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Biology

CD146 के अलगाव Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल, चूहों से प्राथमिक फेफड़ों निवासी mesenchymal stromal कोशिकाओं को प्राप्त करने enzymatic पाचन, घनत्व ढाल जुदाई, प्लास्टिक पालन और CD146 + चुंबकीय मनका चयन के उपयोग के माध्यम के लिए एक अलग तकनीक का वर्णन करता है।

Abstract

Mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) तेजी से रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी चिकित्सीय क्षमता के लिए पहचाने जाते हैं, फेफड़ों के रोगों सहित। अस्थि मज्जा और exogenous सेल थेरेपी के लिए गर्भनाल MSCs के उपयोग के अलावा, वहाँ भी निवासी ऊतक MSCs की मरम्मत में ब्याज और पुनर्योजी क्षमता बढ़ रही है। इसके अलावा, वे संभावना सामान्य अंग विकास में एक भूमिका है, और जिम्मेदार ठहराया गया है रोग में भूमिका, विशेष रूप से एक तंतुमय प्रकृति के साथ थे। इन ऊतक निवासी MSCs के अध्ययन के लिए मुख्य बाधा अलगाव और इन कोशिकाओं की पहचान के लिए एक स्पष्ट मार्कर की कमी है। अलगाव तकनीक यहाँ वर्णित फेफड़ों निवासी MSCs (एल MSCs) के कई विशेषताओं लागू होता है। चूहों के बलिदान पर, फेफड़ों हटा दिया है और रक्त को दूर करने के लिए कई बार rinsed हैं। छुरी से यांत्रिक हदबंदी के बाद, फेफड़ों collagenase प्रकार मैं तटस्थ प्रोटीज और DNase प्रकार मैं obtaine का एक मिश्रण का उपयोग कर 2-3 घंटे के लिए पचा रहे हैंडी एकल कक्ष निलंबन बाद में धोया और घनत्व ढाल मध्यम (घनत्व १.०७३ जी / एमएल) पर स्तरित है। centrifugation के बाद, अंतरावस्था से कोशिकाओं को धोया और संस्कृति का इलाज बोतल में चढ़ाया जाता है। प्रकोष्ठों शारीरिक 5% 2 हे में 4-7 दिनों 5% सीओ 2 की स्थिति के लिए सुसंस्कृत हैं। Fibroblasts (CD146 -) व्यय करना और CD146 + कोशिकाओं के लिए केवल एल MSCs (CD146 +), सकारात्मक चयन की आबादी सुनिश्चित करने के लिए चुंबकीय मनका चयन के माध्यम से किया जाता है। सारांश में, इस प्रक्रिया को मज़बूती से आगे इन विट्रो अध्ययन और हेरफेर के लिए प्राथमिक एल MSCs की आबादी पैदा करता है। प्रोटोकॉल की प्रकृति के कारण, यह आसानी से अन्य प्रयोगात्मक पशु मॉडल में अनुवाद किया जा सकता है।

Introduction

Mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) तेजी से रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में उनकी चिकित्सीय क्षमता के लिए पहचाने जाते हैं, फेफड़ों के रोगों सहित। अस्थि मज्जा और exogenous सेल थेरेपी के लिए गर्भनाल MSCs के उपयोग के अलावा, वहाँ भी निवासी ऊतक MSCs की मरम्मत में ब्याज और पुनर्योजी क्षमता बढ़ रही है। विकास के दौरान, फेफड़ों में शामिल है, mesenchyme विकासात्मक संकेतों का एक महत्वपूर्ण स्रोत है, और MSCs निवासी एक संभावित उम्मीदवार इस के केंद्र में होना करने के लिए कर रहे हैं। इसके अलावा, सबूत में उभर रहा है कि निवासी MSCs वयस्क रोगों में आनाकानी कर रहे हैं कैंसर 1,2 और 3 फाइब्रोसिस भी शामिल है। इन ऊतक निवासी MSCs के अध्ययन के लिए मुख्य बाधा अलगाव और इन कोशिकाओं 4 की पहचान के लिए एक स्पष्ट मार्कर की कमी है। स्टेम सेल प्रतिजन -1 (एससीए -1) ऊतक स्टेम कोशिकाओं की एक किस्म के लिए एक मार्कर के रूप में चूहों में पहचान की थी, और एल MSCs 5 के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन दुर्भाग्य हैकोई अन्य प्रजातियों 6 में जाना जाता orthologs। शोधकर्ताओं ने या तो फेफड़े के ऊतकों या तरल पदार्थ से एल MSCs के अलगाव के लिए अलग अलग तरीकों की एक किस्म की सूचना है। / CD45 - - / CD90 + कोशिकाओं 7, CD31 - / CD45 - / उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) - ये छँटाई (FACS) आधारित विधियों CD31 के लिए चयन प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल से बदलती हैं / SCA-1 + कोशिकाओं 8, बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टर एटीपी बाध्यकारी कैसेट जी (ABCG2) सकारात्मक कोशिकाओं 9 या Hoechst 33342 डाई तपका 10, प्लास्टिक पालन 11,12 और कीमा बनाया हुआ ऊतक 13 से बाहर पलायन करने के लिए।

इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि के लाभ में कई गुना कर रहे हैं। एक सज्जन enzymatic पाचन और घनत्व ढाल 14 का उपयोग करके, एक घनत्व रेंज के सभी कोशिकाओं है कि MSCs शामिल हैं, लेकिन उपकला या endothelial कोशिकाओं को बाहर प्राप्त करता है। बाद में प्लास्टिक पालन कदम है कि केवल mesench सुनिश्चित करता हैymal कोशिकाओं पालन करना और संस्कृति में रहना है, ल्यूकोसाइट्स को नष्ट करने। सबसे महत्वपूर्ण बात यह हालांकि, CD146 + चयन कदम इन कोशिकाओं CD146 व्यक्त नहीं करते, fibroblasts के उन्मूलन के लिए अनुमति देता है। कोशिका आसंजन अणु CD146 की अभिव्यक्ति सकारात्मक multipotency के साथ जोड़ा जाता है, और इसलिए एक mesenchymal सेल की आबादी 15-19 से fibroblasts को साफ़ करने के लिए एक अच्छा मार्कर है। के रूप में यह केवल MSCs में बल्कि lipofibroblasts 5,20 में व्यक्त नहीं कर रहा है यह, CD90 एक चयन मार्कर के रूप में प्रयोग पर एक फायदा है। इस प्रोटोकॉल में हम स्पष्ट रूप से, एक चुंबकीय मनका चयन को चुना है के रूप में यह कोशिकाओं पर gentler है, और पूरी प्रक्रिया बाँझ परिस्थितियों में किया जा सकता है। इस अलगाव विधि का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ के रूप में परिणाम विधि करने का विरोध किया है, कि यह अपेक्षाकृत तेजी, 6-10 दिनों के रूप में परिणाम है विधि के लिए एक महीने या अधिक करने का विरोध किया है। तीन से पांच दिनों के प्रारंभिक अलगाव के बाद mesenchymal आबादी CD146 + Sele के लिए तैयार है ction; एक और तीन से पांच दिनों के बाद CD146 + कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं या बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है। के रूप में लंबे समय तक MSCs पूर्व vivo संस्कृति 19 में fibroblasts की ओर transdifferentiate संस्कृति के कम समय कोशिकाओं की गुणवत्ता में सुधार। अन्त में, प्रोटोकॉल की प्रकृति के कारण, यह संभव है बस पाचन एंजाइमों और ऊष्मायन समय की पसंद का समायोजन करके भी करने के लिए उचित एंटीबॉडी का चयन, या अन्य अंग प्रणालियों द्वारा अन्य प्रजातियों के लिए इस पद्धति लागू करने के लिए है।

इस अलगाव विधि की एक विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे दी गई है, और अलगाव और CD146 + उप-जनसंख्या के बाद के चयन की एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन क्रमशः चित्रा 1 ए और 1 बी में प्रदान की जाती है। इसके अतिरिक्त, विवरण, passaging के लिए शामिल किए गए हैं ठंड और इन कोशिकाओं विगलन।

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। चित्रा 1. फेफड़े mesenchymal कोशिकाओं (ए) और बाद में CD146 + सेल के चयन (बी) = मिनट मिनट के अलगाव के योजनाबद्ध अवलोकन; EDTA = ethylenediaminetetraacetic एसिड; 2 एन डी AB = माध्यमिक एंटीबॉडी; α-CD146 AB = प्राथमिक विरोधी CD146 एंटीबॉडी; -ve कोशिकाओं = CD146 नकारात्मक कोशिकाओं; + कोशिकाओं = CD146 सकारात्मक कोशिकाओं किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं ओटावा विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल समिति (पशु आचार प्रोटोकॉल ओहरी-1696) द्वारा अनुमोदित किया गया। जानवरों की देखभाल संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था।

1. फेफड़े mesenchymal stromal कोशिकाओं का अलगाव

  1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एंजाइम मिश्रण तैयार करें: 30 यू तटस्थ प्रोटीज में तौलना, 2500 यू कोलेजिनेस मैं और 500 यू DNase मैं इन राशियों एक वयस्क माउस या चूहा पिल्ला के फेफड़ों के लिए पर्याप्त है। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अलगाव और दुकान के दिन पर तैयार करें।
  2. pentobarbital सोडियम की एक अंतर peritoneal इंजेक्शन द्वारा 13 दिन में बलिदान चूहे पिल्ले (0.2 मिलीग्राम, 65 मिलीग्राम / एमएल)। बेहोशी की स्थापना के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा का प्रयोग करें। जानवर की मौत, छाती खोलने के द्वारा यह सुनिश्चित किया नीचे के रूप में उल्लिखित है।
  3. 70% इथेनॉल के साथ पशु छिड़काव द्वारा त्वचा को साफ करता है और ध्यान से शल्य कैंची का उपयोग, डायाफ्राम में शुरू करने और व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष की ओर काटने रिब पिंजरे खुला, बहुत सावधान नहीं किया जा रहाफेफड़ों को नुकसान पहुंचा है। ribcage hemostatic clamps का उपयोग कर खुला बिखरा हुआ है, या वैकल्पिक रूप से दूर कटौती ribcage छाती के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए।
  4. दिल को हटाने के द्वारा पशु रक्तहीन। दिल को दूर करने के लिए, थाइमस और छोटे संदंश के साथ दिल समझ और इन शल्य कैंची से काटा। तुरंत बाद, एक धुंध के साथ रक्त को अवशोषित जब तक कोई और अधिक खून कटे महाधमनी और फेफड़े के धमनी के बाहर आता है।
  5. छाती से फेफड़ों हटाये इस प्रकार है: छोटे संदंश के साथ श्वासनली पकड़ है, तो व्याख्यान चबूतरे तरफ शल्य कैंची के साथ श्वासनली तोड़। धीरे छाती से बाहर फेफड़ों पैकेज खींच जबकि, दूर फेफड़ों को मुक्त करने के ribcage साथ पृष्ठीय पक्ष पर किसी भी संयोजी ऊतक काटा।
  6. शल्य कैंची के साथ डायाफ्राम के साथ काटने से महाधमनी और घेघा से फेफड़ों तोड़। अब जब कि फेफड़े पूरी तरह छाती से मुक्त कर रहे हैं एक धुंध के साथ धीरे किसी भी शेष रक्त को हटा दें।
  7. श्वासनली और सुर के साथ ब्रांकाई हटायेgical कैंची और ध्यान से ठंड 35 मिलीलीटर 30% साइट्रेट-फास्फेट-Dextrose एडिनाइन (CPDA -1) थक्कारोधी युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को फेफड़ों पालियों हस्तांतरण (26.30 छ trisodium साइट्रेट dihydrate, 3.27 छ एस्कॉर्बिक एसिड Monohydrate, 2.22 छ मोनोसोडियम dihydrogen फॉस्फेट, 31.80 जी डी ग्लूकोज, 1 एल में 0.275 जी adenine शुद्ध एच 2 ओ; बाँझ फिल्टर समाधान रक्त और मलबे को हटाने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर) का उपयोग।
  8. 30% CPDA-1 / पीबीएस में एक 5 मिनट कुल्ला करने के बाद, एक नया 50 मिलीलीटर 35 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (आरटी) युक्त ट्यूब के लिए फेफड़ों के हस्तांतरण, धीरे पलटना साइट्रेट हटा दें। एक ट्यूब से युक्त करने के लिए स्थानांतरण 35 मिलीलीटर Dulbecco के पीबीएस + सोडियम-पाइरूवेट + ग्लूकोज (DPBS ++) (आरटी)। प्रत्येक rinsing कदम लगभग 5 मिनट के लिए ले जाना चाहिए।
    नोट: कैल्शियम क्लोराइड dihydrate १३२.४ मिलीग्राम, 100 मिलीग्राम मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate, पोटेशियम क्लोराइड (निर्जल) 200 मीटर: DPBS ++ व्यावसायिक रूप से आदेश दिया जा सकता है या के रूप में बना 21 इस प्रकार हैजी, पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार (निर्जल) 200 मिलीग्राम, सोडियम क्लोराइड (निर्जल) 8,000 मिलीग्राम, सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय (निर्जल) 1,144.5 एमजी, डी ग्लूकोज 1000 मिलीग्राम, सोडियम पाइरूवेट 1 36 में मिलीग्राम एल शुद्ध एच 2 ओ, पीएच 7.3। बाँझ फिल्टर समाधान उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग कर।
  9. 10 मिलीलीटर DPBS जोड़ने ++ (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म) और धीरे inverting जब तक भंग करके एंजाइम मिश्रण भंग।
  10. एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को फेफड़ों स्थानांतरण और एक छुरी का उपयोग कर ट्यूब की दीवार पर फेफड़ों काट जब तक पतले कीमा। (10 मिलीलीटर एंजाइम मिश्रण / वयस्क माउस / चूहा पिल्ला फेफड़ों के प्रति) के ऊतकों को एंजाइम मिश्रण जोड़ें, कसकर ट्यूब बंद करने और कोमल आंदोलन के साथ 38 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं (या तो एक थर्मल मिक्सर, एक मिलाते हुए पानी से स्नान, या एक पानी में नियमित रूप से मैनुअल आंदोलन के साथ स्नान)। भ्रूण ऊतक 60 मिनट, किशोर / वयस्क ऊतक 90-120 मिनट, तंतुमय ऊतक वयस्क 120-150 मिनट: अवधि ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है।
  11. द्विसंयोजक फैटायनों डब्ल्यू chelating से पाचन बंद करोith 200 μl ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, 0.15 मीटर, 7.4 पीएच। बाँझ फिल्टर उपयोग करने से पहले समाधान के लिए एक 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग)।
  12. 20 मिलीलीटर 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) / पीबीएस जोड़ें और एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पूरे निलंबन गुजरती हैं। 10 मिलीलीटर 5% FBS / पीबीएस के साथ ट्यूब और सेल झरनी कुल्ला, 40 मिलीलीटर की कुल मात्रा लाने।
  13. 500 XG, आरटी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  14. सतह पर तैरनेवाला निकालें (गोली स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए), 40 मिलीलीटर 5% FBS / पीबीएस में resuspend और centrifugation कदम 1.13 दोहराएँ।
  15. 4 मिलीलीटर 5% FBS में Resuspend / पीबीएस (आरटी) और 3 मिलीग्राम ध्यान से अधिक घनत्व ढाल मीडिया परत (१.०७३ ग्राम / सेमी 3) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 14। एक अच्छा अंतरावस्था प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एकल कक्ष निलंबन की लेयरिंग बहुत कम गति पर एक> 45 डिग्री के कोण पर होती है।
  16. 900 XG पर अपकेंद्रित्र 20 मिनट, मध्यम (5/10) त्वरण, कोई मंदी, 19 डिग्री सेल्सियस।
  17. कोशिकाओं में में मौजूद लीजिएterphase और उन्हें 10 मिलीलीटर में resuspend बाँझ पीबीएस।
  18. 500 XG पर 5 मिनट, 21 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र।
  19. तैरनेवाला निकालें और 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend पूर्व गर्म पूरा एल एमएससी संस्कृति के माध्यम से (न्यूनतम आवश्यक मीडिया ईगल, अल्फा संशोधन (αMEM), प्रति 500 ​​मिलीलीटर αMEM, 20% / खंड खंड FBS 2 mmol एल Glutamine के साथ पूरक और 1% खंड / खंड पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / Amphotericin बी
  20. दोहराएँ centrifugation कदम 1.18। इसके बाद, 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म ताजा संस्कृति के माध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend को हटा दें।
  21. एक उच्च घनत्व में एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर और प्लेट का उपयोग कोशिकाओं की गणना, के बाद से इस स्तर पर कोशिकाओं के बहुमत प्लास्टिक पक्षपाती नहीं हैं। सटीक चढ़ाना घनत्व, पशु प्रजातियों और उम्र, जैसे, एक वयस्क माउस फेफड़ों की कोशिकाओं 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं पर निर्भर करता है, जबकि एक चूहा पिल्ला फेफड़ों से कोशिकाओं को 1-2 की एक बोने घनत्व पर पर्याप्त घने हैं x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 2 सेमी का प्रयोग करें।
  22. संस्कृति एल MSCs एक humidified 5% ओ 2, 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  23. पीबीएस के साथ एक बार rinsing के बाद प्रारंभिक बोने के बाद मध्यम 24 घंटा, और बाद में हर 3 दिन बदल जाते हैं। जब तक कोशिकाओं 80-90% संगम है, जो मूल के पशु के आधार पर औसतन 3-5 दिन लगते हैं सुसंस्कृत होना चाहिए। उच्चतर संगम fibroblasts में भेदभाव को बढ़ावा देंगे।

2. CD146 + फेफड़े mesenchymal stromal कोशिकाओं का चयन

  1. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय मोतियों की कोटिंग
    1. कोट एक दौर नीचे में biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय मोती, 10 माइक्रोग्राम माध्यमिक एंटीबॉडी / 100 μl चुंबकीय मोती के अनुपात में बाँझ 2 बाँझ परिस्थितियों में cryovial मिलीलीटर। उम्मीद 0.5 x 10 6 कोशिकाओं प्रति 10 μl माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें, और 100 μl चुंबकीय माला और 10 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी की एक न्यूनतम का उपयोग करें।
      नोट: एक के अनुपात सेमोतियों की मात्रा प्रति इस्तेमाल निर्माताओं के बीच भिन्न हो सकती है tibodies, पसंद के मोती के लिए निर्माता के निर्देशों से परामर्श लें। इस प्रोटोकॉल के लिए, मोती और एंटीबॉडी कि इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में इस्तेमाल किया गया के लिए 1 टेबल देखें।
    2. 30 घुमाव / मिनट (आरपीएम), आरटी पर 30 मिनट के लिए एक घूर्णन नमूना मिक्सर में सेते हैं।
    3. 1.5 मिलीलीटर बाँझ 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में मोती Resuspend / पीबीएस और एक 3 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण दौर नीचे ट्यूब (ट्यूब प्रवाह cytometry)। एक अतिरिक्त 1.5 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस के साथ cryovial कुल्ला और 3 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
    4. एक उचित चुंबक पर ट्यूब प्लेस और जब तक सभी मोती ट्यूब के पीछे की दीवार से जुड़े होते हैं और समाधान स्पष्ट रहता 2 मिनट इंतज़ार करो। 3 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस के साथ दो बार अपवाह और दोहराने धोने निकालें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस में माला और दुकान, प्रकाश से सुरक्षित Resuspend। 5 दिनों के भीतर का प्रयोग करें।
  2. लेबलिंग CD146 + L-MSCs
    1. एक सज्जन गैर trypsin समाधान का उपयोग करते हुए पीबीएस के साथ rinsing के बाद mesenchymal कोशिकाओं फसल।
      नोट: खंड संस्कृति कुप्पी का आकार (0.2 मिलीग्राम / 2 सेमी मध्यम या पीबीएस) पर निर्भर करते हैं।
      1. संस्कृति के माध्यम से निकालें और बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं तीन बार कुल्ला।
      2. कोमल गैर trypsin समाधान का उचित मात्रा में जोड़ें (1 टेबल देखें)। जब तालिका 1 में समाधान का उपयोग इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग किया है, लगभग 10 मिनट।
      3. कम 500 x जी 5 मिनट के लिए एल एमएससी संस्कृति के माध्यम से, और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर एंजाइम निष्क्रिय।
    2. 0.1% बीएसए / पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला निकालें, resuspend कोशिकाओं और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गिनती।
      नोट: 0.1% बीएसए की मात्रा / पीबीएस संस्कृति कुप्पी के आकार पर निर्भर करता है: 5 या 10 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस के लिए लक्ष्य।
    3. दोहराएँ कदम 2.2.2 और 3 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस (ब्लॉक संयुक्त राष्ट्र में कोशिकाओं की राशि समर्पित resuspendविशिष्ट बाध्यकारी साइटों और) जीवित कोशिकाओं रहता है। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
    4. प्राथमिक विरोधी CD146 एंटीबॉडी के साथ एक 3 मिलीलीटर नीचे ट्यूब दौर तैयार है, और बर्फ पर रख।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता है कि कोशिकाओं के समर्पित राशि में जोड़ा जाता है कि एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है पर निर्भर करता है। एक सुझाव दिया विरोधी चूहा CD146 एंटीबॉडी के लिए 1 टेबल देखें।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ट्यूब के लिए कदम 2.2.3 से कोशिकाओं की कुल मात्रा में जोड़ें। बंद कसकर और 15 आरपीएम, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन नमूना मिक्सर पर 30 मिनट सेते हैं।
    6. 500 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, 3 मिलीलीटर 0.1% BSA / पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकाल दें। दोहराएँ सेंट्रीफ्यूज कदम है।
    7. माध्यमिक एंटीबॉडी लिपटे मोतियों कि धारा 2.1 में दिए गए निर्देशों के अनुसार तैयार किया और 15 आरपीएम, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन नमूना मिक्सर पर 30 मिनट के लिए सेते था युक्त 3 मिलीलीटर समाधान में कोशिकाओं Resuspend।
  3. CD146 + L-MSCs का चयन
    1. चुंबक पर लेबल CD146 + L-MSCs युक्त ट्यूब रखें। सकारात्मक कोशिकाओं ट्यूब के पीछे करने के लिए तैयार हो जाएगा। ट्यूब चलती है या मोतियों को छू के बिना, नकारात्मक कोशिकाओं के साथ सतह पर तैरनेवाला फसल धीरे-धीरे एक बाँझ पाश्चर विंदुक (इन या तो एकत्र किया जा सकता है या प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर खारिज कर दिया) के साथ।
    2. चुंबक से ट्यूब निकालें और 3 मिलीग्राम 10% बीएसए / पीबीएस में कोशिकाओं resuspend। चयन प्रक्रिया कदम 2.3.1 में वर्णित दोहराएँ। चार बार (Σ 5 चयन कदम)।
    3. पूर्व गर्म एल एमएससी संस्कृति के माध्यम में CD146 + L-MSCs Resuspend और चुंबक के लिए वापसी।
    4. एक उचित आकार संस्कृति कुप्पी (0.2 मिलीग्राम / 2 सेमी) में सतह पर तैरनेवाला, एल एमएससी संस्कृति के माध्यम से और प्लेट में resuspend निकालें। अंगूठे का एक नियम के रूप में, एक ही आकार संस्कृति फ्लास्क में थाली कोशिकाओं जो कोशिकाओं से मनका चयन करने से पहले उठा लिया गया। CD146 + L-MSCs की संख्या है, और इसलिए चढ़ाना घनत्व, होगाउम्र, प्रजातियों और स्रोत पशु के तनाव पर निर्भर करते हैं। हमेशा ~ 5000 कोशिकाओं / 2 सेमी की चढ़ाना घनत्व के लिए लक्ष्य।
      नोट: मोती सेल के विकास को परेशान नहीं करेंगे और के रूप में कोशिकाओं को पैदा धीरे-धीरे गायब हो जाएगा।

3. बर्फ़ीली प्रकोष्ठों

  1. निम्नलिखित ठंड मीडिया का उपयोग करें: 20% FBS, 12.5% ​​(0.9% NaCl में 10% pentastarch) 60% pentastarch समाधान CPDA-1, 2.5% सोडियम क्लोराइड (0.9%), 5% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) 22।
    नोट: यदि नहीं सभी सामग्री उपलब्ध हैं, एक समाधान 5% DMSO, 30% और 65% FBS αMEM युक्त एक अच्छा विकल्प है।
  2. 1 मिलीलीटर प्रत्येक के cryovials में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल, विभाज्य पर Resuspend कोशिकाओं और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज हे / एन एक ठंड कंटेनर का उपयोग कर।
  3. अगले दिन एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक के लिए स्थानांतरण।

4. विगलन प्रकोष्ठों

  1. 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना।
  2. 10 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओंपूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से और 500 XG पर 5 मिनट, 21 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. तैरनेवाला निकालें और 10 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम में सेल गोली resuspend। एक दिए टोपी सेल संस्कृति में बीज कोशिकाओं 0.2 मिलीग्राम / cm2 मीडिया में 5000 कोशिकाओं / 2 सेमी पर बोतल में इलाज (जैसे, एक 75 सेमी 2 कुप्पी के लिए 15 मिलीलीटर)।
  4. 5% में संस्कृति कोशिकाओं हे 2, 5% सीओ 2 तक कटाई और / या प्रयोगात्मक उपयोग के लिए 80-90% मिला हुआ। ओवर-confluency भेदभाव प्रेरित करेगा। जब 5000 कोशिकाओं / 2 सेमी पर बोने, एल MSCs संस्कृति के 3-4 दिनों के भीतर 80-90% confluency तक पहुंच जाएगा।

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Representative Results

MSCs, घनत्व और प्लास्टिक पालन का सबसे विश्वसनीय शारीरिक विशेषताओं में से दो, फेफड़ों कि एल MSCs होता है की mesenchymal सेल अंश प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल के पहले भाग में उपयोग किया जाता है। हालांकि घनत्व ढाल अंतरावस्था फेफड़े mesenchymal कोशिकाओं के अलावा monocytes और मैक्रोफेज शामिल होंगे, प्लास्टिक पालन सुनिश्चित करता है कि केवल फेफड़े mesenchymal कोशिकाओं रहने संस्कृति के 3-5 दिनों के बाद। दरअसल इस सेल की आबादी क्लासिक एमएससी सतह मार्कर CD73, CD90 और CD146 व्यक्त करता है और मार्कर CD34, CD45, प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल प्रकार द्वितीय (MHCII) -RT1B, CD11b और CD79a के लिए नकारात्मक है, यह दर्शाता है वहाँ नहीं रह में किसी भी ल्यूकोसाइट्स मौजूद हैं कि सेल की आबादी (2A चित्रा)। ब्याज की कि CD146 + सबसेट से बाहर, 44.4-65.7% की एक सीमा भी है CD73 + और ​​CD90 + (डेटा) नहीं दिखाया है। इसके अलावा, इस सेल की आबादी एक करने में सक्षम हैकॉलोनी बनाने इकाई (CFU) दक्षता है कि 30% ~ पर बहुत अधिक से अधिक आम तौर पर अस्थि मज्जा MSCs या यहां तक कि अन्य प्रकार एमएससी चित्रा (2 बी) के लिए सूचना दी है, और तीन क्लासिक एमएससी प्रजातियों (चित्रा 2 सी) के साथ differentiates।

चित्र 2
चित्रा 2. enzymatic पाचन, घनत्व ढाल जुदाई और प्लास्टिक पालन के बाद एमएससी विशेषताओं। (ए) एमएससी संबंधी सतह मार्करों की अभिव्यक्ति CD146, CD73 और CD90, प्लास्टिक पक्षपाती सेल की आबादी के हिस्से में मौजूद है जबकि नकारात्मक ल्युकोसैट मार्कर CD11b, CD79a , CD34, CD45 और MHCII-RT1B लगभग व्यक्त नहीं कर रहे थे। (बी) कालोनी इकाई के गठन के कमजोर पड़ने परख परख (5 कोशिकाओं / 2 सेमी) सीमित के माध्यम से संकेत दिया है कि ~ प्लास्टिक पक्षपाती कोशिकाओं का 30% एक प्रतिरूप क्षमता, MSCs का संकेत था। (सी) प्लास्टिक पक्षपाती सीईlls osteogenic मैट्रिक्स उत्पादन (लाल) करने में सक्षम थे, छोटे लिपिड पुटिकाओं (लाल) जब गैर विभेदित नियंत्रण की तुलना में adipogenic भेदभाव माध्यम से प्रेरित किया और गठन युक्त chondrocytes (लाल) क्षेत्रों की तरह chondrogenic के एक उच्च संख्या निहित। डेटा मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि (SEM) के रूप में प्रस्तुत किया है। सभी डेटा पारित होने के 1-3 कोशिकाओं के साथ उत्पन्न किया गया। एनएम = नकारात्मक मार्कर; CFU = कॉलोनी बनाने इकाइयों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हालांकि, मुख्य चेतावनी इस आबादी की संभावना है जिसमें दोनों एल MSCs और फेफड़ों fibroblasts की विभिन्न उपप्रकार, एल MSCs भेदभाव संतान 23 है। चूंकि multipotency सकारात्मक CD146 अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जाता है, और fibroblasts इस मार्कर का कोई अभिव्यक्ति, CD146 + उप-जनसंख्या ओ के सकारात्मक चयन होना चाहिएstensibly एक सेल की आबादी है कि अत्यधिक एल MSCs में समृद्ध है में हुई। यह स्पष्ट रूप से एमएससी जुड़े सतह मार्कर (चित्रा 3 ए) व्यक्त सेल की आबादी का एक उच्च प्रतिशत द्वारा प्रदर्शन किया है, एक काफी अधिक कॉलोनी के ~ 80% के गठन के संभावित (चित्रा 3 बी) और विशेष रूप से chondrogenic वंश में एक मजबूत भेदभाव प्रतिक्रिया (चित्रा 3 सी) कुल जनसंख्या mesenchymal कि CD146 चयन से पहले प्राप्त किया जाता है की तुलना में। टिप्पणी की है कि इन एल MSCs रूप में ही बहुत कुछ सच adipocytes, लेकिन कई और अधिक धुरी आकार कोशिकाओं है कि छोटे लिपिड vesicles से भर रहे हैं दिखाने के लिए है। ये lipofibroblast वंश कि दोनों फेफड़ों के विकास और वायुकोशीय प्रकार द्वितीय सेल समर्थन के लिए महत्वपूर्ण है प्रतिबिंबित सकता है। CD146 चयन के बाद, बड़े लिपिड पुटिकाओं के साथ भरा कोशिकाओं की तरह अधिक वसाकोशिका मनाया जा सकता है (चित्रा 3 सी) CD146 चयन से पहले की तुलना में अभी तक कोशिकाओं का बहुमत अभी भी lipofibroblasts-तरह सीई हैंछोटे लिपिड पुटिकाओं युक्त lls।

चित्र तीन
अतिरिक्त CD146 + चुंबकीय मनका चयन के बाद एमएससी चित्रा 3. विशेषताओं। CD146 + उप-जनसंख्या के सकारात्मक चयन के बाद, इन कोशिकाओं को विशेष रूप से (ए) में एक उच्च एमएससी संबंधी सतह मार्कर की अभिव्यक्ति, CD73, एकल कोशिका के बाद एक काफी अधिक CFU दक्षता से पता चला चढ़ाना (बी), और विशेष रूप से chondrogenic वंश के लिए और adipogenic वंश (सी) एक हद तक कम करने के लिए एक मजबूत भेदभाव प्रतिक्रिया। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। सभी डेटा पारित होने के 3 कोशिकाओं के साथ उत्पन्न किया गया। एनएम = नकारात्मक मार्कर; CFU = कॉलोनी इकाइयों के गठन। कृपया यहाँ क्लिक करें टीओ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

अलगाव और प्राथमिक एल MSCS की संस्कृति को बेहतर अपने समारोह और एक सेलुलर स्तर पर अन्य सेल आबादी के साथ उनकी बातचीत, और फेफड़ों के विकास, स्वास्थ्य और रोग में उनकी भूमिका को समझने का अवसर प्रस्तुत करता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण इन कोशिकाओं का एक विशिष्ट एकल मार्कर की कमी के रूप में यह लगभग असंभव बगल में इन कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए बनाता है। सभी प्राथमिक सेल आबादी के साथ के रूप में, एक को ध्यान में रखना चाहिए कि इन कोशिकाओं को और अधिक उनके चरित्र को बदलने के लिए अब वे संस्कृति 19 (24 में समीक्षा) में रखा जाता है की संभावना है। एक राज्य है कि उनकी प्राकृतिक अवस्था में संभव के रूप में बंद है में एल MSCs रखने के लिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि वे 5% ओ 2, 5% सीओ 2 में सुसंस्कृत हैं, एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में। श्वसन फिजियोलॉजी में यह आम तौर पर स्वीकार किया है कि आंशिक दबाव के डाल्टन कानून पर आधारित है, परिवेशी वायु (21% हे 2) के आंशिक ऑक्सीजन दबाव 160 एमएमएचजी है, और के लिए चला जाता ~ 10वायुकोशीय हवाई क्षेत्र में 25-27 1 एमएमएचजी। एक परिपक्व फेफड़ों में वायुकोशीय-धमनी पाओ 2 ढाल ~ 3-4 एमएमएचजी है, लेकिन यह काफी एक कोढ़ या अपरिपक्व फेफड़ों जहां वायुकोशीय-धमनी दूरी 25,28 बढ़ जाती है में वृद्धि हो सकती है। शरीर के अंदर, mesenchymal आला सामान्य रूप से 2-8% 29,30 के एक ऑक्सीजन एकाग्रता से अवगत कराया है। केवल कुछ कागजात वास्तव में फेफड़ों में पीओ 2 मापा जाता है, लेकिन एक अध्ययन में 20 रोगियों के फेफड़ों में इस मापा जाता है, एक सीमा 42.8 एमएमएचजी 27,31 के एक औसत के साथ 23 656 एमएमएचजी करने से पीओ 2 सामान्य फेफड़ों में खोजने,। डाल्टन के कानून के अनुसार, 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 5% ओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर ~ 36 एमएमएचजी की एक PO 2, जो सामान्य रेंज फेफड़े के ऊतकों में मापा भीतर पूरी तरह से गिर जाता है और बहुत मंझला के करीब है। इसके अलावा, कम ऑक्सीजन संस्कृति की स्थिति संस्कृति 29 में पूर्वज आबादी के रखरखाव को बढ़ावा देने के। साथ में ले ली, यह मैंयह बताने के लिए कि क्या वास्तव में ऑक्सीजन एकाग्रता एल MSCs सामान्य प्रसव के बाद विकास या बीमारी के दौरान विभिन्न चरणों में सीटू के संपर्क में हैं मुश्किल है, लेकिन ऐसा लगता है कि 5-10% 2 हे की संभावना सबसे अधिक एक शारीरिक परिप्रेक्ष्य 27,31 से सटीक है। ऊपर उद्धृत जानकारी के आधार पर, हम अपनी संस्कृति की स्थिति में 5% 2 हे बनाए रखने के लिए चुना है, और हमने पाया है कि जब इन विट्रो की स्थिति में रखा जाता है, एल MSCs, तेजी से बढ़ने कम तनाव फाइबर प्रदर्शन, और एक छोटे संभावना होगा सहज भेदभाव या वार्धक्य की। अतिरिक्त कारकों है कि सहज भेदभाव या अन्य असामान्यताओं को रोकने जाएगा, passaging के लिए एक सौम्य गैर trypsin हदबंदी एजेंट का उपयोग passaging एल MSCs जब वे 80-90% confluency (घना शर्तों fibroblast भेदभाव को बढ़ावा देंगे) तक पहुँचने, और बीतने संख्या कम रखने के द्वारा होता है (<पी 4)। हॉफमन और उनके सहयोगियों द्वारा एक अध्ययन में, trypsin एल MSCs समारोह पर प्रतिकूल प्रभाव है दिखाया गया था औरphenotype, जबकि trypsin मुक्त हदबंदी एजेंटों इस 13 की रक्षा कर सकता है।

अलगाव की प्रक्रिया के दौरान उपज का अनुकूलन करने के लिए, यह, के रूप में पतले संभव के रूप में फेफड़ों भरती है, जबकि मन में है कि ऊतक सुखाने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए में रखते हुए महत्वपूर्ण है। enzymatic पाचन के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूब अक्सर एक गर्म मिलाते डिवाइस का उपयोग नहीं करते हैं, तो के रूप में ऊतक टुकड़े तलछट जाएगा उत्तेजित कर रहे हैं और एंजाइमों के लिए इष्टतम जोखिम नहीं मिलेगा। एक और महत्वपूर्ण कदम घनत्व ढाल जुदाई है: अगर लेयरिंग बहुत धीरे या एक कोण <45 डिग्री पर नहीं किया जाता है, यह, लेयरिंग के बजाय दो तरल पदार्थ के मिश्रण को बढ़ावा मिलेगा पूरे सेल की आबादी का नुकसान हुआ। इसके अलावा, मध्यम घनत्व ढाल का घनत्व आसपास के तापमान पर बहुत निर्भर है। 19 डिग्री सेल्सियस (या आरटी) की तुलना में किसी अन्य तापमान, सबऑप्टिमल या कोई घनत्व ढाल जुदाई में परिणाम होगा।

एफ के लिए ब्याज कीइस प्रोटोकॉल के uture उन है कि हम सफलतापूर्वक, फेफड़ों कि अलगाव से पहले 24 घंटा के लिए ऊपर काटा गया से व्यवहार्य एल MSCs अलग है बशर्ते कि फेफड़ों सीधे फसल पर ठंड एल एमएससी मीडिया में जमा हो जाती है, और 4 में रखा है सी। यह और अधिक लचीला प्रायोगिक योजना, या विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच फेफड़ों के भी लदान के लिए अनुमति देता है। आम तौर पर उपज हौसले से काटा फेफड़ों के समान है, और कोशिकाओं को समान रूप से अच्छी तरह से जाना।

एक अन्य संशोधन है कि संभव होगा, चुंबकीय मनका चयन के बजाय FACS का उपयोग करने के लिए है, भले ही इस विधि को और अधिक तनाव की कोशिकाओं विषयों के रूप में प्रक्रिया को और अधिक समय लगता है और कोशिकाओं के रूप में उच्च दबाव और गति के अधीन हैं, और संक्रमण के जोखिम को बंदरगाहों नहीं तो बाँझ शर्तों के तहत किया। चुंबकीय यहां इस्तेमाल किया मोती सेल के विकास के साथ हस्तक्षेप नहीं करते, और संस्कृति के कुछ ही दिनों के भीतर गायब हो जाते हैं। FACS या चुंबकीय मनका छँटाई के लिए एक वरीयता भी सुविधाएं उपलब्ध पर निर्भर हो सकता हैअंत उपयोगकर्ता के लिए। इसके अतिरिक्त, यह अन्य ऊतकों से निवासी MSCs अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए संभव हो जाएगा। इस मामले में यह, ब्याज की अंग को एंजाइमों दर्जी के रूप में मैट्रिक्स रचना अंगों के बीच होती है महत्वपूर्ण होगा।

केवल घनत्व ढाल और mesenchymal कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बाद में प्लास्टिक पालन उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि जिसके परिणामस्वरूप जनसंख्या दोनों एल MSCs और fibroblasts शामिल है। CD146 + कोशिकाओं के लिए चयन दृढ़ता से उपचार इस चेतावनी है, लेकिन CD146 + चयन प्रक्रिया और सावधान संवर्धन की स्थिति, एल MSCs की प्रकृति और इन विट्रो सेल संस्कृति के प्रभाव के बावजूद यह fibroblasts में भेदभाव के कुछ डिग्री से बचने के लिए असंभव बना। सामान्य में MSCs multipotency के एक पदानुक्रम है, जो कोशिकाओं में आगे नीचे पदानुक्रम धीरे-धीरे उनकी multilineage संभावित खो जब तक वे टर्मिनली विभेदित fibroblasts बनने को रोकने के लिए सूचित किया गया है <sup> 23। सभी संभावना में यह भी एल एमएससी आला 4 में होता है और सुसंस्कृत CD146 + CD146 + चयन के बाद पहले से ही एक मार्ग कोशिकाओं का लगभग 40% जनसंख्या के रूप में परिलक्षित होना CD146 अभिव्यक्ति खो दिया है लगता है। साथ ही, इस आबादी में सिर्फ 80% और 40% CD73 CD90 अभिव्यक्ति है। भाग में, इस multipotency के एमएससी पदानुक्रम के द्वारा समझाया जा सकता है। यह संभव होगा CD146 + विषम प्रसार से गुजरना है कि, दोनों CD146 सकारात्मक और नकारात्मक MSCs, अधिक विभेदित, बेटी कोशिकाओं को जन्म दे रही है। फेफड़ों के निवासी MSCs भी यथोचित अस्थि मज्जा MSCs से एक कुछ अलग phenotype और समारोह, जिस पर CD73 और CD90 अभिव्यक्ति की परिभाषा के आधार पर किया गया है की उम्मीद की जा सकती है। सेल थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी मान्यता प्राप्त है कि नहीं सभी MSCs CD73 और CD90 सहित क्लासिक एमएससी मार्कर, एक्सप्रेस, और कहा कि सतह मार्कर अभिव्यक्ति MSCs 32 को परिभाषित करने के लिए सबसे अच्छा तरीका नहीं है। ई~ की CD146 + L-एमएससी जनसंख्या का 70% xceptionally उच्च दक्षता CFU इस समर्थन करता है। क्योंकि CD146 + जनसंख्या अवर्गीकृत mesenchymal आबादी की तुलना में एमएससी विशेषताओं के संबंध में बेहतर प्रदर्शन करती है, लेखकों आगे CD146 विशेषता नहीं है - जनसंख्या। हम MSCs के साथ हमारे mesenchymal आबादी को समृद्ध और उन्हें fibroblasts की ख़ाली करने के लिए प्रयासरत है, लेकिन हम यह दावा नहीं करते कि यह केवल सच एल एमएससी आबादी है। एल MSCs दोनों में मूल, phenotype और समारोह, बहुत विषम संभावना है।

हालांकि CD146 व्यापक रूप से MSCs और pericytes 16,17,33,34 में multipotency के एक मार्कर होना स्वीकार किया है, बहुत कम विवो में CD146 + एमएससी जनसंख्या के बारे में जाना जाता है। CD146 एक कोशिका आसंजन अणु है कि angiogenesis और endothelial सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है, और endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, pericytes, MSCs और टी लिम्फोसाइटों 15,16,35,36 में व्यक्त किया जाता है। हाल के वर्षों मेंMSCs कि कई अंगों में परिवाहकीय आला निवास, सबूत में उभरा है, एमएससी-मार्कर CD73 और CD105 37 के लिए CD146 + कोशिकाओं सह दाग के रूप में। दरअसल, सुसंस्कृत और pericytes MSCs का मानना ​​है कि MSCs pericytes 4,39 से निकाली गई है मजबूत बनाने, एक बहुत ही इसी जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल 38 लोगों की है। हालांकि हम प्रदर्शन नहीं किया है प्रतिरक्षाऊतकरसायन हमारे CD146 + L-एमएससी जनसंख्या का स्थान निर्धारित करने के लिए विश्लेषण करती है, यह बहुत संभावना है कि वे भी एक परिवाहकीय स्थान में स्थित हो जाएगा। भविष्य के अध्ययन करता है, तो यह वास्तव में मामला है सत्यापित करने की जरूरत होगी। हालांकि यह बताया जाना चाहिए कि सभी कोशिकाओं phenotypically CD146 + चयन के बाद बहुत इसी तरह लग यह संभव है, कि हमारे सेल की आबादी का एक सबसेट pericytes हैं।

Mesenchymal stromal कोशिकाओं एक भी सभी को शामिल मार्कर की कमी के कारण कुख्यात पहचान करने के लिए मेहनत कर रहे हैं। विभिन्न अध्ययनों से अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों को सूचित किया हैएल MSCS की, और खांसने से पता चला है कि इन सेल आबादी एमएससी मार्कर अभिव्यक्ति के लिए सम्मान के साथ एक दूसरे के समान हैं। CD146 + L-एमएससी के लक्षण वर्णन के आधार पर यहाँ के रूप में प्रस्तुत किया है, CD146 + L-एमएससी आबादी बहुत पहले से सूचना दी एल एमएससी आबादी के रूप में परिणाम या FACS के विभिन्न रूपों के रूप में इस तरह के Sca स्टेम सेल जुड़े सतह मार्कर का उपयोग करके हासिल करने के लिए इसी तरह की है -1, ABCG2 और CD90। जब परिणाम के लिए एल MSCs 13 की तुलना में, CD146 + L-MSCs एक अधिक से अधिक एकल कक्षों से कालोनियों को जन्म देने की क्षमता है करने के लिए दिखाई देते हैं, यह दर्शाता है कि हमारे विधि एक अधिक समृद्ध multipotent एल एमएससी आबादी पैदावार। यह लाभ है, जब कि तरीकों को अलग एल MSCs CD90 7 या प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर α (PDGFRα) 40,41 के आधार पर की तुलना में सच भी है, क्योंकि दोनों सतह मार्करों भी अधिक टर्मिनली विभेदित lipofibroblasts और वायुकोशीय / स्ट्रक्चरल fibroblasts और के लिए चयन कर सकते हैं इसलिए केवल यथोचित खई stromal कोशिकाओं 20,42 के रूप में पहचान की। इसके विपरीत, दोनों Sca -1 और ABCG2 अच्छी तरह मार्करों कि stemness और एमएससी अभिव्यक्ति 9,43-46 के साथ संबंध स्थापित दस्तावेज हैं। ABCG2 + L-MSCs हालांकि एक अधिक endothelial प्रकृति के रूप में वे CD31 46 के लिए 99% सकारात्मक रहे हैं, जबकि विधि यहां बताया Ficoll ढाल और प्लास्टिक पालन के माध्यम से endothelial कोशिकाओं के खिलाफ चयन करता है। McQualter और उनके सहयोगियों 5.8 की Sca -1 आधारित अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में हमारे विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह व्यापक रूप से चूहों की तुलना में अन्य प्रजातियों, जिसमें Sca -1 के लिए लागू नहीं किया जा सकता है।

हालांकि यह बहुत चुनौतीपूर्ण है, शायद असंभव पर निकट है, एक देर के विकास या वयस्क फेफड़ों से एल MSCS की एक "शुद्ध" जनसंख्या को प्राप्त करने और एक undifferentiated राज्य में इसे बनाए रखने के लिए, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक तेज, सुसंगत और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है एक सेल की आबादी प्राप्त करने के अत्यधिक multipotent स्वयं renewing फेफड़ों रेस में समृद्धअध्यक्ष MSCs। इस विधि का प्रयोग रोग मॉडल की एक विस्तृत विविधता और विकासशील फेफड़ों में उनकी भूमिका में एल MSCs की भूमिका की एक अधिक परिभाषित अध्ययन सक्षम हो जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

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CD146 के अलगाव<sup&gt; +</sup&gt; चूहा फेफड़ों से निवासी फेफड़े mesenchymal stromal कोशिकाओं
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Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

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