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Biology

Aislamiento de CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Este protocolo describe una técnica de aislamiento para obtener células mesenquimales del estroma residentes de pulmón primarios de ratas, mediante el uso de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia de plástico y CD146 + selección de perlas magnéticas.

Abstract

las células estromales mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos por su potencial terapéutico en una amplia gama de enfermedades, incluyendo enfermedades pulmonares. Además del uso de la médula ósea y las MSC del cordón umbilical para la terapia celular exógena, hay también un creciente interés en la reparación y el potencial regenerativo de las MSC de tejido residentes. Por otra parte, que probablemente tienen un papel en el desarrollo normal de órganos, y se han atribuido funciones en la enfermedad, en particular aquellos con una naturaleza fibrótica. El obstáculo principal para el estudio de estos MSC de tejido residentes es la falta de un marcador claro para el aislamiento e identificación de estas células. La técnica de aislamiento descrito aquí se aplica múltiples características de las MSC residentes de pulmón (L-MSC). Después del sacrificio de las ratas, los pulmones se retiran y se enjuagan varias veces para eliminar la sangre. Tras la disociación mecánica por bisturí, los pulmones se digieren durante 2-3 hr usando una mezcla de colagenasa tipo I, proteasa neutra y el tipo de DNasa I. El obtainesuspensión de células individuales d se lava posteriormente y en capas sobre medio de gradiente de densidad (densidad 1,073 g / ml). Después de la centrifugación, las células de la interfase se lavaron y se sembraron en frascos de cultivo tratadas. Las células se cultivan durante 4-7 días en fisiológica 5% de O2, 5% de CO 2 condiciones. Para agotar los fibroblastos (CD146 -) y para asegurar una población de sólo la selección L-MSC (CD146 +), positivo para las células CD146 + se lleva a cabo a través de la selección de perlas magnéticas. En resumen, este procedimiento fiable produce una población de primaria L-MSC para su posterior estudio y manipulación in vitro. Debido a la naturaleza del protocolo, que puede ser fácilmente traducido a otros modelos animales experimentales.

Introduction

las células estromales mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos por su potencial terapéutico en una amplia gama de enfermedades, incluyendo enfermedades pulmonares. Además del uso de la médula ósea y las MSC del cordón umbilical para la terapia celular exógena, hay también un creciente interés en la reparación y el potencial regenerativo de las MSC de tejido residentes. Durante el desarrollo, incluyendo en el pulmón, el mesénquima es una importante fuente de señales de desarrollo, y las MSC residentes son un probable candidato para estar en el centro de esta. Por otra parte, la evidencia está emergiendo que las MSC residentes son perturbados en enfermedades de adultos, incluyendo el cáncer y la fibrosis 1,2 3. El obstáculo principal para el estudio de estos MSC de tejido residentes es la falta de un marcador claro para el aislamiento e identificación de estas células 4. Célula de vástago antígeno-1 (Sca-1) fue identificado en ratones como un marcador para una variedad de células madre de tejido, y se puede utilizar para el aislamiento de L-MSC 5, pero tiene por desgraciasin ortólogos conocido en otras especies 6. Los investigadores han informado una variedad de diferentes métodos de aislamiento para el aislamiento de L-MSC ya sea de tejido pulmonar o líquido. Estos varían de células activadas por fluorescencia métodos (FACS) basados ​​selección para CD31 - / CD45 - / CD90 + células 7, CD31 - / CD45 - / epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) - / Sca-1 + 8, resistencia a múltiples fármacos transportador ATP casete de unión a G (ABCG2) células positivas 9 o Hoechst 33342 flujo de salida de colorante 10, a la adherencia de plástico 11,12 y la migración de tejido picado 13.

Las ventajas del método presentado en este documento son varias veces. Mediante el uso de una digestión enzimática suave y gradiente de densidad 14, se obtiene todas las células de la gama de densidad que incluyen MSCs pero excluyen las células epiteliales o endoteliales. El paso de la adherencia de plástico posterior asegura que sólo el mesenchymal células se adhieran y se quedan en la cultura, la eliminación de los leucocitos. Sin embargo es más importante, la etapa de selección CD146 + permite la eliminación de los fibroblastos, ya que estas células no expresan CD146. La expresión de la molécula de adhesión celular CD146 se correlaciona positivamente con la multipotencia, y por lo tanto es un buen marcador para eliminar a los fibroblastos a partir de una población de células mesenquimales 15-19. Esto es una ventaja sobre el uso de CD90 como marcador de selección, ya que no sólo se expresa en las MSC, sino también en lipofibroblasts 5,20. En este protocolo se ha elegido de forma explícita una selección de perlas magnéticas, ya que es más suave en las células, y todo el procedimiento se puede realizar en condiciones estériles. Otra ventaja importante de este método de aislamiento en comparación con el método de derivación, es que es relativamente rápido, 6-10 días en contraposición a un mes o más para el método de extensión. De tres a cinco días después del aislamiento inicial y la población mesenquimales está listo para CD146 + sele cción; después de otros tres a cinco días las células CD146 + están listos para ser utilizados en los experimentos o se pueden congelar para su uso posterior. El tiempo de disminución de la cultura mejora la calidad de las células como MSCs transdifferentiate hacia fibroblastos en cultivo prolongado ex vivo 19. Por último, debido a la naturaleza del protocolo, es posible aplicar este método para otras especies simplemente eligiendo anticuerpos apropiados, o incluso a otros sistemas de órganos mediante el ajuste de la elección de las enzimas de fermentación y el tiempo de incubación.

Un protocolo detallado de este método de aislamiento se da a continuación, y una vista general esquemática del aislamiento y la posterior selección de la subpoblación CD146 + se proporciona en la Figura 1A y 1B, respectivamente. Además, se incluyen detalles de los pases, la congelación y descongelación estas células.

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Figura 1. Esquema general del aislamiento de las células pulmonares mesenquimales (A) y la posterior CD146 + selección de célula (B) min = minutos.; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; 2º Ab = anticuerpo secundario; a-CD146 Ab = anticuerpo anti-CD146 primaria; células negativas -ve células CD146 =; + ve células células CD146 positivas =. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa (animal protocolo de ética OHRI-1696). cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales.

1. Aislamiento de células mesenquimales de pulmón estromales

  1. Prepare la mezcla de enzimas en un tubo de 50 ml: se pesan en 30 U proteasa neutra, 2.500 U de colagenasa I y 500 U de DNasa I. Estas cantidades son suficientes para los pulmones de un ratón adulto o crías de rata. Preparar el día del aislamiento y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
  2. cachorros Sacrificio de rata en el día 13 mediante una inyección intra-peritoneal de pentobarbital de sodio (0,2 ml, 65 mg / ml). Utilice el pellizco reflejo del dedo del pie para establecer la inconsciencia. La muerte del animal se garantiza mediante la apertura del pecho, como se describe a continuación.
  3. Desinfectar la piel por pulverización al animal con 70% de etanol y abrir con cuidado la caja torácica utilizando tijeras quirúrgicas, a partir de la membrana y de corte hacia el lado rostral, siendo muy cuidado de nodañar los pulmones. Corre la caja torácica abierta usando pinzas hemostáticas, o alternativamente cortar la caja torácica para proporcionar acceso al tórax.
  4. Exsanguinate el animal mediante la eliminación del corazón. Para quitar el corazón, captar el timo y corazón con pequeñas pinzas y cortar éstos con tijeras quirúrgicas. Inmediatamente después, absorber la sangre con una gasa hasta que no sale sangre de la aorta y la arteria pulmonar cortada.
  5. Retire los pulmones desde el tórax de la siguiente manera: mantener la tráquea con pequeñas pinzas, a continuación, cortar la tráquea con tijeras quirúrgicas en la parte rostral. Mientras tira suavemente el paquete de pulmón fuera del tórax, cortar y retirar cualquier tejido conectivo en la cara dorsal a lo largo de la caja torácica para liberar a los pulmones.
  6. Sever los pulmones de la aorta y el esófago por el corte a lo largo del diafragma con tijeras quirúrgicas. Ahora que los pulmones están completamente libres de tórax eliminar la sangre restante suavemente con una gasa.
  7. Retire la tráquea y los bronquios con el surtijeras gicas y transferir cuidadosamente los lóbulos pulmonares a un tubo de 50 ml que contiene 35 ml de 30% de citrato-fosfato-dextrosa adenina (CPDA-1) anticoagulante fría (26.30 g de citrato trisódico dihidrato, 3,27 g de monohidrato de ácido ascórbico, 2,22 g de fosfato monosódico dihidrógeno, 31,80 g de D-glucosa, 0,275 g adenina en 1 L purificó H 2 O; filtro estéril de la solución utilizando un filtro de 0,22 micras membrana antes de su uso) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y los residuos.
  8. Después de un enjuague de 5 min en 30% CPDA-1 / PBS, transferir el pulmón a un nuevo tubo de 50 ml que contiene 35 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) (RT), invertir suavemente para eliminar el citrato. Transferir a un tubo que contiene 35 ml de PBS + de sodio-piruvato de Dulbecco + glucosa (DPBS ++) (RT). Cada etapa de aclarado debería tomar aproximadamente 5 minutos.
    Nota: DPBS ++ puede pedirse comercialmente o se hace de la siguiente manera 21: cloruro de calcio dihidrato 132,4 mg, cloruro de magnesio hexahidratado 100 mg, cloruro de potasio (anhidro) 200 mg, fosfato de potasio monobásico (anhidro) 200 mg, cloruro de sodio (anhidro) 8,000 mg, fosfato dibásico de sodio (anhidro) 1,144.5 mg, D-glucosa 1.000 mg, piruvato de sodio 36 mg en 1 L H purificada 2 O, pH 7,3. Filtro estéril la solución utilizando un filtro de 0,22 micras membrana antes de su uso.
  9. Disolver la mezcla de enzima por adición de 10 ml de DPBS ++ (pre-calentado a 37 ° C) y invirtiendo suavemente hasta que se disuelva.
  10. La transferencia de los pulmones a un nuevo tubo de 50 ml y picar el pulmón en la pared del tubo utilizando un bisturí hasta que quede finamente picado. Añadir la mezcla de enzimas en el tejido (10 ml de mezcla de enzima / por ratón adulto / crías de rata de pulmón), tape el tubo y se incuba a 38 ° C con agitación suave (ya sea en una mezcladora térmica, un baño de agua con agitación, o un agua baño con agitación manual y habitual). La duración depende del tipo de tejido: el tejido fetal 60 min, juvenil / adulto tejido 90 a 120 min, tejido adulto fibrótica 120-150 min.
  11. Detener la digestión mediante la quelación de los cationes bivalentes wITH 200 l de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Filtro estéril la solución utilizando un filtro de 0,22 micras membrana antes de su uso).
  12. Añadir suero de 20 ml 5% fetal bovino (FBS) / PBS y pasar toda la suspensión a través de 100 micras colador celular en un nuevo tubo de 50 ml. Enjuague el filtro de tubo y de células con 10 ml 5% de FBS / PBS, con lo que el volumen total a 40 ml.
  13. Centrifugar durante 5 min a 500 xg, RT.
  14. Eliminar el sobrenadante (pellet debe ser claramente visible), se vuelve a suspender en 40 ml de FBS al 5% / PBS y repetir el paso de centrifugación 1.13.
  15. Resuspender en 4 ml 5% de FBS / PBS (RT) y la capa cuidadosamente sobre 3 ml de medio de gradiente de densidad (1,073 g / cm 3) en un tubo de 15 ml 14. Para obtener una buena interfase, es crucial que las capas de la suspensión de células individuales se produce en un ángulo °> 45 a muy baja velocidad.
  16. Centrifugar 20 minutos a 900 xg, medio (5/10) de aceleración, no deceleración, 19 ° C.
  17. Recoger las células presentes en el enterphase y los resuspender en 10 ml de PBS estéril.
  18. Centrifugar durante 5 min a 500 xg, 21 ° C.
  19. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml pre-calentado medio completado cultura L-MSC (mínimo medio esencial Eagle, modificación alfa (aMEM), suplementado con 2 mmol L-glutamina por 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS y 1% de penicilina vol / vol / estreptomicina / anfotericina B.
  20. Repita el paso de centrifugación 1.18. Posteriormente, eliminar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de medio de cultivo fresco precalentado.
  21. Recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado y la placa a una densidad alta, ya que la mayoría de las células en esta etapa no son adherentes de plástico. La densidad de placas exacta depende de la especie animal y de la edad, por ejemplo, las células de un pulmón de ratón adulto se siembran a 10 5 células / cm 2, mientras que las células de un pulmón cría de rata son suficientemente densa a una densidad de siembra de 1-2 x 10 4 células / cm2 2.
  22. Cultura L-MSC humidificado en un 5% de O2, 5% de CO2 a 37 ° C.
  23. Cambie medio 24 horas después de la siembra inicial, y posteriormente cada 3 días después de enjuagar una vez con PBS. Las células deben ser cultivadas hasta 80-90% de confluencia, que toma 3-5 días en promedio en función del animal de origen. confluencia superior promoverá la diferenciación en los fibroblastos.

2. Selección de células CD146 + estromales mesenquimales de pulmón

  1. El recubrimiento de perlas magnéticas con el anticuerpo secundario
    1. Recubrir las perlas magnéticas con el anticuerpo secundario biotinilado, a razón de 10 mg perlas de anticuerpo secundario / 100 l magnéticos en un fondo redondo estériles de 2 ml criovial en condiciones estériles. Utilice 10 l de anticuerpo secundario por esperados células 0,5 x 10 6, y el uso de un mínimo de 100 l perlas magnéticas y 10 mg de anticuerpo.
      Nota: La relación de unaticuerpos utilizados por volumen de los granos pueden diferir entre fabricantes, por favor, consulte las instrucciones del fabricante para las perlas de elección. Para este protocolo, consulte la tabla 1 para los granos y los anticuerpos que se utilizaron en la optimización de este protocolo.
    2. Incubar en un mezclador giratorio de la muestra durante 30 min a 30 rotaciones / min (rpm), a temperatura ambiente.
    3. Resuspender las perlas en 1,5 ml estéril 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS y transferir a un tubo de 3 ml ronda inferior (citometría de flujo tubo). Enjuague el criovial con un 1,5 ml 0,1% adicional de BSA / PBS y transferir al tubo de 3 ml.
    4. Se coloca el tubo en un imán adecuado y esperar 2 min hasta que todas las cuentas están unidas a la pared trasera del tubo y la solución permanece clara. Retire la escorrentía y repetir el lavado con 3 ml de 0,1% de BSA / PBS dos veces.
    5. Volver a suspender las perlas en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz. Utilice el plazo de 5 días.
  2. Etiquetado CD146 + L-MSC
    1. Recoger las células mesenquimales después de enjuagar con PBS utilizando una solución no tripsina suave.
      Nota: Los volúmenes dependen del tamaño de frasco de cultivo (0,2 ml / cm 2 medio o PBS).
      1. Retire el medio de cultivo y enjuagar las células tres veces con PBS estéril.
      2. Añadir el volumen adecuado de solución no tripsina suave (ver Tabla 1). Incubar a 37 ° C en la incubadora hasta que las células han individual, de aproximadamente 10 min cuando se utiliza la solución en la Tabla 1.
      3. Inactivar la enzima mediante la adición de medio de cultivo L-MSC, y centrifugar durante 5 min a 500 x g.
    2. Extraer el sobrenadante, Resuspender las células en 0,1% de BSA / PBS y contar las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
      Nota: El volumen de 0,1% de BSA / PBS depende del tamaño de frasco de cultivo: objetivo de 5 o 10 ml 0,1% de BSA / PBS.
    3. Repita el paso 2.2.2 y volver a suspender la cantidad dedicada de células en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS (bloques de la ONUsitios de unión específicos y mantiene las células vivas). Mantener las células en hielo.
    4. Preparar un tubo redondo de 3 ml de fondo con el anticuerpo anti-CD146 primaria, y mantener en hielo.
      Nota: La concentración de anticuerpo primario que se añade a la cantidad dedicado de las células depende de que el anticuerpo que se utiliza. Para un anticuerpo CD146 anti-rata sugerido véase la Tabla 1.
    5. Añadir el volumen total de las células de la etapa 2.2.3 al tubo con el anticuerpo primario. Cerrar herméticamente y se incuba 30 min en un mezclador muestra que gira a 15 rpm, 4 ° C.
    6. Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 xg, 4 ° C, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml 0,1% de BSA / PBS. Repita el paso de centrifugación.
    7. Resuspender las células en la solución de 3 ml que contenía perlas recubiertas de anticuerpo secundario que se preparó de acuerdo con las instrucciones en la sección 2.1 y se incuba 30 min en un mezclador muestra que gira a 15 rpm, 4 ° C.
  3. Selección de CD146 + L-MSC
    1. Se coloca el tubo que contiene la etiqueta CD146 + L-MSC en el imán. Las células positivas serán atraídos a la parte posterior del tubo. Sin mover el tubo o tocar las perlas, recoger el sobrenadante con las células negativas lentamente con una pipeta Pasteur estéril (estos pueden ser o bien recogidas o descartados basado en el diseño experimental).
    2. Retire el tubo del imán y resuspender las células en 3 ml de 10% de BSA / PBS. Repetir el procedimiento de selección descrito en el paso 2.3.1. cuatro veces más (pasos 5 Σ selección).
    3. Resuspender el CD146 + L-MSC en medio de cultivo pre-calentado L-MSC y volver al imán.
    4. Extraer el sobrenadante, resuspender en medio de cultivo L-MSC y la placa en un matraz de cultivo de tamaño apropiado (0,2 ml / cm 2). Como regla general, las células de la placa en el mismo frasco de cultivo de tamaño de la que se eliminaron las células antes de talón de selección. El número de CD146 + L-MSC, y por lo tanto la densidad de placas, sedependerá de la edad, la especie y la cepa del animal fuente. Siempre apuntar a una densidad de placas de ~ 5000 células / cm 2.
      Nota: Las cuentas no perturbar el crecimiento celular y desaparecerán gradualmente a medida que las células proliferan.

3. Las células de congelación

  1. Use los siguientes medios de congelación: solución pentastarch 60% (10% pentastarch en 0,9% NaCl), 20% de FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) 22.
    Nota: Si no todos los ingredientes están disponibles, una solución que contiene 5% de DMSO, 30% de FBS y 65% ​​aMEM es una buena alternativa.
  2. Resuspender las células en 0.5 x 10 6 células / ml, alícuotas en crioviales de 1 ml cada una y se congelan O / N a -80 ° C usando un recipiente de congelación.
  3. Transferir a un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido al día siguiente.

4. Las células de descongelación

  1. Descongelar un vial de células en un baño de agua a 37 ° durante 5 min.
  2. Resuspender las células en 10 mlmedio de cultivo pre-calentado y centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, 21 ° C.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo 10 ml. Sembrar las células en un cultivo celular tapa ventilada tratados matraces a 5.000 células / cm 2 en 0,2 ml de medio / cm2 (por ejemplo, 15 ml para un matraz de 75 cm2).
  4. Células de cultivo en 5% de O 2, 5% de CO 2 hasta 80-90% de confluencia para la recolección y / o el uso experimental. El exceso de confluencia inducirá la diferenciación. Cuando la siembra a 5.000 células / cm 2, L-MSC llegará a 80-90% de confluencia dentro de 3-4 días de cultivo.

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Representative Results

Dos de las características físicas más fiables de las MSC, la densidad y la adhesión de plástico, se utilizan en la primera parte de este protocolo para obtener la fracción de células mesenquimales del pulmón que contiene L-MSC. Aunque la interfase gradiente de densidad incluirá monocitos y macrófagos, además de las células mesenquimales de pulmón, la adherencia de plástico seguido de 3-5 días de cultivo se asegura de que sólo las células mesenquimales de pulmón permanecen. De hecho esta población celular expresa los clásicos marcadores de superficie CD73 MSC, CD90 y CD146 y es negativa para los marcadores CD34, CD45, complejo mayor de histocompatibilidad tipo II (MHCII) -RT1B, CD11b y CD79a, lo que indica que ya no hay ningún leucocitos presentes en la población de células (Figura 2A). De interés es que de el subconjunto CD146 +, una gama de 44,4 a 65,7% es también CD73 + y CD90 + (datos no presentados). Además, esta población celular es capaz de unaunidad de formación de la eficiencia (CFU) colonia que en ~ 30% es mucho más alta de lo que generalmente informó para las MSC de médula ósea o incluso otros tipos de MSC (Figura 2B), y diferencia a lo largo de los tres linajes de MSC clásicos (Figura 2C).

Figura 2
Figura 2. Características de MSC después de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad y la adherencia de plástico. (A) Expresión de marcadores de superficie relacionados con el MSC CD146, CD73 y CD90 está presente en parte de la población de células adherentes de plástico, mientras que los marcadores de leucocitos CD11b negativos, CD79a , CD34, CD45 y MHCII-RT1B fueron prácticamente no expresaron. (B) de formación de colonias de ensayo a través de la unidad de ensayo de dilución limitante (5 células / cm 2) indicó que ~ 30% de células adherentes de plástico tenía una capacidad clonal, indicativo de MSCs. Ce adherente (C) PlásticoLLS eran capaces de la producción de matriz osteogénico (rojo), contenía un mayor número de pequeñas vesículas lipídicas (rojo) cuando se induce con medio de diferenciación adipogénica en comparación con los controles no diferenciadas y condrogénica como esferas que contienen condrocitos (rojo) formado. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Todos los datos fueron generados con células paso 1-3. NM = marcadores negativos; UFC = unidades formadoras de colonia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sin embargo, la advertencia principal es que esta población que contiene tanto L-MSC y diferentes subtipos de fibroblastos de pulmón, la L-MSC progenie 23 diferenciadas. Desde multipotencia se correlacionó positivamente con la expresión de CD146, y fibroblastos debe tener ninguna expresión de este marcador, la selección positiva de la CD146 + subpoblación ostensibly dado lugar a una población de células que está altamente enriquecida en L-MSC. Esto se demuestra claramente por un mayor porcentaje de la población celular que expresa MSC asociado marcadores de superficie (figura 3A), una considerablemente mayor potencial de formación de colonias de ~ 80% (Figura 3B) y una respuesta de diferenciación más fuerte en todo el linaje condrogénico (Figura 3C) en comparación con la población mesenquimales total que se obtiene antes de la selección CD146. Cabe destacar que estos formen L-MSC solamente muy pocos adipocitos verdaderos, pero muestran muchas más células en forma de huso que están llenos de pequeñas vesículas lipídicas. Estos podrían reflejar el linaje lipofibroblast que es crucial tanto para el desarrollo de los pulmones y el apoyo de células alveolares de tipo II. Después de la selección CD146, más adipocito como las células llenas de grandes vesículas lipídicas se puede observar (Figura 3C) en comparación con antes de la selección CD146, sin embargo, la mayoría de las células siguen siendo los ce-como lipofibroblastsLLS contienen pequeñas vesículas lipídicas.

figura 3
Figura 3. Características de MSC después de + selección perla magnética adicional CD146. Después de la selección positiva de la subpoblación CD146 +, estas células mostraron una mayor expresión de marcadores de superficie relacionados con el MSC, CD73, en particular, (A), una considerablemente mayor eficiencia CFU después sola célula chapado (B), y una respuesta más fuerte para la diferenciación particularmente el linaje condrogénico y en menor medida el linaje adipogénico (C). Los datos se presentan como media ± SEM. Todos los datos se generaron con 3 células de paso. NM = marcadores negativos; UFC = unidades formadoras de colonia. Por favor, haga clic aquí to ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El aislamiento y cultivo de primaria L-MSC presenta una oportunidad para comprender mejor su función y su interacción con otras poblaciones celulares a nivel celular, y su papel en el desarrollo del pulmón, la salud y la enfermedad. Esto es especialmente importante ya que la falta de un marcador individual específico de estas células hace que sea casi imposible el estudio de estas células in situ. Al igual que con todas las poblaciones de células primarias, se debe tener en cuenta que estas células son más propensos a cambiar su carácter cuanto más tiempo se mantienen en cultivo 19 (revisado en 24). Para mantener L-MSC en un estado que es lo más cercano posible a su estado natural, es muy importante que se cultivan en 5% O 2, 5% de CO 2, en un incubador humidificado 37 ° C. En la fisiología respiratoria en general se acepta que en base a la ley de las presiones parciales de Dalton, la presión parcial de oxígeno del aire ambiente (21% O 2) es de 160 mmHg, y cae a ~ 101 mm de Hg en el espacio aéreo alveolar 25-27. En un pulmón madura la PaO 2 gradiente alveolo-arterial es ~ 3-4 mm Hg, pero esto puede aumentar significativamente en un pulmón enfermo o inmaduro, donde la distancia alveoloarterial se incrementó 25,28. En el interior del cuerpo, el nicho mesenquimales está expuesto normalmente a una concentración de oxígeno del 2-8% 29,30. Sólo unos pocos papeles en realidad han medido la PO 2 en los pulmones, pero un estudio mide esto en los pulmones de los 20 pacientes, la búsqueda de un rango en el pulmón normal PO 2 de 23 a 656 mmHg, con una mediana de 42,8 mmHg 27,31. De acuerdo con la ley de Dalton, un incubador humidificado con una temperatura de 37 ° C y 5% de O2 tiene una pO2 de ~ 36 mm Hg, que cae perfectamente dentro del rango medido en el tejido pulmonar normal y está muy cerca de la mediana. Además, las condiciones de cultivo bajo oxígeno promueven el mantenimiento de poblaciones progenitoras en la cultura 29. Tomados en conjunto, que iEs difícil decir exactamente lo que la concentración de oxígeno L-MSC están expuestos a in situ en diferentes etapas durante el desarrollo postnatal normal o enfermedad, pero parece que el 5-10% de O 2 es probablemente el más certero desde el punto de vista fisiológico 27,31. Sobre la base de la información antes citada, se optó por mantener el 5% de O2 en nuestras condiciones de cultivo, y se encontró que cuando estas condiciones se mantienen in vitro, la L-MSC crecerá más rápido, mostrar un menor número de fibras de estrés, y tienen una probabilidad menor de diferenciación espontánea o la senescencia. Los factores adicionales que impidan diferenciación espontánea u otras anomalías es mediante el uso de un agente de disociación no tripsina suave para pases, pases L-MSCs cuando alcanzan 80-90% de confluencia (condiciones densos promoverán la diferenciación de fibroblastos), y mantener el número de pase bajo (<P4). En un estudio realizado por Hoffmann y sus colegas, la tripsina fue demostrado tener efectos adversos sobre la función L-MSC yfenotipo, mientras que los agentes de disociación libre de tripsina podría preservar este 13.

