Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/53972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Abstract

אמבת discoideum Dictyostelium נמצאת באדמה, האכלה על חיידקים. כאשר מקורות המזון הופכים נדירים, הם מפרישים גורמים ליזום תוכנית פיתוח רב-תאיים, במהלכה תאים בודדים chemotax לעבר מרכזי צבירה 1-4. תהליך זה תלוי בשחרור של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) 5. cAMP מופק בגלים דרך הפעולה המתואמת של cyclase adenylate ו phosphodiesterases, ונקשר לקולטנים cAMP G- חלבון בשילוב 6,7. Assay בשימוש נרחב כדי לנתח את המנגנונים מעורבים מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium eukaryote הנמוך מבוסס על התצפית של צבירת תא בתנאים שקועים 8,9. פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של התפקיד של coronin במחזור התפתחותי ברעב צלחות רקמות תרבות שקועה תמיסת מלח המאוזן (BSS) 10. Coronin A הוא חבר pr נשמרת נרחבהמשפחה otein של coronins כי היו מעורבים במגוון רחב של פעילויות 11,12. תאים Dictyostelium חסר coronin A הם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, פגם זה יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של cAMP מפל 10. הטכניקות המתוארות מחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים בשלבים הראשונים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium במעלה הזרם של מפל cAMP. לכן, ניצול assay אגרגציה זה עשוי לאפשר מחקר נוסף של coronin פונקציה ולקדם את הבנתנו ביולוגיה coronin.

Introduction

משפחת coronin של חלבונים הוא שמור ביותר ברחבי אאוקריוטים. חלבונים אלה מאופיינים על ידי הנוכחות של אזור אמינו מסוף טריפטופן-aspartate (WD) לחזור המכיל ואחריו אזור ייחודי מחובר לתחום מפותל-סליל carboxy מסוף 13,14 (איור 1). Coronins היו מעורבים במגוון של תפקודים תאיים, כולל רגולציה cytoskeletal האות התמרה 12. ביונקים, עד שש מולקולות coronin קצרות (coronin 1-6) וכן 'טנדם' coronin 7, יכולה להיות שותף הביע 12,15. Coronin 1 הוא בן המשפחה למד בצורה המקיפה ביותר, ו הוצג להיות מעורב הרס הפתוגן, הישרדות תא T ואיתות עצבית. איך, בדיוק, coronin 1 מבצע פעילויות אלה עדיין לא ברורים. בעוד coronin 1 הוצג להסדיר Ca 2 + ו cAMP תלוי איתות וכן F- תקטין cytoskeleton אפנון 16-18, שיתוף הפוטנציאל-expression של עד 7 בני משפחה ביונקים עשתה זה מאתגר ללמוד את הפונקציה מולקולרית של coronins במערכות אלה, בשל כפילויות פוטנציאליים. בניגוד אורגניזמים יונקים, discoideum Dictyostelium eukaryote נמוך מבטא רק שני בני משפחה coronin (א coronin, את ortholog של B יונקים coronin 1 ו coronin, את ortholog של יונקים coronin 7) עם כנראה לא יתירים פונקציות 15,19,20. עובדה זו הופכת discoideum Dictyostelium מודל חזק כדי ללמוד את הפונקציה של coronins.

כדי ללמוד את התפקיד של coronin ב discoideum Dictyostelium, אנו מושרה מעגל ההתפתחות ברעב צלחות רקמות תרבות המכילות תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ או באמצעות תאי סוג ברים או תאים חסרי coronin A 10. מצאנו כי התאים חסרי coronin לא הצליחו ליצור אגרגטים רבים-תאי על רעב. לקבלת הערכה כמותית מדויקת של פנוטיפ זההדמית תא חייה אוטומטית המתואר בפרוטוקול זה היא כלי חיוני. הפגם בייזום של התגובה רעב מוקדם בתאים חסר coronin A יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של מפל cAMP. היישום אקסוגני של פולסים cAMP לדמות לתחילת עבודות הפיתוח נוצל על ידי מספר מעבדות ב 8,9 בעבר. עם זאת, הליך זה ידוע גם להיות תלוי מאוד צפיפות תא ועיתוי. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן שואף להפחית variabilities הללו על מנת להבטיח רמה גבוהה של שחזור. יחדיו, טכניקות נוצלו במחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים במהלך השלבים המוקדמים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium ויש להם את הפוטנציאל לזהות החצים למעלה וכן effectors במורד הזרם של coronin פונקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

  1. שים את התגובה הרעבה מוקדם של discoideum Dictyostelium ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות.
    1. לגדל תאים DH1.10 או תאים -deficient קורה בתוך הבקבוק Erlenmayer המכיל בינוני HL-5 (1 L: 5 גרם proteose peptone, 5 גרם thiotone E peptone, 10 גלוקוז גרם, תמצית שמרים 5 גרם, 0.35 גרם Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0.35 גרם KH 2 4 PO, 0.05 גרם dihydrostreptomycin-סולפט, pH 6.6) בשעה 22 ° C באינקובטור רועד עם סיבוב של 160 סל"ד. שמור התאים בצפיפות בין 0.01 x 10 6 תאים / מ"ל ו -2 x 10 6 תאים / מ"ל.
    2. בדוק צבירת תא, על ידי תאי DH1.10 קצירת יומן פאזיים וגדל 21 או תאי -deficient קורה 10 שנוצרו ברקע DH1.10, גדלים רועדים תרבות עם מדיום HL-5 על 22 מעלות צלזיוס. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ"ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG לשטוף את התאים פעמיים BSS (10 mM NaCl, 10 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl 2, pH 6.5).
    3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. כתוצאה מכך, תאי צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 סנטימטר בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס BSS.
    4. דמיינו צבירה ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות כפי שתואר קודם לכן 10, לקחת תמונות כל 135 שניות. באמצעות הדמית תא חי להגדיר מצויד האובייקטיבי 5X ומצלמת מכשיר אלקטרונים-הכפלת תשלום מצמידים אוטומתית את התוכנה המתאימה (ראה לוח חומרים).
  2. פועם cAMP של תאים discoideum Dictyostelium במהלך רעב.
    1. לבחון את השפעת פולסים cAMP לשימוש חיצוני על התפתחות תאים DH1.10 21 או תאים -deficient DH1.10 קורה 10, על ידי איסוף תאים. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ"ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף פעמיים BSS.
    2. couNT תאים באמצעות hemocytometer ו resuspend התאים בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מ"ל ב BSS. לנער את תרבויות (160 סל"ד) בשעה 22 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני יישום קטניות. להוסיף קטניות cAMP באמצעות משאבת peristaltic נשלט טיימר. לתכנת את המשאבה כדי לספק דופק שניות 5 כל 6.5 דקות של 15 μl של 50 ננומטר cAMP (ריכוז סופי) על פני תקופה של 5 שעות.
    3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. בהמשך לכך, צלחת התאים בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס"מ בצלחת 24 גם. אפשר לדבוק עבור שעה 1 ב BSS.
    4. דמיין צבירה לאחר 16 שעות ב 22 מעלות צלזיוס על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X.
  3. אינדוקציה של פיתוח discoideum Dictyostelium באמצעות חשיפה בינונית מותנה.
    1. כן בינוני מותנה טרי כמתואר 22. איסוף תאי יומן פאזיים DH1.10 21 או תאי -deficient DH1.10 קורית 10, מן רעד כתures עם המדיום HL-5 ב 22 ° C בעזרת פיפטה, צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף תאים שלוש פעמים PBM (0.02 M פוספט אשלגן, 10 מיקרומטר CaCl 2, ו 1 מ"מ MgCl 2, pH 6.1).
    2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, resuspend אלה PBM בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מ"ל ולנער במשך 20 שעות ב 110 סל"ד / 22 מעלות צלזיוס.
    3. אסוף בינוני מותנה לאחר צנטריפוגה ב g 400 × 3 דקות ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב 8000 גרם × במשך 15 דקות ב 4 ° C..
    4. מותנה מסנן בינוני דרך פילטר 0.45 מיקרומטר (ראה לוח חומרים) לדלל משולש ב PBM.
    5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס"מ בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס.
    6. supernatant Exchange של תאים עם המדיום המותנה שהוכן קודם לכן.
    7. דמיינו צבירהחרה 16 ​​שעות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאים חסרים coronin מופע פגם בהתפתחות מוקדמת (איור 2). בהעדר coronin תאים אינם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, המהווה את הצעד הראשוני במהלך מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium. לכן, coronin ינוגן תפקיד במהלך התגובה הרעבה מוקדם ו / או איתות cAMP. אכן, חוסר היווצרות המצרפי רב-תאיים ב בהיעדר coronin מלווה cAMP מופחת איתות 10. עם זאת, היישום של פולסים cAMP אקסוגניים מלא משחזר את פנוטיפ wild-type (איור 3). זה מקשר כי coronin A, במקום להיות מעורבים ישירות איתות cAMP, פונקציות במעלה הזרם של מפל cAMP (איור 5). כאשר תאי Dictyostelium חשופים לתנאים רעבים הוא להשרות את הפרשת הרעב מוקדם גורמי 22,23. אחד Chara הטוב ביותרגורמי cterized המעורבים בתגובה הרעבה מוקדם מותנים גורם בינוני (CMF) 22. בהתבסס על התוצאות שלנו, שערנו כי coronin גם מסדיר את הפרשת הגורמים הרעבים המוקדמים אלה או מעורב הולכים אותות המושרה על ידי גורמים אלה. על מנת להיות מסוגלים להבדיל בין שתי השפעות אלה ביצענו מותנה ניסויים בינוני. Wild-type או תאי -deficient קורים נחשפו supernatants מ -10 או wild-type המורעבת או תאי -deficient קורה (איור 4). supernatants אלה היוזמים חזק של היווצרות המצרפי רב-תאיים ולכן מכילים הגורמים ליזום מסלולי איתות התפתחותי במורד הזרם, כולל איתות cAMP. התוצאות שלנו מראות כי supernatant מתאי -deficient קורה היה מסוגל באותה מידה לגרום לפיתוח כפי שהיה עבור supernatant מתאי wild-type (איור 4). זה מקשר כי קורה -תאים לקויים מסוגלים לייצר ולהפריש גורמים רעבים מוקדם ברמות דומות שולט wild-type שלהם. עם זאת, תאי -deficient קורה הם לא מסוגלים להגיב supernatant משלהם ולא supernatant הניתן מתאי wild-type (איור 4). לכן, coronin נראה מעורב מסלולי איתות מושרים על ידי גורמים רעבים מוקדם, ולא בביטוי שלהם / הפרשת 10 (איור 5).

באופן כללי, כדי להיות מסוגל להמשיך לחקור את האותות מופרשים על ידי הרעבת תאי Dictyostelium משרי מעגל ההתפתחות, assay אגרגציה בתנאים שקועים הוא לקריאה מתוך עצמה. תאים שנזרעו בצפיפויות גבוהות המצרפי יהיה ספונטני בשל שפע של כל האותות שנקבעו. עם זאת, בצפיפויות נמוכות רק התוספת של בינוני מותנה תניע צבירה הסלולר (איור 4) 22,24

איור 1
איור 1: Coronin החלבונים יונקים discoideum Dictyostelium משפחת coronin מתאפיין בנוכחות N-terminal אזורים WD-repeat ואחריו תחום ייחודי באזור סליל מפותל-מסוף C.. בעוד יונקים להביע 7 חלבונים coronin (א), discoideum Dictyostelium מכיל רק שני בני משפחה (B), מה שהופך את הסיכון של יתירות פחות סביר כאשר לומדים את תפקידם. Coronin A הוא ortholog של יונקים coronin 1 ו- B coronin מראה מבנה תחום דומה כמו coronin 7. קיצורים: CC, תחום מפותל-סליל; א.ד., תחום ייחודי; WD חוזר, טריפטופן חזרות -aspartate. אורך ניתן עבור רצפי עכבר (א) בחומצות אמינו (aa). שונה מן Pieters et al., 2013 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. קורה - discoideum Dictyostelium אינם מסוגלים לצבור במהלך התגובה רעב מוקדם wild-type (א) או -deficient קורה (ב) בתאים Dictyostelium היו זורעים לתוך צלחות multiwell בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / 2 ס"מ, מורעב ב BSS, צלם על פני תקופה של 20 שעות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר..jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: חיצוני להחיל cAMP פולסים להציל את פגם התפתחותי מוקדם של קורה - discoideum Dictyostelium wild-type וגטטיבי (A ו- B) ותאי -deficient קורה (C ו- D) נשטפו ומורעבת עבור שעה 2 בטרם פעם עם (B. ו- D) או בלי (A ו- C) 50 ננומטר cAMP במהלך 5 שעות כל 6.5 דקות ההשעיה. תאים נשטפו אז, resuspended ב BSS, והניח על צלחת פטרי בצפיפות של 10 x 10 4 תאים / 2 ס"מ. תמונות צולמו 20 שעות לאחר הזריעה של התאים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: discoideum Dictyostelium -deficient קורה מסוגלים לייצר כל הגורמים הנדרשים לזירוז התפתחותית אך אינם מסוגלים להגיב אליהם באופן אקספוננציאלי גדל wild-type ותאי -deficient קורה נשטפו PBM ו זורעים לתוך צלחות multiwell בצפיפות של (. 5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס"מ, מודגרות במדיום מותנה המתקבל wild-type (א) או תאים רעבים -deficient קורה (B). התמונות צולמו 16 שעות לאחר זריעת התאים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר."Target =" tp_upload / 53,972 / 53972fig4large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. מודל הנוכחי של Coronin פונקציה ב discoideum Dictyostelium Coronin א 'מעורבת הולך אותות של הגורם (ים) המופרש במהלך התגובה הרעבה מוקדם מוביל האינדוקציה של מפל cAMP ואת ההתקדמות דרך המחזור התפתחותית. שונה מן Vinet et al., 2014 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החלבונים coronin נמצאים מינים רוב clade איקריוטיים. Coronin Dictyostelium discoideum, את homologue של יונקים coronin 1, הוא מעורב בתגובה רעב מוקדם, מאז coronin A-לקוי התאים אינם מסוגלים ליצור מרכזי צבירה במהלך המוקדמות התפתחותי מחזור 10. כדי להיות מסוגל כמותית להעריך נכונת העיכוב בהתפתחות בין הזנים, הדמית תא מיקרוסקופ חי הגדרה עם בקר השלב אוטומטית היא כלי חיוני.

ד discoideum מנצל cAMP בתור מולקולת איתות חשובה במהלך כמה שלבים של מחזור החיים שלו 1-4. אחד המחסומים שבמהלכה cAMP שנדרש הוא המעבר מתא בודד להיווצרות של מבנים רבים-תאיים. תחילתה של גלי במחנה לאחר ~ 6 שעות של רעב הנקלטות על ידי התאים מספקות את אות chemotactic לנוע לעבר מרכז צבירה 5. cAMP אלהגלי ניתן חיקה באופן ניסיוני על ידי פועם המורעב ד תאי discoideum עם cAMP כל 6.5 דקות על פני תקופה של 5 שעות 8,9. באמצעות הליך זה חשוב להרעיב את התאים עד 2H לפני החלת פולסים cAMP, על מנת לקבל תוצאות אמינות. ניצול זה הניסיון להגדיר הצלחנו להראות כי coronin פועל נגד זרם של איתות cAMP, כמו פולסים חיצוני להחיל אלה הציל את הפיתוח בתאי -deficient קורה (איור 3 ו -5). תוצאות אלו גם עולות כי בעוד coronin נראה יש תפקיד חיוני חישת התגובה הרעבה מוקדם, זה לוותר על תהליכים כגון chemotaxis ותא צבירה כשלעצמה 10.

את assay אגרגציה עצם הוא שיטה חזקה לחקר ההתפתחות המוקדמת של discoideum Dictyostelium. עם זאת, יש מלכודות שיכולות להשפיע על השחזור של דואר אלהxperiments, ועל כן חשוב כי מספר גורמים נלקחים בחשבון: גיל התאים ממלא תפקיד חשוב בעת ניתוח תאים -deficient קורה. תאים אלה נוטים לפצות את הפנוטיפ מחדש המצרפי כ אחרי 2 שבועות מהנקודה הם מופשרים. צפיפות התאים הוא גורם מכריע, כמו גם, כמו תאים המראים פגם איתות ולא פגמו chemotactic אולי נוטים לצבור בצפיפויות גבוהות יותר בשל הריכוז גבוה יותר של גורמי רעב מוקדם. חשיבותה של הספירה המדויקת דילול של תאים אלה מבחנים לא יכולה להיות מוגזמת. עבור זנים שונים, התאמה של משתנים מרובים של assay, כגון צפיפות תא, זמן של דבקות, זמן פיתוח, תידרש. את assay אגרגציה כמתואר כאן הוא טכניקה צדדית כי יכול להיות שונה כדי להתאים פניות שונות: התאים ניתן להרעיב, או פיתוח יכול להיות מגורה או עכבות באמצעות תרכובות שונות, כלבשל עבור אפנון של צבירה ספציפית. הכאן תאר הגדרה גם מאפשרת גישות משוחדות לזהות זנים עם פגמים התפתחותיים מוקדם, כמו גם עבור זיהוי של גנים או גורמים אשר חשובים בהתפתחות מוקדמת. זהו גם החיסרון העיקרי של השיטה: את assay צבירה הוא גרסה מופחתת של מעגל ההתפתחות המלאה. לכן, זה לא מתאים לניתוח של פנוטיפים המשפיעים בשלבים מאוחרים יותר של מחזור התפתחותית. היתרון העיקרי הוא האפשרות לאמץ את assay הצבירה בקנה מידה גדול פורמט אוטומטי: ב 48-גם צלחות עם 16 שעות של פיתוח רשם במהלך הדמיה אוטומטית, assay אגרגציה מוכיח להיות יותר זמן ומשאבים ויעילים יותר מאשר פיתוח על צלחות אגר.

בניסויים שבהם עקפנו את התגובה רעב מוקדם, באמצעות פולסים cAMP לשימוש חיצוני, הראינו ש- A coronin מעורב חישה של גורמים המופרשים <em> תאי Dictyostelium על רעב. המנגנון המדויק של איתות-תיווך coronin במהלך התגובה הרעבה מוקדם עדיין לא ברור. מספר גורמים מעורבים בשלב זה של התפתחות נחקרו, בגורם בינוני מותנה בפרט (CMF) 25,26. עם זאת, אם CMF פועל בכוחות עצמו או עם שיתוף גורמים לא ברור ואת מפל האיתות שלו מובן באופן חלקי בלבד. באמצעות יכולת הצבירה של תאי Dictyostelium בתנאים שקועים כאן מתוארים לקריאה מתוך חיובית לפיתוח מאפשר לבצע ניסויי הקרנה בקנה מידה גדולה באופן זמן יעיל לעומת מבחני אגרגציה על משטחים אגרו. עם זאת, מבחני אגרגציה בתנאים שקועים יש את החסרון של לא מקיים את מעגל התפתחות המלא כתאים ייעצרו בשלב ההצטברות הראשוני. לכן, הטכניקה המתוארת כאן אינה מתאימה לבחינת proce התפתחותי מאוחר יותרsses. לסיכום, הגישה הניסויית המתועד כאן עשויה לאפשר אפיון נוסף של גורם רעב מוקדם פוטנציאל (ים) משרי כניסת A-תלוי coronin את התגובה הרעבה מוקדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone BD Bioscience 211693
Thiotone E peptone BD Bioscience 211684
Yeast extract BD Bioscience 212750
Glucose AppliChem A3666
Na2HPO4*2H2O Fluka 71643
KH2PO4 AppliChem A1043
dihydrostreptomycin-sulfate Sigma-Aldrich D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) self made
0.45-μm Filtropure S filter Sarstedt 83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate Fisher Scientific 08-772-1H
Cellobserver microscope Zeiss custom built
AxioVision software Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump ISMATEC ISM 931
Axiovert 135M microscope Zeiss 491237-0001-000
Incubation Shaker Inforst HT Minitron

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 112, Coronin A התפתחות מוקדמת cAMP צבירה בתגובה רעבה בינוני מותנות
חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drexler, S. K., Brogna, F., Vinet,… More

Drexler, S. K., Brogna, F., Vinet, A., Pieters, J. Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays. J. Vis. Exp. (112), e53972, doi:10.3791/53972 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter