Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Denne protokol beskriver en isolation teknik til opnåelse primære lunge residente mesenchymal stromaceller fra rotter, ved brug af enzymatisk fordøjelse, gradient separation massefylde, plast adhærens og CD146 + magnetiske perler markering.

Abstract

Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er i stigende grad anerkendt for deres terapeutiske potentiale i en lang række sygdomme, herunder lungesygdomme. Udover brugen af ​​knoglemarv og navlestrengen MSC for eksogen celleterapi er der også stigende interesse i reparation og regenerativ potentiale hjemmehørende væv MSC. Desuden har de sandsynligvis have en rolle i normal organudvikling, og er blevet tilskrevet roller i sygdom, især dem med en fibrotisk natur. Den vigtigste hindring for studiet af disse residente væv MSC'er er manglen på en klar markør til isolering og identifikation af disse celler. Isoleringen teknikken beskrevet her anvender flere karakteristika lunge residente MSC'er (L-MSC). Efter aflivning af rotterne, er lungerne fjernes og skylles flere gange for at fjerne blod. Efter mekanisk dissociation af skalpel, er lungerne fordøjes i 2-3 timer ved anvendelse af en blanding af kollagenase type I, neutral protease og DNase type I. Den obtained enkelt cellesuspension vaskes efterfølgende og lagt over densitetsgradient medium (densitet 1,073 g / ml). Efter centrifugering er celler fra interfasen vasket og udpladet i kultur-behandlede kolber. Celler dyrkes i 4-7 dage i fysiologisk 5% O2, 5% CO2 betingelser. At nedbryder fibroblaster (CD146 -) og for at sikre en befolkning på kun L-MSC'er (CD146 +), positiv selektion for CD146 + celler udføres gennem magnetisk perle markering. Sammenfattende denne procedure pålideligt producerer en population af primær L-MSC'er til yderligere in vitro-undersøgelse og manipulation. På grund af karakteren af ​​protokollen, kan det nemt oversættes til andre eksperimentelle dyremodeller.

Introduction

Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er i stigende grad anerkendt for deres terapeutiske potentiale i en lang række sygdomme, herunder lungesygdomme. Udover brugen af ​​knoglemarv og navlestrengen MSC for eksogen celleterapi er der også stigende interesse i reparation og regenerativ potentiale hjemmehørende væv MSC. Under udvikling, herunder i lungerne, mesenchymet er en vigtig kilde til udviklingsmæssige signaler, og bosiddende MSC er en sandsynlig kandidat til at være i centrum af dette. Desuden er beviser opstå, at hjemmehørende MSC forstyrres i voksne sygdomme, herunder cancer 1,2 og fibrose 3. Den vigtigste forhindring for studiet af disse hjemmehørende væv MSC er manglen på en klar markør til isolering og identifikation af disse celler 4. Stamcelle antigen-1 (Sca-1) blev identificeret i mus som en markør for en række væv stamceller, og kan anvendes til isolering af L-MSC'er 5, men har desværreingen kendt orthologer i andre arter 6. Forskere har rapporteret om en række forskellige isoleringsmetoder til isolering af L-MSC'er fra enten lungevæv eller væske. Disse varierer fra fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) baserede metoder selektion for CD31 - / CD45 - / CD90 + celler 7, CD31 - / CD45 - / epitel celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) - / Sca-1 + -celler 8, multilægemiddelresistens transportør ATP bindende kassette G (ABCG2) positive celler 9 eller Hoechst 33342 farvestof udstrømning 10, til plast tilslutning 11,12 og migration ud af hakket væv 13.

Fordelene ved heri præsenterede metode er flere gange. Ved at bruge en blid enzymatisk fordøjelse og densitetsgradient 14, opnår man alle cellerne i tæthedsområdet der omfatter MSC'er men udelukker epiteliale eller endotelceller. Den efterfølgende plast adhærencetrin sikrer, at kun den mesenchymal celler klæbe og ophold i kultur, fjerne leukocytter. Vigtigst imidlertid CD146 + selektionstrin muliggør fjernelse af fibroblaster, da disse celler ikke udtrykker CD146. Ekspression af celleadhæsionsmolekyle CD146 er positivt korreleret med multipotency, og er derfor en god markør for at frasortere fibroblaster fra en mesenchymal cellepopulation 15-19. Dette er en fordel ved at benytte CD90 som en selektionsmarkør, da det ikke kun udtrykkes i MSC'er men også i lipofibroblasts 5,20. I denne protokol har vi udtrykkeligt valgt en magnetisk perle udvælgelse, da det er blidere på cellerne, og hele proceduren kan udføres under sterile forhold. En anden vigtig fordel ved denne isolation metode frem for udvæksten metode, er at det er relativt hurtig, 6-10 dage i modsætning til en måned eller mere for udvækst metode. Tre til fem dage efter den oprindelige isolering af mesenkymale befolkning er klar til CD146 + sele Indsatsen; efter yderligere tre til fem dage CD146 + celler er klar til brug i forsøg, eller kan fryses til senere brug. Den reducerede tid Kulturens forbedrer kvaliteten af cellerne som MSC'er transdifferentiate dybt fibroblaster i langvarig ex vivo kultur 19. Endelig på grund af arten af ​​protokollen, er det muligt at anvende denne metode på andre arter ved blot at vælge egnede antistoffer, eller endda til andre organsystemer ved at justere valget af fordøjelsesenzymer og inkubationstid.

En detaljeret protokol af denne isolation fremgangsmåde følger nedenfor, og en skematisk oversigt over isoleringen og efterfølgende udvælgelse af CD146 + subpopulationen er tilvejebragt i figur 1A og 1B henholdsvis. Derudover er detaljer inkluderet for passage, frysning og optøning disse celler.

annonce / 53.782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk oversigt over isolering af pulmonale mesenkymale celler (A) og efterfølgende CD146 + celle valg (B) min = minutter.; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre 2. Ab = sekundært antistof; a-CD146 Ab = primære anti-CD146-antistof; -ve celler = CD146-negative celler; + ve celler = CD146 positive celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Animal Care udvalg fra University of Ottawa (dyr etik protokol Ohri-1696). Animal pleje blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.

1. Isolering af Lung Mesenchymale stromacellers

  1. Forbered enzymet mix i en 50 ml rør: vejer 30 U Neutral Protease, 2500 U Collagenase I og 500 U DNAse I. Disse beløb er tilstrækkelige til lungerne af en voksen mus eller rotte hvalp. Forbered på dag af isolation og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
  2. Sacrifice rotteunger på dag 13 ved en intraperitoneal injektion af pentobarbital-natrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Brug tå knivspids refleks at etablere bevidstløshed. Dyrets død sikres ved at åbne brystet, som skitseret nedenfor.
  3. Sanitize huden ved at sprøjte dyret med 70% ethanol og forsigtigt åbne brystkassen anvendelse af kirurgiske sakse, begyndende ved membranen og skære mod rostralt side, bliver meget omhyggelig med ikkeat beskadige lungerne. Spred brystkassen åben hjælp hæmostatiske klemmer, eller alternativt skåret væk brystkassen at give adgang til brystkassen.
  4. Exsanguinate dyret ved at fjerne hjertet. For at fjerne hjertet, tage fat i thymus og hjerte med små pincet og skær disse væk med kirurgiske sakse. Umiddelbart herefter absorbere blodet med en gaze, indtil der ikke mere blod kommer ud af afhuggede aorta og lungepulsåren.
  5. Fjern lungerne fra brystkassen som følger: Hold luftrøret med små pincet, derefter afskære luftrøret med kirurgiske saks på rostrale side. Mens forsigtigt at trække lungerne pakke ud af brystkassen, skæres væk enhver bindevæv på den dorsale side langs brystkassen at befri lungerne.
  6. Sever lungerne fra aorta og spiserøret ved at skære langs membranen med kirurgiske sakse. Nu, at lungerne er helt fri fra brystkassen fjerne enhver resterende blod forsigtigt med en gaze.
  7. Fjern luftrør og bronkier med surgiske saks og omhyggeligt overføre lungelapperne til et 50 ml rør indeholdende kold 35 ml 30% citrat-phosphat-dextrose adenin (CPDA-1) antikoagulant (26.30 g trinatriumcitratdihydrat, 3,27 g ascorbinsyre monohydrat, 2,22 g mononatrium dihydrogenphosphat, 31,80 g D-glucose, 0,275 g adenin i 1 L oprenset H2O; sterilt filter opløsningen under anvendelse af en 0,22 um membranfilter før brug) i phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne blod og efterladenskaber.
  8. Efter en 5 min skylning i 30% CPDA-1 / PBS, overføre lungen til et nyt 50 ml glas indeholdende 35 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) (RT), vendes forsigtigt for at fjerne citrat. Overførsel til et rør indeholdende 35 ml Dulbeccos PBS + Natrium-pyruvat + Glukose (DPBS ++) (RT). Hver skylning skridt bør tage ca 5 min.
    Bemærk: DPBS ++ kan bestilles kommercielt eller består af følgende 21: kalciumchloriddihydrat 132,4 mg, magnesiumchloridhexahydrat 100 mg, kaliumklorid (vandfri) 200 mg, monobasisk kaliumphosphat (vandfrit) 200 mg, natriumchlorid (vandfrit) 8.000 mg, natriumfosfat dibasisk (vandfrit) 1,144.5 mg, D-glucose 1000 mg, natriumpyruvat 36 mg i 1 oprensede H2O, pH 7,3. Opløsningen sterilfiltreres under anvendelse af en 0,22 um membranfilter før brug.
  9. Opløs enzymblandingen ved tilsætning af 10 ml DPBS ++ (forvarmet til 37 ° C) og vende forsigtigt, indtil opløst.
  10. Overfør lungerne til et nyt 50 ml rør og hak lungen på væggen af ​​røret ved hjælp af en skalpel indtil fint hakket. Tilføj enzymblandingen til vævet (10 ml enzymblanding / per voksen mus / rotte pup lunge), lukke tuben tæt og inkuberes ved 38 ° C under forsigtig omrøring (enten i en termisk mixer, et rystevandbad, eller en vand bad med regelmæssig manuel agitation). Varigheden afhænger af typen af ​​væv: fostervæv 60 min, juvenil / voksent væv 90-120 min, fibrotisk voksent væv 120-150 min.
  11. Stop fordøjelse ved chelatering de bivalente kationer wed 200 pi ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Opløsningen sterilfiltreres under anvendelse af en 0,22 um membranfilter før brug).
  12. Tilsæt 20 ml 5% føtalt bovint serum (FBS) / PBS og passere hele suspensionen gennem 100 um cellefilter i et nyt 50 ml rør. Skyl røret og cellefilter med 10 ml 5% FBS / PBS, hvorved det samlede volumen til 40 ml.
  13. Centrifuger i 5 minutter ved 500 xg, RT.
  14. Fjern supernatanten (pellet skal være klart synligt), resuspender i 40 ml 5% FBS / PBS og gentag centrifugering trin 1.13.
  15. Resuspender i 4 ml 5% FBS / PBS (RT) og lag forsigtigt over 3 ml densitetsgradient medier (1,073 g / cm3) i et 15 ml rør 14. At opnå en god interfase, er det afgørende, at lagdeling af den enkelt cellesuspension forekommer ved a> 45 ° vinkel ved meget lav hastighed.
  16. Centrifuger 20 min ved 900 xg, medium (5/10) acceleration, ingen deceleration, 19 ° C.
  17. Opsamle cellerne til stede i iterphase og resuspender dem i 10 ml sterilt PBS.
  18. Centrifuger i 5 minutter ved 500 xg, 21 ° C.
  19. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml forvarmet afsluttet L-MSC dyrkningsmedium (minimum essential medium Eagle, alfa modifikation (aMEM), suppleret med 2 mmol L-glutamin pr 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS og 1% vol / vol Penicillin / streptomycin / amphotericin B.
  20. Gentag centrifugering trin 1.18. Efterfølgende fjernes supernatanten og resuspender i 10 ml forvarmet frisk dyrkningsmedium.
  21. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller og plade ved en høj densitet, da størstedelen af ​​celler på dette stadium er ikke plastik vedhængende. Den nøjagtige udpladningsdensitet afhænger af dyrearten og alder, f.eks cellerne af en voksen muselunge podet ved 10 5 celler / cm2, hvorimod celler fra en rotte pup lunge er tilstrækkeligt tæt på en seeding tæthed på 1-2 x 10 4 celler / cm2 cm2.
  22. Kultur L-MSC'er i en befugtet 5% O2, 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C.
  23. Skift medium 24 timer efter den første podning og derefter hvert 3 dage efter skylning en gang med PBS. Celler bør dyrkes indtil 80-90% sammenløb, hvilket tager 3-5 dage i gennemsnit afhængigt dyret oprindelseslandet. Højere konfluens vil fremme differentiering til fibroblaster.

