Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Denne protokollen beskriver en isolasjons teknikk for å oppnå primær lunge hørende mesenchymal stromale celler fra rotter, ved bruk av enzymatisk fordøyelse, tetthetsgradient separasjon, plast tilslutning og CD146 + magnetiske kuler utvalg.

Abstract

Mesenchymale stromale celler (MSC) er i økende grad anerkjent for deres terapeutiske potensial i et bredt spekter av sykdommer, inkludert lungesykdommer. I tillegg til bruk av benmarg og navlestreng MSC for eksogene celleterapi, er det også økende interesse for reparasjon og regenerativ potensialet bosatt vev MSC. Dessuten har de sannsynligvis ha en rolle i normal organutvikling og er blitt tilskrevet roller i sykdommer, spesielt de med en fibrotisk natur. Den største hinder for studiet av disse hørende vev MSCer er mangelen på en klar markør for isolering og identifisering av disse cellene. Isolasjon teknikken beskrevet her gjelder flere kjennetegn ved lunge bosatt MSC (L-MSC). Etter ofring av rottene blir lunger ble fjernet og skyllet flere ganger for å fjerne blod. Etter mekanisk dissosiasjon av skalpellen, er lungene spaltet i 2-3 timer ved bruk av en blanding av kollagenase type I, nøytral protease og DNase type I. Det som ble oppnåddd enkeltcelle-suspensjon ble deretter vasket og lagt over tettshetsgradient medium (densitet 1,073 g / ml). Etter sentrifugering blir cellene fra den inter vasket og sådd ut i kultur-behandlede kolber. Celler dyrkes i 4-7 dager i fysiologisk 5% O2, 5% CO2-forhold. Å utarme fibroblaster (CD146 -) og for å sikre en befolkning på bare L-MSC (CD146 +), positiv utvelgelse for CD146 + celler utføres gjennom magnetiske kuler utvalg. Oppsummert produserer denne prosedyren pålitelig en befolkning på primær L-MSC for videre in vitro studier og manipulasjon. På grunn av naturen av protokollen, kan det lett bli oversatt til andre eksperimentelle dyremodeller.

Introduction

Mesenchymale stromale celler (MSC) er i økende grad anerkjent for deres terapeutiske potensial i et bredt spekter av sykdommer, inkludert lungesykdommer. I tillegg til bruk av benmarg og navlestreng MSC for eksogene celleterapi, er det også økende interesse for reparasjon og regenerativ potensialet bosatt vev MSC. Under utviklingen, blant annet i lungene, er det mesenchyme en viktig kilde til utviklings signaler, og bosatt MSC er en sannsynlig kandidat til å være i sentrum for dette. Videre er bevis dukker opp som ilegges MSC er gjennomtrengt på voksne sykdommer, inkludert kreft 1,2 og fibrose tre. Den største hinder for studiet av disse hørende vev MSCer er mangelen på en klar markør for isolering og identifisering av disse cellene 4. Stamcelle antigen-1 (Sca-1) ble identifisert i mus som en markør for en rekke forskjellige vev stamceller, og kan anvendes for isolering av L-MSC 5, men har dessverreingen kjent ortologer i andre arter 6. Forskere har rapportert en rekke forskjellige isoleringsmetoder for isolering av L-MSC enten fra lungevev eller væske. Disse varierer fra fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) baserte metoder som selekterer for CD31 - / CD45 - / CD90 + celler 7, CD31 - / CD45 - / epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) - / Sca-1 + -celler til 8, multiresistens transporter ATP bindende kassett G (ABCG2) positive celler 9 eller Hoechst 33342 fargestoff utstrømming 10, til plast etterlevelse 11,12 og migrasjon ut av hakket vev 13.

Fordelene med den her presenterte fremgangsmåten er flere ganger. Ved hjelp av en svak enzymatisk fordøyelse og tetthetsgradient 14, får man alle cellene i tetthetsområdet som inkluderer MSC men ekskluderer epitelceller eller endotelceller. Den påfølgende plast adherenstrinn sikrer at bare den mesenchymal cellene holder seg og bo i kultur, eliminere leukocytter. Viktigst er imidlertid lar CD146 + seleksjonstrinnet for eliminering av fibroblaster, da disse celler ikke uttrykker CD146. Ekspresjon av celleadhesjonsmolekyl CD146 er positivt korrelert med multipotency, og er derfor en god markør for å luke ut fibroblaster fra en mesenchymale cellepopulasjon 15-19. Dette er en fordel i forhold til å bruke CD90 som en seleksjonsmarkør, som det ikke er bare uttrykt i MSC men også i lipofibroblasts 5,20. I denne protokoll har vi eksplisitt valgt en på magnetiske kuler valg, som det er mildere på cellene, og hele prosedyren kan utføres i sterile betingelser. En annen viktig fordel med denne isolasjonsmetoden i motsetning til den utvekst metode, er at det er forholdsvis rask, 6-10 dager i motsetning til en måned eller mer for utveksten metode. Tre til fem dager etter den første isolering av mesenchymale befolkningen er klar for CD146 + sele Dette skjer; etter ytterligere tre til fem dager CD146 + cellene er klare til å bli brukt til eksperimenter eller kan bli frosset for senere bruk. Den reduserte tiden av kultur forbedrer kvaliteten på cellene som MSC transdifferentiate mot fibroblaster i forlenget ex vivo kultur 19. Til slutt, på grunn av naturen av protokollen, er det mulig å anvende denne fremgangsmåte for andre arter ved ganske enkelt å velge egnede antistoffer, eller til og med til andre organsystemer ved å justere valg av fordøyelsesenzymer og inkubasjonstid.

En detaljert protokoll av denne isolasjonsmetoden er gitt nedenfor, og en skjematisk oversikt over isolasjon og påfølgende valg av CD146 + undergruppe er gitt i Figur 1A og 1B henholdsvis. I tillegg er detaljer inkludert for aging, frysing og tining disse cellene.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk oversikt over isolasjonen av pulmonale mesenchymale celler (A) og etterfølgende CD146 + valget av celler (B), min = minutter.; EDTA = Ethylenediaminetetraacetic syre; 2. Ab = sekundært antistoff; a-CD146 Ab = primære anti-CD146 antistoff; ve celler = CD146 negative celler; + ve celler = CD146-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Animal Care komité University of Ottawa (dyreetikk protokollen Ohrí-1696). Dyr behandling ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer.

1. Isolering av Lung Mesenchymale stromale celler

  1. Forbered enzymet blandingen i en 50 ml tube: veie 30 U nøytral Protease, 2500 U Collage I og 500 U DNAse I. Disse beløpene nok for lungene til en voksen mus eller rotte valp. Forbered på dag av isolasjon og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.
  2. Offer rotteunger ved dag 13 etter en intra-peritoneal injeksjon av pentobarbital-natrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Bruk tå klype refleks å etablere bevisstløshet. Død av dyret sikres ved åpning av brystkassen, som beskrevet nedenfor.
  3. Rense huden ved sprøyting dyret med 70% etanol og nøye åpne brystkassen ved hjelp av kirurgisk saks, starter på membranen og kutte mot rostral side, å være veldig forsiktigtil skader lungene. Spre brystkasse åpen ved hjelp av hemostatiske klemmer, eller alternativt klippe bort brystkasse for å gi tilgang til brystkassen.
  4. Exsanguinate dyret ved å fjerne hjertet. For å fjerne hjertet, ta tak i thymus og hjerte med små tang og kuttet disse bort med kirurgiske saks. Umiddelbart etterpå, absorbere blodet med et gasbind inntil det ikke mer blod kommer ut av det avkuttede aorta og lungearterien.
  5. Fjern lungene fra thorax som følger: hold luftrøret med små tang, deretter kutte luftrøret med kirurgisk saks på rostral side. Mens forsiktig trekke lungen pakke ut av thorax, skjære bort for bindevev på den dorsale side langs brystkasse for å frigjøre lungene.
  6. Sever lungene fra aorta og spiserøret ved å skjære langs membranen med kirurgiske sakser. Nå som lungene er helt gratis fra thorax fjerne eventuelle gjenværende blod forsiktig med en kompress.
  7. Ta av luftrøret og bronkiene med surbiologiske saks og nøye overføre lungefliker til et 50 ml rør inneholdende kald 35 ml 30% Citrat-fosfat-dekstrose-adenin (CPDA-1) antikoagulant (26,30 g trinatriumcitrat-dihydrat, 3,27 g askorbinsyre-monohydrat, 2,22 g mononatrium dihydrogenfosfat, 31,80 g D-glukose, 0,275 g adenin i en L renset H2O, sterilt filter oppløsningen ved hjelp av et 0,22 um membranfilter før bruk) i fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne blod og smuss.
  8. Etter en 5 minutters skylling i 30% CPDA-1 / PBS, overføre lunge til en ny 50 ml rør inneholdende 35 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS) (romtemperatur), inverterer forsiktig for å fjerne citrat. Overføring til et rør som inneholder 35 ml Dulbeccos PBS + Sodium-pyruvat + Glukose (DPBS ++) (RT). Hvert rensetrinnet bør ta ca 5 min.
    Merk: DPBS ++ kan bestilles kommersielt eller fremstilt som følger 21: kalsiumkloriddihydrat 132,4 mg, magnesiumkloridheksahydrat 100 mg, kalium-klorid (vannfritt) 200 mg, monobasisk kaliumfosfat (vannfri) 200 mg natrium-klorid (vannfri) 8000 mg, natriumfosfat dibasisk (vannfritt) 1,144.5 mg, D-glukose 1000 mg, natriumpyruvat 36 mg i 1 liter renset H2O, pH 7,3. Sterilt filter oppløsningen ved hjelp av et 0,22 um membranfilter før bruk.
  9. Oppløs den enzymblandingen ved tilsetning av 10 ml DPBS ++ (forvarmet til 37 ° C) og inverterende forsiktig inntil oppløsning.
  10. Overfør lungene til en ny 50 ml rør og hakk lunge på veggen av røret ved hjelp av en skalpell til fint hakket. Tilsett enzymblandingen til vevet (10 ml enzym-blanding / per voksen mus / rotte pup lunge), lukker røret tett og inkuberes ved 38 ° C med forsiktig omrøring (enten i en termisk blander, et ristende vannbad eller en vann bad med vanlig manuell agitasjon). Varigheten avhenger av typen av vev: føtalt vev 60 min, juvenil / voksent vev 90-120 min, fibrotisk voksent vev 120-150 min.
  11. Stopp fordøyelsen ved chelaterande de toverdige kationer wed 200 ul etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Sterilt filter oppløsningen ved hjelp av et 0,22 um membranfilter før bruk).
  12. Tilsett 20 ml 5% føtalt bovint serum (FBS) / PBS og passere hele suspensjonen gjennom 100 mikrometer celle sil inn i en ny 50 ml tube. Skyll røret og cellefilter med 10 ml 5% FBS / PBS, og det totale volum til 40 ml.
  13. Sentrifuger i 5 minutter ved 500 xg, RT.
  14. Fjern supernatanten (pellet bør være godt synlig), resuspender i 40 ml 5% FBS / PBS og gjenta sentrifugeringstrinn 1.13.
  15. Resuspender i 4 ml 5% FBS / PBS (RT) og lag forsiktig i løpet av 3 ml tettshetsgradient materiale (1,073 g / cm 3) i et 15 ml rør 14. For å få en god inter, er det avgjørende at lagdelingen av singelen cellesuspensjon skjer på en> 45 ° vinkel ved svært lav hastighet.
  16. Sentrifuger 20 min ved 900 xg, medium (5/10) akselerasjon, ingen retardasjon, 19 ° C.
  17. Samle cellene som er tilstede i iterphase og resuspender dem i 10 ml sterilt PBS.
  18. Sentrifuger i 5 minutter ved 500 xg, 21 ° C.
  19. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 10 ml forvarmet fullført L-MSC kulturmedium (minimum essential media Eagle, a-modifikasjon (aMEM), supplert med 2 mmol L-glutamin pr 500 ml aMEM, 20% volum / volum FBS og 1% vol / vol penicillin / streptomycin / Amphotericin B.
  20. Gjenta sentrifugeringstrinn 1.18. Deretter fjerner supernatanten og resuspender i 10 ml forvarmet frisk kultur medium.
  21. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller og plate ved en høy tetthet, siden de fleste av cellene på dette stadium ikke er plast tilhenger. Den nøyaktige plating tetthet er avhengig av dyreart og alder, for eksempel, blir cellene i en voksen mus lunge sådd med 10 5 celler / cm 2, mens celler fra en rotteunge lunge er tilstrekkelig tett ved en seeding tetthet på 1-2 x 10 4 celler / cm2 cm2.
  22. Kultur L-MSC i en fuktig 5% O2, 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C.
  23. Endre medium 24 timer etter den første såing, og deretter hver 3. dag etter skylling en gang med PBS. Cellene skal være dyrket inntil 80-90% samløpet, som tar 3-5 dager i gjennomsnitt, avhengig av animalsk opprinnelse. Høyere samløpet vil fremme differensiering i fibroblaster.

2. Valg av CD146 + Lung Mesenchymale stromale celler

  1. Belegg av magnetiske kuler med sekundært antistoff
    1. Belegge de magnetiske perler med biotinylert sekundært antistoff, ved et forhold på 10 ug sekundært antistoff / 100 ul magnetiske perler i en rundbunnet sterile 2 ml kryoampulle i sterile betingelser. Bruke 10 pl sekundært antistoff per forventede 0,5 x 10 6 celler, og bruker et minimum på 100 ul magnetiske perler og 10 ug antistoff.
      Merk: Forholdet mellom entibodies brukt per volum av perler kan variere mellom produsenter, kan du se produsentens instruksjoner for perler av valget. For denne protokollen, se tabell 1 for de perler og antistoffer som ble brukt i optimalisering av denne protokollen.
    2. Inkuber i en roterende blander prøven i 30 minutter ved 30 omdreininger / minutt (rpm) ved RT.
    3. Resuspendere kulene i 1,5 ml steril 0,1% bovint serumalbumin (BSA) / PBS og overfør til en 3 ml rundbunnet rør (strømningscytometri tube). Skyll kryoampulle med ytterligere 1,5 ml 0,1% BSA / PBS og overføre til 3 ml rør.
    4. Plasser røret på en passende magnet og vente 2 min inntil alle perlene er festet til den bakre vegg av røret, og oppløsningen forblir klar. Fjern avrenning og gjenta vask med 3 ml 0,1% BSA / PBS to ganger.
    5. Resuspender perlene i 3 ml 0,1% BSA / PBS og oppbevar ved 4 ° C, beskyttet mot lys. Brukes innen 5 dager.
  2. Merking CD146 + L-MSC
    1. Høste mesenchymalceller etter skylling med PBS med en mild non-trypsin løsning.
      Merk: Volumer avhenge av størrelsen av kulturflaske (0,2 ml / cm 2 medium eller PBS).
      1. Fjerne dyrkningsmedium og skylle cellene tre ganger med sterilt PBS.
      2. Tilsett passende mengde av milde ikke-trypsin-løsning (se tabell 1). Inkuber ved 37 ° C i inkubator inntil cellene er frittliggende, tilnærmet 10 min ved bruk av løsningen i tabell 1.
      3. Inaktivere enzymet ved å tilsette L-MSC kulturmedium, og sentrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
    2. Fjern supernatanten, resuspender cellene i 0,1% BSA / PBS og tell cellene med et hemocytometer eller automatisk celleteller.
      Merk: Volumet av 0,1% BSA / PBS, avhenger av størrelsen på kultur kolbe: satse på 5 eller 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Gjenta trinn 2.2.2 og resuspender den dedikerte mengden av celler i 3 ml 0,1% BSA / PBS (blokker unspesifikke bindingssteder og holder cellene i live). Hold celler på is.
    4. Forbered en 3 ml rund bunn rør med den primære anti-CD146 antistoff, og holde på is.
      Merk: Konsentrasjonen av primære antistoff som tilsettes til den dedikerte mengden av celler som er avhengig av antistoffet som brukes. For en foreslått anti-rotte CD146 antistoff se tabell 1.
    5. Legge til det totale volum av celler fra trinn 2.2.3 til røret med det primære antistoff. Lukk tett og inkuberes 30 min på en roterende prøve mikser ved 15 rpm, 4 ° C.
    6. Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 x g, 4 ° C, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml 0,1% BSA / PBS. Gjenta sentrifuge trinn.
    7. Suspender cellene i 3 ml oppløsning inneholder sekundære antistoff kuler som ble utarbeidet i henhold til instruksjonene i kapittel 2.1 og inkuberes 30 min på en roterende prøve mikser ved 15 rpm, 4 ° C.
  3. Velge CD146 + L-MSC
    1. Plasser røret som inneholder den merkede CD146 + L-MSCer på magneten. De positive cellene vil bli trukket til på baksiden av røret. Uten å flytte røret eller berøre perler, høste supernatanten med de negative celler sakte med en steril Pasteur pipette (disse kan enten samlet eller forkastet basert på eksperimentell design).
    2. Fjerne røret fra magneten og resuspender cellene i 3 ml 10% BSA / PBS. Gjenta utvelgelsesprosedyren beskrevet i trinn 2.3.1. fire ganger (Σ fem utvalgs trinn).
    3. Resuspender CD146 + L-MSC i forvarmet L-MSC kulturmedium og gå tilbake til magneten.
    4. Fjern supernatanten, resuspender i L-MSC kulturmedium og plate i en passe stor kulturflaske (0,2 ml / cm 2). Som en tommelfingerregel, plate celler i samme størrelse kultur kolbe som cellene ble løftet før perle-utvalget. Antallet CD146 + L-MSC, og derfor plating tetthet, vilavhenge av alder, arter og belastning av kilden dyret. Alltid satse på en plating tettheten av ~ 5.000 celler / cm2.
      Merk: Perlene vil ikke forstyrre cellevekst og vil gradvis forsvinne som cellene sprer.

3. Frysing Cells

  1. Bruke følgende frysemiddel: 60% pentastarch oppløsning (10% pentastarch i 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimetylsulfoksid (DMSO) 22.
    Merk: Hvis ikke alle ingredienser som er tilgjengelige, er en oppløsning inneholdende 5% DMSO, 30% FBS og 65% aMEM et godt alternativ.
  2. Resuspender celler 0.5 x 10 6 celler / ml, alikvoter i cryovials av 1 ml hver og fryse O / N ved -80 ° C ved anvendelse av en frysebeholder.
  3. Overføring til en flytende nitrogen lagertank neste dag.

4. Tining Cells

  1. Tine en ampulle av celler i et 37 ° C vannbad i 5 min.
  2. Resuspender cellene i 10 mlforvarmet kulturmedium og sentrifuger i 5 minutter ved 500 xg, 21 ° C.
  3. Fjern supernatant og cellepelleten suspenderes i 10 ml kulturmedium. Seed celler i en ventilert lokk cellekultur behandlet kolber på 5.000 celler / cm2 i 0,2 ml / cm2 media (f.eks 15 ml for en 75 cm 2 kolbe).
  4. Kultur cellene i 5% O 2, 5% CO 2 til 80-90% konfluens for høsting og / eller eksperimentell bruk. Over-konfluens vil indusere differensiering. Ved såing ved 5.000 celler / cm 2, vil L-MSC når 80-90% konfluens i løpet av 3-4 dagers dyrking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To av de mest pålitelige fysiske egenskapene til MSC, tetthet og plast tilslutning, blir brukt i den første del av denne protokollen for å oppnå den mesenchymale cellefraksjon i lungene som inneholder L-MSC. Selv om densitetsgradient mellomfase vil omfatte monocytter og makrofager i tillegg til lunge mesenchymale celler, plast tilslutning fulgt av 3-5 dagers dyrking sørger for at bare de lunge mesenchymale celler forbli. Faktisk denne cellen befolkningen uttrykker de klassiske MSC overflatemarkører CD73, CD90 og CD146 og er negativ for markørene CD34, CD45, store histocompatibility kompleks type II (MHCII) -RT1B, CD11b og CD79a, noe som indikerer at det er ikke lenger noen leukocytter til stede i den cellepopulasjon (figur 2A). Av interesse er det ute av CD146 + undergruppe, er en rekke 44,4 til 65,7% også CD73 + og CD90 + (data ikke vist). Dessuten er denne cellepopulasjon som kan oppnå enkolonidannende enhet (CFU) effektivitet som på ~ 30% er mye høyere enn vanligvis rapportert for benmargs MSC eller til andre MSC-typer (figur 2B), og skiller langs de tre klassiske MSC linjer (figur 2C).

Figur to
Figur 2. MSC karakteren etter enzymatisk fordøyelse, densitetsgradient separering og plast tilslutning. (A) Ekspresjon av MSC-relaterte overflatemarkører CD146, CD73 og CD90 er til stede i en del av plastheftende cellepopulasjon, mens de negative leukocytt markører CD11b, CD79a , CD34, CD45 og MHCII-RT1B var nesten ikke til uttrykk. (B) kolonidannende enhet assay ved begrensende fortynningsanalyse (5-celler / cm2) indikerte at ~ 30% av plast adherente celler hadde en klonal kapasitet, en indikasjon på MSC. (C) Plastic tilhenger cells var i stand til å osteogen matriksproduksjon (rød), inneholdt et høyere antall små lipidvesikler (rød) når indusert med adipogenic differensiering medium sammenlignet med ikke-differensierte kontroller og dannet chondrogenic som kuler som inneholder kondrocytter (rød). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Alle data ble samlet inn med passasje 1-3 celler. NM = negative markører; CFU = kolonidannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Imidlertid er det viktigste forbeholdet at denne populasjonen sannsynlig inneholder både L-MSC og ulike undergrupper av lunge fibroblaster, L-MSC differensiert avkom 23. Siden multipotency er positivt korrelert med CD146 uttrykk, og fibroblaster bør ikke ha ekspresjon av denne markøren, positiv seleksjon av CD146 + subpopulasjonen ostensibly resulterte i en cellepopulasjon som er sterkt anriket med L-MSC. Dette er klart vist ved en høyere prosentandel av cellepopulasjonen som uttrykker MSC forbundet overflatemarkører (figur 3A), en betydelig høyere kolonidannende potensial på ~ 80% (figur 3B) og en sterkere differensiering respons i spesielt chondrogenic avstamning (figur 3C) sammenlignet med den totale mesenchymale populasjonen som blir oppnådd før CD146 utvalg. Av notatet er at disse L-MSC skjemaet bare svært få ekte adipocytter, men viser mange flere spindelformede celler som er fylt med små lipidvesikler. Dette kan reflektere lipofibroblast avstamning som er avgjørende for både lunge utvikling og alveolær type II celle støtte. Etter CD146 utvalg, kan mer adipocyte som celler fylt med store lipidvesikler bli observert (Figur 3C) sammenlignet med før CD146 valg, men de fleste av cellene er fortsatt den lipofibroblasts lignende cells inneholder små lipidvesikler.

Figur 3
Figur 3. MSC karakteren etter ytterligere CD146 + magnetiske kuler utvalg. Etter positiv utvelgelse av CD146 + undergruppe, disse cellene viste en høyere ekspresjon av MSC-relaterte overflatemarkører, CD73 spesielt (A), en betydelig høyere virkningsgrad CFU etter enkeltcelle plating (B), og en sterkere differensiering respons for spesielt chondrogenic avstamning og i mindre grad adipogenic avstamning (C). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Alle data ble samlet inn med passasje 3-celler. NM = negative markører; CFU = kolonidannende enheter. Klikk her to vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Isolering og kultur av primær L-MSC presenterer en mulighet til å bedre forstå deres funksjon og deres samspill med andre cellepopulasjoner på cellenivå, og deres rolle i lunge utvikling, helse og sykdom. Dette er særlig viktig som mangel på en spesifikk markør enkelt av disse cellene gjør det nesten umulig å studere disse cellene in situ. Som med alle primære cellepopulasjoner, bør man huske på at disse cellene er mer sannsynlig å endre sin karakter jo lengre de blir holdt i kultur 19 (anmeldt i 24). For å holde L-MSC i en tilstand som ligger så nær som mulig til sin naturlige tilstand, er det meget viktig at de blir dyrket i 5% O 2, 5% CO2, i et 37 ° C fuktet inkubator. I luftveiene fysiologi er det generelt akseptert at basert på Daltons lov av partialtrykk, det partielle oksygentrykket av omgivende luft (21% O 2) er 160 mm Hg, og faller til ~ 101 mmHg i alveolar luftrom 25-27. I en moden lunge alveolar-arteriell PaO to gradient er ~ 3-4 mmHg, men dette kan økes betydelig i en syk eller umoden lunge der alveolær-arteriell lengden økes 25,28. Inne i legemet, er det mesenchymale nisje som normalt utsettes for en oksygenkonsentrasjon på 2-8% 29,30. Bare noen papirer har faktisk målt PO 2 i lungene, men en studie målt dette i lungene til 20 pasienter, finne et område i normal lunge PO 2 fra 23 til 656 mmHg, med en median på 42,8 mmHg 27,31. I henhold til Daltons lov, en fuktig inkubator med en temperatur på 37 ° C og 5% O 2 har en pO 2 av ~ 36 mmHg, som faller helt innenfor området målt i normalt lungevev og er svært nær til median. I tillegg lavt oksygendyrkningsforhold fremme vedlikehold av stamceller populasjoner i kultur 29. Tatt sammen, det jeger vanskelig å si nøyaktig hva oksygenkonsentrasjons L-MSC er utsatt for in situ på forskjellige stadier i løpet av normal postnatal utvikling eller sykdom, men det ser ut til at 5-10% O 2 er sannsynligvis den mest nøyaktige fra et fysiologisk perspektiv 27,31. Basert på informasjonen henvist til ovenfor, valgte vi å opprettholde 5% O 2 i våre kulturbetingelsene, og vi har funnet at når disse betingelser blir opprettholdt in vitro, vil de L-MSC vokser raskere, viser mindre stress-fibre, og har en mindre sannsynlighet av spontan differensiering eller alderdom. Andre faktorer som vil hindre spontan differensiering eller andre abnormiteter er ved hjelp av en svak ikke-trypsin dissosiasjon middel for aging, aging L-MSC når de når 80-90% konfluens (tette betingelser vil fremme differensiering fibroblast), og å holde passasjen antall lave (<P4). I en studie av Hoffmann og kolleger, ble trypsin vist seg å ha negative effekter på L-MSC-funksjon ogfenotype, mens trypsin-free dissosiasjon midler kunne bevare denne 13.

For å optimalisere avkastningen i løpet av isolasjonsprosess, er det viktig å hakke lungene så fint som mulig, men husk at vevet ikke bør få lov til å tørke. Under enzymatisk oppslutning, er det viktig at rørene blir agitert ofte, om ikke ved hjelp av en oppvarmet risteanordning, som vevet stykkene vil sedimentere, og vil ikke få optimal eksponering for enzymene. Et annet viktig trinn er densitetsgradient separasjon: hvis lagdelingen ikke er gjort svært sakte eller i en vinkel <45 °, vil det føre til blandingen av de to væsker i stedet for lagdeling, forårsaker tap av hele celle-populasjonen. Dessuten er tettheten av densitetsgradienten medium er svært avhengig av temperaturen i omgivelsene. En hvilken som helst annen temperatur enn 19 ° C (eller romtemperatur), vil resultere i suboptimal eller ingen densitetsgradient separasjon.

Av interesse for future brukere av denne protokollen er at vi har lyktes i å isolere levedyktige L-MSC fra lungene som ble høstet opp til 24 timer før isolasjon, forutsatt at lungene er direkte lagret i kaldt L-MSC media på høsten, og holdt på fire ° C. Dette åpner for mer fleksibel forsøksplanlegging, eller til og med forsendelse av lungene mellom ulike laboratorier. Utbyttet er generelt lik den i nyhøstede lunger, og cellene vokser like godt.

En annen modifikasjon som ville være mulig, er å bruke FACS i stedet for magnetiske kuler valg, selv om denne fremgangsmåte utsetter cellene til mer stress som prosedyren tar mer tid og som cellene blir utsatt for høye trykk og hastigheter, og havner risikoen for forurensning hvis det ikke gjøres under sterile betingelser. De magnetiske kuler er brukt her ikke påvirker cellevekst, og forsvinne i løpet av noen få dager kultur. En preferanse for FACS eller magnetiske kuler sortering kan også avhenge av de tilgjengelige fasilitetertil sluttbrukeren. I tillegg vil det være mulig å modifisere denne protokollen for å isolere hørende MSC fra andre vev. I dette tilfellet vil det være viktig å skreddersy enzymene til organet av interesse, som matriseblandingen varierer mellom organene.

En viktig begrensning for bare ved hjelp av tetthetsgradient og påfølgende plast tilslutning for oppnåelse av mesenchymale celler, er at det resulterende populasjonen inneholder både L-MSC og fibroblaster. Seleksjon for CD146 + -celler sterkt remedier dette forbeholdet, men til tross for det CD146 + utvelgelsesprosedyren og det forsiktig dyrkningsbetingelser, arten av L-MSC og virkningene av in vitro cellekultur gjøre det umulig å unngå en viss grad av differensiering i fibroblaster. MSC generelt har blitt rapportert å inneholde et hierarki av multipotency, i hvilke celler lengre ned i hierarkiet langsomt mister sin multilineage potensial før de blir terminalt differensierte fibroblaster <sup> 23. I all sannsynlighet også dette skjer i L-MSC nisje 4, og ser ut til å bli reflektert i den kultiverte CD146 + befolkningen allerede en passasje etter CD146 + utvalg omtrent 40% av cellene har mistet CD146 uttrykk. I tillegg til denne pasientgruppen er det bare 80% CD73 og 40% CD90 uttrykk. I del, kan dette forklares ved MSC hierarki av multipotency. Det vil være mulig at CD146 + gjennomgå asymmetrisk spredning, noe som gir opphav til både CD146 positive MSC og negative, mer differensierte, datterceller. Resident MSC i lungene kan også rimelighet kan forventes å ha en noe annen fenotype og funksjon fra benmargs MSC, som definisjonen av CD73 og CD90 uttrykk var basert på. The International Society for Cell Therapy har erkjent at ikke alle MSC uttrykke de klassiske MSC markører, inkludert CD73 og CD90, og at overflate markør uttrykk er ikke den beste måten å definere MSC 32. exceptionally høy CFU effektiviteten til ~ 70% av CD146 + L-MSC populasjonen støtter denne. Fordi CD146 + befolkningen utfører bedre med hensyn til MSC egenskaper enn usortert mesenchymale befolkningen, har forfatterne ikke lenger preget CD146 - befolkningen. Vi forsøkt å berike vår mesenchymale befolkning med MSC og tømme dem av fibroblaster, men vi kan ikke hevde at dette er den eneste sanne L-MSC befolkningen. L-MSC er sannsynligvis meget heterogen, både i sin opprinnelse, fenotype og funksjon.

Selv CD146 er allment anerkjent for å være en markør for multipotency i MSC og pericytes 16,17,33,34, er svært lite kjent om CD146 + MSC befolkningen in vivo. CD146 er en celle adhesjonsmolekyl som er viktig for angiogenese og endotelial cellefunksjon, og er uttrykt i endotelceller, glatte muskelceller, pericytes, MSC og T-lymfocytter 15,16,35,36. I de senere år, Bevis har kommet fram at MSC bebo perivaskulær nisje i flere organer, som CD146 + celler co-flekken for MSC-markører CD73 og CD105 37. Faktisk dyrkede pericytes og MSC har en veldig lik genekspresjon profil 38, styrking av den oppfatning at MSC er utledet fra pericytes 4,39. Selv om vi ikke har utført immunhistokjemiske analyser for å bestemme plasseringen av vår CD146 + L-MSC befolkningen, er det svært sannsynlig at de også ville bli plassert i en perivaskulær plassering. Fremtidige studier vil være nødvendig for å bekrefte om dette er faktisk tilfelle. Det er mulig at en undergruppe av vår cellepopulasjon er pericytes, selv om det skal påpekes at alle cellene ser fenotypisk svært like etter CD146 + utvalg.

Mesenchymale stromale celler er notorisk vanskelig å identifisere på grunn av mangel på en enkelt altomfattende markør. Ulike studier har rapportert ulike metoder for isoleringav L-MSC, og har en overbevisende vist at disse cellepopulasjoner er lik hverandre med hensyn til MSC markør uttrykk. Med utgangspunkt i den karakteriseringen av CD146 + L-MSC som presenteres her, CD146 + L-MSC befolkning er meget lik den tidligere rapporterte L-MSC populasjoner som oppnås ved utvekst eller ulike former for FACS ved bruk av stamcelle tilhørende overflatemarkører som Sca -1, ABCG2 og CD90. Når sammenlignet med utvekst L-MSC 13, CD146 + L-MSC ser ut til å ha en større evne til å gi opphav til kolonier fra enkle celler, noe som indikerer at vår fremgangsmåte gir en mer anriket multipotent L-MSC befolkning. Denne fordel gjelder også når sammenlignet med metoder som isolerer L-MSC basert på CD90 7 eller blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor α (PDGFRα) 40,41, som begge overflatemarkører også velge for flere terminalt differensierte lipofibroblasts og alveolære / strukturelle fibroblaster og kan derfor bare rimelig be identifisert som stromale celler 20,42. I motsetning til dette er både Sca-1 og ABCG2 godt dokumentert markører som korrelerer med stemness og MSC uttrykk 9,43-46. ABCG2 + L-MSC imidlertid ha en mer endotelial natur som de er 99% positive for CD31 46, mens den metode som er rapportert her velger mot endotelceller gjennom Ficoll-gradient og plast tilslutning. Den største fordelen med vår metode i forhold til den Sca-1 basert isolasjonsprotokoll av McQualter og kolleger 5,8, er at det er bredt anvendelig for andre enn mus arter, hvori Sca-en ikke kan brukes.

Selv om det er svært utfordrende, sannsynligvis nesten umulig, å oppnå en "ren" populasjon av L-MSC fra en sen utviklende eller voksen lunge og opprettholde det i en udifferensiert tilstand, protokollen presenteres her gir en hurtig, konsekvent og pålitelig metode for oppnåelse av en cellepopulasjon høyanriket i multipotente selv-fornyende lunge resID- MSC. Ved hjelp av denne fremgangsmåte vil muliggjøre en mer definert undersøkelse av rollen til L-MSC i et bredt spekter av sykdomsmodeller og deres rolle i utviklingen av lunge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

Stem Cell Biology Mesenchymale stromale celler vev bosatt stilk / stamceller lunge rotte regenerativ medisin magnetiske kuler utvalg
Isolering av CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung Mesenchymale stromale celler fra Rat Lunger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter