Abstract
Dictyostelium의 discoideum의 아메바는 박테리아에 먹이 토양에서 발견된다. 음식 공급원이 부족해질 때, 그들은 단일 세포 집계 센터 1-4 향해 chemotax 동안 다세포 개발 프로그램을 시작하는 인자를 분비. 이 과정은 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) (5)의 분리에 의존한다. 캠프는 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 포스 포의 공동 작업을 통해 파도에서 생산, 및 G 단백질 결합 된 cAMP 수용체 6,7 결합된다. 널리 사용되는 분석은 잠긴 상태에서 8,9 세포 응집의 관찰에 기초 하부의 진핵 Dictyostelium discoideum의 개발주기와 관련된 메커니즘을 분석한다. 이 프로토콜은 평형 염 용액 (BSS) (10)에 잠긴 조직 배양 플레이트에 기아로 발달주기 coronin A의 역할의 분석을 설명한다. Coronin A는 광범위하게 보존 된 PR의 구성원활동 (11, 12)의 다양한 연루되어 coronins의 otein 가족.를 coronin 부족한 Dictyostelium 세포는 다세포 응집체를 형성 할 수없는, 이러한 결함은 제안 된 cAMP의 펄스를 공급하여 구출 될 수의 상류 작용 coronin 캠프는 10 계단식. 이러한 연구에서 설명 된 기술은 캠프 캐스케이드의 상류 Dictyostelium discoideum의 개발주기의 초기 단계에서의 단백질의 기능을 조사하기 위하여 강력한 도구를 제공한다. 따라서이 집계 분석을 이용하여 함수를 coronin의 추가 연구를 허용하고 coronin 생물학에 대한 우리의 이해를 진행할 수있다.
Introduction
단백질의 coronin 제품군은 높은 진핵 생물에 걸쳐 보존됩니다. 이 단백질은 아미노 말단 트립토판 아스파 테이트 (WD) 반복 함유 카르복시 말단 꼬인 코일 도메인 (13, 14)에 접속 된 고유 영역 다음 영역 (도 1)의 존재를 특징으로한다. Coronins는 골격 조절 및 신호 전달 (12)을 포함한 세포 기능의 다양성에 연루되어왔다. 포유 동물에서, 최대 6 개의 짧은 coronin 분자 (coronin 1-6)뿐만 아니라 7 coronin는 '텐덤', 12,15 공동 발현 될 수있다. Coronin 1은 가장 광범위하게 연구 가족 구성원이며, 병원균 파괴, T 세포 및 신경 세포의 생존 시그널링에 관여하는 것으로 나타났다. 어떻게, 정확히, coronin 1은 이러한 활동을 수행하는 것은 확실하지 않다. 1 coronin하는 칼슘 및 캠프 종속 신호뿐만 아니라 F - 굴지으로 세포 골격 변조 16-18, 잠재적 인 협력을 조절하는 것으로 나타났다 동안포유 동물에서 최대 7 가족의 -expression는 도전으로 인해 잠재적 중복에, 이러한 시스템에 coronins의 분자 기능을 공부했다. 포유 동물의 생물과는 달리, 낮은 진핵 생물의 Dictyostelium의 discoideum은 분명히 비 중복 기능 15,19,20 만이 coronin 가족 (coronin의 A, 포유 동물 coronin 1 coronin B의 ortholog, 포유 동물 coronin 7의 ortholog)을 표현한다. 이 사실은 Dictyostelium의 discoideum에게 coronins의 기능을 연구하는 강력한 모델을 만든다.
Dictyostelium의 discoideum에서 coronin A의 역할을 연구하기 위해, 우리는 10 coronin 결여 야생형 세포 또는 세포를 사용하여 평형 염 용액 (BSS) 버퍼를 포함하는 조직 배양 플레이트에 기아로 발달주기를 유도. 우리는 coronin 부족한 세포가 기아에 따라 다세포 집계를 형성 할 수없는 것으로 나타났다. 이 본 표현형의 정확한 정량 평가이 프로토콜에 설명 된 자동화 라이브 세포 이미징은 중요한 도구입니다. 을 coronin 부족한 세포에서 초기 기아 응답의 시작에 결함이 캠프 폭포의 상류 행위를 coronin 것을 제안, 캠프의 펄스를 공급하여 구조 할 수 있습니다. 발전 개시를 시뮬레이트 된 cAMP 펄스 외인성 출원은 과거 8,9 여러 실험실에서 이용되고있다. 그러나,이 절차는 세포 밀도 및 타이밍에 크게 의존하는 것으로 알려져있다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 재현성의 높은 수준을 보장하기 위해 이러한 가변성을 감소시키는 것을 목적으로한다. 종합하면, 이들 연구에 이용 된 기술은 Dictyostelium의 discoideum의 개발주기의 초기 단계에서의 단백질의 기능을 조사하기 위하여 강력한 도구를 제공하고, 업 식별뿐만 아니라 기능 coronin 하류 이펙터 할 가능성이있다.
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Protocol
- 시간 경과 현미경에 의해 Dictyostelium의 discoideum의 초기 기아 응답을 관찰한다.
- HPO 4 5 g의 proteose 펩톤 5 g thiotone의 E 펩톤 10 g 글루코스, 5 g의 효모 추출물, 0.35 g이 나트륨 : 1 L에 대해 HL-5 매체 (함유의 Erlenmayer 플라스크 DH1.10 세포 또는 CORA 결핍 세포 성장 * 7H 2 O, 0.35 g의 KH 160 rpm의 회전 진탕 배양기에서 22 ° C에서 2 PO 4, 0.05 g의 dihydrostreptomycin - 황산, 산도 6.6). 0.01 × 106 세포 / ㎖, 2 × 106 세포 / ml 사이의 밀도로 세포를 유지한다.
- 수확 로그 단계 성장 DH1.10 셀 (21) 또는 22 ° C에서 HL-5 매체와 문화를 흔들어 성장 코라 결핍 셀 DH1.10 배경에서 발생 (10)에 의해, 세포 응집을 검사합니다. 이를 위해 400 XG에서 3 분 동안 세포 (통상 10 내지 50 ㎖), 원심 분리기의 적당량을 취하고 BSS (10 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 두 번 세포를 씻어2.5 mM의 CaCl2를, pH가 6.5).
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 계속해서, (5, 10, 20, 40)의 밀도로 접시의 세포를 24- 웰 플레이트에 104 세포 / cm × 2. 그들이 BSS에서 22 ° C에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- 이미지마다 135 초를 복용, 10 전에 설명 된 바와 같이 시간 경과 현미경에 의해 집계를 시각화합니다. 설정 5X 목적과 적절한 소프트웨어에 의해 자동으로 전자 승산 전하 결합 소자 카메라를 구비 한 생균 이미징을 사용하여 (재료 표 참조).
- 기아 동안 Dictyostelium의 discoideum 세포의 캠프 펄스.
- 세포를 수확하여 DH1.10 셀 21 DH1.10 CORA 결핍 셀 (10)의 개발에 대한 외부로부터인가 된 cAMP 펄스의 효과를 조사한다. 이렇게하려면 400 XG에 3 분 동안 적절한 세포의 양 (보통 10 ~ 50 ㎖), 원심 분리기를 가지고 BSS에 두 번 씻는다.
- COUBSS에서 1 × 107 세포 / ml의 농도로 세포를 혈구를 사용하여 재현 탁 NT 세포. 펄스를 적용하기 전에 2 시간 동안 22 ° C에서 배양 (160 rpm으로)를 흔들어. 타이머 제어 연동 펌프를 사용하여 캠프 펄스를 추가합니다. 5 시간에 걸쳐 5 초 펄스 50 nM의 캠프 (최종 농도) 15 μL 매 6.5 분을 제공하는 펌프를 프로그래밍.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 계속해서, (5, 10, 20, 40)의 밀도로 세포를 플레이트를 24- 웰 플레이트에 104 세포 / cm × 2. BSS에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- 5 배 목표를 사용하여 밝은 필드 현미경으로 22 ° C에서 16 시간 후 집계를 시각화합니다.
- 에어컨 매체에 노출을 통해 Dictyostelium discoideum 개발 유도.
- (22) 한 바와 같이 신선한 컨디셔닝 매체를 준비합니다. 숭배를 흔들어에서 로그 상 DH1.10 세포 21 DH1.10 코라 결핍 셀 (10)를 수집400 XG에서 3 분 동안 피펫, 원심 분리기를 이용하여 22 ° C에서 HL-5 매체와 URES 및 PBM에서 세포를 세 번 씻어 (0.02 M 인산 칼륨, 10 μM 염화칼슘 2, 1 ㎜의 MgCl 2, pH를 6.1).
- 혈구를 사용하여 세포를 카운트 ml의 1 × 10 7 세포 /의 밀도로 PBM에서 다음을 재현 탁하고 110 회전 / 22 ° C에서 20 시간 동안 흔들어.
- 3 분 동안 400 × g에서 원심 분리 후 조정 배지를 수집하고 4 ℃에서 15 분 동안 8,000 × g에서 원심 분리하여 명확히.
- 0.45 μm의 필터를 통해 필터 에어컨 매체 (재료 표 참조) PBM에서 배를 희석.
- (5, 10, 20, 40)의 밀도 혈구 접시를 사용하여 세포를 카운트 24- 웰 플레이트에 104 세포 / cm × 2. 그들이 22 ° C에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- 이전에 제조 된 배지로 교환 세포 상등액.
- 집계 a를 시각화5 배 목표를 사용하여 밝은 필드 현미경에 의한 따고 16 시간.
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Representative Results
초기 개발에 쇼에게 결함을 coronin 결핍 세포 (그림 2). 세포 coronin의 부재 Dictyostelium의 discoideum의 발달주기 동안의 초기 단계 다세포 응집체를 형성 할 수 없다. 따라서, coronin A는 초기 기아 응답 및 / 또는 캠프 신호 동안 역할을 나타납니다. 실제로 coronin A의 부재 하에서 다세포 골재 형성의 결여는 감소 캠프 10 시그널링을 수반한다. 그러나, 외인성 cAMP를 펄스의인가 완전히 야생형 표현형 (도 3)를 복원한다. 이것은을 coronin보다는 직접 캠프 신호, 캠프 폭포의 상류 기능 (그림 5)에 포함되는 것을 연루. Dictyostelium 세포는 굶어 조건에 노출되면 그들은 초기 기아의 분비가 22, 23 인자 유도한다. 최고의 체인지 중 하나초기 기아 응답에 참여 cterized 요인 매체 인자 (CMF) (22)를 조절한다. 이러한 결과에 기초하여, 우리는 coronin 것은 어느 이러한 초기 기아 인자의 분비를 조절하거나 이들 인자에 의해 유도되는 신호 전달에 관여하는 것으로 가정 하였다. 위해 우리는 매체 실험을 조절 수행이 두 가지 효과를 구별 할 수 있습니다. 야생 형 또는 코라 결핍 세포는 굶주린 야생 형 또는 코라 결핍 셀 (10) (그림 4) 중 하나에서 상층 액에 노출되었다. 이 상층 액은 다세포 집계 형성의 강력한 개시제이며, 따라서 캠프 신호를 포함하는 하류 발달 신호 경로를 시작 요소가 포함되어 있습니다. 우리의 결과는 야생형 세포로부터의 상등액의 경우는 (도 4)이었던 것에 CORA 결핍 세포 상등액 개발을 유도 동등 할 것을 나타낸다. 이것은 그 코라 연루 -결핍 세포 생성 및 야생형 제어 유사한 수준으로 초기 기아 인자를 분비 할 수있다. 그러나 CORA 결핍 세포는 모두 자신의 상등액도 야생형 세포 (도 4)로부터 제공되는 상등액에 응답 할 수있다. 따라서, coronin A는 오히려 발현 / 분비 (10) (그림 5)보다, 초기 기아 요인에 의해 유도 된 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 나타납니다.
일반적으로, 더 개발주기를 유도 Dictyostelium 세포 배고파 분비 신호를 조사 할 수있는, 침지 조건 하에서 응집 분석은 강력한 판독된다. 자발적으로 집계 인해 필요한 모든 신호의 풍부에 의지 높은 밀도에서 시드 셀. 그러나, 낮은 농도로 조정 배지의 첨가가 세포 응집을 유도 할 것이다 (도 4) (22, 24)
도 1 : 포유류 Dictyostelium의 discoideum 존재 Coronin 단백질 coronin 가족 고유 도메인과 C 말단 꼬인 코일 영역 다음에 N 말단 WD 반복 영역의 존재를 특징으로한다.. 포유류 7 coronin 단백질 (A)를 표현하지만, Dictyostelium의 discoideum는 자신의 기능을 연구 할 때 덜 중복의 위험을, 두 가족 (B)가 포함되어 있습니다. Coronin A는 포유류 coronin 1 coronin B의 ortholog가 coronin 7. 요약과 동일한 도메인 구조 도시이다 CC, 코일 된 코일 도메인; UD, 고유 한 도메인; WD는 트립토판을 반복 -aspartate 반복. 길이는 아미노산 (AA)에서 마우스 서열 (A)에 대해 설명한다. 피에 터스 외. 2013 년 12에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. CORA - Dictyostelium discoideum 이른 기아 반응 동안에 응집없는 야생형 (A) 또는 CORA 결핍 (B) Dictyostelium 세포를 2 × 105 세포 / ㎠의 밀도로 멀티 웰 플레이트에 접종하고, BSS의 결핍, 및 20 시간에 걸쳐 이미지화. 스케일 바 = 100 μm의..JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 3 : 외부 캠프가 코라의 초기 발달 결함을 구출 펄스 적용 - Dictyostelium discoideum을 식물 야생 형 (A와 B)와 코라 결핍 세포 (C와 D)는 B (와 펄스 전에 세척하고 2 시간 동안 굶어했다 및 D) 또는 5 시간 정지의 모든 6.5 분 동안 A와 C) 50 nM의 캠프 (없이. 세포를 재현 탁 BSS 세정 및 / cm 2 내지 10 × 104 세포의 밀도로 배양 접시에 두었다. 이미지는 세포의 파종 후 20 시간을 촬영했다. 스케일 바 = 100 μm의는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 코라 결핍 Dictyostelium의 discoideum는 (개발 유도에 필요한 모든 요소를 생산할 수 있지만 응답 할 수없는 급격하게 야생형 성장과 코라 결핍 세포가 PBM에서 세척의 밀도로 멀티 웰 플레이트에 접종 하였다. 5, 10, 20, 40)은 야생형 (A) 또는 CORA 결핍 배고파 세포 (B)에서 수득 된 배지에서 배양 / cm 2 × 104 세포를 X. 이미지는 세포 파종 후 16 시간을 촬영 하였다. 스케일 바 = 100 μm의.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. Coronin의 현재 모델 Dictyostelium의 discoideum에서 기능 Coronin A는 캠프 캐스케이드의 유도 및 발달주기를 통해 진행으로 이어지는 초기 기아 응답 중에 분비 인자 (들)의 신호 전달에 참여하고있다. 에서 Vinet 등. 수정 된 2014 년 (10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
coronin 단백질은 진핵 계통 군의 대부분 분류군에서 발견된다. Dictyostelium의 discoideum의 coronin A는 포유류 coronin (1)의 동체는 세포 초기 발달 동안 응집 중심을 형성 할 수없는 A-결핍을 coronin 때문에, 초기 기아 반응에 관여 사이클 10. 정량적으로 정확하게 균주 개발 사이의 지연을 평가할 수 있도록, 자동 스테이지 컨트롤러 현미경 생균 촬상 설정 필수적인 도구이다.
D. discoideum는 수명주기 1-4의 여러 단계에서 필수적인 신호 전달 분자로 캠프를 이용한다. 캠프 요구되는 중에 체크 포인트 중 하나는 다세포 구조의 형성을 단일 셀로부터의 전환이다. 기아 ~ 6 시간이 세포에 의해 감지 및 집계 센터 (5)을 향해 이동하는 주화 신호를 제공 한 후 캠프 파의 개시. 이 캠프파도가 굶주리고 D.을 펄스에 의해 실험적으로 모방 할 수있다 캠프와 discoideum 세포 5 시간 8,9의 기간 동안 매 6.5 분. 이 절차를 사용하여이 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 캠프 펄스를인가하기 전에이 2h까지 위해 세포를 굶하는 것이 중요하다. 설정이 실험을 활용하여 우리는 이러한 외부 적으로 적용 펄스가 코라 결핍 세포의 개발 구조로, 캠프 신호의 상류 역할을하는 coronin A를 표시 할 수 있었다 (그림 3, 5). 이러한 결과는 또한 coronin A는 초기 기아 응답 검출에 필수적인 역할을 보이는 반면, 그와 같은 화학 주성 및 세포 응집 자체 10 공정 비용 소비임을 나타낸다.
집계 분석 자체는 Dictyostelium의 discoideum의 초기 개발을 연구하는 강력한 방법이다. 그러나, 이러한 전자의 재현성에 영향을 미칠 수있는 여러 함정 존재xperiments, 그리고 여러 가지 요인이 고려되는 것이 중요하다 : CORA 결핍 세포 분석시 세포의 연령은 중요한 역할을한다. 이 세포는 약 그들이 해동 된 지점에서 이주 후 표현형 및 재 집계를 보상하는 경향이있다. 시그널링 결함이 아닌 표시 셀 화성 결함으로 인해 조기 기아 인자의 증가 된 농도보다 높은 농도에서 응집 경향 하듯 세포의 밀도뿐만 아니라 매우 중요한 요소이다. 이러한 분석에서 세포의 정확한 카운트와 희석액의 중요성은 과장 될 수 없다. 다른 균주를 들어, 세포 밀도, 부착시, 현상 시간 등의 분석의 여러 변수의 조절이 요구 될 것이다. 모든 세포가 서로 다른 화합물을 사용하여 고갈되거나, 현상 자극 또는 억제 할 수있다 : 여기에서 기술 된 바와 같이 응집 분석은 다른 질의에 맞게 변형 될 수있는 다용도 기술이다응집 특정 변조 때문에. 바이어스 방식 일찍 개발에 중요한 유전자 또는 요소의 식별뿐만 아니라, 초기 발달 결함 균주를 식별하기 위해 여기에 설명 된 설정도 허용한다. 또한이 방법의 주요 단점이다 응집 분석 완전한 개발 사이클의 축소 된 버전이다. 따라서, 개발주기의 후반부에 영향을 표현형 분석에 적합하지 않다. 상기 응집 분석은 시간 및 자원 절약에 대한 개발보다는 것으로 판명 48- 웰 플레이트에서 자동화 된 촬상 동안 기록 개발 16 시간으로 : 주요 장점은 응집 대규모로 분석하고 자동 포맷을 채택 할 가능성 한천 플레이트.
우리는 외부에서인가 된 cAMP 펄스를 사용하여 초기 기아 응답을 무시하는 실험에서는 coronin A는 <분비 인자의 검출과 연관되어 있음을 보여 주었다EM> 기아에 따라 Dictyostelium 세포. 초기 기아 응답 동안 coronin의 A-매개 신호의 정확한 메커니즘은 불분명 남아있다. 개발이 단계에서 관련된 여러 가지 요인 특히 컨디셔닝 매체 인자 (CMF) 25, 26에서 연구되고있다. 그러나, CMF 자체 또는 공동 요인으로 작용 불분명 남아 있고 그 신호 캐스케이드는 부분적으로 만 이해된다. Dictyostelium 세포의 응집 용량을 사용 침지 조건은 현재 개발 포지티브 판독로서 기술 하에서 한천 표면에 응집 분석법에 비해 시간이 효율적인 방식으로 대규모 스크리닝 실험을 수행 할 수있다. 그러나, 침수 조건에서 집계 분석은 세포가 초기 집계 단계에서 체포되는 바와 같이, 전체 개발주기를 이행하지 않는 단점이있다 않습니다. 따라서, 여기에 설명 된 기술은 나중에 proce을 발달의 검사에 적합하지 않다SSES. 요약하면, 여기에 설명 된 실험 방법은 초기 기아 응답에 coronin의 A-종속 항목을 유도하는 잠재적 인 초기 기아 인자 (들)의 추가 특성을 허용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
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