Summary
Este protocolo descreve uma técnica de isolamento para a obtenção de células do estroma mesenquimal residentes primários de pulmão de ratos, através do uso de digestão enzimática, separação por gradiente de densidade, e aderência ao plástico CD146 + selecção esférulas magnéticas.
Abstract
células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Além disso, é provável que têm um papel no desenvolvimento normal do órgão, e foram papéis na doença, particularmente aqueles com uma natureza fibrótica atribuída. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células. A técnica de isolamento descritas aqui se aplica múltiplas características de MSCs residentes de pulmão (L-MSCs). No momento do sacrifício dos ratos, os pulmões são removidos e enxaguados várias vezes para remover o sangue. Após dissociação mecânica por bisturi, os pulmões são digeridos durante 2-3 hr usando uma mistura de colagenase de tipo I, tipo protease neutra e ADNase I. A obtainesuspensão de células única d é subsequentemente lavado e colocado em camadas sobre média densidade gradiente (densidade 1,073 g / ml). Após centrifugação, as células da interfase foram lavadas e plaqueadas em frascos tratados de cultura. As células são cultivadas durante 4-7 dias em fisiológico 5% de O2, 5% Condições de CO 2. Para esgotar fibroblastos (CD146 -) e para assegurar uma população de apenas, a selecção positiva de L-MSCs (CD146 +) para células CD146 + é realizado por meio de selecção esférulas magnéticas. Em resumo, este processo produz uma população de forma fiável primária G-MSC para posterior estudo e manipulação in vitro. Devido à natureza do protocolo, que pode facilmente ser convertidos a outros modelos animais experimentais.
Introduction
células estromais mesenquimais (MSCs) são cada vez mais reconhecida pelo seu potencial terapêutico em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças pulmonares. Além disso a utilização de medula óssea e as MSCs do cordão umbilical para a terapia com células exógenas, há também um interesse crescente na reparação e o potencial regenerador das MSCs de tecido residentes. Durante o desenvolvimento, incluindo o pulmão, o mesênquima é uma importante fonte de sinais de desenvolvimento, e as MSCs residentes é um candidato provável para estar no centro desta. Além disso, estão surgindo evidências de que MSCs residentes são perturbados em doenças de adultos, incluindo o cancro 1,2 e fibrose 3. O principal obstáculo para o estudo destas MSCs residentes de tecido é a falta de um marcador claro para o isolamento e identificação destas células 4. Células-tronco antigénio-1 (Sca-1) foi identificada em ratos como um marcador para uma variedade de células estaminais do tecido, e pode ser utilizado para o isolamento de MSCs de L-5, mas tem infelizmentenão conhecido orthologs em outras espécies 6. Os investigadores relataram uma variedade de diferentes métodos de isolamento para o isolamento de L-MSCs a partir de qualquer tecido ou fluido pulmonar. Estes variam de células activadas por fluorescência (FACS) modos baseados selecionando para CD31 - / CD45 - / CD90 + células 7, CD31 - / CD45 - / molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) - / Sca-1 + células 8, a resistência a múltiplos fármacos transportador ATP cassete de ligação G (ABCG2) células positivas 9 ou Hoechst 33342 dye efluxo 10, a aderência ao plástico 11,12 e migração para fora do tecido picada 13.
As vantagens do método aqui apresentado são várias vezes. Usando uma digestão enzimática suave e em gradiente de densidade 14, obtém-se todas as células da gama de densidades que incluem MSC, mas excluem células epiteliais ou endoteliais. O passo subsequente aderência ao plástico assegura que apenas o mesenchcélulas ymal aderir e ficar em cultura, eliminando leucócitos. Mais importante, no entanto, o passo de selecção CD146 + permite a eliminação de fibroblastos, uma vez que estas células não expressam CD146. Expressão da molécula de adesão celular CD146 é positivamente correlacionada com multipotency, e por isso é um bom marcador para eliminar os fibroblastos a partir de uma população de células mesenquimais 15-19. Esta é uma vantagem sobre o uso de CD90 como um marcador de selecção, uma vez que não só é expressa no MSC, mas também em lipofibroblasts 5,20. Neste protocolo, escolheu explicitamente uma selecção esfera magnética, uma vez que é mais suave sobre as células, e todo o processo pode ser realizado em condições estéreis. Outra vantagem importante do método de isolamento, em oposição ao método de crescimento, é de que é relativamente rápido, 6-10 dias, em oposição a um mês ou mais para o método de desdobramento. Três a cinco dias após o isolamento inicial da população mesenquimal está pronto para CD146 + sele cção; depois de mais de três a cinco dias, as células CD146 + está pronto para ser usado nas experiências, ou pode ser congelado para posterior utilização. O tempo de diminuição de cultura, melhora a qualidade das células como as MSCs transdiferenciar em direcção fibroblastos em cultura ex vivo prolongada 19. Por último, devido à natureza do protocolo, é possível aplicar este método para outras espécies simplesmente escolhendo anticorpos adequados, ou mesmo com outros sistemas de órgãos, ajustando a escolha de enzimas de digestão e tempo de incubação.
Um protocolo detalhado deste método de isolamento é dada a seguir, e uma vista geral esquemática do isolamento e subsequente selecção da sub-população CD146 + é fornecida na Figura 1A e 1B, respectivamente. Além disso, os detalhes são incluídos para Passaging, congelamento e descongelamento estas células.
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Figura 1. Visão esquemática do isolamento de células pulmonares mesenquimais (A) e CD146 + subsequente selecção de células (B) min = minuto.; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; 2 nd Ab = anticorpo secundário; a-CD146 Ab = anticorpo anti-CD146 primário; células negativas -ve = células CD146; + ve células positivas células = CD146. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa (animal ética protocolo Ohri-1696). cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.
1. Isolamento de células estromais mesenquimais do pulmão
- Preparar a mistura de enzima em um tubo de 50 ml: pesar 30 U protease neutra, 2.500 U de colagenase I e 500 U DNAse I. Estas quantidades suficientes para os pulmões de um rato adulto ou filhote de rato. Preparam-se no dia de isolamento e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
- Sacrifício filhotes de ratazana no dia 13 através de uma injecção intra-peritoneal de pentobarbital de sódio (0,2 mL, 65 mg / ml). Use o aperto reflexo toe para estabelecer inconsciência. A morte do animal é assegurada através da abertura da caixa, tal como delineado abaixo.
- Higienizar a pele pulverizando o animal com etanol a 70% e cuidadosamente abrir a caixa torácica usando tesouras cirúrgicas, a partir de o diafragma e o corte no sentido do lado rostral, sendo muito cuidado para nãopara danificar os pulmões. Espalhe a caixa torácica aberta usando grampos hemostáticos, ou alternativamente cortar a caixa torácica para fornecer acesso ao tórax.
- Desangrar o animal através da remoção do coração. Para remover o coração, segure o timo e coração com pequenas pinças e cortar estes afastado com uma tesoura cirúrgica. Imediatamente a seguir, absorver o sangue com uma gaze até não haver mais sangue sai da aorta e a artéria pulmonar cortada.
- Remover os pulmões do tórax da seguinte forma: mantenha a traqueia com pequenas pinças, em seguida, atingir a traquéia com uma tesoura cirúrgica no lado rostral. Enquanto puxa o pacote de pulmão para fora do tórax, cortar qualquer tecido conjuntivo no lado dorsal ao longo da caixa torácica para libertar os pulmões.
- Cortar os pulmões a partir da aorta e do esófago por corte ao longo do diafragma com tesouras cirúrgicas. Agora que os pulmões estão completamente livres do tórax remover qualquer sangue restante cuidadosamente com uma gaze.
- Remova a traqueia e os brônquios com surgicos tesoura e transferir cuidadosamente os lobos pulmonares para um tubo de 50 ml contendo citrato-fosfato-dextrose e adenina (CPDA-1) anticoagulante frio de 35 ml de 30% (26,30 g de citrato trissódico di-hidratado, 3,27 g de mono-hidrato de ácido ascórbico, 2,22 g de fosfato monossódico di-hidrogenofosfato, 31,80 g de D-glucose, 0,275 g de adenina em 1 L de H2O purificada; a filtração estéril da solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização) em tampão fosfato salino (PBS) para remover o sangue e detritos.
- Depois de uma lavagem de 5 min em 30% CPDA-1 / PBS, transferir o pulmão para um novo tubo de 50 ml contendo 35 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) (RT), inverter suavemente para remover o citrato. Transferir para um tubo contendo 35 ml de PBS + Sódio-piruvato de Dulbecco + Glicose (DPBS ++) (RT). Cada passo de lavagem deve demorar cerca de 5 min.
Nota: DPBS ++ pode ser encomendado no mercado ou a seguinte composição 21: cloreto de cálcio hidratado 132,4 mg, cloreto de magnésio hexa-hidratado 100 mg, cloreto de potássio (anidro) 200 mg, monobásico de fosfato de potássio (anidro) 200 mg de cloreto de sódio (anidro) 8,000 mg, fosfato de sódio dibásico (anidro) 1,144.5 mg, D-glicose 1,000 mg, piruvato de sódio 36 mg em 1 L de H 2 O purificada, pH 7,3. Filtrar em condições estéreis a solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização. - Dissolve-se a mistura de enzima por adição de 10 ml de DPBS ++ (pré-aquecido a 37 ° C) e invertendo suavemente até se dissolver.
- Transferir os pulmões para um novo tubo de 50 ml e cortar o pulmão na parede do tubo, usando um bisturi, até finamente picados. Adicionar a mistura de enzima ao tecido (10 ml de mistura de enzima / por ratinho adulto / cria de rato do pulmão), fechar o tubo firmemente e incubar a 38 ° C com agitação suave (ou em um misturador térmico, um banho de água em agitação, ou uma água banho com agitação manual regular). A duração depende do tipo de tecido: feto tecido 60 min, juvenil / adulto tecido 90-120 min, adulto tecido fibrótico 120-150 min.
- Parar a digestão por quelação os cátions bivalentes wom 200 ul de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. a filtração estéril da solução usando um filtro de membrana de 0,22 um antes da utilização).
- Adicionar 20 ml de soro de bovino fetal a 5% (FBS) / PBS e passar toda a suspensão através de peneira de 100 uM de células para um novo tubo de 50 ml. Lavar o filtro e tubo de células com 10 ml de 5% de FBS / PBS, levando o volume total a 40 ml.
- Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g, temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante (pellet deve ser claramente visível), ressuspender em 40 ml de 5% FBS / PBS e repita o passo centrifugação 1,13.
- Ressuspender em 4 ml de 5% de FBS / PBS (RT) e a camada cuidadosamente sobre 3 ml de meio de gradiente de densidade (1,073 g / cm3) em um tubo de 15 ml de 14. Para obter uma boa interfase, é crucial que as camadas da suspensão única célula ocorre em um ângulo de °> 45 a uma velocidade muito baixa.
- Centrifugar 20 min a 900 xg, meio (5/10) de aceleração, desaceleração sem, 19 ° C.
- Recolher as células presentes na emterphase e ressuspender-los em 10 ml de PBS estéril.
- Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml pré-aquecido meio completado cultura G-MSC (meio mínimo essencial de Eagle, modificação alfa (aMEM), suplementada com 2 mmol de L-glutamina por 500 ml de aMEM, 20% vol / vol de FBS e 1% em vol / vol de penicilina / estreptomicina / anfotericina B.
- Repita etapa de centrifugação 1,18. Subsequentemente, remover o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meio de cultura fresco pré-aquecido.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado e placa a uma densidade elevada, uma vez que a maioria das células, nesta fase, não são aderentes plástico. A densidade de revestimento exacto depende da espécie e idade dos animais, por exemplo, as células de um pulmão de ratinho adulto são semeadas a 10 5 células / cm2, enquanto que as células de um pulmão cria de rato é suficientemente densa para uma densidade de sementeira de 1-2 x 10 4 células / cm2 2.
- Culturas de L-MSC numa atmosfera humidificada de 5% de O 2, 5% de CO2 a 37 ° C.
- Mudança de meio 24 horas após a inoculação inicial, e, posteriormente, a cada 3 dias após a lavagem uma vez com PBS. As células devem ser cultivadas até 80-90% de confluência, o que leva 3-5 dias, em média, dependendo do animal de origem. confluência superior irá promover a diferenciação em fibroblastos.
2. Seleção de Células CD146 + Lung estromais mesenquimais
- O revestimento de esferas magnéticas com anticorpo secundário
- O revestimento dos grânulos magnéticos com anticorpo secundário biotinilado, à razão de 10 ug de anticorpo secundário / contas magnéticas em 100 ul de fundo redondo estéreis criotubo de 2 ml em condições estéreis. Use anticorpo secundário 10 ul por esperados células 0,5 x 10 6, e utilizar um mínimo de 100 ul de contas magnéticas e anticorpo ug 10.
Nota: O rácio de umtibodies usados por volume de contas podem ser diferentes entre os fabricantes, por favor consulte as instruções do fabricante para as contas de escolha. Para este protocolo, consulte a tabela 1 para as contas e anticorpos que foram utilizados na otimização deste protocolo. - Incubar numa misturadora rotativa amostra durante 30 minutos a 30 rotações / min (rpm), a temperatura ambiente.
- Ressuspender as contas em 1,5 ml estéril 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS e transferir para um tubo redondo de 3 ml de fundo (tubo de citometria de fluxo). Lavar o frasco de congelação com um adicional de 1,5 mL de 0,1% BSA / PBS e transferir para o tubo 3 ml.
- Colocar o tubo em um íman apropriado e esperar 2 min, até que todos os grânulos estão ligados à parede posterior do tubo e a solução permanece límpida. Retirar do escoamento em repetir a lavagem com 3 mL de 0,1% BSA / PBS duas vezes.
- Ressuspender as esferas em 3 mL de 0,1% BSA / PBS e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Utilizar no prazo de 5 dias.
- O revestimento dos grânulos magnéticos com anticorpo secundário biotinilado, à razão de 10 ug de anticorpo secundário / contas magnéticas em 100 ul de fundo redondo estéreis criotubo de 2 ml em condições estéreis. Use anticorpo secundário 10 ul por esperados células 0,5 x 10 6, e utilizar um mínimo de 100 ul de contas magnéticas e anticorpo ug 10.
- Etiquetas de CD146 + L-MSCs
- Colher as células mesenquimais após a lavagem com PBS utilizando uma solução não-tripsina suave.
Nota: os volumes dependem do tamanho do frasco de cultura (0,2 ml / cm 2 ou meio PBS).- Remover o meio de cultura e lavar as células três vezes com PBS estéril.
- Adicionar o volume apropriado de solução não-tripsina suave (ver Tabela 1). Incubar a 37 ° C na incubadora até as células terem individual, com cerca de 10 min quando se utiliza a solução na Tabela 1.
- Inactivar a enzima através da adição de meio de cultura L-MSC, e centrifuga-se durante 5 min a 500 x g.
- Remover o sobrenadante, as células ressuspender em 0,1% BSA / PBS e contagem das células com um hemocitómetro ou contador de células automatizado.
Nota: O volume de 0,1% de BSA / PBS depende do tamanho do frasco de cultura: alvo de 5 ou 10 mL de 0,1% BSA / PBS. - Repita o passo 2.2.2 e ressuspender o montante dedicado de células em 3 ml de 0,1% BSA / PBS (blocos unlocais de ligação específicos e mantém as células vivas). Manter as células no gelo.
- Preparar um tubo redondo 3 ml de fundo com o anticorpo anti-CD146 primário, e manter em gelo.
Nota: A concentração de anticorpo primário que é adicionado com a quantidade específica de células depende do anticorpo que é usado. Para um anticorpo anti-CD146 de rato sugeriram ver Tabela 1. - Adicionar o volume total de células a partir do passo 2.2.3 do tubo com o anticorpo primário. Fechar firmemente e incubar 30 min num misturador de amostras de rotação a 15 rpm, 4 ° C.
- Centrifugar as células durante 5 min a 500 xg, 4 ° C, remover sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 3 mL de 0,1% BSA / PBS. etapa de centrifugação de repetição.
- Ressuspender as células em solução de 3 ml contendo esferas revestidas de anticorpo secundário que foi preparado de acordo com as instruções na Secção 2.1 e incubar 30 min num misturador de amostras de rotação a 15 rpm, 4 ° C.
- Colher as células mesenquimais após a lavagem com PBS utilizando uma solução não-tripsina suave.
- Seleccionar CD146 + L-MSC
- Coloque o tubo que contém o marcado CD146 + L-MSCs no ímã. As células positivas vai ser desenhada para a parte de trás do tubo. Sem mover o tubo ou tocar as contas, recolher o sobrenadante com as células negativas lentamente com uma pipeta de Pasteur estéril (estes podem ser recolhidas ou descartadas com base no design experimental).
- Remover o tubo do íman e ressuspender as células em 3 ml de 10% de BSA / PBS. Repita o procedimento de selecção descrito no passo 2.3.1. mais quatro vezes (passos Σ 5 seleção).
- Ressuspender o CD146 + L-MSCs em meio de cultura L-MSC pré-aquecida e retornar para o íman.
- Remover o sobrenadante, ressuspender em meio de cultura L-MSC e placa num frasco de cultura de tamanho apropriado (0,2 ml / cm 2). Como uma regra de ouro, células da placa no mesmo frasco de cultura de tamanho a partir do qual as células foram retiradas antes do grânulo-selecção. O número de CD146 + L-MSC, e, portanto, a densidade de revestimento, serádepender da idade, espécie e da estirpe do animal de origem. Sempre apontar para uma densidade de revestimento de ~ 5000 células / cm2.
Nota: As contas não vai perturbar o crescimento celular e irá gradualmente desaparecer à medida que as células proliferam.
3. Células de congelação
- Utilizar os seguintes tipos de congelação: solução pentastarch 60% (10% pentastarch em 0,9% de NaCl), FBS a 20%, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) 22.
Nota: Se nem todos os ingredientes estão disponíveis, uma solução contendo 5% de DMSO, 30% de FBS e 65% aMEM é uma boa alternativa. - Ressuspender as células em 0,5 X 10 6 células / ml, da alíquota para criotubos de 1 ml de cada vez e congelar O / N à temperatura de -80 ° C utilizando um recipiente de congelação.
- Transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido no dia seguinte.
4. Células descongelamento
- Descongelar uma ampola de células num banho de água a 37 ° C durante 5 min.
- Ressuspender as células em 10 mlmeio de cultura pré-aquecido e centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura de 10 mL. Semear as células em uma cultura de células tampa ventilada frascos tratados a 5000 células / cm2 em 0,2 ml de meio / cm2 (por exemplo, 15 mL para um frasco de 75 2 cm).
- Células de cultura em 5% de O2, 5% de CO2, até 80-90% confluentes para a colheita e / ou o uso experimental. O excesso de confluência irá induzir a diferenciação. Quando semeando a 5000 células / cm 2, G-MSC irá chegar a 80-90% de confluência dentro de 3-4 dias de cultura.
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Representative Results
Duas das características físicas mais fiáveis de MSC, densidade e aderência ao plástico, são usadas na primeira parte deste protocolo para obter a fracção de células mesenquimais do pulmão que contém L-MSCs. Embora a interfase em gradiente de densidade incluem monócitos e macrófagos, além de células mesenquimais do pulmão, a aderência ao plástico seguido de 3-5 dias de cultura garante que apenas as células mesenquimais do pulmão permanecem. Na verdade, esta população de células expressa os marcadores de superfície MSC clássicos CD73, CD90 e CD146 e é negativo para os marcadores CD34, CD45, de histocompatibilidade principal tipo complexo II (MHCII) -RT1B, CD11b e CD79a, indicando que não há mais qualquer leucócitos presentes no a população de células (Figura 2A). De interesse é que o subconjunto de CD146 +, uma gama de 44,4-65,7% é também CD73 + e CD90 + (dados não mostrados). Além disso, esta população de células é capaz de umunidade de formação de colónias (CFU) em eficiência que ~ 30% é muito maior do que geralmente relatado para MSC de medula óssea ou mesmo outros tipos de MSC (Figura 2B), e diferencia ao longo das três linhagens MSC clássico (Figura 2C).
Figura 2. Características MSC após a digestão enzimática, separação por gradiente de densidade e aderência ao plástico. (A) Expressão de marcadores de superfície relacionadas MSC-CD146, CD73 e CD90 está presente numa parte da população de células aderentes de plástico, enquanto que os marcadores negativos de leucócitos CD11b, CD79a , CD34, CD45 e MHCII-RT1B praticamente não foram expressos. (B) ensaio de formação de colónia por unidade através de ensaio de diluição limitante (5 células / cm 2) indicou que ~ 30% das células aderentes de plástico tinha uma capacidade clonal, indicativo de MSCs. Ce aderente (C) plásticolls eram capazes da produção de matriz osteogénico (vermelho), continham um maior número de pequenas vesículas lipídicas (vermelho), quando induzidas com meio de diferenciação adipogênica comparação com os controlos não-diferenciadas e formados condrogênicas, como esferas contendo condrócitos (vermelho). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Todos os dados foram gerados com células passagem 1-3. NM = marcadores negativos; CFU = unidades formadoras de colónias. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No entanto, a ressalva principal é que esta população susceptível contém L-MSCs e diferentes subtipos de fibroblastos de pulmão, a L-MSCs progênie 23 diferenciadas. Desde multipotência está positivamente correlacionada com a expressão de CD146, e fibroblastos não deve ter nenhum expressão deste marcador, a selecção positiva de CD146 + subpopulação óstensibly resultou numa população de células que é altamente enriquecida em L-MSCs. Isto é claramente demonstrado por uma percentagem mais elevada da população de células que expressam MSC associado marcadores de superfície (Figura 3A), uma consideravelmente mais elevada formação de colónias potencial de ~ 80% (Figura 3B) e uma resposta de diferenciação mais forte em particular a linhagem condrogénica (Figura 3C) em comparação com a população mesenquimais total obtido antes selecção CD146. Digno de nota é que estes forma L-MSCs muito poucos verdadeiros adipócitos, mas mostram muito mais células fusiformes que são preenchidos com pequenas vesículas lipídicas. Estes poderiam refletir a linhagem lipofibroblast que é crucial tanto para o desenvolvimento do pulmão e suporte de células alveolares tipo II. Após selecção CD146, mais adipócito como células preenchidas com grandes vesículas lipídicas pode ser observado (Figura 3C) em comparação com antes da selecção CD146, no entanto, a maioria das células estão ainda a ce lipofibroblasts semelhantells contendo pequenas vesículas lipídicas.
Figura 3. Características MSC + após selecção grânulo magnético adicional CD146. Após selecção positiva da subpopulação CD146 +, estas células apresentaram uma maior expressão de marcadores de superfície relacionadas com o MSC, CD73, em particular, (A), uma eficiência consideravelmente mais elevada CFU após uma única célula revestimento (B), e uma resposta de diferenciação mais forte para especialmente a linhagem condrogénica e, em menor medida, a linhagem adipogênica (C). Os dados são apresentados como média ± SEM. Todos os dados foram gerados com 3 células de passagem. NM = marcadores negativos; CFU = unidades formadoras de colónias. Por favor clique aqui to visualizar uma versão maior desta figura.
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Discussion
O isolamento e cultura de principal L-MSCs apresenta uma oportunidade para entender melhor a sua função ea sua interacção com outras populações de células em um nível celular, e seu papel no desenvolvimento do pulmão, a saúde ea doença. Isto é especialmente importante porque a falta de um marcador único específica destas células faz com que seja quase impossível para estudar estas células in situ. Tal como acontece com todas as populações de células primárias, deve-se ter em mente que estas células são mais propensos a mudar seu caráter quanto mais tempo eles são mantidos em cultura 19 (revisto em 24). Para manter a L-MSC num estado que está tão perto quanto possível do seu estado natural, é muito importante que elas são cultivadas em 5% de O2, 5% de CO 2, num incubador humidificado a 37 ° C. Em fisiologia respiratória é geralmente aceite que, com base na lei de pressões parciais de Dalton, a pressão parcial de oxigênio do ar ambiente (21% O 2) é de 160 mmHg, e cai para ~ 101 mmHg no espaço aéreo alveolar 25-27. Em um pulmão maduro o gradiente PaO 2 alveolar-arterial é ~ 3-4 mmHg, mas isso pode ser significativamente aumentada em um pulmão doente ou imaturo, onde a distância alveolar-arterial é aumentado 25,28. No interior do corpo, o nicho mesenquimal está normalmente exposto a uma concentração de oxigénio de 2-8% 29,30. Apenas alguns trabalhos têm a medida real da PO 2 nos pulmões, mas um estudo mediu isso nos pulmões de 20 pacientes, encontrando uma gama no pulmão normal PO 2 de 23 a 656 mmHg, com mediana de 42,8 mmHg 27,31. De acordo com a lei de Dalton, num incubador humidificado com uma temperatura de 37 ° C e 5% de O 2 tem uma pO 2 de ~ 36 mmHg, o qual encaixa-se perfeitamente dentro do intervalo medido em tecido pulmonar normal e é muito próximo da mediana. Além disso, as condições de cultura de baixo oxigênio promover a manutenção das populações progenitoras na cultura 29. Tomados em conjunto, ele ié difícil dizer exactamente o de concentração de oxigénio L-MSC são expostos a in situ em diferentes estágios durante o desenvolvimento pós-natal normal ou doença, mas verifica-se que 5-10% de O2 é provavelmente o mais preciso do ponto de vista fisiológico 27,31. Com base na informação já referido, optou-se por manter 5% de O2 nas nossas condições de cultura, e observou-se que quando estas condições são mantidas in vitro, o G-MSC irá crescer mais rapidamente, exibir menos fibras de stress, e têm uma probabilidade menor de diferenciação espontânea ou senescência. Fatores adicionais que irão impedir a diferenciação espontânea ou outras anormalidades é usando um agente de dissociação não tripsina delicado para passaging, passaging L-MSCs quando atingem 80-90% de confluência (condições densas vai promover a diferenciação de fibroblastos), e manter o número de passagens de baixo (<P4). Em um estudo realizado pela Hoffmann e seus colegas, tripsina foi mostrado para ter efeitos adversos para a função L-MSCs efenótipo, enquanto agentes de dissociação livre de tripsina poderia preservar este 13.
Para optimizar o rendimento durante o processo de isolamento, é importante para picar os pulmões tão finamente quanto possível, mantendo em mente que o tecido não deve ser deixada a secar. Durante a digestão enzimática, é importante que os tubos são agitados frequentemente não se utilizando um dispositivo de agitação aquecida, como os pedaços de tecido irá sedimentar e não irá obter a exposição óptima para as enzimas. Um outro passo crucial é a separação por gradiente de densidade: Se as camadas não for feito muito lentamente, ou com um ângulo <45 °, que irá conduzir a a mistura dos dois líquidos, em vez de camadas, provocando a perda de toda a população celular. Além disso, a densidade do meio de gradiente de densidade é muito dependente da temperatura circundante. Qualquer outra temperatura de 19 ° C (ou RT), irá resultar na separação por gradiente de densidade sub-óptima ou não.
De interesse para fusuários RÓXIMOS deste protocolo é que nós isolamos com sucesso viável L-MSCs dos pulmões que foram colhidos até 24 horas antes do isolamento, desde que os pulmões são armazenados diretamente no frio media L-MSC após a colheita, e mantido a 4 ° C. Isso permite o planejamento experimental mais flexível, ou mesmo a expedição dos pulmões entre diferentes laboratórios. O rendimento é de modo geral semelhante à dos pulmões recém-colhidas, e células crescem igualmente bem.
Outra modificação que seria possível, é a utilização de FACS em vez de selecção de grânulo magnético, embora este método submete as células de mais stress como o processo demora mais tempo e como as células são sujeitas a altas pressões e velocidades, e alberga o risco de contaminação se não for feito em condições estéreis. Os grânulos magnéticos utilizados aqui não interferem com o crescimento celular, e desaparecem dentro de alguns dias de cultura. A preferência por FACS ou triagem grânulo magnético pode também depender das facilidades disponíveispara o utilizador final. Além disso, seria possível modificar este protocolo para isolar MSCs residentes de outros tecidos. Neste caso, seria importante adaptar as enzimas para o órgão de interesse, como a composição da matriz varia entre órgãos.
Uma importante limitação de apenas utilizando o gradiente de densidade e subsequente aderência ao plástico para a obtenção de células mesenquimais, que é a população resultante contém ambos os L-MSC e fibroblastos. Selecção de células CD146 + fortemente remédios este alerta, mas apesar da CD146 + procedimento de selecção e as condições cuidadosas de cultura, a natureza de L-MSC e os efeitos de cultura celular in vitro tornam impossível evitar algum grau de diferenciação em fibroblastos. MSCs em geral, têm sido relatados para conter uma hierarquia de multipotência, em que as células na parte inferior da hierarquia lentamente perdem o seu potencial de multilinhagens até que eles se tornam terminalmente diferenciadas fibroblastos <sup> 23. Em toda a probabilidade isto também ocorre no nicho L-MSC 4, e parece estar refletida no CD146 cultivadas + população como já uma passagem após CD146 + selecção cerca de 40% das células perderam expressão CD146. Além disso, nesta população, há apenas 80% de CD73 e CD90 40% de expressão. Em parte, isto pode ser explicado pelo MSC hierarquia de multipotência. Seria possível que a CD146 + sofrer proliferação assimétrica, dando origem a dois MSCs CD146 positivos e negativos, as células filhas, mais diferenciadas. MSCs residentes no pulmão, poderia também ser razoavelmente esperado para ter um fenótipo um pouco diferente e função de MSCs da medula óssea, em que a definição de CD73 e CD90 expressão foi baseado. A Sociedade Internacional de Terapia Celular reconheceu que nem todos os MSCs expressam os marcadores MSC clássicos, incluindo CD73 e CD90, e que a expressão de marcadores de superfície não é a melhor maneira de definir MSCs 32. o exceptionally alta eficiência CFU de ~ 70% da população CD146 + L-MSC suporta isso. Porque o CD146 + população tem melhor desempenho no que diz respeito às características MSC do que a população mesenquimais indiferenciados, os autores não têm caracterizado ainda mais a CD146 - população. Nós nos esforçamos para enriquecer nossa população mesenquimais com MSCs e esgotam-los de fibroblastos, mas não afirmam que este é o único verdadeiro população L-MSC. L-MSCs são susceptíveis muito heterogêneo, tanto na origem, fenótipo e função.
Embora CD146 é amplamente reconhecido como um marcador de multipotency em MSCs e pericitos 16,17,33,34, muito pouco se sabe sobre a população CD146 + MSC in vivo. CD146 é uma molécula de adesão celular que é importante para a angiogénese e função das células endoteliais, e é expresso em células endoteliais, células musculares lisas, pericitos, as MSCs e T-linfócitos 15,16,35,36. Nos últimos anos, Surgiram evidências de que MSCs habitam o nicho perivascular em vários órgãos, como CD146 + células co-mancha para MSC-marcadores CD73 e CD105 37. Na verdade, pericitos cultivados e MSCs têm um perfil de expressão gênica muito semelhante 38, reforçando a visão de que MSCs são derivados de pericitos 4,39. Embora não se tenha realizado análise imuno-histoquímica para determinar a localização da nossa população CD146 + L-MSC, é muito provável que eles também ser localizado numa localização perivascular. serão necessários futuros estudos para verificar se este é realmente o caso. É possível que um subconjunto de população de células a são pericitos, embora deva ser salientado que todas as células fenotipicamente olhar muito semelhante depois de CD146 + selecção.
células estromais mesenquimais são notoriamente difíceis de identificar devido à falta de um único marcador abrangente. Diversos estudos relataram métodos diferentes para o isolamentode L-MSC, e convincentemente demonstrado que estas populações celulares são semelhantes um ao outro no que diz respeito à expressão do marcador de MSC. Com base na caracterização do CD146 + L-MSC conforme apresentado aqui, a população CD146 + L-MSC é muito semelhante para populações de L-MSC anteriormente avaliado como obtidos por desdobramento ou várias formas de FACS, utilizando marcadores de superfície de células estaminais associados, tais como Sca -1, ABCG2 e CD90. Quando comparado com o crescimento de L-MSC 13, CD146 + L-MSC parecem ter uma maior capacidade de dar origem a colónias de células individuais, indicando que o nosso método produz uma população multipotentes G-MSC mais enriquecido. Esta vantagem também é verdadeiro quando comparado com os métodos que isolam G-MSC com base em CD90 ou 7 α do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) 40,41, ambos os marcadores de superfície como também seleccionar para mais lipofibroblasts terminalmente diferenciadas e alveolares / fibroblastos e estruturais portanto, só podem razoavelmente be identificadas como células estromais 20,42. Em contraste, tanto Sca-1 e ABCG2 estão bem documentados marcadores que se correlacionam com stemness e MSC expressão 9,43-46. ABCG2 + L-MSCs no entanto, ter uma natureza mais endotelial como eles são 99% positivo para CD31 46, enquanto que o método aqui relatado seleciona contra células endoteliais através do gradiente de Ficoll e aderência ao plástico. A principal vantagem do nosso método em comparação com o protocolo de isolamento Sca-1 com base de McQualter e colegas 5,8 é que ele é amplamente aplicável a outras espécies de ratos, em que murganhos Sca-1 não podem ser usados.
Embora seja muito desafiante, provavelmente quase impossível, para se obter uma população "puro" de L-MSCs a partir de um atraso de desenvolvimento ou adulto pulmão e mantê-lo num estado indiferenciado, o protocolo aqui apresentado proporciona um método rápido, consistente e fiável de a obtenção de uma população de células altamente enriquecida no res pulmonares auto-renovação multipotentesMSCs ident. Usando este método irá permitir um estudo mais definido do papel da L-MSCs em uma ampla variedade de modelos de doença e o seu papel no pulmão em desenvolvimento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use |
| Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | - | Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more. |
| Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C. |
| αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| 200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
| biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE |
| anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
| Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | - | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C |
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