Para optimizar el rendimiento durante el proceso de aislamiento, es importante para picar los pulmones lo más finamente posible, teniendo en cuenta que el tejido no se debe permitir que se seque. Durante la digestión enzimática, es importante que los tubos se agitan con frecuencia si no se utiliza un dispositivo de agitación con calefacción, como las piezas de tejido se sedimentar y no obtener una exposición óptima para las enzimas. Otro paso crucial es la separación en gradiente de densidad: si la estratificación no se realiza muy lentamente o en un ángulo <45 °, que dará lugar a la mezcla de los dos líquidos en lugar de capas, causando la pérdida de toda la población celular. Por otra parte, la densidad del medio de gradiente de densidad es muy dependiente de la temperatura circundante. Cualquier otra temperatura de 19 ° C (o RT), dará lugar a la separación en gradiente de densidad subóptima o no.

De interés para fUTURO usuarios de este protocolo es que hemos aislado con éxito viable L-MSC de los pulmones que fueron cosechados hasta 24 horas antes del aislamiento, siempre que los pulmones se almacenan directamente en los medios de comunicación L-MSC fría después de la cosecha, y se mantiene a 4 DO. Esto permite la planificación experimental más flexible, o incluso el envío de los pulmones entre los diferentes laboratorios. El rendimiento es generalmente similar a la de los pulmones recién cosechadas, y las células crecen igualmente bien.

Otra modificación que sería posible, es el uso de FACS en lugar de selección de perlas magnéticas, a pesar de que este método somete a las células a más estrés como el procedimiento toma más tiempo y como las células se someten a altas presiones y velocidades, y alberga el riesgo de contaminación si no se realiza en condiciones estériles. Las perlas magnéticas usadas aquí no interfieren con el crecimiento celular, y desaparecen en unos pocos días de cultivo. Una preferencia por FACS o selección de perlas magnéticas también puede depender de las instalaciones disponiblespara el usuario final. Además, sería posible modificar este protocolo para aislar MSC residentes de otros tejidos. En este caso, sería importante adaptar las enzimas para el órgano de interés, como la composición de la matriz varía entre órganos.

Una limitación importante de sólo utilizar el gradiente de densidad y la posterior adherencia de plástico para la obtención de células mesenquimales, es que la población resultante contiene ambos L-MSC y fibroblastos. Seleccionando las células CD146 + fuertemente remedios esta advertencia, pero a pesar de la CD146 + procedimiento de selección y las condiciones de cultivo cuidadosas, la naturaleza de L-MSC y los efectos de cultivo celular in vitro que sea imposible evitar un cierto grado de diferenciación en fibroblastos. MSCs en general se han reportado para contener una jerarquía de multipotencia, en el que las células más abajo en la jerarquía lentamente pierden su potencial multilinaje hasta que se convierten fibroblastos terminalmente diferenciadas <sup> 23. Lo más probable es que esto también ocurre en el nicho de L-MSC 4, y parece reflejarse en el CD146 + cultivadas población ya un paso después de la selección CD146 + aproximadamente el 40% de las células han perdido la expresión de CD146. Además, en esta población sólo hay 80% CD73 y 40% de expresión CD90. En parte, esto puede ser explicado por la jerarquía de MSC multipotencia. Sería posible que CD146 + se someten a la proliferación asimétrico, dando lugar a los dos MSCs positivos CD146 y células hijas, negativos, más diferenciadas. También podría razonablemente esperar que las MSC residentes del pulmón a tener un fenotipo algo diferente y la función de las MSC de médula ósea, en la que se basa la definición de la expresión de CD73 y CD90. La Sociedad Internacional de Terapia Celular ha reconocido que no todas las MSC expresan los marcadores clásicos de MSC, incluyendo CD73 y CD90, y que la expresión de marcadores de superficie no es la mejor manera de definir las MSC 32. el correoxceptionally alta eficiencia CFU de ~ 70% de la población CD146 + L-MSC apoya esta. Debido a que el CD146 + población tiene un mejor rendimiento con respecto a las características de MSC que la población mesenquimales sin clasificar, los autores no han caracterizado además el CD146 - población. Nos esforzamos para enriquecer nuestra población mesenquimales con MSC y agotar los de los fibroblastos, pero no pretendemos que esta es la única población real L-MSC. L-MSC probabilidades son muy heterogéneos, tanto en su origen, fenotipo y función.

Aunque CD146 es ampliamente reconocido como un marcador de la multipotencia en las MSC y pericitos 16,17,33,34, se sabe muy poco acerca de la población CD146 + MSC in vivo. CD146 es una molécula de adhesión celular que es importante para la angiogénesis y la función de las células endoteliales, y se expresa en células endoteliales, células del músculo liso, pericitos, MSCs y T-linfocitos 15,16,35,36. En los últimos años, Han surgido pruebas de que las MSC habitan en el nicho perivascular en múltiples órganos, como las células CD146 + co-tinción de MSC-marcadores CD73 y CD105 37. De hecho, los pericitos cultivadas y las MSC tienen un perfil de expresión de genes muy similares 38, el fortalecimiento de la opinión de que las MSC se derivan de los pericitos 4,39. Aunque no hemos realizado análisis inmunohistoquímicos para determinar la ubicación de nuestra población CD146 + L-MSC, es muy probable que también se encuentra en una zona perivascular. Se necesitan más estudios para verificar si este es realmente el caso. Es posible que un subconjunto de la población de células son los pericitos, aunque debe señalarse que todas las células se ven fenotípicamente muy similar después de la selección CD146 +.

Las células estromales mesenquimales son notoriamente difíciles de identificar debido a la falta de un único marcador que lo abarca todo. Varios estudios han informado de diferentes métodos para el aislamientode L-MSC, y han demostrado convincentemente que estas poblaciones de células son similares entre sí con respecto a la expresión del marcador MSC. Sobre la base de la caracterización de la CD146 + L-MSC como se presenta aquí, la población CD146 + L-MSC es muy similar a las poblaciones L-MSC previamente reportados como logra por excrecencia o diversas formas de FACS utilizando marcadores de superficie de células madre asociadas tales como Sca -1, ABCG2 y CD90. Cuando se compara con excrecencia L-MSC 13, CD146 + L-MSC parecen tener una mayor capacidad para dar lugar a colonias de células individuales, lo que indica que nuestro método produce una población más enriquecido multipotentes L-MSC. Esta ventaja también es cierto cuando se compara con los métodos que aíslan L-MSC sobre la base de CD90 7 o α del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) 40,41, ya que ambos marcadores de superficie también seleccionan para más lipofibroblasts terminales diferenciadas y alveolares / fibroblastos y estructurales por tanto, sólo puede razonablemente be identificado como células estromales 20,42. En contraste, tanto Sca-1 y ABCG2 son bien marcadores que se correlacionan con la expresión stemness y MSC 9,43-46 documentado. ABCG2 + L-MSC sin embargo, tienen una naturaleza más endotelial, ya que son el 99% positivas para CD31 46, mientras que el método presentado aquí selecciona contra las células endoteliales a través del gradiente de Ficoll y la adhesión de plástico. La principal ventaja de este método en comparación con el protocolo de aislamiento Sca-1 basado de McQualter y colegas 5,8 es que es ampliamente aplicable a otras especies distintas de ratones, en los que Sca-1 no se puede utilizar.

A pesar de que es muy difícil, probablemente casi imposible, para obtener una población "puro" de L-MSC de un desarrollo o adulto finales de pulmón y mantenerla en un estado indiferenciado, el protocolo presentado aquí proporciona un método rápido, consistente y fiable de la obtención de una población de células altamente enriquecido en res pulmonares auto-renovación multipotentesMSC Nº ref. Usando este método permitirá un estudio más definido del papel de la L-MSC en una amplia variedad de modelos de enfermedad y su papel en el pulmón en desarrollo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

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Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

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