2. Udvælgelse af CD146 + Lung Mesenchymale stromacellers

  1. Coating af magnetiske perler med sekundært antistof
    1. Coat de magnetiske perler med biotinyleret sekundært antistof, ved et forhold på 10 ug sekundært antistof / 100 pi magnetiske perler i en rundbundet sterile 2 ml kryoglas i sterile betingelser. Brug 10 pi sekundært antistof pr forventede 0,5 x 10 6 celler, og bruge mindst 100 pi magnetiske perler og 10 ug antistof.
      Bemærk: Forholdet mellem entibodies anvendes pr volumen af ​​perler kan variere mellem producenter, henvises til producentens anvisninger for perlerne af valg. Til denne protokol henvises til tabel 1 for de perler og antistoffer, der blev brugt i optimeringen af ​​denne protokol.
    2. Inkuber i en roterende prøve blander i 30 minutter ved 30 omdrejninger / min (rpm), ved stuetemperatur.
    3. Resuspendere perlerne i 1,5 ml steril 0,1% bovint serumalbumin (BSA) / PBS og overføres til en 3 ml rundbundet rør (flowcytometri rør). Skyl cryovialet med yderligere 1,5 ml 0,1% BSA / PBS og overføre til 3 ml rør.
    4. Glasset anbringes på en egnet magnet og vent 2 min, indtil alle perlerne er fastgjort til den bageste væg af røret, og opløsningen forbliver klar. Fjern afstrømning og gentag vask med 3 ml 0,1% BSA / PBS to gange.
    5. Resuspendere perlerne i 3 ml 0,1% BSA / PBS og opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys. Anvendes inden 5 dage.
  2. Mærkning CD146 + L-MSC'er
    1. Høste mesenkymale celler efter skylning med PBS ved anvendelse af en mild ikke-trypsin-opløsning.
      Bemærk: Mængder afhænger af størrelsen af dyrkningskolbe (0,2 ml / cm2 medium eller PBS).
      1. Fjern dyrkningsmedium og skyl celler tre gange med sterilt PBS.
      2. Derpå tilsættes en passende mængde af blid ikke-trypsin-opløsning (se tabel 1). Der inkuberes ved 37 ° C i inkubatoren indtil cellerne har fritstående, ca. 10 min ved brug af løsningen i tabel 1.
      3. Inaktivere enzymet ved tilsætning af L-MSC dyrkningsmedium, og centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g.
    2. Fjern supernatanten, resuspender cellerne i 0,1% BSA / PBS og tælle cellerne med et hæmocytometer eller automatisk celletæller.
      Bemærk: Mængden af ​​0,1% BSA / PBS afhænger af størrelsen af ​​dyrkningskolbe: sigt efter 5 eller 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Gentag trin 2.2.2 og resuspender dedikerede mængde celler i 3 ml 0,1% BSA / PBS (blokke unspecifikke bindingssteder og holder cellerne i live). Hold celler på is.
    4. Forbered en 3 ml runde bund rør med det primære anti-CD146-antistof, og holde på is.
      Bemærk: Koncentrationen af ​​primært antistof, der tilsættes til den dedikerede mængde celler afhænger af det antistof, der anvendes. For en foreslået anti-rotte CD146-antistof se tabel 1.
    5. Tilføj det samlede volumen af ​​celler fra trin 2.2.3 til røret med det primære antistof. Luk stramt og inkuber 30 minutter på en roterende prøve blander ved 15 rpm, 4 ° C.
    6. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 xg, 4 ° C, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml 0,1% BSA / PBS. Gentag centrifuge trin.
    7. Resuspender cellerne i 3 ml opløsning indeholdende sekundært antistof overtrukne perler, der blev fremstillet ifølge anvisningerne i afsnit 2.1 og inkuber 30 minutter på en roterende prøve blander ved 15 rpm, 4 ° C.
  3. Valg af CD146 + L-MSC'er
    1. Placer røret med det mærkede CD146 + L-MSC'er på magneten. De positive celler vil blive draget til bagsiden af ​​røret. Uden at flytte røret eller rører perlerne, høste supernatanten med de negative celler langsomt med en steril Pasteur-pipette (disse kan enten opsamles eller bortkastes baseret på det eksperimentelle design).
    2. Fjern røret fra magneten og cellerne resuspenderes i 3 ml 10% BSA / PBS. Gentag udvælgelsesproceduren beskrevet i trin 2.3.1. fire gange mere (Σ 5 valg trin).
    3. Resuspender CD146 + L-MSC'er i forvarmet L-MSC dyrkningsmedium og vende tilbage til magneten.
    4. Fjern supernatanten, resuspender i L-MSC dyrkningsmedium og pladen i en hensigtsmæssigt dimensioneret dyrkningskolbe (0,2 ml / cm2). Som en tommelfingerregel, plade celler i samme størrelse kultur kolbe, hvorfra cellerne blev løftet før perle-selektion. Antallet af CD146 + L-MSC'er, og derfor klædningen tæthed, vilafhænger af alder, art og stamme af kilden dyr. Sigter altid efter en plating tæthed af ~ 5.000 celler / cm2.
      Bemærk: Perlerne vil ikke forstyrre cellevækst og vil gradvist forsvinde efterhånden som cellerne prolifererer.

3. Frysning Celler

  1. Brug følgende frysning medier: 60% pentastarch opløsning (10% pentastarch i 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimethylsulfoxid (DMSO) 22.
    Bemærk: Hvis ikke alle ingredienser er til rådighed, en opløsning, der indeholder 5% DMSO, 30% FBS og 65% aMEM er et godt alternativ.
  2. Resuspender celler ved 0,5 x 10 6 celler / ml alikvoter i kryoglas af 1 ml hver og fryse O / N ved -80 ° C under anvendelse af en frysning beholder.
  3. Overførsel til en flydende nitrogen lagertank den næste dag.

4. Optøning Celler

  1. Optø et hætteglas med celler i et 37 ° C vandbad i 5 minutter.
  2. Resuspender cellerne i 10 mlforopvarmet dyrkningsmedium og centrifugeres i 5 minutter ved 500 xg, 21 ° C.
  3. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml dyrkningsmedium. Seed celler i en ventileret hætte cellekultur behandlet kolber ved 5.000 celler / cm2 i 0,2 ml / cm2 medier (f.eks, 15 ml til en 75 cm2 kolbe).
  4. Kultur celler i 5% O 2, 5% CO 2, indtil 80-90% sammenflydende til høst og / eller eksperimenterende brug. Over-konfluens vil inducere differentiering. Når podning på 5000 celler / cm2, vil L-MSC'er nå 80-90% konfluens inden for 3-4 dages dyrkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To af de mest pålidelige fysiske egenskaber for MSC, tæthed og plast vedhæftning, der bruges i den første del af denne protokol til at opnå den mesenkymale cellefraktion af lungen, der indeholder L-MSC'er. Selvom densitetsgradient interfase vil omfatte monocytter og makrofager foruden lunge mesenchymal-celler, plast vedhæftning efterfulgt af 3-5 dages dyrkning sikre at det kun lungen mesenkymale celler forbliver. Faktisk denne celle population udtrykker de klassiske MSC overflademarkører CD73, CD90 og CD146 og er negativ for markørerne CD34, CD45, større histokompatibilitetskompleks type II (MHCII) -RT1B, CD11b og CD79a, hvilket indikerer, at der ikke længere er nogen leukocytter til stede i cellepopulationen (figur 2A). Af interesse er, at ud af CD146 + delmængde, et udvalg af 44,4-65,7% er også CD73 + og CD90 + (data ikke vist). Desuden er denne cellepopulation er i stand til enkolonidannende enhed (CFU) effektivitet, som på ~ 30% er meget højere end generelt rapporteret for knoglemarvsceller MSC'er eller endda andre MSC typer (Figur 2B), og adskiller sig i de tre klassiske MSC slægter (figur 2C).

Figur 2
Figur 2. MSC karakteren efter enzymatisk fordøjelse, densitetsgradient separation og plast adhærens. (A) Ekspression af MSC-relaterede overflademarkører CD146, CD73 og CD90 er til stede i en del af plast adhærerende cellepopulation, hvorimod de negative leukocyt markører CD11, CD79a , CD34, CD45 og MHCII-RT1B var næsten ikke udtrykkes. (B) kolonidannende enhed assay gennem begrænsende fortynding assay (5 celler / cm2) indikerede, at ~ 30% af plast adhærerende celler havde en klonal kapacitet, indikerer MSC'er. (C) Plastic klæbende ceLLS var i stand osteogent matrixproduktion (rød), indeholdt en højere antal små lipidvesikler (rød), når induceret med adipogenisk differentiering medium sammenlignet med ikke-opdelte kontroller og dannede chondrogen lignende kugler indeholdende chondrocytter (rød). Dataene er angivet som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). Alle data blev genereret med passage 1-3 celler. NM = negative markører; CFU = kolonidannende enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den vigtigste undtagelse er imidlertid, at denne population sandsynligvis indeholder både L-MSC'er og forskellige undertyper af lungefibroblaster, L-MSC'er differentieret afkom 23. Da multipotency er positivt korreleret med CD146 udtryk, og fibroblaster bør ikke have nogen udtryk for denne markør, positiv selektion af CD146 + subpopulationen ostensibly resulteret i en celle population, der er stærkt beriget med L-MSC. Dette fremgår klart af en højere procentdel af cellepopulationen udtrykker MSC forbundet overflademarkører (figur 3A), en betydelig højere kolonidannende potentiale ~ 80% (figur 3B) og en stærkere differentiering reaktion i særligt den chondrogene afstamning (figur 3C) forhold til det samlede mesenchymale befolkning, som opnås inden CD146 markering. Det skal bemærkes, at disse L-MSC'er formular kun meget få ægte adipocytter, men viser mange flere spindel formede celler, der er fyldt med små lipidvesikler. Disse kunne afspejle lipofibroblast afstamning, der er afgørende for både lunge udvikling og alveolær type II celle support. Efter CD146 udvælgelse, kan mere adipocyt lignende celler fyldt med store lipidvesikler observeres (figur 3C) sammenlignet med før CD146 udvælgelse, men de fleste celler er stadig den lipofibroblasts-lignende ceLLS indeholder små lipidvesikler.

Figur 3
Figur 3. MSC karakteren efter yderligere CD146 + magnetiske perler markering. Efter positiv selektion af CD146 + subpopulationen, udviste disse celler en højere ekspression af MSC-relaterede overflademarkører, CD73 især (A), en betydelig højere CFU effektivitet efter enkelt celle plating (B), og en stærkere differentiering svar for især chondrogene afstamning og i mindre grad den adipogeniske linie (C). Dataene er angivet som middelværdi ± SEM. Alle data blev genereret med passage 3 celler. NM = negative markører; CFU = kolonidannende enheder. Klik her to se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den isolering og dyrkning af primære L-MSC'er giver mulighed for bedre at forstå deres funktion og samspil med andre cellepopulationer på celleniveau, og deres rolle i lunge udvikling, sundhed og sygdom. Dette er især vigtigt da manglen på en specifik enkelt markør for disse celler gør det næsten umuligt at studere disse celler in situ. Som med alle primære cellepopulationer, bør man huske på, at disse celler er mere tilbøjelige til at ændre deres karakter jo længere de holdes i kultur 19 (revideret i 24). For at holde L-MSC'er i en tilstand, der er så tæt som muligt på deres naturlige tilstand, er det meget vigtigt, at de er dyrket i 5% O2, 5% CO2, i en 37 ° C befugtet inkubator. I respirationsfysiologi er det generelt accepteret, at baseret på Daltons lov af partialtryk, det partielle oxygentryk af omgivende luft (21% O2) er 160 mmHg, og falder til ~ 101 mmHg i alveolære luftrum 25-27. I en moden lunge alveolær-arteriel PaO2 gradient er ~ 3-4 mmHg, men dette kan øges betydeligt i en syg eller umoden lunge, hvor alveolær-arteriel afstand øges 25,28. Inde i kroppen, er den mesenkymale niche normalt udsættes for en oxygenkoncentration på 2-8% 29,30. Kun få papirer har faktisk målt PO 2 i lungerne, men en undersøgelse målte det i lungerne hos 20 patienter, at finde en vifte i normal lunge PO 2 fra 23 til 656 mmHg, med en median på 42,8 mmHg 27,31. Ifølge Daltons lov, en fugtig inkubator med en temperatur på 37 ° C og 5% O2 har en PO 2 ~ 36 mmHg, der falder perfekt inden for intervallet målt i normalt lungevæv og er meget tæt på medianen. Derudover lav ilt dyrkningsbetingelser fremme opretholdelsen af progenitorpopulationer i kultur 29. Tilsammen det jeger svært at sige præcis, hvad oxygenkoncentrationen L-MSC'er eksponeres for in situ på forskellige stadier under normal postnatal udvikling eller sygdom, men det lader til, at 5-10% O 2 er sandsynligvis den mest nøjagtige ud fra et fysiologisk synspunkt 27,31. På baggrund af oplysningerne dommen, valgte vi at fastholde 5% O 2 i vores dyrkningsbetingelser, og vi fandt, at når disse forhold opretholdes in vitro, vil L-MSC vokse hurtigere, vise færre stress fibre og har en mindre sandsynlighed af spontan differentiering eller ældning. Yderligere faktorer, der vil forhindre spontan differentiering eller andre afvigelser er ved anvendelse af en forsigtig ikke-trypsin dissociation middel til passage, passage L-MSC'er når de når 80-90% konfluens (tætte betingelser vil fremme fibroblast differentiering), og holde passagen nummer lav (<P4). I en undersøgelse af Hoffmann og kolleger, blev trypsin vist sig at have negative virkninger på L-MSC funktion ogfænotype, mens trypsin-fri dissociation agenter kunne bevare denne 13.

For at optimere udbytte i isolation proces, er det vigtigt at hakke lungerne så fint som muligt, uden at glemme, at vævet ikke skal have lov til at tørre. Under den enzymatiske fordøjelse, er det vigtigt, at rørene omrystes hyppigere, hvis ikke anvendelse af en opvarmet rysteudstyr, som vævsstykkerne vil sedimentere og vil ikke få optimal eksponering for enzymerne. Et andet afgørende trin er densitetsgradient separation: hvis lagdelingen ikke sker meget langsomt eller i en vinkel <45 °, vil det føre til blandingen af ​​de to væsker i stedet for lagdeling, der forårsager tab af hele cellepopulationen. Endvidere er densiteten af ​​den densitetsgradient medium er meget afhængig af den omgivende temperatur. Enhver anden temperatur end 19 ° C (eller RT), vil resultere i suboptimal eller ingen densitetsgradient separation.

Af interesse for fOMMENDE brugere af denne protokol er, at vi med succes har isoleret levedygtige L-MSC'er fra lungerne, som blev høstet op til 24 timer før isolation, forudsat at lungerne er direkte opbevares i koldt L-MSC medier på høst, og holdes ved 4 ° C. Dette giver mulighed for en mere fleksibel eksperimentel planlægning, eller endda forsendelse af lungerne mellem forskellige laboratorier. Udbyttet er generelt svarer til den i frisk høstede lunger, og celler vokser lige godt.

En anden ændring, der ville være muligt, er at bruge FACS stedet for magnetiske perler udvælgelse, selv om denne fremgangsmåde udsætter cellerne til mere stress som proceduren tager mere tid og som celler udsættes for høje tryk og hastigheder, og indebærer risiko for kontaminering hvis det ikke gøres under sterile betingelser. De magnetiske perler, der anvendes her ikke forstyrrer cellevækst, og forsvinder inden for få dages dyrkning. En præference for FACS eller magnetisk perle sortering kan også afhænge af de faciliteter til rådighedtil slutbrugeren. Derudover vil det være muligt at ændre denne protokol til at isolere bosiddende MSC'er fra andre væv. I dette tilfælde ville det være vigtigt at skræddersy enzymerne på organet af interesse, som matrix sammensætning varierer mellem organer.

En vigtig begrænsning af kun ved hjælp af densitet gradient og efterfølgende plast adhærens til opnåelse mesenkymceller, er, at den resulterende population indeholder både L-MSC'er og fibroblaster. Selektere for CD146 + celler kraftigt midler dette forbehold men trods CD146 + procedure, samt de omhyggelige dyrkningsbetingelser, arten af L-MSC'er og virkningerne af in vitro-cellekultur gør det umuligt at undgå en vis grad af differentiering til fibroblaster. MSC'er i almindelighed er blevet beskrevet at indeholde et hierarki af multipotency, hvor celler længere nede i hierarkiet langsomt mister deres multilineage potentiale indtil de bliver terminalt differentierede fibroblaster <sup> 23. Efter al sandsynlighed dette sker også i L-MSC niche 4, og synes at være afspejlet i den dyrkede CD146 + befolkning allerede en passage efter CD146 + udvalg omkring 40% af cellerne har mistet CD146 udtryk. Derudover er der i denne population er der kun 80% CD73 og 40% CD90-ekspression. I del, kan dette forklares ved MSC hierarki af multipotency. Det vil være muligt, at CD146 + gennemgå asymmetrisk spredning, der giver anledning til både CD146 positive MSC og negative, mere differentierede, datterceller. kunne også med rimelighed forventes residente MSC'er i lungen til at have en noget anden fænotype og funktion fra knoglemarv MSC'er, hvor definitionen af ​​CD73 og CD90 ekspression blev baseret. Den internationale Society for Cell Therapy har erkendt, at ikke alle MSC'er udtrykker de klassiske MSC markører, herunder CD73 og CD90, og at overfladen markør udtryk er ikke den bedste måde at definere MSC 32. exceptionally høj CFU effektivitet ~ 70% af CD146 + L-MSC befolkning understøtter dette. Fordi CD146 + -populationen fungerer bedre med hensyn til MSC egenskaber end den usorterede mesenchymale befolkning har forfatterne ikke yderligere karakteriserede CD146 - befolkning. Vi bestræbt os på at berige vores mesenkymale befolkning med MSC og nedbryder dem af fibroblaster, men vi påstår ikke, at dette er den eneste sande L-MSC befolkning. L-MSC'er sandsynligvis meget uensartet, både i oprindelse, fænotype og funktion.

Selvom CD146 er bredt anerkendt for at være en markør for multipotency i MSC og pericytes 16,17,33,34, er meget lidt kendt om CD146 + MSC befolkning in vivo. CD146 er et celleadhæsionsmolekyle, der er vigtigt for angiogenese og endotelcellefunktion, og udtrykkes i endotelceller, glatte muskelceller, pericytter, MSC og T-lymfocytter 15,16,35,36. I de seneste år, Beviser frem, at MSC bebor perivaskulær niche i flere organer, som CD146 + celler co-pletten for MSC-markører CD73 og CD105 37. Faktisk dyrkede pericytter og MSC har en meget lignende genekspression profil 38, styrkelse af den opfattelse, at MSC er afledt af pericytter 4,39. Selvom vi ikke har udført immunhistokemiske analyser til at bestemme placeringen af vores CD146 + L-MSC befolkning, er det meget sandsynligt, at de også ville blive placeret i en perivaskulær placering. Fremtidige studier vil være nødvendige for at kontrollere, om dette virkelig er tilfældet. Det er muligt, at en delmængde af vores cellepopulation er pericyter, selv om det skal bemærkes, at alle celler ser fænotypisk meget ens efter CD146 + selektion.

Mesenkymale stromaceller er notorisk svære at identificere på grund af manglen på en enkelt altomfattende markør. Forskellige undersøgelser har rapporteret forskellige metoder til isoleringaf L-MSC'er, og har overbevisende vist, at disse cellepopulationer ligner hinanden med hensyn til MSC markør ekspression. Baseret på karakterisering af CD146 + L-MSC som præsenteres her, den CD146 + L-MSC befolkning er meget lig tidligere rapporterede L-MSC populationer som opnås ved udvækst eller forskellige former for FACS under anvendelse stamcelle tilknyttede overflademarkører såsom Sca -1, ABCG2 og CD90. Ved sammenligning med udvækst L-MSC'er 13, CD146 + L-MSC'er synes at have en større evne til at give anledning til kolonier fra enkelte celler, hvilket indikerer, at vores metode giver en mere beriget multipotente L-MSC befolkning. Denne fordel gælder også i forhold til metoder, som isolerer L-MSC'er baseret på CD90 7 eller blodpladeafledte vækstfaktorreceptor α (PDGFRα) 40,41, som begge overflademarkører også selektere for mere terminalt differentierede lipofibroblasts og alveolære / strukturelle fibroblaster og kan derfor kun rimeligt be identificeret som stromaceller 20,42. I modsætning hertil er både Sca-1 og ABCG2 veldokumenteret markører, der korrelerer med stemness og MSC-ekspression 9,43-46. ABCG2 + L-MSC'er dog have en mere endotel natur som de er 99% positive for CD31 46, hvorimod den metode rapporteres her vælger imod endotelceller gennem Ficoll gradient og plast vedhæftning. Den største fordel ved vores metode sammenlignet med Sca-1 baseret isolation protokollen ifølge McQualter og kolleger 5,8 er, at det er bredt anvendelig til andre end mus arter, hvori Sca-1, ikke kan anvendes.

Selv om det er meget udfordrende, sandsynligvis næsten umuligt, at opnå en "ren" population af L-MSC'er fra en sen udviklingsland eller voksen lunge og vedligeholde det i en udifferentieret tilstand, den protokol præsenteres her giver en hurtig, konsekvent og pålidelig metode til opnåelse af en cellepopulation er stærkt beriget med multipotente selvfornyende lung resident MSC. Under anvendelse af denne metode vil muliggøre en mere defineret undersøgelse af den rolle L-MSC'er i en lang række forskellige sygdomsmodeller og deres rolle i udviklingen af ​​lungen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

Stem Cell Biology Mesenchymale stromaceller væv resident stamceller / progenitorceller lunge rotte regenerativ medicin magnetisk perle udvælgelse
Isolering af CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung Mesenchymale stromacellers fra Rotte Lunger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter