Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/53972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Abstract

تم العثور على Dictyostelium discoideum الاميبا في التربة وتتغذى على البكتيريا. عندما تصبح المصادر الغذائية الشحيحة، لأنها تفرز عوامل لبدء برنامج تنمية متعددة الخلايا خلالها الخلايا وحيدة chemotax نحو مراكز التجميع 1-4. هذه العملية تعتمد على إطلاق سراح الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم) 5. وينتج المخيم في موجات من خلال اتخاذ إجراءات متضافرة من محلقة محلقة وphosphodiesterases، ويربط G البروتين يقترن مستقبلات المخيم 6،7. وفحص تستخدم على نطاق واسع لتحليل الآليات التي تشارك في دورة التنموية للانخفاض حقيقي النواة Dictyostelium discoideum يقوم على الملاحظة من تجميع الخلايا في ظروف المغمورة 8،9. يصف هذا البروتوكول تحليل دور coronin (أ) في دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة مغمورة في محلول ملحي متوازن (BSS) 10. Coronin (أ) هو عضو في العلاقات العامة المحفوظة على نطاق واسععائلة otein من coronins التي تورطت في مجموعة واسعة من الأنشطة 11،12 الخلايا Dictyostelium تفتقر coronin وغير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، ويمكن إنقاذ هذا العيب من خلال تزويد البقول من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع لل تتالي المخيم 10. التقنيات الموضحة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل الأولى من دورة التنموية للDictyostelium discoideum المنبع من سلسلة المخيم. لذلك، وذلك باستخدام هذا التجميع الفحص قد تسمح للمزيد من الدراسة coronin وظيفة وتعميق فهمنا للبيولوجيا coronin.

Introduction

الأسرة coronin من البروتينات وحفظها للغاية في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وتتميز هذه البروتينات عن طريق وجود الأمينية محطة التربتوفان اسبارتاتي (WD) تكرار المحتوية على المنطقة تليها منطقة فريدة من نوعها متصلة مجال ملفوف لفائف-كربوكسي محطة 13،14 (الشكل 1). قد تورطت Coronins في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تنظيم هيكل الخلية ونقل الإشارة 12. في الثدييات، وتصل إلى ستة جزيئات قصيرة coronin (coronin 1-6)، فضلا عن "جنبا إلى جنب" coronin 7، يمكن أن يشترك في اعرب 12،15. Coronin 1 هو فرد من أفراد الأسرة الأكثر دراسة على نطاق واسع، وتبين أن تشارك في تدمير مسببات المرض، T بقاء الخلية والإشارات العصبية. كيف، بالضبط، coronin 1 تنفذ هذه الأنشطة لا تزال غير واضحة. في حين coronin 1 وقد تبين لتنظيم الكالسيوم 2+ إشارة، التي تعتمد على المخيم وكذلك F-الأكتين الهيكل الخلوي تعديل 16-18، وشارك محتملجعلت -expression تصل إلى 7 أفراد الأسرة في الثدييات صعوبة في دراسة وظيفة الجزيئية للcoronins في هذه الأنظمة، وذلك بسبب التكرار المحتملة. على عكس الكائنات الثديية، وانخفاض discoideum حقيقي النواة Dictyostelium يعبر عن اثنين فقط من أعضاء coronin الأسرة (coronin ألف، ortholog من الثدييات coronin 1 و coronin باء، ortholog من coronin الثدييات 7) مع وظائف على ما يبدو غير زائدة 15،19،20. هذه الحقيقة تجعل Dictyostelium discoideum نموذجا قويا لدراسة وظيفة coronins.

لدراسة دور coronin وفي Dictyostelium discoideum، نحن الناجم عن دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على عازلة متوازن محلول الملح (BSS) باستخدام خلايا نوع البرية أو الخلايا التي تفتقر إلى coronin و10. لقد وجدنا أن الخلايا التي تفتقر إلى coronin وكانت غير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا على الموت جوعا. للحصول على التقييم الكمي الدقيق لهذا النمط الظاهري للالآلية تصوير الخلايا الحية وصفها في هذا البروتوكول هو أداة حيوية. الخلل في الشروع في الاستجابة للجوع في وقت مبكر في الخلايا التي تفتقر إلى coronin ويمكن إنقاذهم عن طريق توفير نبضات من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع من سلسلة المخيم. وقد استخدم تطبيق خارجي من البقول المخيم لمحاكاة بدء التنمية من خلال عدة مختبرات في 8،9 الماضي. ومع ذلك، ويعرف هذا الإجراء أيضا أن تعتمد إلى حد كبير على كثافة الخلايا وتوقيت. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يهدف للحد من هذه المتغيرات وذلك لضمان درجة عالية من التكاثر. معا، والتقنيات المستخدمة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل المبكرة من دورة التنموية للDictyostelium discoideum ولديها القدرة على تحديد حتى- وكذلك المؤثرات المصب coronin وظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

  1. مراقبة الاستجابة للجوع في وقت مبكر من Dictyostelium discoideum بواسطة المجهر مرور الزمن.
    1. زراعة خلايا DH1.10 أو خلايا كورا -deficient في قارورة تحتوي على Erlenmayer HL-5 متوسط ​​(لمدة 1 L: 5 ز بروتيوز ببتون، 5 ز thiotone E ببتون، و 10 غرام جلوكوز، 5 ز خلاصة الخميرة، 0.35 ز نا 2 هبو 4 * 7H 2 O، 0.35 ز KH 2 PO 4، 0.05 غ ثنائي هيدروستريبتوميسين للكبريتات، ودرجة الحموضة 6.6) عند 22 درجة مئوية في حاضنة تهتز مع دوران 160 دورة في الدقيقة. حفاظ على الخلايا في مناطق ذات كثافة بين 0.01 × 10 6 خلية / مل و 2 × 10 6 خلية / مل.
    2. دراسة تجميع الخلية، من خلال حصاد سجل مرحلة النمو خلايا DH1.10 21 أو خلايا كورا -deficient 10 ولدت في الخلفية DH1.10، ونمت في هز الثقافة مع HL-5 المتوسط ​​عند 22 درجة مئوية. للقيام بذلك، أخذ كمية مناسبة من الخلايا (عادة ما بين 10 و 50 مل)، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 x ج وغسل الخلايا مرتين في BSS (10 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل2.5 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة 6.5).
    3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. وفي وقت لاحق، وخلايا لوحة في كثافة (5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2 في 24 لوحة جيدا. تسمح لهم الالتزام لمدة 1 ساعة على 22 درجة مئوية في BSS.
    4. تصور التجميع بواسطة المجهر مرور الزمن كما هو موضح قبل 10، التقاط الصور في كل 135 ثانية. باستخدام التصوير الخلية الحية اقامة مجهزة الهدف 5X وكاميرا الجهاز المسؤول عن جانب-بضرب الإلكترون الآلي عن البرنامج المناسب (انظر المواد الجدول).
  2. ينبض معسكر خلايا discoideum Dictyostelium خلال المجاعة.
    1. دراسة تأثير البقول المخيم تطبيقها خارجيا على تطوير خلايا DH1.10 21 أو خلايا 10 DH1.10 كورا -deficient، من خلال حصاد الخلايا. للقيام بذلك، أخذ كمية مناسبة من الخلايا (عادة ما بين 10 و 50 مل)، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 x ج ويغسل مرتين في BSS.
    2. فصول التوجيه الجامعيخلايا الإقليم الشمالي باستخدام عدادة الكريات و resuspend الخلايا إلى كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل في BSS. يهز الثقافات (160 دورة في الدقيقة) عند 22 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل تطبيق البقول. إضافة البقول المخيم باستخدام جهاز توقيت تسيطر مضخة تحوي. برمجة المضخة لتسليم نبض 5 ثانية كل 6.5 دقيقة 15 ميكرولتر من 50 نانومتر مخيم (تركيز النهائي) خلال الفترة من 5 ساعة.
    3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. وفي وقت لاحق، لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من (5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2 في 24 لوحة جيدا. السماح لتنضم لمدة 1 ساعة في BSS.
    4. تصور التجميع بعد 16 ساعة على 22 درجة مئوية بواسطة المجهر مشرق الميدان باستخدام الهدف 5X.
  3. تحريض Dictyostelium تطوير discoideum من خلال التعرض إلى متوسطة مكيفة.
    1. إعداد المتوسطة مشروط جديدة كما هو موضح 22. جمع سجل في المرحلة خلايا DH1.10 21 أو خلايا 10 DH1.10 كورا -deficient، من الهز عبادةures مع HL-5 المتوسط ​​عند 22 درجة مئوية باستخدام ماصة، الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 x ج وغسل خلايا ثلاث مرات في PBM (0.02 فوسفات البوتاسيوم M، 10 ميكرومتر CaCl 2، و 1 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 6.1).
    2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، و resuspend هذه في PBM في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل ويهز لمدة 20 ساعة على 110 دورة في الدقيقة / 22 ° C.
    3. جمع المتوسطة مكيفة بعد الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 3 دقائق وتوضيح بواسطة الطرد المركزي في 8000 × ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. مرشح مكيفة المتوسطة من خلال مرشح 0.45 ميكرون (انظر الجدول المواد)، ويخفف بمقدار ثلاثة أضعاف في PBM.
    5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ولوحة في كثافة (5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2 في 24 لوحة جيدا. تسمح لهم الالتزام لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية.
    6. صرف طاف من الخلايا مع المتوسط ​​مكيفة أعدت مسبقا.
    7. تصور تجميع لfter 16 ساعة بواسطة المجهر مشرق الميدان باستخدام الهدف 5X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلايا من نقص في coronin وتظهر وجود خلل في التنمية في وقت مبكر (الشكل 2). في غياب coronin والخلايا غير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، التي هي الخطوة الأولى خلال دورة التنموية للDictyostelium discoideum. لذلك، يظهر coronin ألف للعب دور خلال الاستجابة للجوع في وقت مبكر و / أو إشارات المخيم. في الواقع، ويرافق عدم تشكيل الكلي متعددة الخلايا في غياب coronin A عن طريق خفض المخيم مما يشير إلى 10. ومع ذلك، فإن تطبيق نبضات المخيم الخارجية يستعيد كامل البرية من نوع النمط الظاهري (الشكل 3). تورط هذا أن coronin A، بدلا من التورط مباشرة في مخيم الإشارات، وظائف المنبع من سلسلة المخيم (الشكل 5). عندما تتعرض الخلايا Dictyostelium لظروف تجويع أنها تحفز إفراز من الجوع في وقت مبكر عوامل 22،23. واحدة من أفضل شاراالعوامل cterized تشارك في الاستجابة للجوع في وقت مبكر مشروط عامل المتوسط ​​(مركز المرأة والأسرة) 22. وبناء على نتائجنا، ونحن افترضنا أن coronin وإما ينظم إفراز هذه العوامل المجاعة في وقت مبكر أو تشارك في نقل الإشارة الناجمة عن هذه العوامل. من أجل أن تكون قادرة على التفريق بين هذين التأثيرين أجرينا مكيفة التجارب المتوسطة. تعرضت النوع البري أو خلايا كورا -deficient إلى supernatants من إما جوعا من النوع البري أو كورا -deficient خلايا 10 (الشكل 4). هذه supernatants هي المبادرين قوية من تشكيل الكلي متعددة الخلايا، وبالتالي تحتوي على العوامل التي تبدأ المصب مسارات إشارات التنموية، بما في ذلك إشارات المخيم. نتائجنا تظهر أن طاف من الخلايا كورا -deficient كان قادرا على قدم المساواة للحث على تنمية كما كان الحال بالنسبة لطاف من الخلايا من النوع البري (الشكل 4). تورط هذا أن كورا -خلايا ناقصة قادرة على إنتاج وإفراز عوامل الموت جوعا في وقت مبكر عند مستويات مماثلة لضوابط البرية من نوع الخاصة بهم. ومع ذلك، فإن الخلايا كورا -deficient ليست قادرة على الاستجابة لطاف بهم ولا طاف المقدمة من البرية من نوع الخلايا (الشكل 4). لذلك، يظهر coronin وأن تشارك في مسارات الإشارات التي تسببها العوامل المجاعة في وقت مبكر، بدلا من التعبير عنها / إفراز 10 (الشكل 5).

بشكل عام، لتكون قادرة على مواصلة التحقيق في إشارات يفرز عن طريق تجويع الخلايا Dictyostelium التي تحفز الدورة التنموية، وفحص التجميع في ظل ظروف المغمورة هو قوي للقراءة خارج. الخلايا المزروعة بكثافة أعلى سوف عفويا مجموع المباراتين بسبب وفرة من كل الإشارات المطلوبة. ومع ذلك، في انخفاض الكثافة فقط إضافة المتوسطة مكيفة ستؤدي إلى تجميع الخلوي (الشكل 4) 22،24

شكل 1
الشكل 1: البروتينات Coronin موجودة في الثدييات وDictyostelium discoideum تتميز الأسرة coronin عن وجود N-محطة WD-تكرار المناطق تليها مجال فريدة من نوعها ومنطقة لفائف ملفوف C-المحطة. بينما الثدييات تعبر 7 البروتينات coronin (A)، Dictyostelium discoideum يحتوي فقط على اثنين من أفراد الأسرة (ب)، مما يجعل خطر التكرار أقل احتمالا عند دراسة وظيفتها. Coronin وهو ortholog من coronin الثدييات 1 و coronin B يظهر بنية مجال مماثل coronin 7. المختصرات: CC، مجال ملفوف لفائف. UD، نطاق فريد. WD يكرر، التربتوفان يكرر -aspartate. ونظرا لطول تسلسل الماوس (A) في الأحماض الأمينية (أأ). تعديل من بيترز وآخرون، 2013 (12). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: كورا - discoideum Dictyostelium غير قادرين على تجميع خلال الاستجابة للجوع في وقت مبكر والمصنف البرية من نوع (A) أو كورا -deficient (ب) خلايا Dictyostelium في لوحات multiwell في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلية / سم 2، جوعا في BSS، وتصويرها على مدى 20 ساعة. شريط مقياس = 100 ميكرون..jpg و"الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تطبق خارجيا المخيم البقول إنقاذ الخلل التنموي في وقت مبكر من كورا - discoideum Dictyostelium الخضري البرية من نوع (A و B) وغسلت كورا -deficient خلايا (C و D) وتجويع لمدة 2 ساعة قبل أن يتم نابض مع (ب. وD) أو بدون (A و C) 50 نانومتر المخيم خلال 5 ساعة كل 6.5 دقيقة في تعليق. تم غسلها ثم الخلايا، معلق في BSS، وتوضع على طبق بيتري في مناطق ذات كثافة من 10 × 10 4 خلية / سم 2. واتخذت صورة 20 ساعة بعد البذر من الخلايا. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: كورا -deficient discoideum Dictyostelium قادرون على انتاج جميع العوامل اللازمة لتحريض التنموي ولكن غير قادرين على الرد عليها أضعافا مضاعفة متزايد من النوع البري وكانت تغسل الخلايا كورا -deficient في PBM والمصنفة في لوحات multiwell في كثافة (. 5، 10، 20، أو 40) × 10 4 خلية / سم 2، المحتضنة في المتوسط ​​مشروط تم الحصول عليها من البرية من نوع (A) أو كورا -deficient خلايا يتضورون جوعا (B). التقطت الصور 16 ساعة بعد البذر الخلايا. شريط مقياس = 100 ميكرون.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: النموذج الحالي من Coronin وظيفة في Dictyostelium discoideum Coronin وتشارك في نقل الإشارة من عامل (ق) يفرز خلال الاستجابة للجوع في وقت مبكر مما يؤدي إلى تحريض شلال المخيم والتقدم من خلال دورة التنموية. تعديل من فينيه وآخرون، 2014 (10). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتوجد البروتينات coronin في معظم الأنواع من كليد حقيقية النواة. Dictyostelium discoideum coronin A، ونديد من coronin الثدييات 1، ويشارك في الاستجابة للجوع في وقت مبكر، منذ coronin A-نقص الخلايا ليست قادرة على تشكيل مراكز التجميع خلال وقت مبكر التنموية دورة 10. لتكون قادرة على كميا وبدقة تقييم تأخير في التنمية بين السلالات، المجهر الخلية الحية التصوير انشاء مع وحدة تحكم مرحلة الآلي هو أداة أساسية.

D. discoideum يستخدم المخيم بمثابة جزيء إشارة أساسيا خلال عدة مراحل دورة حياتها 1-4. واحدة من نقاط التفتيش خلالها مطلوب المخيم هو الانتقال من خلية واحدة إلى تشكيل هياكل متعددة الخلايا. ظهور موجات المخيم بعد لمس ~ 6 ساعات من الموت جوعا من قبل الخلايا ويوفر إشارة الكيميائي للتحرك نحو إنشاء مركز تجميع 5. هذه المخيمموجات يمكن تحاكي التجربة التي ينبض تجويع د. خلايا discoideum مع المخيم كل 6.5 دقيقة على مدى فترة من 5H 8،9. باستخدام هذا الإجراء من المهم أن تجويع الخلايا لمدة تصل إلى 2H قبل تطبيق نبضات المخيم، من أجل الحصول على نتائج موثوقة. استخدام هذا التجريبية انشاء كنا قادرين على إظهار أن coronin ويتصرف المنبع من الإشارات المخيم، كما أنقذت هذه النبضات تطبيقها خارجيا والتنمية في خلايا كورا -deficient (الشكل 3 و 5). وتشير هذه النتائج أيضا أنه في حين coronin ويبدو أن يكون لها دور أساسي في الاستشعار عن بعد في الاستجابة للجوع في وقت مبكر، من الاستغناء عن عمليات مثل الكيميائي وتجميع خلية في حد ذاته (10).

فحص التجميع في حد ذاته هو وسيلة قوية لدراسة التطور المبكر للDictyostelium discoideum. ومع ذلك، هناك العديد من المزالق التي يمكن أن تؤثر على استنساخ هذه هxperiments، ولذلك فمن المهم أن تؤخذ عدة عوامل في الاعتبار: عمر الخلايا ويلعب دورا هاما عند تحليل خلايا كورا -deficient. هذه الخلايا تميل إلى تعويض النمط الظاهري وإعادة تجميع-بعد حوالي 2 أسابيع من وجهة يتم إذابة فيها. كثافة الخلايا هي عامل حاسم أيضا، كما الخلايا التي تظهر وجود خلل الإشارات وليس عيبا الكيميائي قد تميل إلى تجميع بكثافة أعلى نظرا لزيادة تركيز العوامل المجاعة في وقت مبكر. لا يمكن المبالغة في أهمية الفرز الدقيق والتخفيف من الخلايا في هذه المقايسات. لسلالات مختلفة، وتعديل متغيرات متعددة من الفحص، مثل كثافة الخلايا، والوقت من الالتزام، والوقت من التنمية، سوف تكون هناك حاجة. فحص التجميع كما هو موضح هنا هو أسلوب متعدد الاستعمالات التي يمكن تعديلها لتناسب استفسارات مختلفة: يمكن تجويع الخلايا، أو تطوير يمكن تحفيز أو تثبيط استخدام مركبات مختلفة، كلنظرا لتعديل محدد من التجميع. يسمح صفها هنا انشاء أيضا عن النهج مشاركات لتحديد السلالات مع العيوب التنموية في وقت مبكر، وكذلك لتحديد الجينات أو العوامل التي تعتبر هامة للتنمية في وقت مبكر. وهذا هو أيضا العيب الرئيسي في هذه الطريقة: فحص التجميع هو نسخة مخفضة للدورة تنموية كاملة. ولذلك، فإنه ليست مناسبة لتحليل الظواهر التي تؤثر على مراحل لاحقة من دورة التنموية. والميزة الرئيسية هي إمكانية اعتماد فحص التجميع على نطاق واسع وشكل الآلية: في لوحات 48-جيدا ومع 16 ساعة من تطوير سجلت خلال التصوير الآلي، وفحص تجميع يبرهن على أن تكون المزيد من الوقت ومن التطوير في مجال كفاءة في استخدام الموارد لوحات أجار.

في التجارب التي نعمل تجاوز الاستجابة للجوع في وقت مبكر، وذلك باستخدام نبضات المخيم تطبيقها خارجيا، أظهرنا أن coronin وتشارك في الاستشعار من العوامل التي يفرزها <م> خلايا Dictyostelium على الموت جوعا. آلية دقيقة من coronin بوساطة والإشارات خلال الاستجابة للجوع في وقت مبكر لا تزال غير واضحة. وقد تم دراسة العديد من العوامل التي تدخل في هذه المرحلة من التنمية، ولا سيما عامل المتوسط ​​مشروط (CMF) 25،26. ومع ذلك، ما إذا كان مركز المرأة والأسرة يتصرف من تلقاء نفسها أو مع زملاء العوامل لا يزال غير واضح ويفهم شلال يشير إلا بصفة جزئية. باستخدام قدرة تجميع الخلايا Dictyostelium في ظل ظروف المغمورة التي توصف هنا لقراءة نتيجته ايجابية للتنمية تسمح لإجراء تجارب فحص على نطاق واسع بطريقة فعالة وقت بالمقارنة مع المقايسات التجميع على الأسطح أجار. ومع ذلك، المقايسات تجميع في ظل ظروف مغمورة لا يكون لها مساوئ لا تفي دورة تنموية كاملة كما سيتم اعتقال الخلايا في مرحلة التجميع الأولية. ولذلك، فإن تقنية وصفها هنا ليست مناسبة لدراسة صناعة تج التنموي لاحقالمؤسسات الصغيرة الحجم. وباختصار، فإن المنهج التجريبي موثقة هنا قد تسمح بالمزيد من توصيف المحتملين عامل الجوع في وقت مبكر (ق) التي تحفز coronin تعتمد على إدخال إلى الاستجابة للجوع في وقت مبكر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone BD Bioscience 211693
Thiotone E peptone BD Bioscience 211684
Yeast extract BD Bioscience 212750
Glucose AppliChem A3666
Na2HPO4*2H2O Fluka 71643
KH2PO4 AppliChem A1043
dihydrostreptomycin-sulfate Sigma-Aldrich D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) self made
0.45-μm Filtropure S filter Sarstedt 83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate Fisher Scientific 08-772-1H
Cellobserver microscope Zeiss custom built
AxioVision software Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump ISMATEC ISM 931
Axiovert 135M microscope Zeiss 491237-0001-000
Incubation Shaker Inforst HT Minitron

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 112،
التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; من جانب تجميع فحوصات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drexler, S. K., Brogna, F., Vinet,… More

Drexler, S. K., Brogna, F., Vinet, A., Pieters, J. Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays. J. Vis. Exp. (112), e53972, doi:10.3791/53972 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter