Summary
이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.
Abstract
중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 또한, 그들은 가능성이 정상 장기 발전에 역할을, 질병의 역할, 섬유 성 자연과 특히 때문이라고했다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물은 이러한 세포의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 여기에 설명 된 분리 기술은 폐 상주 중간 엽 줄기 세포 (L-중간 엽 줄기 세포)의 여러 특성을 적용합니다. 쥐의 희생에, 폐를 제거하고 혈액을 제거하기 위해 여러 번 세척한다. 메스에 의한 기계적 해리 후에, 폐 콜라겐 타입 I, 중성 프로테아제 및 DNase의 유형 I. obtaine의 혼합을 사용하여 2-3 시간 동안 소화D는 단일 세포 현탁액을 연속적으로 세척하고, 밀도 구배 배지 (밀도 1.073 g / ㎖) 위에 적층된다. 원심 분리 후, 계면에서 세포를 세척 및 문화 처리 된 플라스크에 도금. 세포는 생리 5 % O 2 4 내지도 7 일간 5 % CO 2 조건에서 배양했다. 섬유 아 세포 (CD146을 -) 고갈 및 CD146 + 세포 만 L-중간 엽 줄기 세포 (CD146 +), 긍정적 인 선택의 인구를 보장하기 위해 자기 비드 선택을 통해 수행된다. 요약하면,이 절차는 확실하게 더 시험관 연구와 조작을위한 기본 L-중간 엽 줄기 세포의 인구를 생성합니다. 때문에 프로토콜의 특성 때문에 용이하게 다른 실험 동물 모델로 변환 할 수있다.
Introduction
중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 개발하는 동안, 폐 비롯한 중간 엽 발달 큐의 중요한 원천이며, 거주자 엽 줄기 세포는이 중심에있을 가능성의 후보이다. 또한, 증거는 상주 중간 엽 줄기 세포가 암 1, 2, 3 섬유증을 포함한 성인병에 교란되는 부상하고있다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물이 셀 (4)의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 줄기 세포 항원 1 SCA (1)의 조직 줄기 세포의 다양한 마커로서 마우스에서 확인하고, L-5 엽 줄기 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 불행하게도 갖는다다른 종 6 orthologs은 알려진 바 없음. 연구팀은 폐 조직 또는 유체 중 하나에서 L-중간 엽 줄기 세포의 분리를위한 다른 분리 다양한 방법을보고했다. / CD45 - - / CD90 + 세포 (7), CD31 - / CD45 - / 상피 세포 부착 분자 (는 EpCAM) -이 CD31에 대한 선택 (FACS) 기반 방법 정렬 형광 활성화 세포 다를 / 무서-1 + 세포 8 약제 내성 트랜스 다진 조직 (13) 중 플라스틱 부착 11, 12 및 마이그레이션에 ATP 바인딩 카세트 G (ABCG2) 양성 세포 9 훽스트 33342 염료 유출 10.
본원에 제시된 방법의 장점은 여러 배이다. 부드러운 효소 소화와 밀도 구배 (14)를 사용함으로써, 하나의 중간 엽 줄기 세포를 포함하지만, 상피 세포 또는 내피 세포를 제외 밀도 범위의 모든 세포를 얻는다. 후속 플라스틱 접착 공정 만 mesench 보장ymal 세포는 백혈구를 제거, 준수 문화를 유지. 이들 세포는 CD146을 발현하지 않는 가장 중요하지만, CD146 + 선택 단계는 섬유 아세포의 제거를 허용한다. 세포 부착 분자 CD146의 발현 양 능성과 상관되고, 중간 엽 세포 집단 15-19에서 섬유 아세포를 걸러 좋은 마커 따라서이다. 그것만 엽 줄기 세포뿐만 아니라 lipofibroblasts 5,20에서 발현되지 않기 때문에 이는 선별 마커로서 CD90을 사용 위에 이점이다. 이 세포에 완만으로이 프로토콜에서 우리는 명시 적으로, 자기 비드 선택을 선택했으며, 전체 절차는 무균 상태에서 수행 할 수 있습니다. 가지 방법과 반대로,이 분리 방법의 다른 중요한 이점은 가지 방법에 대해 개월 이상의 대향로 6-10 일 비교적 빠른 점이다. 3 ~ 5 일 초기 격리 후 중간 엽 인구는 CD146 + 실리 준비가 ction; 다른 3-5일 후 CD146 + 세포는 실험에 사용될 준비가 이후 사용을 위해 고정 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 장기간의 체외 배양 (19)의 섬유 아세포으로 transdifferentiate로 문화의 감소 시간은 세포의 품질을 향상시킵니다. 마지막으로 인해 프로토콜의 특성으로 인해 소화 효소와 인큐베이션 시간의 선택을 조정함으로써, 다른 기관계를 단순히 적절한 항체를 선택하는, 또는에 의해 다른 종에이 방법을 적용하는 것이 가능하다.
이 분리 방법의 상세한 프로토콜은 아래와되고, 분리 및 CD146 + 아군 후속 선택의 개략도는 각각도 1a 및 1b에 제공된다. 또한, 세부 사항은이 세포를 냉동과 해동, 계대 포함되어 있습니다.
광고 / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
. 폐 중간 엽 세포 (A) 및 후속 CD146 + 세포 선택 (B) 분 = 분 격리 그림 1. 개요도; EDTA = 에틸렌 디아민 테트라 아세트산; 2 차 순이 = 차 항체; α-CD146 순이 = 차 항 CD146 항체; - 제가 세포 = CD146 부정적인 세포; + 세포 = CD146 양성 세포를했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차는 오타와 대학의 동물 관리위원회 (동물 윤리 프로토콜 OHRI-1696)에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다.
폐 중간 엽 기질 세포의 분리 (1)
- 50 ML 튜브에 효소 믹스를 준비 : 30 U 중립 프로테아제에 무게, 2,500 U 콜라게나 I 500 U DNase의 I.이 금액은 성인 마우스 또는 쥐 강아지의 폐 충분. 사용까지 4 ° C에서 분리 및 저장의 날 준비합니다.
- 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사 하루에 13에서 희생 쥐 새끼 (0.2 ㎖의 65 ㎎ / ㎖). 무의식을 설정 발가락 핀치 반사를 사용합니다. 아래에 설명 된대로 동물의 죽음은, 가슴을 열어 보장된다.
- 아주 조심하지되고, 70 % 에탄올로 동물을 분사하여 피부를 소독 조심스럽게 다이어프램에서 시작 주동이의 측면으로 절단 수술 가위를 사용하여 흉곽을 열폐를 손상시킬 수 있습니다. 가슴에 대한 액세스를 제공하기 위해 흉곽을 절단 대안 지혈 클램프를 사용하여 열려있는 흉곽 확산, 또는.
- 마음을 제거하여 동물에게서 피를 뽑다. 마음을 제거하려면, 작은 집게로 흉선과 마음을 잡고 수술 가위이를 절단. 더 이상 혈액이 절단 된 대동맥과 폐동맥 나오는 않을 때까지 즉시 그 후, 거즈로 피를 흡수한다.
- 다음과 같이 흉부에서 폐를 제거 : 작은 집게로 기관을 보유하고 주동이의 측면에서 수술 가위로 기관을 절단. 부드럽게 가슴에서 폐 패키지를 당기면서, 폐를 무료로 흉곽을 따라 지느러미 측면에있는 결합 조직을 절단.
- 수술 가위로 다이어프램을 따라 절단하여 대동맥과 식도에서 폐를 절단. 이제 폐가 완전히 가슴이없는 것을 거즈로 부드럽게 남아있는 혈액을 제거합니다.
- 쉬르와 기관 및 기관지를 제거학적 위 신중 차가운 35 mL의 30 % 시트르산 - 인산 - 덱 스트로스 아데닌 (CPDA-1) 항응고제를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 폐 로브 트랜스퍼 (26.30 g 트리 나트륨 시트 레이트 이수화 물, 3.27 g 아스코르브 산 수화물 2.22 g 모노 나트륨 디 히드로 겐 포스페이트, 31.80 g의 D- 글루코오스는, 1 L의 0.275 g 아데닌은 H 2 O를 정제하여, 멸균 필터 혈액과 이물질을 제거하기 위해 인산 완충 식염수 (PBS)에 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터)를 사용하여 용액.
- 30 % CPDA-1 / PBS에서 5 분간 세정 한 후, 35 mL의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) (RT)를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에 폐를 전송하고, 시트르산을 제거 부드럽게 반전. 포함하는 튜브로 전송 35 ml를 둘 베코의 PBS + 나트륨 - 피루브산 + 포도당 (DPBS ++) (RT). 각 세척 단계는 약 5 분 소요됩니다.
주 : 염화칼슘 이수화 132.4 ㎎, 염화 마그네슘 수화물 100 ㎎, 염화칼륨 (무수) 200m : DPBS ++ 상업적으로 정렬 또는 구성 될 수있는 21 이하g, 1 인산 칼륨 (무수물) 200 ㎎, 염화나트륨 (무수) 8000 ㎎, 인산 나트륨 (무수) 1,144.5 ㎎, D- 글루코스 1,000 ㎎, 피루브산 나트륨 36 mg을 1 L 정제 H 2 O, pH가 7.3. 멸균 필터를 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 용액. - (37 ° C로 미리 예열) ++의 DPBS 10 ㎖를 첨가하고 용해 될 때까지 조심스럽게 반전 효소 믹스를 녹인다.
- 새로운 50 ㎖ 튜브에 폐를 전송하고 잘게 다진까지 메스를 사용하여 튜브의 벽에 폐 들어온다. 조직에 (10 ㎖ 성인 마우스 / 쥐 강아지 폐 당 효소 믹스 /) 효소 믹스를 추가 단단히 튜브를 닫고 (교반과 함께 38 ° C에서 부화 중 하나를 열 믹서, 진탕 수조 또는 물에 일반 수동 교반 조). 태아 조직 60 분, 청소년 / 성인 조직 90-120 분, 섬유 성 성인 조직 120-150 분 : 기간은 조직의 유형에 따라 달라집니다.
- 가의 양이온 w 킬레이트하여 소화를 중지i 번째 200 μL 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 0.15 M, pH가 7.4. 멸균 필터를 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 용액).
- 20 mL의 5 % 소 태아 혈청 (FBS) / PBS를 첨가하고 50 ㎖의 새로운 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전체 현탁액을 통과한다. 40 ml의 총 부피를 데리고, 10 ml의 5 % FBS / PBS로 튜브와 셀 스트레이너를 씻어.
- 500 XG, 실온에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 40 ml의 5 % FBS / PBS에 재현 탁 (펠렛 명확하게 볼 수 있어야합니다) 상층 액을 제거하고 원심 분리 단계 1.13를 반복합니다.
- 4 ml의 5 % FBS에 재현 탁 / PBS (RT) 위에 조심스럽게 3 ㎖ 밀도 구배 매체 층 (1.073 g / cm 3) 15 ㎖의 튜브 14. 양호한 계면을 얻기 위해서는, 단일 세포 현탁액의 계층화는 매우 낮은 속도에서> 45 ° 각도에서 발생하는 것이 중요하다.
- 900 XG에 원심 분리기 20 분, 중간 (5/10) 가속, 감속 없음, 19 ° C.
- 의에 존재하는 세포를 수집terphase 및 멸균 PBS 10 ㎖에이를 재현 탁.
- 500 XG에 5 분, 21 ° C에 대한 원심 분리기.
- 500ml의 αMEM, 20 % 부피 / 부피 FBS 당 2 밀리몰의 L 글루타민, 상청액을 제거하고 10 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁 예열 완료 L-MSC 배지 (최소 필수 매체 이글 알파 변경 (αMEM) 1 % 부피 / 부피 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 B.
- 반복 원심 분리 단계 1.18. 그 후, 미리 예열 신선한 배지 10ml에 뜨는 및에 resuspend를 제거합니다.
- 이 단계에서 세포의 대부분은, 플라스틱 접착하지 않기 때문에, 고밀도 또는 자동 혈구 세포 카운터 플레이트를 이용하여 세포 수를 계산. 래트 새끼 폐에서 세포가 1-2의 접종 밀도로 충분히 조밀 한 반면 정확한 도금 밀도는 X, 예를 들면, 성인 마우스의 폐의 세포를 105 세포 / cm 2의 시딩 동물의 종 및 나이에 따라 104 세포 / ㎠ 2를 사용합니다.
- 배양 L-MSC들 가습 5 % O 2, 5 % CO 2 분위기에서 37 ℃.
- PBS로 한번 세척 한 후 중간 초기 시딩 후 24 시간, 그 후 매 3 일마다 변경합니다. 세포 기원의 동물에 따라 평균 3-5 일이 소요 80-90% 합류, 때까지 배양해야한다. 높은 합류는 섬유 아세포로 분화를 촉진 할 것이다.
CD146 + 폐 중간 엽 기질 세포의 2. 선택
- 이차 항체와 자석 구슬의 코팅
- 멸균 조건 cryovial 코트 환저 10 μg의 차 항체 / 100 μl의 자성 비드의 비율 비오틴 이차 항체와 자성 비드, 2 ㎖의 멸균. 예상 0.5 × 10 6 세포 당 10 μl의 차 항체를 사용하여 100 ㎕의 자기 구슬과 10 μg의 항체의 최소 사용합니다.
주 : 비율을제조 업체 사이에 다를 수 있습니다 구슬의 볼륨 당 사용 tibodies는 선택의 구슬에 대한 제조업체의 지침을 참조하십시오. 이 프로토콜은이 프로토콜의 최적화에 사용 된 구슬과 항체 표 1을 참조하시기 바랍니다. - RT / 분 (30)의 회전 수 (rpm)에서 30 분 동안 샘플을 회전 혼합기에서 인큐베이션.
- 1.5 ㎖의 멸균 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 비드를 재현 탁 / PBS 및 3 ㎖에 전송 둥근 바닥 튜브 (튜브 유동 세포 계측법). 추가로 1.5 ml의 0.1 % BSA / PBS로 cryovial을 씻어 3 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 해당 자석에 튜브를 삽입하고 모든 비드가 튜브의 후 방벽에 부착되고, 투명한 용액이 유지 될 때까지 2 분을 기다린다. 3 ml의 0.1 % BSA / PBS 두 번에 유출 반복 세척을 제거합니다.
