Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolatie van CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 + magnetische bead selectie.

Abstract

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC's voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC's. Bovendien hebben ze waarschijnlijk een rol bij normale orgaanontwikkeling en zijn toegewezen rol in ziekte, met name die met een fibrotische aard. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen. De isolatie techniek die hier beschreven geldt meerdere kenmerken van de long resident MSC's (L-MSC). Bij het offer van de ratten, zijn longen verwijderd en gespoeld meerdere keren om bloed te verwijderen. Naar aanleiding van mechanische dissociatie door scalpel, worden de longen verteerd gedurende 2-3 uur met behulp van een mix van het type collagenase I, neutraal protease en het type DNase I. De obtained enkele celsuspensie wordt vervolgens gewassen en gelaagd over dichtheidsgradiënt medium (dichtheid 1,073 g / ml). Na centrifugatie worden cellen uit de interfase gewassen en uitgeplaat in kweek behandelde flessen. Cellen worden gekweekt gedurende 4-7 dagen in fysiologische 5% O2, 5% CO 2 condities. Om fibroblasten (CD146 -) afbreken en een bevolking van slechts L-MSC's (CD146 +), positieve selectie voor CD146 + cellen te waarborgen wordt uitgevoerd door middel van magnetische bead selectie. Samengevat, deze procedure levert betrouwbare een populatie van primaire L-MSC's voor verdere in vitro onderzoek en manipulatie. Vanwege de aard van het protocol, kan het gemakkelijk worden vertaald naar andere experimentele diermodellen.

Introduction

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC's voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC's. Tijdens de ontwikkeling, waaronder de longen, het mesenchym is een belangrijke bron van ontwikkelings signalen en resident MSCs een waarschijnlijke kandidaat te zijn in het midden van dit. Bovendien is het bewijs in opkomst die inwoner MSC's worden verstoord bij volwassen ziekten, waaronder kanker 1,2 en fibrose 3. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen 4. Stamcel antigeen-1 (Sca-1) werd geïdentificeerd bij muizen als een marker voor een verscheidenheid van weefsels stamcellen, en kan worden gebruikt voor de isolatie van L-MSC 5, maar heeft helaasgeen bekende orthologen uit andere soorten 6. Onderzoekers hebben een verschillende isolatiemethoden voor de isolatie van L-MSC's van ofwel longweefsel of vloeibare gerapporteerd. Deze variëren van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebaseerde methodes selecteren op CD31 - / CD45 - / CD90 + cellen 7, CD31 - / CD45 - / epitheliale cel adhesiemolecuul (EpCAM) - / Sca-1 + -cellen 8, multidrug resistentie transporter ATP bindende cassette G (ABCG2) positieve cellen 9 of Hoechst 33342 kleurstof efflux 10, kunststof hechting 11,12 en migratie uit gehakt weefsel 13.

De voordelen van de hierin voorgestelde werkwijze zijn meervoudig. Door middel van een zachte enzymatische digestie en dichtheidsgradiënt 14, verkrijgt men alle cellen van het dichtheidbereik dat MSC's omvatten maar exclusief epitheel- en endotheelcellen. De daaropvolgende plastic hechting maatregel wordt bereikt dat alleen de mesenchymal cellen hechten en verblijf in de cultuur, waardoor leukocyten. Belangrijker echter, de CD146 + selectiestap maakt de eliminatie van fibroblasten, aangezien deze cellen niet CD146 tot expressie. Expressie van de celadhesie molecuul CD146 is positief gecorreleerd met multipotentie, en is daarom een goede marker om onkruid uit fibroblasten van een mesenchymale celpopulatie 15-19. Dit is een voordeel boven het gebruik van CD90 als een selectiemerker, omdat het niet alleen uitgedrukt in MSC's maar ook in lipofibroblasts 5,20. In dit protocol hebben we nadrukkelijk gekozen voor een magnetisch bolletje selectie, omdat het zachter op de cellen, en de gehele procedure kan worden uitgevoerd in steriele omstandigheden. Een ander belangrijk voordeel van deze isolatiemethode in plaats van de uitgroei methode is dat het relatief snel, 6-10 dagen in tegenstelling tot een maand of meer voor de uitgroei methode. Drie tot vijf dagen na de oorspronkelijke isolatie de mesenchymale populatie is gereed voor CD146 + sele ction; Na nog drie tot vijf dagen de CD146 + cellen direct worden gebruikt voor experimenten of kan worden ingevroren voor later gebruik. De verminderde tijd cultuur verbetert de kwaliteit van de cellen als MSCs transdifferentiëren richting fibroblasten verlengde ex vivo kweken 19. Tenslotte vanwege de aard van het protocol, is het mogelijk om deze methode toe te passen op andere soorten door simpelweg geschikte antilichamen te kiezen of zelfs andere orgaansystemen door aanpassing van de keuze van verteringsenzymen en incubatietijd.

Een gedetailleerd protocol van deze isolatiewerkwijze wordt hieronder gegeven, en een schematisch overzicht van de isolatie en daaropvolgende selectie van de CD146 + subpopulatie wordt respectievelijk gegeven in Figuur 1A en 1B. Bovendien worden gegevens welke voor passage, invriezen en ontdooien van deze cellen.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematisch overzicht van de isolatie van pulmonale mesenchymale cellen (A) en daaropvolgende CD146 + celselectie (B) min = minuten.; EDTA = Ethyleendeniaminetetraacetaat; 2 e Ab = secundair antilichaam; a-CD146 Ab = primaire anti-CD146 antilichaam; ve cellen = CD146 negatieve cellen; + ve cellen = CD146 positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa (dierethiek protocol OHRI-1696). Dierenzorg werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen.

1. Isolatie van Lung mesenchymale stromacellen

  1. Bereid het enzym mix in een 50 ml tube: wegen 30 U neutraal protease, 2500 AL Collagenase I en 500 U DNAse I. Deze bedragen volstaan ​​voor de longen van een volwassen muis of rat pup. Bereid op dag van isolatie en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  2. Offer ratten op dag 13 door een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (0,2 ml, 65 mg / ml). Gebruik de teen knijpen reflex tot bewusteloosheid vast te stellen. Dood van het dier wordt verzekerd door het openen van de borstkas, zoals hieronder beschreven.
  3. Ontsmetten van de huid van het dier sproeien met 70% ethanol en open voorzichtig de ribbenkast gebruik chirurgische schaar, vanaf het membraan en snijden naar de rostrale zijde, zeer voorzichtigde longen beschadigen. Spreid de ribbenkast geopend met behulp van hemostatische klemmen, of als alternatief weggesneden de borstkas om de toegang tot de thorax te bieden.
  4. Exsanguinate het dier door het verwijderen van het hart. Om het hart te verwijderen, pakt u de thymus en hart met kleine tang en snijd deze weg met chirurgische schaar. Onmiddellijk daarna, absorberen het bloed met een gaasje tot er geen bloed meer komt uit de afgehakte aorta en longslagader.
  5. Verwijder de longen uit de thorax als volgt: houd de luchtpijp met kleine tang, dan scheiden de luchtpijp met chirurgische schaar op de rostrale kant. Terwijl voorzichtig uit de thorax trekken van de longen pakket wegsnijden elke bindweefsel aan de rugzijde langs de ribbenkast naar de longen te bevrijden.
  6. Scheiden de longen van de aorta en de slokdarm door snijden langs het membraan met chirurgische schaar. Nu de longen zijn volledig vrij van de thorax te verwijderen alle resterende bloed voorzichtig met een gaasje.
  7. Verwijder de luchtpijp en de bronchiën met surgische schaar en zorgvuldig de longkwabben overgebracht in een 50 ml buis met koude 35 ml 30% citraat-fosfaat-dextrose Adenine (CPDA-1) anticoagulant (26,30 g trinatriumcitraat dihydraat, 3,27 g ascorbinezuur monohydraat, 2,22 g mononatriumdiwaterstoffosfaat, 31,80 g D-glucose, 0,275 g adenine in 1 L gezuiverd H 2 O, steriele filter de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed en vuil te verwijderen.
  8. Na 5 min spoelen bij 30% CPDA-1 / PBS, breng de long een nieuwe 50 ml buis met 35 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (RT), keren zachtjes citraat verwijderen. Transfer naar een buis met 35 ml Dulbecco's PBS + Natrium-pyruvaat + Glucose (DPBS ++) (RT). Elke spoelen stap moet ongeveer 5 minuten duren.
    Opmerking: DPBS ++ kan commercieel worden besteld of als volgt opgebouwd 21: calciumchloridedihydraat 132,4 mg, magnesiumchloridehexahydraat 100 mg, kaliumchloride (watervrij) 200 mg monobasisch kaliumfosfaat (watervrij) 200 mg, natriumchloride (watervrij) 8000 mg, dibasisch natriumfosfaat (watervrij) 1,144.5 mg, D-glucose 1000 mg, 36 mg natriumpyruvaat in 1 L gezuiverd H2O, pH 7,3. Filtreer steriel de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik.
  9. Los het enzymmengsel door toevoeging van 10 ml DPBS ++ (voorverwarmd tot 37 ° C) en inverterende voorzichtig tot opgelost.
  10. Breng de longen in nieuw 50 ml buis en hak de long aan de wand van de buis met behulp van een scalpel tot fijn gehakt. Voeg het enzym mix aan het weefsel (10 ml enzym mix / per volwassene muis / rat pup long), sluit de buis stevig en incubeer bij 38 ° C onder zacht schudden (hetzij in een thermische mixer, een schuddend waterbad, of een water bad met regelmatig handmatig agitatie). De tijdsduur hangt af van het type weefsel: foetaal weefsel 60 min, juveniele / volwassen weefsel 90-120 min, fibrotische volwassen weefsel 120-150 min.
  11. Stop de spijsvertering door het chelerende het bivalente kationen wi 200 pl ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Filtreer steriel de oplossing onder toepassing van een 0,22 urn membraanfilter voor gebruik).
  12. Voeg 20 ml 5% foetaal runderserum (FBS) / PBS en laat de gehele suspensie door 100 urn cel zeef in een nieuwe 50 ml buis. Spoel de buis cel zeef met 10 ml 5% FBS / PBS, waardoor het totale volume op 40 ml.
  13. Centrifugeer 5 min bij 500 xg, RT.
  14. Verwijder de bovenstaande vloeistof (pellet moet duidelijk zichtbaar zijn), resuspendeer in 40 ml 5% FBS / PBS en herhaal centrifugeren stap 1.13.
  15. Resuspendeer in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) en laag voorzichtig over 3 ml dichtheidsgradiënt media (1,073 g / cm 3) in een 15 ml buis 14. Om een ​​goede interfase verkrijgen, is het cruciaal dat de laagvolgorde van de enkele celsuspensie optreedt bij a> 45 ° hoek zeer lage snelheid.
  16. Centrifugeer 20 minuten bij 900 xg, medium (5/10) versnelling, zonder vertraging, 19 ° C.
  17. Verzamel de cellen in de interphase en resuspendeer ze in 10 ml steriel PBS.
  18. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg, 21 ° C.
  19. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml voorverwarmde aangevuld L-MSC kweekmedium (minimaal essentieel medium Eagle, alfa modificatie (aMEM), aangevuld met 2 mmol L-glutamine per 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS en 1% vol / vol penicilline / streptomycine / Amfotericine B.
  20. Herhaal het centrifugeren stap 1.18. Vervolgens, verwijder supernatant en resuspendeer in 10 ml voorverwarmde vers kweekmedium.
  21. Aantal cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller en plaat met een hoge dichtheid, aangezien de meeste cellen in dit stadium niet hechtende kunststof. De exacte uitplaatdichtheid afhankelijk van de diersoort en de leeftijd, bijvoorbeeld, zijn de cellen van een volwassen muislong gezaaid met 10 5 cellen / cm2, terwijl cellen van een rattenpup long voldoende dicht bij een zaaidichtheid van 1-2 x 10 4 cellen / cm 2 cm2.
  22. Cultuur L-MSC's in een bevochtigde 5% O2, 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C.
  23. Veranderen medium 24 uur na de eerste enting, en vervolgens om de 3 dagen na eenmaal spoelen met PBS. De cellen moeten gekweekt tot 80-90% confluentie, die 3-5 dagen duurt gemiddeld afhankelijk van het dier van herkomst. Hogere samenloop zal differentiatie te bevorderen in fibroblasten.

2. Selectie van CD146 + Lung mesenchymale stromale cellen

  1. Coating van Magnetic Beads met secundair antilichaam
    1. Laag de magnetische kralen met gebiotinyleerd secundair antilichaam, in een verhouding van 10 ug secundair antilichaam / 100 gl magnetische beads in een ronde bodem steriel 2 ml cryovial onder steriele omstandigheden. Gebruik 10 ul secundair antilichaam per verwachte 0,5 x 10 6 cellen en gebruik minste 100 gl magnetische korrels en 10 ug antilichaam.
      Opmerking: De verhouding van eentibodies gebruikt per volume van kralen kunnen verschillen tussen de fabrikanten, volg dan de instructies van de fabrikant voor de kralen van uw keuze. Voor dit protocol, zie tabel 1 voor de kralen en antilichamen die werden gebruikt in de optimalisatie van dit protocol.
    2. Incubeer in een roterende steekproef mixer gedurende 30 minuten bij 30 omwentelingen / min (rpm), bij kamertemperatuur.
    3. Resuspendeer de kralen in 1,5 ml steriele 0,1% runderserumalbumine (BSA) / PBS en transfer naar een 3 ml ronde bodem buis (flow cytometrie buis). Spoel de cryovial met een extra 1,5 ml 0,1% BSA / PBS en plaats het 3 ml buisje.
    4. De buis wordt op geschikte magneet en wacht 2 min totdat alle korrels zijn bevestigd aan de achterwand van de buis en de oplossing blijft helder. Verwijder afvoer en herhaal wassen met 3 ml 0,1% BSA / PBS twee keer.
    5. Resuspendeer de kralen in 3 ml 0,1% BSA / PBS en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Gebruik binnen 5 dagen.
  2. Etikettering CD146 + L-MSC's
    1. Oogst de mesenchymale cellen na spoelen met PBS met behulp van een zachte niet-trypsine oplossing.
      Opmerking: Volumes afhankelijk van de grootte van kweekfles (0,2 ml / cm 2 medium of PBS).
      1. Verwijder kweekmedium en spoel de cellen drie keer met steriele PBS.
      2. Voeg de juiste hoeveelheid zachte niet-trypsine oplossing (zie tabel 1). Incubeer bij 37 ° C in de incubator totdat de cellen losgemaakt, ongeveer 10 minuten bij gebruik van de oplossing in tabel 1.
      3. Inactiveren enzym door toevoeging van L-MSC kweekmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g.
    2. Verwijder supernatant, resuspendeer cellen in 0,1% BSA / PBS en tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan.
      Opmerking: Het volume van 0,1% BSA / PBS afhankelijk van de grootte van kweekfles: streven naar 5 of 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Herhaal stap 2.2.2 en resuspendeer de specifieke hoeveelheid cellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (blokken unspecifieke binding sites en houdt de cellen in leven). Houd cellen op ijs.
    4. Bereid een 3 ml ronde bodem buis met de primaire anti-CD146 antilichaam, en blijf op ijs.
      Opmerking: De concentratie van primair antilichaam dat wordt toegevoegd aan de specifieke hoeveelheid cellen afhankelijk van het antilichaam dat wordt gebruikt. Voor een adviesprijs anti-rat CD146 antilichaam zie tabel 1.
    5. Voeg het totale volume van de cellen uit stap 2.2.3 aan de buis met het primaire antilichaam. Sluit en incubeer 30 min op een roterende steekproef mixer bij 15 rpm, 4 ° C.
    6. Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 500 xg, 4 ° C, verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. Herhaal stap centrifuge.
    7. Resuspendeer de cellen in 3 ml oplossing die secundair antilichaam beklede kralen die werd bereid volgens de instructies in paragraaf 2.1 en incubeer 30 min op een roterende steekproef mixer bij 15 rpm, 4 ° C.
  3. Het selecteren van CD146 + L-MSC's
    1. Plaats de buis met het label CD146 + L-MSCs op de magneet. De positieve cellen wordt gevestigd op de achterkant van de buis. Zonder het verplaatsen van de buis of het aanraken van de kralen, de oogst van de bovenstaande vloeistof met de negatieve cellen langzaam met een steriele Pasteur pipet (deze kunnen ofwel worden afgehaald of weggegooid op basis van de experimenteel design).
    2. Haal de buis uit de magneet en resuspendeer de cellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Herhaal de selectieprocedure in stap 2.3.1 beschreven. vier keer (Σ 5 selectie stappen).
    3. Resuspendeer de CD146 + L-MSC in voorverwarmde L-MSC kweekmedium en terug naar de magneet.
    4. Verwijder supernatant, resuspendeer in L-kweekmedium en MSC plaat in een geschikt formaat kolf (0,2 ml / cm 2). Als vuistregel plaat cellen in dezelfde grootte kolf waaruit de cellen werden vóór bead-selectie opgeheven. Het aantal CD146 + L-MSC's, en derhalve de plaatdichtheid, zalafhankelijk van de leeftijd, soort en stam van de dierlijke bron. Streven altijd naar een plating dichtheid van ~ 5000 cellen / cm2.
      Opmerking: De kralen zal niet verstoren de celgroei en zal geleidelijk verdwijnen als de cellen vermenigvuldigen.

3. vriescellen

  1. Gebruik de volgende vriesmedium: 60% pentazetmeel-oplossing (10% pentazetmeel in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimethylsulfoxide (DMSO) 22.
    Opmerking: Indien niet alle ingrediënten zijn, een oplossing die 5% DMSO, 30% FBS en 65% aMEM is een goed alternatief.
  2. Resuspendeer cellen bij 0,5 x 10 6 cellen / ml, in cryovials hoeveelheid van 1 ml elk en vries O / N bij -80 ° C met een bevriezing container.
  3. Verwijzing naar een vloeibare stikstof opslagtank de volgende dag.

4. Ontdooien Cellen

  1. Dooi een flacon van cellen in een 37 ° C waterbad gedurende 5 min.
  2. Resuspendeer cellen in 10 mlvoorverwarmd kweekmedium en centrifugeer 5 min bij 500 xg, 21 ° C.
  3. Verwijder supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml kweekmedium. Zaadcellen in een ontluchtingsdop celkweek behandeld kolven bij 5000 cellen / cm2 in 0,2 ml / cm2 media (bijvoorbeeld 15 ml voor een 75 cm2 kolf).
  4. Kweekcellen in 5% O2, 5% CO2 totdat 80-90% confluent voor het oogsten en / of experimenteel gebruik. Over-confluentie zal differentiatie induceren. Wanneer zaaien bij 5.000 cellen / cm 2, zal L-MSC's 80-90% confluentie bereiken binnen 3-4 dagen van de cultuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Twee van de meest betrouwbare fysische eigenschappen van MSCs, dichtheid en kunststof hechting, worden in het eerste deel van dit protocol om de mesenchymale celfractie van de long die L-MSC's bevat te verkrijgen. Hoewel de dichtheidsgradiënt interfase omvat monocyten en macrofagen naast long mesenchymale cellen, de plastic hechting gevolgd door 3-5 dagen kweken zorgt ervoor dat alleen de long mesenchymale cellen blijven. Inderdaad deze celpopulatie drukt de klassieke MSC oppervlak markers CD73, CD90 en CD146 en is negatief voor de markers CD34, CD45, major histocompatibility complex type II (MHCII) -RT1B, CD11b en CD79a, wat aangeeft dat er niet meer leukocyten aanwezig de celpopulatie (figuur 2A). Van belang is dat van de CD146 + deelverzameling, een bereik van 44,4-65,7% is ook CD73 + en CD90 + (gegevens niet getoond). Bovendien is deze celpopulatie waarmee eenkiemgetal (CFU) efficiëntie die bij ~ 30% is veel hoger dan algemeen gerapporteerd beenmerg MSCs of andere MSC (figuur 2B), en onderscheidt langs de drie klassieke MSC lijnen (figuur 2C).

figuur 2
Figuur 2. MSC eigenschappen na enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding en plastic hechting. (A) Expressie van MSC-gerelateerde oppervlakmerkers CD146, CD73 en CD90 is aanwezig in een gedeelte van de plastic hechtende celpopulatie, terwijl de negatieve leukocyten markers CD11b, CD79a , CD34, CD45 en MHCII-RT1B werden vrijwel niet tot expressie. (B) kiemgetal assay door middel van beperkende verdunning assay (5 cellen / cm 2) gaf aan dat ~ 30% plastic hechtende cellen hadden een klonale capaciteit, indicatief voor MSCs. (C) Plastic adherent cells konden osteogeen matrixproductie (rood), bevat een groter aantal kleine lipide vesikels (rood) wanneer geïnduceerd met adipogene differentiatiemedium vergelijking met niet-gedifferentieerde controles en vormden chondrogene dergelijke spheres met chondrocyten (rood). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Alle gegevens werden gegenereerd met passage 1-3 cellen. NM = negatieve markers; CFU = kolonievormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Echter, het belangrijkste nadeel is dat deze populatie waarschijnlijk bevat zowel L-MSC's en de subtypen longfibroblasten, de L-MSCs gedifferentieerde nageslacht 23. Aangezien multipotent positief gecorreleerd is met CD146 expressie en fibroblasten mag geen expressie van deze marker, positieve selectie van de CD146 + subpopulatie o hebbenstensibly resulteerde in een celpopulatie die sterk verrijkt is met L-MSC's. Dit wordt duidelijk uit een hoger percentage van de celpopulatie tot expressie MSC geassocieerd oppervlaktemerkers (figuur 3A), een aanzienlijk hogere kolonievormende vermogen van ~ 80% (figuur 3B) en een sterkere differentiatie reactie in het bijzonder de chondrogene lijn (figuur 3C) vergeleken met de totale populatie mesenchymale dat wordt bereikt vóór CD146 selectie. Opmerkelijk is dat deze L-MSCs vorm slechts zeer weinig ware adipocyten, maar vertonen veel meer spoelvormige cellen die zijn gevuld met kleine lipide blaasjes. Deze kunnen weerspiegelen de lipofibroblast lineage die cruciaal is voor zowel de ontwikkeling van de longen en de alveolaire type II cellen ondersteuning. Na CD146 selectie, kan meer vetcellen achtige cellen gevuld met grote lipide blaasjes worden waargenomen (Figuur 3C) in vergelijking met vroeger CD146 selectie, maar de meerderheid van de cellen zijn nog steeds de lipofibroblasts-achtige ceLLS met kleine lipide blaasjes.

figuur 3
Figuur 3. MSC karakteristieken na aanvullende CD146 + magnetische bead selectie. Na positieve selectie van de CD146 + subpopulatie deze cellen vertoonden een hogere expressie van MSC-gerelateerde oppervlak markers, CD73 name (A), een aanzienlijk hoger rendement CFU na enkele cel plating (B), en een sterkere respons voor differentiatie bijzonder de chondrogene lijn en in mindere mate de adipogene lijn (C). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Alle gegevens werden gegenereerd met passage 3 cellen. NM = negatieve markers; CFU = kolonievormende eenheden. Klik hier to bekijk een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De isolatie en de cultuur van primaire L-MSC's biedt een kans om hun functie en hun interactie met andere celpopulaties op cellulair niveau, en hun rol in de ontwikkeling van de longen, gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Dit is vooral belangrijk omdat het ontbreken van één specifieke marker van deze cellen maakt het bijna onmogelijk om deze cellen te bestuderen in situ. Zoals bij alle primaire cel populaties, moet men in gedachten houden dat deze cellen meer kans om hun karakter te veranderen hoe langer ze in de cultuur 19 (besproken in 24) gehouden. L-MSC's in een staat die zo dicht mogelijk bij hun natuurlijke toestand te houden, is het van groot belang dat ze worden gekweekt in 5% O2, 5% CO2 in een 37 ° C bevochtigde incubator. In ademhalingsfysiologie wordt algemeen aangenomen dat op basis van de wet van Dalton partiële drukken van de partiële zuurstofdruk van de lucht (21% O2) is 160 mmHg, en daalt tot 10 ~1 mmHg in de alveolaire luchtruimte 25-27. In een volwassen long de alveolaire-arteriële gradiënt PaO 2 ~ 3-4 mmHg, maar kan aanzienlijk in een zieke of onrijpe longen waar de alveolaire-arteriële afstand bedraagt ​​25,28 verhoogd. In het lichaam, wordt de mesenchymale niche normaliter blootgesteld aan een zuurstofconcentratie van 2-8% 29,30. Slechts enkele documenten daadwerkelijk gemeten PO 2 in de longen, maar een studie gemeten dit in de longen van 20 patiënten, vinden een bereik in normaal longweefsel PO 2 23-656 mmHg, met een gemiddelde van 42,8 mmHg 27,31. Volgens de wet van Dalton, een bevochtigde incubator met een temperatuur van 37 ° C en 5% O2 heeft pO 2 van ~ 36 mmHg, die perfect valt binnen het bereik gemeten normaal longweefsel en is zeer dicht bij de mediaan. Bovendien, lage zuurstofconcentraties kweekomstandigheden het bevorderen van de handhaving van de voorlopercellen populaties in cultuur 29. Bij elkaar genomen, is het imoeilijk te zeggen wat zuurstofconcentratie L-MSCs blootgesteld aan in situ in verschillende stadia tijdens de normale postnatale ontwikkeling of ziekte, maar het blijkt dat 5-10% O 2 is waarschijnlijk de meest nauwkeurige vanuit fysiologisch oogpunt 27,31. Op basis van de bovengenoemde informatie, kozen we 5% O 2 handhaven onze kweekomstandigheden, en we vonden dat wanneer deze omstandigheden in vitro worden gehandhaafd, zal de L-MSCs sneller groeien, geven minder stressvezels, en hebben een kleinere kans spontane differentiatie of senescentie. Bijkomende factoren die spontane differentiatie of andere afwijkingen zullen voorkomen is door het gebruik van een zachte niet-trypsine dissociatie middel voor passage, passage L-MSC's als ze 80-90% confluentie (dichte voorwaarden fibroblast differentiatie bevorderen) bereikt, en het houden van het lage passagenummer (<P4). In een studie van Hoffmann en collega's, werd trypsine aangetoond dat negatieve effecten op de L-MSC functie enfenotype, terwijl trypsine-vrije dissociatie agenten zou dit 13 te behouden.

De opbrengst in de isolatie te optimaliseren, is het belangrijk om de longen zo fijn mogelijk gehakt, terwijl het feit dat het weefsel niet mag laten drogen. Tijdens de enzymatische vertering, is het belangrijk dat de buizen worden geschud vaak wanneer geen verwarmd schudapparaat, zoals het weefsel stukken bezinken en optimale blootstelling aan de enzymen niet. Een andere cruciale stap is de dichtheidsgradiënt scheiding: wanneer de lagen niet langzaam of onder een hoek <45 ° is gedaan, zal leiden tot het mengen van de twee vloeistoffen in plaats van lagen, het verlies van de gehele celpopulatie. Bovendien is de dichtheid van de dichtheidsgradiënt medium is zeer afhankelijk van de omgevingstemperatuur. Andere temperatuur dan 19 ° C (of RT), leidt tot suboptimale of geen dichtheidsgradiënt scheiding.

Van belang voor fOEKOMSTIGE gebruikers van dit protocol is dat we succesvol zijn geïsoleerde levensvatbare L-MSC's van longen opgevoerd werden geoogst 24 uur voor isolatie, op voorwaarde dat de longen direct opgeslagen in koude L-MSC media bij oogst, en bewaard bij 4 ° C. Dit maakt meer flexibele experimentele planning, of zelfs de verzending van de longen tussen verschillende labs. De opbrengst is over het algemeen vergelijkbaar met die van vers geoogste longen en cellen groeien even goed.

Een andere modificatie die mogelijk is, is FACS in plaats van magnetische bead selectie, hoewel deze werkwijze onderwerpt de cellen meer stress procedure kost meer tijd en als cellen worden blootgesteld aan hoge drukken en snelheden, en herbergt het risico van besmetting indien niet uitgevoerd onder steriele omstandigheden. De magnetische korrels hier gebruikt niet interfereren met celgroei en verdwijnen binnen een paar dagen van kweken. Voorkeur voor FACS of magnetische parel-sortering kan ook afhangen van de beschikbare faciliteitenaan de eindgebruiker. Bovendien zou het mogelijk zijn om dit protocol aan ingezeten MSC's te isoleren van andere weefsels te wijzigen. In dit geval zou het belangrijk zijn om de enzymen aan te passen aan het betreffende orgaan, als matrix samenstelling varieert tussen organen.

Een belangrijke beperking van alleen met de dichtheidsgradiënt en daaropvolgende plastic hechting te verkrijgen van mesenchymale cellen, is dat de resulterende populatie bevat zowel L-MSC's en fibroblasten. Het selecteren op CD146 + cellen sterk remedies dit voorbehoud, maar ondanks de CD146 + selectieprocedure en de zorgvuldige kweekcondities, de aard van L-MSC's en de effecten van in vitro celkweek mogelijk is en een zekere mate van differentiatie in fibroblasten voorkomen. MSCs algemeen gemeld een hiërarchie van multipotent, waarbij cellen verder naar beneden hiërarchie langzaam hun multilineage potentiële verliezen tot ze terminaal gedifferentieerde fibroblasten bevatten <sup> 23. Naar alle waarschijnlijkheid dit gebeurt ook in de L-MSC niche 4 en schijnt tot uiting in de gekweekte CD146 + populatie reeds één passage na CD146 + selectie ongeveer 40% van de cellen CD146 expressie verloren. Bovendien moet in deze populatie is er slechts 80% en 40% CD73 CD90 expressie. Voor een deel kan dit worden verklaard door de MSC hiërarchie van multipotent. Het is mogelijk dat CD146 + ondergaan asymmetrische proliferatie, die leidt tot zowel CD146 positieve en negatieve MSCs, meer gedifferentieerde dochtercellen. Resident MSCs van de long kan redelijkerwijs worden verwacht dat een enigszins ander fenotype en functie van beenmerg MSCs, waarop de definitie van CD73 en CD90 expressie werd gestald. De International Society for Cell Therapy heeft erkend dat niet alle MSC's drukken de klassieke MSC markers, met inbegrip van CD73 en CD90, en dat oppervlak marker meningsuiting is niet de beste manier om MSC 32 definiëren. de exceptionally hoge CFU rendement van ~ 70% van de CD146 + L-MSC bevolking steunt dit. Omdat de CD146 + bevolking beter met betrekking tot MSC kenmerken dan de ongesorteerde mesenchymale bevolking voert, hebben de auteurs niet verder gekenmerkt de CD146 - bevolking. Wij streven ernaar om onze mesenchymale bevolking te verrijken met MSC's en afbrekende hen van fibroblasten, maar we beweren niet dat dit de enige echte L-MSC bevolking. L-MSCs waarschijnlijk zeer heterogeen, zowel oorsprong, fenotype en functie.

Hoewel CD146 op grote schaal wordt erkend als een marker van multipotentie in MSC en pericytes 16,17,33,34 zijn, is zeer weinig bekend over de CD146 + MSC populatie in vivo. CD146 is een celadhesie molecuul dat belangrijk is voor angiogenese en endotheliale celfunctie, en wordt uitgedrukt in endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, MSCs en T-lymfocyten 15,16,35,36. In de afgelopen jaren, Bewijs is gebleken dat MSC's bewonen de perivasculaire niche in meerdere organen, zoals CD146 + cellen co-vlek voor MSC-markers CD73 en CD105 37. Inderdaad, beschaafd pericytes en MSC's hebben een zeer vergelijkbare genexpressieprofiel 38, de versterking van de opvatting dat MSC's zijn afgeleid van pericyten 4,39. Hoewel we hebben uitgevoerd immunohistochemische analyse om de locatie van onze CD146 + L-MSC populatie te bepalen, is het zeer waarschijnlijk dat zij ook zouden worden in een perivasculaire locatie. Toekomstig onderzoek zal nodig zijn om te controleren of dit inderdaad het geval is. Het is mogelijk dat een deel van onze mobiele bevolking pericytes, al moet worden opgemerkt dat alle cellen kijken fenotypisch zeer gelijkaardig na CD146 + selectie.

Mesenchymale stromale cellen zijn notoir moeilijk te identificeren door het ontbreken van een allesomvattende marker. Diverse studies hebben verschillende methoden voor de isolatie gerapporteerdeL-MSC's, en hebben overtuigend aangetoond dat deze celpopulaties zijn vergelijkbaar met elkaar met betrekking tot MSC markerexpressie. Op basis van de karakterisering van de CD146 + L-MSC hier gepresenteerde, de CD146 + L-MSC populatie is vergelijkbaar met eerder gerapporteerde L-MSC populaties wordt bereikt door uitgroei of diverse vormen van FACS met behulp stamcellen geassocieerd oppervlaktemarkers zoals Sca -1, ABCG2 en CD90. Vergeleken met uitgroei L-MSC 13, CD146 + L-MSC's blijken een groter vermogen om tot kolonies van enkele cellen te zijn, wat aangeeft dat onze methode levert een verrijkt multipotente L-MSC populatie. Dit voordeel geldt ook in vergelijking met methoden die isoleren L-MSC basis van CD90 7 of van bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor α (PDGFRα) 40,41, zoals oppervlakte- merkers ook kiezen voor meer terminaal gedifferentieerd lipofibroblasts en alveolaire / structurele fibroblasten en kan dus alleen redelijk be geïdentificeerd als bindweefselcellen 20,42. Daarentegen worden zowel Sca-1 en ABCG2 goed gedocumenteerd markers die correleren met stemness en MSC expressie 9,43-46. ABCG2 + L-MSC's hebben echter een meer endotheel natuur als ze zijn 99% positief voor CD31 46, terwijl de hier vermelde methode kiest tegen endotheliale cellen door de Ficoll gradiënt en plastic therapietrouw. Het belangrijkste voordeel van onze werkwijze vergeleken met de Sca-1 gebaseerde isolatieprotocol van McQualter en collega 5,8 is dat het breed toepasbaar op andere soorten dan muizen, waarin Sca-1 niet kan worden gebruikt.

Hoewel het zeer moeilijk, waarschijnlijk bijna onmogelijk, een "pure" populatie van L-MSC's ontvangt van een late ontwikkelings- of volwassen longen en onderhouden in een ongedifferentieerde toestand, het protocol hier gepresenteerde biedt een snelle, consistente en betrouwbare methode het verkrijgen van een cel populatie sterk verrijkt in multipotente zelfvernieuwende long resident MSC's. Met deze methode wordt een bepaald onderzoek naar de rol van L-MSC's in diverse ziektemodellen en hun rol in het ontwikkelen van long schakelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

Stem Cell Biology mesenchymale stromale cellen weefsels resident stam / voorlopercellen long- rat regeneratieve geneeskunde magnetische bead selectie
Isolatie van CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter