Abstract
Dictyostelium discoideum amöba finns i jord, livnär sig på bakterier. När matkällor blir knappa, de utsöndrar faktorer att inleda en flercellig utvecklingsprogram, under vilken enskilda celler chemotax mot aggregering centra 1-4. Denna process är beroende på frisättningen av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) 5. cAMP produceras i vågor genom samordnade åtgärder av adenylatcyklas och fosfodiesteraser, och binder till G-proteinkopplade receptorer cAMP 6,7. En allmänt använd analys för att analysera de mekanismer som är involverade i utvecklingscykeln för lägre eukaryot Dictyostelium discoideum baseras på observation av cell aggregation i submersa betingelser 8,9. Detta protokoll beskriver analys av den roll coronin A i utvecklingscykeln av svält i vävnadsodlingsplattor nedsänkta i balanserad saltlösning (BSS) 10. Coronin A är en medlem av den allmänt bevarade protein familj av coronins som har implicerats i ett stort antal olika aktiviteter 11,12. Dictyostelium celler som saknar coronin A är oförmögna att bilda flercelliga aggregat, och denna defekt kan räddas genom att tillföra pulser av cAMP, vilket antyder att coronin A akter uppströms om cAMP kaskad 10. De tekniker som beskrivs i dessa studier ger robusta verktyg för att undersöka funktioner av proteiner under de inledande skedena av utvecklingscykeln av Dictyostelium discoideum uppströms cAMP kaskad. Därför kan utnyttja denna aggregering analys tillåta ytterligare studier av coronin En funktion och förbättra vår förståelse av coronin biologi.
Introduction
Den coronin familj av proteiner är mycket konserverad hela eukaryoter. Dessa proteiner kännetecknas av närvaron av en aminoterminal tryptofan-aspartat (WD) upprepa-innehållande regionen följt av en unik region som är ansluten till en karboxiterminal coiled-coil domain 13,14 (Figur 1). Coronins har varit inblandade i en mängd olika cellfunktioner, inklusive cytoskelettala reglering och signaltransduktion 12. I däggdjur, upp till sex korta coronin molekyler (coronin 1-6) samt en "tandem" coronin 7, kan samuttryckas 12,15. Coronin ett är den mest omfattande studerade familjemedlem, och visade sig vara inblandade i patogen förstörelse, T-cellöverlevnad och neuronal signalering. Hur exakt, coronin en utför dessa aktiviteter är fortfarande oklart. Medan coronin en visades reglera Ca2 + och cAMP-beroende signalering liksom F-aktin cytoskelettet module 16-18, den potentiella co-expression på upp till 7 familjemedlemmar i däggdjur har gjort det svårt att studera den molekylära funktionen av coronins i dessa system, på grund av potentiella uppsägningar. Till skillnad från däggdjursorganismer, uttrycker lägre eukaryot Dictyostelium discoideum endast två coronin familjemedlemmar (coronin A, den ortolog av däggdjurs coronin en och coronin B, den ortolog av däggdjurs coronin 7) med till synes icke-redundanta funktioner 15,19,20. Detta faktum gör Dictyostelium discoideum en potent modell för att studera funktionen av coronins.
För att studera den roll som coronin A i Dictyostelium discoideum, inducerade vi utvecklingscykeln genom svält i vävnadsodlingsplattor innehållande balanserad saltlösning (BSS) buffert med användning av antingen vildtyp-celler eller celler som saknar coronin A 10. Vi fann att celler som saknar coronin A kunde inte bilda flercelliga aggregat vid svält. För en exakt kvantitativ bedömning av denna fenotyp denautomatiserad levande cell imaging beskrivs i detta protokoll är ett viktigt verktyg. Defekten i inledandet av tidig svält svar i celler som saknar coronin A kan räddas genom att tillföra pulser av cAMP, vilket tyder på att coronin A agerar uppströms cAMP kaskad. Den exogena tillämpning av cAMP pulser för att simulera inledandet av utvecklingen har använts av flera laboratorier under de senaste 8,9. Emellertid är detta förfarande också känt för att vara starkt beroende av celldensiteter och timing. Därför det protokoll som beskrivs här syftar till att minska dessa variabilitet i syfte att garantera en hög grad av reproducerbarhet. Sammantaget teknikerna som används i dessa studier ger robusta verktyg för att undersöka funktioner av proteiner under tidiga skeden av utvecklingscykeln av Dictyostelium discoideum och har potential att identifiera upp- liksom nedströms effektorer av coronin En funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- Observera tidiga svält respons Dictyostelium discoideum av tidsförlopp mikroskopi.
- Växa DH1.10 celler eller CORA med brist celler i en Erlenmayerkolv innehållande HL-5-medium (för 1 L: 5 g proteospepton, 5 g thiotone E pepton, 10 g glukos, 5 g jästextrakt, 0,35 g Na 2 HPO 4 * 7 H2O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g dihydrostreptomycin-sulfat, pH 6,6) vid 22 ° C i ett skakande inkubator med en rotation av 160 varv per minut. Hålla cellerna vid en densitet mellan 0,01 x 10 6 celler / ml och 2 x 10 6 celler / ml.
- Undersök cell aggregering, genom att skörda log-fas växande DH1.10 celler 21 eller CORA med brist celler 10 genereras i DH1.10 bakgrunden, som odlas i skakodling med HL-5-medium vid 22 ° C. För att göra detta, ta lämplig mängd celler (vanligtvis mellan 10 och 50 ml), centrifugera i 3 min vid 400 xg och tvätta cellerna två gånger i BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5).
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Därefter platt celler vid en densitet av (5, 10, 20, eller 40) x 10 4 celler / cm 2 i en 24-brunnsplatta. Tillåta dem att vidhäfta under 1 timme vid 22 ° C i BSS.
- Visualisera aggregering av tidsförlopp mikroskopi såsom beskrivits tidigare 10, tar bilder varje 135 sek. med hjälp av en levande cell imaging inrätta utrustad med 5X objektiv och en elektron multiplicera charge-coupled device kamera automatiserat med lämplig mjukvara (se Materials tabell).
- cAMP pulserande av Dictyostelium discoideum celler under svält.
- Undersöka effekten av externt applicerade cAMP pulser på utvecklingen av DH1.10 cellerna 21 eller DH1.10 CORA med brist cellerna 10, genom att skörda celler. För att göra detta, ta lämplig mängd celler (vanligtvis mellan 10 och 50 ml), centrifugera i 3 min vid 400 xg och tvätta två gånger i BSS.
- Count-celler med användning av en hemocytometer och återsuspendera cellerna till en densitet av 1 x 10 7 celler / ml i BSS. Skaka kulturerna (160 rpm) vid 22 ° C under 2 h före applicering pulser. Lägg cAMP pulser med hjälp av en timer kontrolleras peristaltisk pump. Programmera pumpen att leverera en 5 sek puls var 6,5 min av 15 | il av 50 nM cAMP (slutlig koncentration) under en period av 5 timmar.
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Därefter platta cellerna vid en densitet av (5, 10, 20, eller 40) x 10 4 celler / cm 2 i en 24-brunnsplatta. Gör det möjligt att vidhäfta under 1 h i BSS.
- Visualisera aggregering efter 16 h vid 22 ° C genom ljusfält mikroskopi med användning av ett 5X objektiv.
- Induktion av Dictyostelium discoideum utveckling genom exponering för konditionerat medium.
- Bered en färsk konditionerat medium som beskrivits 22. Samla log-fas DH1.10 celler 21 eller DH1.10 CORA med brist celler 10, skakar kultgärder med HL-5-medium vid 22 ° C med hjälp av en pipett, centrifug under 3 minuter vid 400 xg och tvätta cellerna tre gånger i PBM (0,02 M kaliumfosfat, 10 iM CaCl2 och 1 mM MgCl2, pH 6,1).
- Räkna celler med användning av en hemocytometer, återsuspendera dessa i PBM vid en densitet av 1 x 10 7 celler / ml och skaka i 20 h vid 110 rpm / 22 ° C.
- Samla konditionerat medium efter centrifugering vid 400 x g under 3 min och klargöra genom centrifugering vid 8000 x g under 15 min vid 4 ° C.
- Filter konditionerat medium genom ett 0,45 um filter (se Material tabell) och späd trefaldig i PBM.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer och platta vid en densitet av (5, 10, 20, eller 40) x 10 4 celler / cm 2 i en 24-brunnsplatta. Tillåta dem att vidhäfta under 1 timme vid 22 ° C.
- Utbyte supernatanten av cellerna med den tidigare beredda konditionerade mediet.
- Visualisera aggregering enfter 16 timmar efter ljusfält mikroskopi med hjälp av en 5X mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler som lider brist på coronin En show en defekt i tidig utveckling (Figur 2). I avsaknad av coronin A-celler inte kan bilda flercelliga aggregat, som är det första steget under utvecklingscykeln Dictyostelium discoideum. Därför verkar coronin A att spela en roll under den tidiga svält respons och / eller cAMP-signalering. I själva verket är avsaknaden av multicellulär aggregatbildning i frånvaro av coronin A åtföljs av minskad cAMP signalering 10. Tillämpningen av exogena cAMP pulser åter helt vildtyp fenotyp (Figur 3). Detta implicerar att coronin A, i stället för att direkt inblandade i cAMP-signalering, funktioner uppströms cAMP kaskad (Figur 5). När Dictyostelium celler utsätts för svältande villkor de inducerar utsöndringen av tidig svält faktorer 22,23. En av de bästa characterized faktorer som i början av svält svar konditionerat medium faktor (CMF) 22. Baserat på våra resultat, hypotes vi att coronin A reglerar antingen utsöndringen av dessa tidiga svält faktorer eller är involverad i signaltransduktion som induceras av dessa faktorer. För att kunna skilja mellan dessa två effekter vi utförs konditionerat medium experiment. Vildtyp eller CORA med brist celler exponerades för supernatanter från antingen svalt vildtyp eller CORA med brist celler 10 (figur 4). Dessa supernatanter är potenta initiativtagare flercelliga aggregatbildning och därför innehåller faktorer som initierar nedströms utvecklingssignalvägar, inklusive cAMP-signalering. Våra resultat visar att supernatant från CORA med brist-celler var lika kapabla att inducera utveckling som var fallet för supernatanten från celler av vild typ (fig 4). Detta implicerar att CORA -saknande celler kan producera och utsöndra tidiga svältfaktorer på liknande nivåer till deras vildtyp kontroller. Men CORA med brist celler varken kan svara på sin egen supernatant eller till supernatant tillhandahålls från celler av vild typ (Figur 4). Därför verkar coronin A vara inblandade i signalvägar som induceras av tidiga svält faktorer, snarare än deras uttryck / sekre 10 (Figur 5).
I allmänhet, för att kunna ytterligare undersöka de signaler som utsöndras av svältande Dictyostelium celler som inducerar utvecklingscykeln, sammanläggning analysen under submersa betingelser är en potent utläsning. Celler sådda vid högre densiteter kommer spontant aggregat på grund av ett överflöd av alla nödvändiga signaler. Dock vid lägre densiteter endast tillsats av konditionerat medium kommer att inducera cellulär aggregation (figur 4) 22,24
Figur 1: Coronin proteiner närvarande i däggdjur och Dictyostelium discoideum Den coronin familjen kännetecknas av närvaron av N-terminala WD-upprepade områden följt av ett unikt domän och en C-terminal tvinnat slingområde.. Medan däggdjur uttrycker 7 coronin proteiner (A), endast Dictyostelium discoideum innehåller två familjemedlemmar (B), vilket gör risken för övertalighet mindre sannolikt när man studerar deras funktion. Coronin A är ortolog av däggdjurs coronin en och coronin B visar en liknande domänstruktur som coronin 7. Förkortningar: CC, lindad spole domän; UD, unik domän; WD upprepar, tryptofan -aspartat upprepningar. Längd ges för mussekvenser (A) i aminosyror (aa). Modifierad från Pieters et al., 2013 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. CORA - Dictyostelium discoideum är oförmögna att aggregera under den tidiga svält svaret Vildtyp (A) eller CORA med brist på (B) Dictyostelium-celler såddes i multibrunnplattor vid en densitet av 2 x 10 5 celler / cm 2, svälta i BSS, och avbildas över en period av 20 h. Skalstreck = 100 | j, m..jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tillämpas externt cAMP pulser rädda den tidiga utvecklingsdefekt av CORA - Dictyostelium discoideum Vegetativ vildtyp (A och B) och CORA med brist celler (C och D) tvättades och svälta under 2 timmar innan den pulsade med (B. och D) eller utan (A och C) 50 nM cAMP under 5 h varje 6,5 min i suspension. Cellerna tvättades därefter, återsuspenderades i BSS, och placerades i en petriskål med en täthet av 10 x 10 4 celler / cm 2. Bilder togs 20 h efter ympning av cellerna. Skalstreck = 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CORA med brist Dictyostelium discoideum kan producera alla nödvändiga faktorer för utvecklings induktion men kan inte svara på dem exponentiellt växande vild-typ och Cora med brist cellerna tvättades i PBM och såddes i flerbrunnsplattor med en täthet av (. 5, 10, 20, eller 40) x 10 4 celler / cm 2, inkuberades i konditionerat medium erhållet från vildtyp (A) eller CORA med brist svältande celler (B). Bilderna togs 16 timmar efter sådd av cellerna. Skalstreck = 100 | j, m.tp_upload / 53.972 / 53972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Aktuell modell av Coronin En funktion i Dictyostelium discoideum Coronin A är involverad i signaltransduktion av faktor (er) som utsöndras under den tidiga svält svar som leder till induktionen av cAMP kaskad och fortskridande genom utvecklingscykeln. Modifierad från Vinet et al., 2014 10. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De coronin proteiner som finns i de flesta taxa av den eukaryota clade. Dictyostelium discoideum coronin A, homolog av däggdjurs coronin 1, är involverad i den tidiga svält svar, eftersom coronin A-bristande celler inte är i stånd att bilda aggregering centra under den tidiga utvecklings cykel 10. För att kunna kvantitativt och exakt bedöma fördröjningen i utvecklingen mellan stammarna, är ett mikroskop levande cell imaging set-up med den automatiserade steget styrenheten ett viktigt verktyg.
D. discoideum utnyttjar cAMP som en viktig signalmolekyl under flera stadier av dess livscykel 1-4. En av de kontrollpunkter under vilken cAMP krävs är övergången från en enda cell till bildningen av multicellulära strukturer. Uppkomsten av cAMP vågor efter ~ 6 timmar av svält känns av cellerna och ger kemotaktiska signalen att röra sig mot en sammanläggning centrum 5. dessa cAMPvågor kan imiteras experimentellt genom att pulsa svältande D. discoideum celler med cAMP varje 6,5 minut under en period av 5 h 8,9. Med hjälp av detta förfarande är det viktigt att svälta cellerna upp till 2h innan tillämpa cAMP pulser, för att få tillförlitliga resultat. Med hjälp av detta experimentella inrättat vi kunde visa att coronin A agerar uppströms av cAMP-signalering, eftersom dessa externt applicerade pulser räddade utvecklingen i CORA med brist celler (Figur 3 och 5). Dessa resultat visar också att medan coronin A verkar ha en viktig roll i avkänning av tidig svält svar är det onödigt för processer såsom kemotaxi och cell aggregering i sig 10.
Den aggregationsanalys själv är en robust metod för att studera den tidiga utvecklingen av Dictyostelium discoideum. Emellertid finns det flera fallgropar som kan påverka reproducerbarheten av dessa experiments, och det är därför viktigt att flera faktorer beaktas: ålder celler spelar en viktig roll när man analyserar CORA med brist celler. Dessa celler tenderar att kompensera fenotypen och åter aggregat ungefär efter 2 veckor från den punkt de tinas. Densiteten av cellerna är en avgörande faktor också, eftersom celler som visar en signaldefekt och inte en kemotaktisk fel kan ha en tendens att aggregera vid högre densiteter på grund av den ökade koncentrationen av tidiga svält faktorer. Vikten av den precisa räkning och spädning av celler i dessa analyser kan inte överskattas. För olika stammar, en justering av multipla variabler i analysen, såsom celldensiteter, tid på vidhäftning, tiden för utvecklingen, kommer att erfordras. Den aggregationsanalys som beskrivs här är en mångsidig teknik som kan modifieras för att passa olika förfrågningar: cellerna kan svälta eller utveckling kan stimuleras eller inhiberas med hjälp av olika föreningar, allagrund för en specifik modulering av aggregering. Den här beskrivna installation gör det också möjligt för objektiva metoder för att identifiera stammar med tidiga utvecklingsdefekter, liksom för identifiering av gener eller faktorer som är viktiga för tidig utveckling. Detta är också metodens stor nackdel: den aggregering analysen är en reducerad version av den fullständiga utvecklingscykeln. Därför är det inte lämpligt för analys av fenotyper som påverkar senare skeden av utvecklingscykeln. Den största fördelen är möjligheten att anta aggregering analys för att i stor skala och automatiserad format: i 48-brunnsplattor och med 16 timmar av utveckling registrerats under automatiserad bildbehandling, bevisar aggregering analys för att vara mer tid och resurseffektiv än utvecklingen på agarplattor.
I experiment där vi förbikopplade tidig svält respons, med användning av externt applicerade cAMP pulser, visade vi att coronin A är involverad i avkänningen av utsöndrade faktorer med <em> Dictyostelium celler vid svält. Den exakta mekanismen för coronin A-medierad signalering under den tidiga svält svar är fortfarande oklart. Flera faktorer som under detta skede av utvecklingen har studerats, i synnerhet konditionerat medium faktor (CMF) 25,26. Men om CMF agerar på egen hand eller med kofaktorer förblir oklar och dess signaleringskaskad är endast delvis förstås. Använda aggregering kapacitet Dictyostelium celler under submersa betingelser här beskrivs som en positiv utläsning för utveckling gör det möjligt att genomföra storskaliga screeningsexperiment på ett tidseffektivt sätt jämfört med aggregeringsanalyser på agar ytor. Men aggregering analyser under submersa betingelser har den nackdelen att de inte uppfyller hela utvecklingscykeln celler kommer att arresteras i den första aggregering scenen. Därför är inte lämplig för undersökning av senare utvecklings förfa den teknik som beskrivs härSSES. Sammanfattningsvis kan den experimentella tillvägagångssätt dokumenteras här tillåter ytterligare karakterisering av potentiella tidiga svält faktor (er) som inducerar coronin A-beroende inträde i början av svält svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J.
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E.
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