- 빛으로부터 보호 4 ° C에서 3 ml의 0.1 % BSA / PBS에있는 구슬과 저장소를 재현 탁. 후 5 일 이내에 사용하십시오.
- 멸균 조건 cryovial 코트 환저 10 μg의 차 항체 / 100 μl의 자성 비드의 비율 비오틴 이차 항체와 자성 비드, 2 ㎖의 멸균. 예상 0.5 × 10 6 세포 당 10 μl의 차 항체를 사용하여 100 ㎕의 자기 구슬과 10 μg의 항체의 최소 사용합니다.
- CD146 + L-중간 엽 줄기 세포를 표지
- 부드러운 비 트립신 용액을 사용하여 PBS로 세정 후, 중간 엽 세포를 수확.
참고 : 볼륨은 문화 플라스크의 크기 (0.2 ㎖ / cm 2 중간 또는 PBS)에 따라 달라집니다.- 배지를 제거하고 멸균 PBS로 세포를 세 번 씻어.
- 부드러운 비 트립신 용액의 적절한 용적을 추가 (표 1 참조). 세포가 분리 될 때까지 표 1의 용액을 사용하는 경우 대략 배양기에서 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 500 x g에서 5 분 동안 L-MSC 배지, 원심 분리를 첨가하여 효소를 불 활성화.
- 0.1 % BSA / PBS에 재현 탁 세포 상층 액을 제거하고 혈구 또는 자동 세포 계수기와 세포를 계산합니다.
참고 : 0.1 % BSA의 볼륨 / PBS 문화 플라스크의 크기에 따라 달라집니다 : 5 또는 10 ml의 0.1 % BSA / PBS 목표. - 단계를 반복 2.2.2 3 ml의 0.1 % BSA / PBS (블록되지 않은 세포의 전용 금액을 재현 탁특정 결합 부위 등) 살아있는 세포를 유지합니다. 얼음에 세포를 유지합니다.
- 기본 안티 CD146 항체 바닥 튜브 라운드 3 ㎖를 준비하고 얼음에 보관하십시오.
주 : 셀 전용 량 첨가 차 항체의 농도는 사용되는 항체에 따라 달라진다. 제안 안티 쥐 CD146 항체는 표 1을 참조하십시오. - 일차 항체와 튜브 단계 2.2.3에서 세포의 총 부피를 추가한다. 닫기 긴밀하게 15 rpm으로, 4 ° C에서 회전 샘플 믹서에 30 분을 품어.
- 500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 세포는 3 ml의 0.1 % BSA / PBS에 뜨는 및에 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 반복 원심 분리 단계를 포함한다.
- 2.1의 지침에 따라 제조, 15 rpm으로, 4 ° C에서 회전 샘플 믹서에 30 분 배양 된 이차 항체 코팅 구슬을 포함하는 3 ㎖ 용액에 세포를 재현 탁.
- 부드러운 비 트립신 용액을 사용하여 PBS로 세정 후, 중간 엽 세포를 수확.
- CD146 + L-중간 엽 줄기 세포를 선택
- 자석에 표시 CD146 + L-중간 엽 줄기 세포를 포함하는 튜브를 놓습니다. 양성 세포는 튜브의 후방으로 인출된다. 튜브를 이동하거나 구슬을 건드리지 않고, 천천히 멸균 파스퇴르 피펫 (이 수집하거나 실험 설계에 따라 폐기 될 수 있습니다)와 음성 세포와 상층 액을 수확.
- 자석에서 관을 제거하고 3 ml의 10 % BSA / PBS에 세포를 재현 탁. 단계 2.3.1에 설명 된 선택 절차를 반복합니다. 네 번 이상 (Σ 5 선택 단계).
- 예열 L-MSC 배지에서 CD146 + L-엽 줄기 세포를 재현 탁 및 자석에 반환한다.
- 적절한 크기의 문화 플라스크 (0.2 ㎖ / cm 2)에 L-MSC 문화 매체와 접시에 뜨는,에 resuspend를 제거합니다. 경험적으로, 동일한 크기의 배양 플라스크에서 세포를 플레이트있는 세포 비드 선택 이전에 해제되었다. CD146 + L-엽 줄기 세포의 수, 따라서 도금 밀도 것소스 동물의 연령, 종 및 변형에 따라 달라집니다. 항상 ~ 5,000 세포 / cm 2의 도금 밀도를 목표로하고 있습니다.
주 : 비드 세포 성장을 방해하지 않으며, 세포 증식 점차 사라진다.
3. 냉동 세포
- 다음 동결 미디어 사용하여, 20 % FBS, 12.5 % (0.9 % NaCl을 10 % pentastarch) 60 % pentastarch 용액 CPDA-1, 2.5 % 염화나트륨 (0.9 %), 5 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 22.
주 : 모든 재료를 사용할 수있는 경우, 5 % DMSO, 30 % FBS와 65 % αMEM를 함유하는 용액이 좋은 대안이된다. - 1 ml의 각 크리오 바이알 (cryovial) 0.5 × 106 세포 / ㎖, 분취 액에 재현 탁 된 세포는 냉동 컨테이너를 사용하여 -80 ℃에서 O / N을 고정.
- 다음날 액체 질소 저장 탱크에 전송합니다.
4. 해동 세포
- 5 분 동안 37 ° C까지 수조에서 세포의 바이 얼을 해동.
- (10) 용액에 재현 탁 세포미리 예열 문화 매체와 500 XG에 5 분, 21 ° C에 대한 원심 분리기.
- 상청액을 제거하고 10 ㎖의 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 통기 캡 세포 배양 종자 세포 0.2 ㎖ / cm2 배지에서 5,000 세포 / cm 2에서 플라스크를 처리 (예를 들면, 75cm 2 플라스크에 15 mL)을 첨가 하였다.
- 5 %에서 배양 세포 O 2, 5 % 수확 및 / 또는 실험적인 사용을위한 80-90% 합류 할 때까지 CO 2. 오버 포화 상태가 분화를 유도 할 것이다. 5,000 세포 / cm 2에 파종 할 때, L-중간 엽 줄기 세포는 배양 3 ~ 4 일 이내에 80~90%의 포화 상태에 도달합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
중간 엽 줄기 세포 밀도 및 플라스틱 접착의 가장 신뢰할 수있는 물리적 특성 둘, L-엽 줄기 세포를 포함하는 폐 중간 엽 세포 분획을 얻기 위해이 프로토콜의 첫번째 부분에서 사용된다. 밀도 구배 상간 폐 중간 엽 세포뿐만 아니라 단핵구 및 대 식세포를 포함 할 것이지만, 플라스틱 접착 배양 3-5 일까지 만 폐 중간 엽 세포 유지되도록 하였다. 실제로이 세포 인구는 고전 MSC 표면 마커 CD73, CD90 및 CD146을 표현하고 더 이상 어떤 백혈구 존재가 있음을 표시하지 마커 CD34, CD45, 주요 조직 적합성 복합체 유형 II (MHCII) -RT1B, CD11b를하고 CD79a에 대한 부정적 세포 집단 (도 2A). 관심 CD146 + 서브 세트에서, 44.4-65.7 %의 범위는 CD73 + 및 CD90 + (데이터는 도시하지 않음)는 것이다. 또한,이 세포 집단을 할집락 형성 단위 (CFU) 효율이 30 %는 일반적으로 골수 MSC들 또는 다른 유형의 MSC (도 2b)에 대해보고 된 것보다 훨씬 더 높은, 상기 3 계통 고전 MSC (도 2c)에 따라 차별화 ~.
효소 소화 밀도 구배 분리 플라스틱 접착 후의도 2 MSC 특성. MSC 관련된 표면 마커의 (A) 식 CD146, CD73 및 CD90은 플라스틱 접착 세포 집단의 일부에 존재하는 음의 백혈구 마커 CD11b를, CD79a 반면 , CD34, CD45 및 MHCII-RT1B은 거의 발현되지 않았다. (B) 콜로니 희석 분석법 (105 세포 / ㎠)를 통해 유닛 제한 분석법을 형성하는 플라스틱 부착 세포의 30 %는 중간 엽 줄기 세포를 나타내는 클론 용량을 가지고 ~ 것으로 나타났다. (C) 플라스틱 접착 CELLS가 조골 매트릭스 생산 (적색) 할 수 있었다 비 분화 된 대조군에 비해 지방 세포 분화 배지에서 유도 된 연골 세포 (적색)을 함유하는 구체와 같은 연골 형성 작은 지질 소포 (적색)의 더 많은 수를 포함 하였다. 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시됩니다. 모든 데이터는 통과 1-3 세포를 생성 하였다. NM = 음의 마커; CFU = 식민지 단위를 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그러나, 메인주의해야 할 점은이 인구 가능성이 L-중간 엽 줄기 세포와 폐 섬유 아세포의 다른 아형 모두, L-중간 엽 줄기 세포는 자손 (23) 차별화가 포함되어 있다는 것입니다. 능성이 긍정적 인 CD146의 발현과 상관되고, 섬유 아세포는이 마커의 어떤 표현, CD146 +의 모집단 오의 긍정적 인 선택을 안하기 때문에stensibly 높은 L-중간 엽 줄기 세포에 농축 된 세포 집단 발생했습니다. 이것은 분명히 MSC 관련된 표면 마커 (도 3A)을 발현 세포 집단의 높은 비율에 의해 설명되며, ~ 80 %의 상당히 높은 콜로니 형성 전위 (도 3b), 특히 연골 리니지 강한 분화 응답 (도 3c) CD146 선택 전에 얻어지는 총 간엽 인구 비교. 참고로이 L-중간 엽 줄기 세포의 형태 만 거의 사실 지방 세포,하지만 작은 지질 소포로 가득 더 많은 스핀들 모양의 세포를 보여줄 것입니다. 이들은 폐 개발 및 폐포 유형 II 셀 지원 모두 중요하다 lipofibroblast 혈통을 반영 할 수있다. CD146 선택되면, 대형 지질 소포로 채워진 세포와 같은 더 많은 지방 세포가 CD146 선택 이전에 비하여 (도 3C)을 관찰 할 수 있고, 또 전지의 대부분은 여전히 lipofibroblasts 같은 CE 아르소형 지질 소포를 함유 LLS.
추가 CD146 + 자성 비드 선택 후도 3 MSC 특성. CD146 + 아군의 양성 선별 한 후, 이들 세포는 특정의 (A)에서 MSC 관련된 표면 마커의 높은 발현, CD73, 단일 셀 후 상당히 높은 CFU 효율을 보였다 도금 (B), 및 지방 세포 계보 (C), 특히 연골 리니지 및 정도는 덜 강한 분화 응답. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. 모든 데이터는 통로 (3) 세포를 생성 하였다. NM = 음의 마커; 단위를 형성 CFU = 식민지. t 여기를 클릭하십시오오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
차 L-중간 엽 줄기 세포의 분리 및 배양은 더 나은 자신의 기능과 세포 수준에서 다른 세포 집단과의 상호 작용, 폐 개발, 건강과 질병에서의 역할을 이해 할 수있는 기회를 제공합니다. 이들 세포의 특정 단일 마커의 부족이 거의 불가능 반응계에서 이들 세포를 연구 할 수있다 이것은 특히 중요하다. 모든 기본 세포 집단과 마찬가지로, 하나는 이러한 세포들이 (24에서 검토) 문화 (19)에 보관되어 더 이상 자신의 캐릭터를 변경 가능성이 있음을 알아 두셔야합니다. 자연 상태에 가능한 한 가깝게 한 상태에서 L-엽 줄기 세포를 유지하기 위해, 그들은 37 ° C 가습 인큐베이터에서 5 % O 2, 5 % CO 2에서 배양하는 것이 매우 중요하다. 호흡 생리 일반적 분압 돌턴의 법칙에 기초하여, 주위 공기 (21 % O 2)의 산소 분압이 10 ~ 160 mmHg로, 그리고 방울 것을 수락폐포 영공 25-27 1 mmHg로. 성숙한 폐의 폐포 - 동맥 파오 2 그라데이션 ~ 3-4 mmHg로하지만,이 폐포 - 동맥 거리가 25, 28이 증가하는 질병 또는 미숙 한 폐에 크게 증가 될 수있다. 체내, 간엽 틈새는 보통 2~8% 29,30 산소 농도에 노출된다. 단지 몇 종이 실제로 폐 PO 2 측정했지만, 한 연구 42.8 mmHg로 27,31 중앙값 23 656 mmHg로부터 PO이 정상 폐 범위 찾기 20 환자의 폐에서이를 측정 하였다. 돌턴의 법칙에 따르면, 37 ° C의 온도 및 5 % O 2 가습 인큐베이터 정상적인 폐 조직에서 측정 범위 내에 머물 폭포 중앙값 매우 가까이 ~ 36 mmHg로의 포 (2)를 갖는다. 또한, 낮은 산소 배양 조건은 문화 29 전구 인구의 정비를 추진합니다. 함께 찍은, 그것은 내가산소 농도 L-중간 엽 줄기 세포가 정상 출생 후의 개발 또는 질병 동안 여러 단계에서 현장에 노출 정확히 말해 어렵다,하지만 5 ~ 10 %의 O 2는 생리 학적 관점 27,31에서 가능성이 가장 정확한 것 같습니다. 위에서 언급 한 내용에 기초하여, 우리는 배양 조건에 5 % O 2를 유지하도록 선택, 우리는 이러한 조건이 시험 관내에서 유지 될 때, L-엽 줄기 세포가 빠르게 성장할 적은 스트레스 섬유를 표시하고, 작은 확률을 가질 것으로 발견 자발적 분화 또는 노화. 자발적 분화 또는 다른 이상을 방지 할 추가 요인, 계대을위한 부드러운 비 트립신 해리 에이전트를 사용하여 그들이 80-90%의 포화 상태 (조밀 한 조건이 섬유 아세포의 분화를 촉진합니다)에 도달하면 L-중간 엽 줄기 세포를 계대, 낮은 통로 번호를 유지하는 것입니다 (<P4). 호프만과 동료의 연구에서, 트립신은 L-중간 엽 줄기 세포의 기능에 부정적 영향을 미칠 것으로 나타났다과트립신없는 해리 에이전트 반면 표현형이 13 보존 할 수있다.
분리 과정에서 수율을 최적화하기 위해, 조직이 건조되도록하지 않아야 명심하면서, 같은 미세 가능한 폐 말하다 것이 중요하다. 효소 소화 동안, 튜브 조직편을 침강하므로 자주 진탕 가열 장치를 사용하지 않는 경우 교반하며 효소 최적의 노출을 얻을하지 않는다는 것이 중요하다. 다른 중요한 단계는 밀도 구배 분리이다 축성 매우 느리게 또는 각도 <45 °로 수행되지 않으면, 전체 세포 집단의 손실을 초래하는 대신 레이어링 두 액체의 혼합으로 이어질 것이다. 또한, 밀도 구배 매질의 밀도가 주위 온도에 매우 의존적이다. 19 ° C (또는 RT) 이외의 온도는 최적 또는 전혀 밀도 구배 분리가 발생합니다.
F에 관심이 프로토콜의 uture 사용자는 우리가 성공적으로 분리하기 전에 24 시간까지 수확 폐에서 실행 가능한 L-중간 엽 줄기 세포를 격리 폐 직접 수확시 차가운 L-MSC 매체에 저장되어 제공되며, 4로 유지 한 것입니다 기음. 이보다 유연 실험 계획, 또는 다른 실험실 사이의 폐도 출하 수 있습니다. 수율은 갓 수확 된 폐의 일반적으로 유사하며, 세포는 동일하게 잘 성장한다.
가능할 것이다 다른 변형이 절차는 세포가 높은 압력과 속도로 실시 될 때 더 많은 시간이 필요하고,이 방법은 더 많은 스트레스 세포 주제에도 대신 자성 비드 선택 FACS를 사용하고, 오염의 위험을 품고 경우는 무균 조건 하에서 수행하지. 여기에 사용되는 자석 구슬은 세포의 성장을 방해, 문화의 몇 일 내에 사라지지 않습니다. FACS 또는 자기 비드 분류에 대한 환경 설정도 가능 시설에 따라 달라질 수 있습니다최종 사용자에게. 또한, 다른 조직으로부터 거주자 엽 줄기 세포를 분리,이 프로토콜을 변경하는 것이 가능하다. 이 경우에는 매트릭스 조성물은 장기 사이의 변화에 따라, 관심 기관에 효소를 조정하는 것이 중요하다.
단지 중간 엽 세포를 얻기위한 밀도 구배 이후 플라스틱 밀착성 사용 중요한 제한은 결과적 인구 L-엽 줄기 세포와 섬유 아세포를 모두 포함한다. CD146 + 세포 강하게 요법이 경고를 선택하지만, CD146 + 선택 절차 및주의 배양 조건 L-엽 줄기 세포의 특성과 시험 관내 세포 배양의 효과에도 불구 불가능 섬유 아세포로 분화를 어느 정도 방지 할 수 있습니다. 일반적으로 중간 엽 줄기 세포는 말기 분화 될 때까지 섬유 아세포 세포가 더 아래 계층 서서히 multilineage 잠재력을 잃게되는 능성의 계층을 포함하는 것으로보고되었다 <SUP> 23. 십중팔구이 또한 L-MSC 틈새 (4)에 발생하고, CD146 발현을 잃은 CD146 + 선택 후 이미 통과 세포의 약 40 %로 배양 CD146 + 인구에 반영 될 것으로 보인다. 또한이 집단에서 단지 80 % 40 % CD73 CD90의 발현이있다. 부분적으로,이 다 능성의 MSC 계층 구조에 의해 설명 될 수있다. CD146 +는 CD146 긍정적 인 중간 엽 줄기 세포 및 음, 더 차별화 딸 세포 모두에 상승을 제공, 비대칭 확산을받을 가능성이 될 것입니다. 폐 상주 엽 줄기 세포는 또한 CD73 및 CD90 합리적 식의 정의에 기초하고있는 골수에서 중간 엽 줄기 세포의 표현형과 다소 상이한 기능을 가질 것으로 기대 될 수있다. 세포 치료에 대한 국제 사회는 모든 중간 엽 줄기 세포는 CD73과 CD90를 포함하여 고전 MSC 마커를 표현하는 것으로 인식하고 있으며, 그 표면 마커의 발현은 중간 엽 줄기 세포 (32)을 정의하는 가장 좋은 방법이 아닙니다. 전자CD146 + L-MSC 인구의 70 % ~의 xceptionally 높은 CFU 효율이를 지원합니다. CD146 + 인구가 정렬되지 않은 중간 엽 인구보다 MSC 특성에 대해 더 잘 수행하기 때문에, 저자는 더 CD146을 특징으로하지 않은 - 인구. 우리는 중간 엽 줄기 세포와 우리의 중간 엽 인구가 풍부하고 섬유 아세포의를 고갈 위해 노력하지만, 우리는 이것이 유일하고 진정한 L-MSC 인구이라고 주장하지 않습니다. L-중간 엽 줄기 세포는 기원, 표현형과 기능 모두에서 가능성이 매우 이질적이다.
CD146 널리 중간 엽 줄기 세포 및 혈관 주위 세포 16,17,33,34에서 다 능성의 마커로 인정 받고 있지만, 거의가 생체 내에서 CD146 + MSC 인구에 대한 알려져있다. CD146은 혈관 내피 세포의 기능에 중요한 세포 접착 분자 및 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 중간 엽 줄기 세포와 T 림프구 15,16,35,36 표현된다. 최근중간 엽 줄기 세포는 여러 장기에 혈관 주위 틈새 시장을 살고 있다는 증거가 등장했다 MSC-마커 CD73와 CD105 (37)에 대한 CD146 + 세포 공동 얼룩있다. 실제로, 배양 혈관 주위 세포와 중간 엽 줄기 세포는 중간 엽 줄기 세포가 혈관 주위 세포 4,39에서 파생 된 뷰를 강화, 매우 유사한 유전자 발현 프로파일 (38)이있다. 우리는 우리의 면역 CD146 + L-MSC 인구의 위치를 결정하기 위해 분석을 수행하지 않지만, 그들은 또한 혈관 주위의 위치에 위치 될 가능성이 매우 높다. 앞으로의 연구는이 사실 경우인지 확인하기 위해 필요합니다. 이 모든 셀이 표현형 CD146 + 선택 후 매우 유사하게 지적해야하지만, 우리의 세포 집단의 일부가 혈관 주위 세포 것을 할 수있다.
간엽 기질 세포 인해 단일 모두 포괄 마커의 부족으로 식별 악명 어렵다. 다양한 연구는 분리를위한 다른 방법을보고L-MSC들, 그리고 설득력이 세포 집단은 MSC 마커의 발현에 대해 서로 유사하다는 것을 보여 주었다. 여기에 제시된 바와 같이 CD146 + L-MSC 인구가 가지 또는 FACS 다양한 형태의 등 무서 등 줄기 세포 관련 표면 마커를 사용하여 달성으로 이전에보고 된 L-MSC 집단과 매우 유사, CD146 + L-MSC의 특성을 바탕으로 -1, ABCG2 및 CD90. L-MSC들 (13)을 가지 비교하면, CD146 + L-엽 줄기 세포가 우리의 방법은 더 농축 능성의 L-MSC 인구를 산출 나타내는 단일 세포 콜로니를 야기 할 수있는 더 큰 능력을 가질 것으로 보인다. CD90 7 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α (PDGFRα) 40, 41에 기초하여 L-엽 줄기 세포를 분리 방법에 비해 두 표면 마커는 더 말단 분화 lipofibroblasts 및 폐포 / 구조 섬유 아세포에 대한 선택으로이 장점은 또한 참 수 따라서 만 합리적으로 나전자는 기질 세포 20,42로 확인. 반면, 두 무서-1과 ABCG2 잘 stemness와 MSC 식 9,43-46과 상관 마커를 설명되어 있습니다. 여기에보고 된 방법은 피콜 구배 및 플라스틱 준수를 통해 내피 세포에 대해 선택하는 반면 그들이 CD31 (46)에 대해 99 %가 긍정적으로 ABCG2 + L은-중간 엽 줄기 세포는 그러나 더 내피 세포의 특성을 가지고있다. McQualter 동료 -5,8-의 무서 -1- 기반 분리 프로토콜에 비해 우리의 방법의 주된 장점은 무서 -1- 사용될 수있는 마우스 이외의 종에 널리 적용 할 수 있다는 것이다.
불가능에 아마도 거의 매우 도전적이지만 후반 현상 또는 성인 폐에서 L-엽 줄기 세포의 "순수"인구 구하여 미분화 상태를 유지하기 위해, 여기에 제시된 프로토콜의 빠르고 지속적이고 신뢰성있는 방법을 제공한다 세포 인구를 얻는 것은 매우 능성 자기 갱신 폐 입술에 풍부한답하라 엽 줄기 세포. 이 방법을 사용하여 다양한 질환 모델의 종류와 현상 폐에서의 역할에 L-엽 줄기 세포의 역할에 대한 추가 연구를 가능하게 정의된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use |
| Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | - | Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more. |
| Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C. |
| αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| 200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
| biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE |
| anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
| Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | - | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C |
References
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
- Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
- Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
- McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
- Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
- Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
- Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
- Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
- Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
- Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
- Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
- Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
- Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
- Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
- Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
- Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
- McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
- Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
- Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
- Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
- Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
- Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
- Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
- Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
- Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
- Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
- Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
- Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
- Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
- Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
- Caplan, A. I.
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
- McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
- Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
- Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
- Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
- Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).
