトリー分析のために安心して使用することができます。
酵素消化および高い細胞生存率の脇腹皮膚細胞の結果の勾配精製
上記で得られた細胞懸濁液の細胞収率およびパーセント生存率は、トリパンブルー色素排除20を使用して評価しました。この消化と勾配分離プロトコルは、OX-チャレンジしたマウスにおけるフランク組織の1mm 2当たり約250の実行可能な免疫細胞や車両チャレンジしたマウスにおける組織の1mm 2当たり約4実行可能な免疫細胞が得られましたそれは、以前にオックス（ 表1）で感作しました。
酵素消化および免疫細胞の強固な回復で脇腹皮膚細胞の結果の勾配精製
次に、皮膚における免疫浸潤の程度は、OX-チャレンジし、ここで記載された方法を用いて、皮膚浸潤性免疫細胞の回復を評価するための対照マウスの脇腹から単離された細胞上のCD45表面タンパク質の存在量を分析することによって決定しました。 CD45は汎造血系統マーカー21です。前方低側方散乱、単一細胞の95％牛、チャレンジしたマウス（図示せずゲーティング）と車両チャレンジコン トロールにおけるこれらの細胞の71％が生CD45 +細胞（ 図2）でした。浸潤CD45 +免疫細胞における〜67倍の増加は、本明細書に記載した手順（ 表1）を使用して、3毎日牛の課題を以下の脇腹の皮膚で検出されました。
三フランク牛の課題は、T細胞および好中球の顕著な浸潤をもたらします
我々の技術は、GR-1 +好中球22、CD4 T細胞およびCD8αT細胞として骨髄およびリンパ細胞サブセットの多様を検出するために使用することができる脇腹皮膚から細胞集団を得ました。我々はそれぞれ〜73倍の好中球の増加、CD4 T細胞、およびCD8αT細胞は、3毎日牛の課題（ 表1）以下、約7倍〜6倍の観察、および。我々は、フローサイトメトリー分析中の生存細胞のゲートのうち、所定の免疫細胞の断片のパーセント（トリパンブルー排除を用いて数えて）得られた生存細胞の総数を乗算することによってこれらの増加を計算しました。それから、私たちを与え、ビヒクル対照マウスについて、対応する番号によって牛処置マウスにおける総生存免疫細胞の数、GR-1 +、CD4 +、またはCD8α+細胞を分割しましたリンパ球サブセットの増加を折ります。 CD11b - -のCD11c -牛処置マウスにおける細胞とエタノールで処理したマウスでは、この集団の10％GR-1 +好中球は、単一の、ライブCD45 + B220の42％を占めました （ 図2B）。牛処置マウスでは、〜ゲーテッドCD3 + T細胞の52％がCD8α+であり、ビヒクル対照で、〜T細胞の9％はCD8α+であり、57％がCD4 +（ 図2C）であった〜34％は、CD4 +でした。従って、ここに記載された技術、アレルギー性および非アレルギー性脇腹皮膚と免疫細胞サブセットの浸潤の高分解能フローサイトメトリーの特徴付けに適した単一細胞懸濁液を得るために処理することができます。
| マウスの脇腹の皮膚からの細胞サブセット | 牛/牛（3） | OX /エタノール（3） | （オックス/ E拡張を折りますthanol） |
| mm 2の組織あたり | |||
| 細胞の総数 | 262.7 | 5.3 | 49.3 |
| CD45 +免疫細胞 | 250.7 | 3.8 | 66.7 |
| CD4 + CD8 -細胞 | 6.5 | 0.9 | 7.2 |
| CD4 - CD8 +細胞 | 10.6 | 0.1 | 72.9 |
| 好中球 | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
ND4雌マウスにおけるアレルギー性脇腹の皮膚から表1細胞収量 。脇腹の皮膚から分離された生細胞をトリパンブルー排除を用いて計数し、細胞/ mm 2隔離皮膚の領域に基づいて、組織とTISごとにプールしたマウスの数に正規化しました。準備を訴えます。私たちは、系統特異的表面マーカーに基づいて、造血細胞表面上の抗原CD45、およびリンパ球サブセットの利回りの検出に基づいて総免疫細胞の収量を計算しました。それから、私たちは、リンパ球サブセットの増加倍与え、ビヒクル対照マウスに対する番号で牛処理マウス中の細胞数を割りました。示したデータは、処理当たり2-3匹のマウスからプールしたデータを表し、2つの独立した実験の代表です。
図1酵素消化および脾細胞の勾配精製は、リンパ球サブセット、細胞活性化マーカーを保持する。脾細胞を、HBSS培地で1時間洗浄しただけではコラゲナーゼDまたはHBSS培地のいずれかと共にインキュベートし、破片および赤血球を除去するために、密度勾配を用いて精製しました。 T細胞は（B220、のCD11b、CD11cの）、CD45 +、ライブ系統として同定されました<SUP> - 、およびCD3ɛ+。 CD4およびCD8αT細胞の頻度は、酵素消化（A）の後に変化しませんでした。 CD4 + T細胞上のCD44とCD62Lの表面密度は、酵素消化（B）以下の変化しませんでした。示されるデータは、一回の実験からの処理当たり2-3匹のマウスからプールしたデータを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.酵素消化および皮膚細胞の勾配精製は、アレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚対コントロールに明確な免疫浸潤を明らかにした。三フランク牛の課題は、以前に増感ND4スイスマウスの皮膚浸潤免疫細胞（中〜67倍の増加をもたらしますA）。三牛の課題もプロブ〜6倍のGR-1 +好中球（B）の増加、および〜73-それぞれ約7倍の増加CD8α+およびCD4 + T細胞、（C）を oked。ライブCD45 +免疫細胞は、単一の前方低側方散乱細胞からゲートされ、 CD11b - -のCD11c - B220からゲートされた好中球およびT細胞の生単一細胞。密度勾配分離後1トリパンブルーに希釈：カウントが1を用いて行きました。示されるデータは、各治療群では2〜3匹のマウスからプールされたデータを表し、2つの独立した実験の代表例である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このようなアトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚疾患のげっ歯類モデルにおいて皮膚常駐白血球の変化を特徴づけることは炎症性細胞の流入および疾患の病理との間に機械的な接続を理解するために重要です。ここでは、ほとんどの生物医学研究室で見つかった基本的な機器を用いて皮膚組織から白血球を分離するために経済的な手法について説明します。この比較的急速な技術は実験台でハンズオンタイムを最小限に抑えながら、資源の節約に貢献し、高価な組織解離機やカスタムチューブおよび試薬の使用を回避します。穏やかな酵素消化及び不連続勾配分離上皮細胞および破片の大部分を除去し、単離された細胞は、フローサイトメトリー分析、細胞選別、転写、細胞培養およびインビトロ刺激アッセイを含む下流の種々の用途に使用することができます。コラゲナーゼDによる酵素消化は、T細胞表面マーカーの完全性に影響を及ぼさない、とPRESERVESの細胞生存率。このプロトコルは、簡単にフランク以外の領域からの皮膚を処理するために修正することができます。
この手順の中で最も重要なステップは、細胞死を最小限に抑えながら、細胞収率を浸潤最大にするために急速に皮膚、2）取り扱いおよび処理組織を採取しながら、十分に慎重に）3）穏やかに勾配を積層し、図4に示すように、任意の脂肪および結合組織を除去する）1であります勾配のインターフェースを抽出します。大規模な実験を開始する前に、密度勾配遠心分離媒体積層界面の除去を実施することが重要です。一つは、それが見るとの間のインターフェースを抽出するためにはるかに簡単である1×PBS染色バッファに70μmのストレーナを介して全体のマウスの脾臓を破砕し、手順5で説明したように密度勾配を行うことにより、不連続密度勾配から収穫細胞を練習することができますSPを使用して44％の密度勾配遠心分離媒体および67％の密度勾配遠心分離媒体現在の免疫細胞の多数によるlenocytes、。
密度勾配で作業する場合、気泡がピペット操作しながら、避けるべきである、と勾配の混乱を最小限に抑える必要があります。勾配を含むコニカルチューブを静かに取り扱い、常に垂直に保持されるべきです。密度勾配遠心分離メディアソリューションは、常に室温であるべきである、最も遅い可能なリリース速度に設定血清学的ピペットは、室温に維持遠心分離機は、外れブレーキと低加速度に設定され、紡績前に慎重にバランスの取れました。白血球浸潤の小さな数字をもたらす皮膚の準備で作業する場合、細胞は、勾配の界面で常に表示されません。これにより、インタフェースが容易に細胞の層を識別できない場合であっても可視化することができるように、HBSSをフェノールレッドを含有する44％の密度勾配遠心分離媒体を作ることが重要です。さらに、それは優しいが、抽出する際に迅速、洗濯することが重要ですそして皮膚をHBSS培地中に置かれる前に、細胞死を回避するために、皮膚組織を処理します。
細胞生存率や純度が低い場合は、短い（〜20分）消化時間は、より微細組織をミンチコラゲナーゼD（〜0.5 mg / mlの）、またはわずかに低い濃度が役に立つかもしれません。オーバー消化および組織の劣化細胞死に寄与する可能性があるため、研究者らは、十分な大きさの細胞試料のサイズ17を提供し 、最小限の消化時間を最適化する必要があります。プロセスは、可能性の高い技術を標準化するために、個々の研究者の手に最適化のいくつかのラウンドを必要とします。コラゲナーゼD活動レベルも消化時間に製造ロットや調整の間で異なる場合があります使用される酵素のロットごとに行う必要があります。最適化中に、信頼性の高い生/死染色ならびに免疫細胞LINと歩調を消化酵素でとせずに精製された（例えば、脾臓）染色参照細胞懸濁液に重要ですEAGEマーカー（例えばCD45、CD3ɛ、のCD11b、CD11cの、など）は、細胞集団と関心の表面マーカーは、組織消化プロセスを通じて保存されていることを確認します。可能な場合は、そのフローサイトメーターで最適化を実行することが有用である前方の測定および側方散乱幅または高さだけでなく、地域、細胞凝集物を除外することができます。最後に、細胞懸濁液は、生存率および一般的な細胞形態の視覚的評価のための光学顕微鏡下で検査されるべきです。細胞は、光学顕微鏡下で計数またはビーズを用いて、フローサイトメーター上で0.4％トリパンブルー色素排除を使用して手動で計数することができます。切除された組織内の特定の細胞型のより厳密な定量化を必要とする研究のために、研究者は、計量または前に、消化後の組織フラグメントの量を測定し、より正確に組織されることに存在する細胞サブセットの数を推定するために、消化の程度を使用することができ分析しました。
これの一つの限界プロトコルは、それが特異的免疫細胞の精製に適合されていることです。一つは、他の細胞集団（例えば、皮膚上皮細胞）の単離、精製、及び分析に関心がある場合、密度勾配セットアップおよび酵素プロトコルダイジェスト最良に変更し、最適化される可能性が高い必要性の両方が目的の細胞を単離します。しかしながら、このプロトコルは、両方のリンパ系および骨髄系細胞サブセットの単離および精製を可能にし、したがって、ほとんどの免疫学的な用途に適合させることができます。別の制限は、このプロトコルは、真皮対皮膚の表皮に浸潤する細胞集団を区別するために使用することができないことです。分化のこのレベルを達成するために、このプロトコルは、さらに前に、ここで説明する手順にまたはその代わりの真皮と表皮を分離酵素的に追加の手順を適合させなければならないだろう。ここでは、サンプルは、することが困難マルチパラメータフローサイトメトリー分析を容易にするために、〜3匹のマウスからプールされ生物学的反復間の変動を検出します。しかし、選択した下流側のアプリケーションに応じて、このプロトコルは、簡単に、単一の被験者からサンプルを得ると使用するように変更することができます。最後に、若い、ND4雌マウスのためにここで紹介するプロトコルは、研究者のニーズに応じて異なる年齢、性別、系統のマウスで変更する必要があります。
要約すると、穏やかな酵素の組み合わせは、消化及び不連続勾配分離は、マウスにおける炎症性皮膚病変の免疫細胞を精製する、単純、有効かつ経済的な方法を提供します。これは、広く免疫浸潤を評価し、下流のアプリケーションのための白血球の純粋な、実行可能な集団を単離するための便利なツールのような皮膚病変の齧歯類モデルの多様な範囲を越えて使用し、適合させることができます。
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Disclosures
著者らは、開示する金銭またはその他の利害関係はありません。
Acknowledgments
国立衛生研究所（NIH R15 DCへNS067536-01A1）、国家外陰部痛協会（DCへの賞）、およびマカレスター大学は、この作品を支持しました。 CBはアーノルドとメイベルベックマン財団によって資金を供給マカレスター大学ベックマン学者プログラムからのフェローシップを受けました。 BTFとTMはJDRF 2-2011-662によってサポートされています。我々は、技術的な助言のために博士ジェイソン・シェンケル博士ジュリアナ・ルイスに感謝し、彼らの助けと支援のためのChatterjeaラボのすべての現在および元メンバー。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
