Visualisering av Vaskulær og Parenkymalt Regeneration etter 70% Delvis hepatectomy i normale mus
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
En modifisert silikon injeksjonsprosedyre ble anvendt for visualisering av den hepatiske vaskulære tre. Denne fremgangsmåten bestod av in-vivo-injeksjon av silikonforbindelse, via en 26 G kateter inn i portalen eller hepatiske vene. Etter silikon injeksjon, ble organer eksplantert og forberedt for ex-vivo mikro CT (μCT) skanning. Silikoninjeksjonsprosedyren er teknisk utfordrende. Å oppnå et vellykket resultat krever omfattende mikrokirurgisk erfaring fra kirurgen. En av utfordringene i denne prosedyren innebærer å bestemme tilstrekkelig perfusjon sats for silikonforbindelsen. Den perfusjonshastighet for silikonforbindelsen må defineres, basert på hemodynamiske av det vaskulære system av interesse. Upassende perfusjon rente kan føre til en ufullstendig perfusjon, kunstig utvidelse og brudd av vaskulære trær.
3D-rekonstruksjon av det vaskulære systemet var basert på CT-skanning og ble oppnådd ved hjelppreklinisk programvare som HepaVision. Kvaliteten av den rekonstruerte vaskulære tre var direkte relatert til kvaliteten av silikon perfusjon. Deretter beregnet vaskulære parametere som indikerer vaskulær vekst, slik som total vaskulær volum, ble beregnet på grunnlag av de vaskulære rekonstruksjoner. Kontrast det vaskulære treet med silikon tillatt for påfølgende histologisk opparbeidelse av prøven etter μCT skanning. Prøven kan utsettes for seriesnitte, histologisk analyse og hele glide skanning, og deretter til 3D rekonstruksjon av de vaskulære trærne basert på histologiske bilde. Dette er en forutsetning for påvisning av molekylære hendelser og deres fordeling i forhold til det vaskulære tre. Denne modifiserte silikon injeksjonsprosedyre kan også brukes til å visualisere og rekonstruere de vaskulære systemer av andre organer. Denne teknikken har potensiale til å bli mye brukt til studier vedrørende vaskulær anatomi og vekst i forskjellige dyr ennd sykdomsmodeller.
Introduction
Liver regenerering blir ofte bestemt ved å måle økning i levervekt og volum, og ved å vurdere den hepatocytter formeringshastigheten 16. Imidlertid er leveren regenerering ikke bare indusere parenkymatøs regenerering men også vaskulær regenerasjon 6. Derfor bør vaskulær vekst bli ytterligere undersøkt med hensyn til sin rolle i progresjon av lever regenerering. Visualisering av lever karsystemet er avgjørende for å fremme vår forståelse av vaskulær regenerasjon. Mange indirekte metoder har blitt utviklet for å studere de underliggende molekylære mekanismene for lever vaskulær regenerasjon. Tradisjonelt, deteksjon av cytokiner (vaskulær endotelial vekstfaktor, VEGF) 14, kjemokiner og deres reseptorer (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 har vært bærebjelken for å studere vaskulær regenerasjon. Imidlertid ville en 3D-modell sammen med kvantitativ analyse av vaskulaturen legg kritiske anatomiskeinformasjon for å få en bedre forståelse av den viktige sammenhengen mellom parenkymatøs lever og vaskulær regenerasjon.
For å visualisere den hepatiske vaskulære system, som krever kontrast de vaskulære trærne ble mus injisert med et radiopakt silikongummi kontrastmiddel direkte inn i portalen eller lever venøse vaskulære tre. Etter polymerisering av silikon og explantation av orgelet ble prøver leveren utsettes for μCT skanning ved hjelp av en CT-skanner. De skanner resulterte i voxel bilde representasjoner av silikon-injeksjon eksemplarer 9.
For kvalitetskontroll, ble det vaskulære systemet først visualisert i 3D ved hjelp av preklinisk programvare. Segmentering ble utført ved å sette en terskel mellom det myke vev intensitet og fartøyet intensitet. Den resulterende Fartøyet Masken ble visualisert ved hjelp av overflaten rendering. Programvaren også tillatt for manuell måling av to parametre av vascular vekst: maksimal fartøy lengde og radius.
En preklinisk programvare ble så brukt for 3D rekonstruksjon av vaskulære trær og påfølgende beregning av leveranser eller drenering vaskulære territorier 13. I tillegg har denne programvaren automatisk fastslått visse parametere av vaskulær vekst, slik som den totale lengde av alle synlige vaskulære strukturer også er kjent som den totale kantlengde eller totalt beholdervolum.
Silikon perfusjon prosedyren ble utført på naive mus og i mus som gjennomgikk 70% partiell hepatektomi (PH). Levere ble oppsamlet ved forskjellige observasjons tidspunkter etter reseksjon for analyse av vaskulær og parenchymale lever regenerering ved hjelp av den tidligere nevnte visualisering og kvantifisering teknikk.
De viktigste målene for denne filmen er å: (1) demonstrere delikat injeksjonsteknikken som kreves for å oppnå optimal kontraster (2) viser den potensielle fordelen resulterer from en detaljert analyse av de resulterende prøven med μCT og histologiske seriesnitt. Etter å ha sett denne filmen, bør leseren ha en bedre forståelse av hvordan du injiserer silikon forbindelse i et bestemt karsystemet og på nytten og anvendbarhet av teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontrast vaskulære treet ved silikon injeksjon og μCT skanning har blitt innført i tumormodeller og nevrologiske sykdomsmodeller ofte for å studere angiogenic progresjon 5,7,8,10. Forbedringer i metodikken av silikon injeksjon ble gjort i denne studien for å visualisere og kvantifisere vaskulær vekst etter delvis hepatectomy hos mus.
Det finnes en rekke kritiske trinn som trenger oppmerksomhet for å oppnå god perfusjon kvalitet. Først av alt, systemisk heparinisering anbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
- Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
- Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
- Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
- Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685 (2012).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
- Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
- Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
- Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
- Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
- Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10 (2013).
- Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
- Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
- Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955 (2014).
