Abstract
תסמונת התנהגותית מתקיימת כאשר התנהגויות מסוימות אינטראקציה תחת בהקשרים שונים. דג הזברה הייתה נבדקת במחקרים אחרונים וזה חשוב לתקנן פרוטוקולים כדי להבטיח ניתוחים ופרשנויות נכונים. במחקרים הקודמים שלנו, אנו מודדים תעוזה ידי ניטור סדרה של התנהגויות (זמן קרוב לפני שטח, חביון מעברים, מספר מעברים, חצים) בתוך טנק טרפז 1.5 ליטר. כמו כן, אנו לכמת תוקפנות על ידי עקיצות התבוננות, מציג לרוחב, חצים, וזמן ליד מראה נוטה בתוך טנק 19 L מלבני. על ידי חלוקת טנק 76 L לשלישים, גם בדקנו העדפות shoaling. את assay shoaling הוא assay להתאמה אישית והוא יכול להיות מותאם עבור השערות ספציפיות. עם זאת, פרוטוקולים עבור assay זה גם חייבים להיות אחידים, אך גמיש מספיק עבור התאמה אישית. במחקרים קודמים, תא הסוף היו או ריק, כלול 5 או 10 דג זברה, או 5 danios פנינה (ד albolineatus). ב folגעיית כתב יד, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ונתוני נציגים שמלווים יישומים מוצלחים של הפרוטוקול, אשר יאפשר לשכפול ניסויי תסמונת התנהגותית.
Introduction
ישנו גוף הולך וגדל של ספרות חוקר את הקשר בין התנהגויות שונות בתוך חיות בודדות באוכלוסיית נתונה. עמותות אלה מכונות תסמונות התנהגותיות, והמדידות כוללות בדרך כלל תעוזה, תוקפנות, התנהגות גישוש, ו חברותיות 1-5. תסמונות התנהגותיות הן בעלי ערך עבור שני סיבות ישירות ועקיפות. ישירות, ידע של תסמונות התנהגותיות יכול לספק תמונה מלאה יותר של תורת האבולוציה, מבנה האוכלוסייה, ואת הדינמיקה באוכלוסייה 3. בעקיפין, ידע לגבי עמותות התנהגותי עשוי להודיע שדות לכמת התנהגות כגון פרמקולוגיה 6, טוקסיקולוגיה 7, גנטיקה התנהגותית 8,9, ו אנדוקרינולוגיה 10. בגלל יתרונות ישירים ועקיפים אלה, ידע מוגבר תסמונות התנהגותיות הוא בעל ערך במיוחד אורגניזמים מודל נפוצים כמו דג הזברה. מחקרים שעשו שימוש דג הזברה נמצאים iדיסציפלינות נה, כולל ניתוח של תסמונות התנהגותיות 11-13. כדי לקדם את הידע במחקר תסמונת התנהגותית, ובגלל דיסציפלינות אחרות גם להשתמש במדידות התנהגותי בדיקת שערות, תיאורים אמינים ותמציתיים של התנהגות נדרשים עבור ניתוחים ופרשנויות תקפים ופרוטוקולים סטנדרטיים יקלו השוואות בין-מחקר בתוך מינים. פרוטוקול שלנו פותחה כדי למדוד תסמונת התנהגותית תעוזה-תוקפנות-shoaling בקרב אוכלוסיה של דג הזברה מעבדה שגדלו 14. עם זאת, הבסיס של הפרוטוקול (מעקב דגים בודדים, הבטחה אקראית ראוי, ניתוחים מתאימים) ניתן לשנות בקלות עבור מגוון רחב של אמצעי התנהגותיים אלטרנטיביים. בנוסף, התעוזה, תוקפנות, או מבחני shoaling ניתן להפעיל בנפרד עבור הבדיקות של השערות ברורות. לכן, בזמן שהוא המטרה שלנו היא לתאר כיצד לערוך מחקר תסמונת התנהגותית ופרוטוקול עבור l הפרט מוצלחמדידת איבל התנהגותי, כל היבט של הליך זה יכול לעמוד לבד.
הספרות על תסמונות התנהגותיות חובקת מספר קבוצות טקסונומיות, מן פרוקי רגליים לבני אדם 4 ו, על מנת למדוד תסמונת התנהגותית, לפחות בשני קשרים ההתנהגותיים חייבים לכמת. למרבה הצער, יש לעתים קרובות עקבי מעט המבחנים המשמשים לכמת את המדידה התנהגותי פני הצירים של התנהגות. לדוגמא, בדגים, תעוזה ניתן למדוד באמצעות מבחני מבוך T, מבחני שדה פתוח, או הקדמה של רומן או גירוי חוץ 15. מחקרי תוקפנות בדגים עלולים להיות כרוכים אינטראקציות הדיאדה, מבחני גירוי וידאו, או מבחנים מחימר 12,16,17. כמו כן, ניתוח של התנהגות shoaling, אשר בדרך כלל כרוכות מדידת העדפת shoalmate, ניתן לבצע סוגים שונים של טנקים, עם שיטות שונות כדי לקבוע עמותת זמן 21-23. בפרוטוקול זה תת-סדרה ספציפית של overaרפרטואר assay ll התנהגותי מוצג. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה כדי לעקוב אחר אנשים דרך תעוזה, תוקפנות, מבחני shoaling באופן המאפשר השוואות בתוך אנשים כדי לקבוע אם המושוות עקביות בכל יחידים בתוך אוכלוסייה. ביצענו פרוטוקול זה עם דג הזברה ציקלידים להרשיע (Amatitlania nigrofasciata) במחקרים קודמים 14,18, וזה יעבוד עם כל דג מים מתוקים בגודל דומה.
מבחני תעוזה נערכים בתוך טנק טרפז 1.5 ליטר כי יש קו אופקי המגדירה אזורים בגודל שווה בחלקים העליונים ותחתונים של הטנק. התנהגויות לכמת כוללות את מספר מעברים ידי הדג הבדיקה בין החלק העליון והתחתון של הטנק, הזמן המושקע בכל חלק, מספר חצים, ואת חביון להיכנס החלק העליון. את assay התוקפנות מתבצע בתוך טנק מלבן 19L הכוללמראה אינץ 3 אינץ 'x 5 נוטה בסביבות 22 מעלות ממוקמות בפינה השמאלית התחתונה של הטנק 19. התנהגויות לכמת לכלול את הסכום הכולל של זמן מושקע על ידי דג יעד אינטראקציה עם המראה 20, יחד עם אינדיקטורים אגרסיווי ספציפית - מספר העקיצות, מציג לרוחב, חצים בין דגי המבחן וההשתקפות שלו. לקבלת מידע אודות מחוונים הספציפיים אלה, עקיצות מוגדרות מזנקים מהיר לעבר המראה עם פה פעור, מציג לרוחב מוגדר הלוהט של לרוחב, חזה, אנאליים הגבה סנפירים לכיוון המראה, וחיצים הם כל תנועות בלתי יציבות, כי הם לא מכוון במראה. לבסוף, assay shoaling מכמת את ההתנהגות של דג בדיקה בתא במרכז טנק תאי-תלת. תאי דופן האקווריום הם או ריקים, או להכיל "נחיל יעד" של דגים, ובפעם דגי המבחן מבלים ליד כל תא בצד נמדד 21-23. ציון כללי אחד, המכונה וויט'לGTH של Shoaling (SOS), מחושב לגבי כל דג בדיקה אישית, ספציפית לגירויים, והוא יכול לשמש במורד זרם מנתח 14. כל ההתנהגויות הם הבקיעו ידי צופה יחיד, או צופה מרובה באמצעות תוכנת כימות התנהגותי חינם המכונית 24 JWatcher.
בדיקת הנוכחות של תסמונת התנהגותית היא מאמץ סטטיסטי בעיקר, ומומלץ לעקוב אחר ההנחיות כפי שהוצג על ידי Budeav 2010 25. באופן ספציפי, מומלץ לבצע ניתוח מרכיבים עיקרי (PCA) על נתונים מרוכזים normed שבו תשומות הן הווקטורים של ההתנהגויות של פרט מבחנים עם מדידות התנהגותי מרובות (כלומר, תעוזה ותוקפנות). את PCA, שבוצעה על מטריצת מתאם, מפחיתה את ממדיות של המדידות התנהגותיות, ובכך מחלצת את הידע החשוב ביותר המסביר ברוב של הווריאציה. הרכיבים שחולצו לאחר מכן ניתן לפרש basאד על מקדמי מתאם גבוה עבור התנהגותם האישית של עשרות ריבית רגרסיה ניתן לחלץ עבור כל אדם על בסיס של רכיבים ההסבר. עשרות רגרסיה אלה לאחר מכן ניתן בהשוואה למדידה SOS ומדידות שאינם התנהגותיות שונות אחרות כגון גודל או מין דגים.
עבודה זו יושמה במחקר של תסמונות התנהגותיות דג זברה שבה תסמונת ההתנהגותיות מין שקיימת בין תעוזת shoaling 14 התגלתה. במצב זה, גברי דג זברה נועזים נוטים יותר לקשר עם מינים אגרסיביים יותר, גדולים יותר (ד albolineatus), אך קשר זה הולך לאיבוד אצל נקבות. עבודה זו יושמה גם במחקר של קרובי משפחה לנוער להרשיע ציקליד (Amatitlania nigrofasciata) 18 שבה תסמונת התנהגותית לא התגלה, פוטנציאל המציין פלסטיות התנהגותית של מינים. לכן, בפרוטוקול הבא מוצג wה- i מטרה של המגדירה את האופי שלושה מבחנים ספציפיים (תעוזה, תוקפנות, shoaling) במסגרת לימוד תסמונת התנהגותית ברמת פרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מתודולוגיות הבאים עבור דיור, טיפול, ולימוד של דג הזברה אושרו על ידי IACUC אוניברסיטת סיינט ג'וזף.
1. שיכון, טיפול דג הזברה
- השג את דג זברת הנושא מן ספק מקומי, או מאוכלוסיות ניצודות. שים לב דיור כי דג הזברה כפופה להנחיות IACUC והיתרים נוספים נדרשים לאוכלוסיות ניצודו דיור.
- זיהוי דג זברה נפרדת לפי מין. לחלופין, לדלג על שלב זה או להחליף עם שיטה אחרת של הפרדה על בסיס השערת המחקר.
הערה: מאפייני סקס קשים לקבוע דג זברה, במיוחד אצל נשים. עיין בהנחיות אלה 10 או מדריכים מקוונים שימושיים להבחין מין. - אקראי להפריד בין האוכלוסיות יותר אל תוך היחס ההולם של דגי מוקדי גירוי דגים. הערה: דגי מיקוד הם נבדקים אחריו דרך הסדרה של behavioמבחני RAL, ודגי גירוי הם האנשים אשר יתפסו את תאי גירוי מבחני תוקפנות shoaling.
הערה: באופן מסורתי, בין 1 ל 5 דגי גירוי לכל דג מוקדי מבחני shoaling לבין 1: גירוי 1: יחס דגי מוקדי מבחני תוקפנות 14,17 משמש. עם זאת, החוקר צריך לעצב את המחקר באופן ספציפי עם ההשערה לזכור (כלומר, צריך גירוי הדגים להישמר קבועים כדי לשמור על עקביות בהתנהגות דגים מוקד, או צריך גירוי דגים לסובב בין כל assay כדי להבטיח אקראי נכון). - אחסן את כל הדגים מתל דיור דג זברה (27.5-28.5 מעלות צלזיוס) תחת מחזור אור / חושך 12:12 קפדן. Feed כל מזון פתית דגי מוקד הגירוי יומי ושבועי ארטמיה, בימים לא מחקריים.
- ודא שכל הבדיקות נעשות בין ZT1 ו ZT5 (זמן צייטגבר) כדי למנוע תופעות מקצב צירקדי 26.
הגדרת רנדומיזציה טנק 2.
- Randomize כל האנשים אפריורי כדי רצף מסוים של מבחני התנהגות. הגדרת ערכה אקראית ואחידה באמצעות מחולל רצף אקראי באינטרנט 27 או מחולל רצף אקראי מתוך חבילת תוכנה סטטיסטית (R).
- לייבל כל assay מ -1 עד 3 ולשמור את המשימה הזאת עקבית. הקצאת רצף אקראי לכל פרט ולמפות את הרצף פי תווית assay התנהגותיים. לדוגמא, במשך שלושה מבחני כולל (1 ממופה Shoaling, 2 ממופים לחוצפה, ו -3 ממופה התוקפנות), אדם נתונה יכול להיות רצף אקראי של "2,3,1", אשר יחייב אותם לבצע את המבוקש מבחני התנהגות לפי הרצף שהוגדר.
- הגדרת הטנקים assay (תעוזה, תוקפנות, shoaling) במעבדה במקומות למזער את האפשרות עבור גירויים חיצוניים לוואי ולהיות בטוח שיש מספיק מקום עבור מצלמת וידאו כדי ללכוד את המיכל כולו. ודא כי מצלמת וידאו יש enough בהירות כדי להציג תוויות טנק, כמו גם להיות מסוגל להבחין התנהגויות עדינות של הדג מוקדי ולהתקין את המצלמת בתנוחה זו.
- להקליט את כל מבחני ההתנהגות עם המצלמה נשמרה באותה התנוחה עם תצוגה מלאה של הטנק שצוין למזער הבדלים לא מכוונים בשערו התנהגותיות כתוצאת קלטות הפרש.
הערה: יש להימנע מהנחת טנקים באזורים כבדים נסחרים ועל ידי דלתות כמו תנועה וצליל תשפיע התנהגות דג זברה. - הקמת פרוטוקולי JWatcher ייחודי 24 בקיע כל assay התנהגותיים. עיין במדריך למשתמש JWatcher כדי ללמוד כיצד ליצור קבצי אב מוקדי להקצות התנהגויות קשות וקבצי ניתוח מוקדים לסכם נתונים שנאספו.
הערה: JWatcher היא תוכנת ניקוד התנהגותית המאפשרת ניקוד התנהגותית אישית אמין דיר 24. - להגדיר ערכת תיוג לעקוב אחר התאריך, מספר דגים, ומספר assay עבור כל מבחני התנהגות (למשל,"F5-B-123,115 'רומז דגים 5, assay בהעזה, ב -31 בדצמבר רח 2015) ואת התווית החלק החיצוני של המיכל עם קלטת לאור ונמצאת בפוקוס של המצלמה. שמור ולהקליט מידע זה במחברת המעבדה לעיון מהיר ובקרת איכות בעתיד.
- הגדרת טנק הסתגלות אשר ישמש בין כל המבחנים וכן ישירות לאחר האנשים מוסרים ממדף הדיור.
הערה: הטנקים הסתגלות וטנקים מסופים נמצאים אקווריומים קטנים (40 ס"מ x 20 ס"מ x 25 ס"מ) עם חצץ מסנן דומות מתלה דיור. - לאחר המבחנים הושלמו כל, להעביר את הפרט לתוך מיכל מסוף נפרד שישמש טנק היעד הסופי לכל אנשים מוקדי בשימוש. השתמש טנק כי הוא גדול מספיק כדי להכיל קבוצה של אנשים לשארית חייהם (למשל, 25 ליטר).
הערה: זה מאוד חשוב לשמור על טמפרטורת המים עולה בקנה אחד ודומה ותנאי acrosהכל הטנקים. זה כולל דיור, הסתגלות, וכל טנקי הבדיקות.
3. עריכת Assay התוקפנות
- לנהל את assay תוקפנות בתוך טנק 19 L מלבני מדידה 30 ס"מ x 15 ס"מ x 10 ס"מ. תלבושת הטנק במחיצות חיצוניות אטומות סביב שלוש דפנות מכל התוקפנות, עוזב את הקדמי החשוף לצפייה, להפחית גירויים חיצוניים רצויים. מחלק את הטנק עם סימונים חיצוניים לארבעה רבעים מלבניים שווים ולתקן מראה לצמיתות (עם קולק סיליקון) בתוך ברבע השמאלי התחתון, נוטה על 22.5 ° ויוצרים משולשת ישר זווית כנגד הצד השמאלי של הטנק.
- ודא את הטמפרטורה של המים במכל המכל ותוקפנות הסתגלות היא בתוך 2 מעלות צלזיוס של מתלת הדיור. לשם כך, יש טריים, מים מיושנים מחומם מראש ל 27.5-28.5 מעלות צלזיוס מוכן להוסיף למיכל תוקפנות. שים לב: חשוב להחליף את המים בין כל assay לחסל מוצדקרמזי חוש ריח.
- העבר, על ידי חופן, דג מוקדים ממדף דיור טנק הסתגלות נפרד שבו זה יהיה להסתגל במשך 10 דקות.
הערה: חשוב להפחית גירוי הציג לדגים באמצעות טיפול לא נכון. אנשי העברה כפי שתוארו לעיל 27.- באופן ספציפי, באופן ידני ובזהירות למקם כוס פלסטיק קטנה, שקופה לתוך הטנק של עניין. מבלי לשבש את הדגים ככל העביר באמצעות נטו, לאט לאסוף את הדגים לתוך הכוס.
- ודא כי מצלמת הווידאו מוכנה להקליט על ידי המאשר כי טנק assay התוקפנות (ראה שלב 3.1) הוא בפוקוס ומייד לפני העברת הפרט לתוך טנק התוקפנות, לחץ על 'תעד במכשיר. העבר דגים מוקדי באמצעות חופנת מטנק הסתגלות לאקווריום תוקפנות.
הערה: חשוב להקליט לפני דגי הזנת טנק התוקפנות כדי לעקוב אחר הזמן המדויק של כניסה. - רשום את aggrטנק ession במשך 10 דקות ו -30 שניות ולאחר מכן כוס דג המוקדים מטנק התוקפנות בחזרה לתוך טנק ההסתגלות.
- בעת הצפייה בהקלטה, לחכות 30 שניות אחרי הדגים כבר הציגו טנק תקופת הסתגלות נוספת לפני התנהגויות ניקוד.
- באמצעות שיטת ניקוד JWatcher המוגדרת עבור התנהגויות תוקפניות, לכמת את ההתנהגויות הבאות במשך 10 דקות: זמן בילה ליד מראה, מספר גישות במראה, מספר החצים, מספר עקיצות ניסו (לפתוח את הפה בכיוון של מראה), ומספר המציג לרוחב (הגבה, חזה, אנאלי, והקמת סנפיר זנב) 9.
- להבקיע assay תוקפנות אחת לפחות פעמים, עד assay הוא בקיע עם את ההסכם גבוה בין חזרות.
4. עריכת Assay בהעזה
- לנהל את assay תעוזה בתוך טנק 1.5 L טרפזי קטן, מדידה 15 ס"מ x 26.5 ס"מ x העליון רוחב 22.5 ס"מ בתחתית x 6 ס"מ. עוטפים בנייר אטום סביב כל הצדדים of הטנק אבל להשאיר את החזית החשופה לצפייה. מניח חתיכה אחת, דקה של קלטת חיצונית למכל לתחום העליון מהחלק התחתון של הטנק.
- ודא שטמפרטורת המים במכל התעוזה היא בתוך 2 מעלות צלזיוס של מתלת הדיור (ראה שלב 3.2)
- מעביר את דג המוקדים ממדף הדיור למכל ההסתגלות (ראה שלב 3.3) ולתת להסתגל במשך 10 דקות.
- ודא כי מצלמת הווידאו הוא מוכן להקליט את assay התעוזה, פעם מוכנה להעביר את הדגים מוקדי, לחץ על 'תעד במכשיר. מעביר את דג המוקדים מטנק ההסתגלות למכל תעוזת שיא 8 דקות ו -30 שניות.
- בעת צפייה בהקלטה, לאפשר תקופת הסתגלות נוספת 30 שניות אחרי הדג הוא הציג את הטנק לפני הניקוד.
- באמצעות תוכנת JWatcher, לכמת התנהגויות תעוזה במשך 8 דקות. באופן ספציפי, לכמת את ההתנהגויות הבאות: זמן קרוב לפני השטח, חביון ולהזין את החלק העליון, מספר transitions לתוך החלק העליון, ומספר תנועות בלתי יציבות (חצים) 29.
- להבקיע assay תעוזה יחיד לפחות פעמים, עד assay הוא בקיע עם את ההסכם גבוה בין חזרות.
5. עריכת Assay Shoaling
- לנהל את assay shoaling במכל 76 L כי יש שלושה תאים מחולקים לשני חוצצי זכוכית אטומים עם קולק סיליקון (השלושה תאים וכתוצאה מכך מורכבים משני אזורי גירוי תא אחד מוקד). מבחינה חיצונית, לסמן שני אזורי עדיפות המיועד 6.35 סנטימטר אחד של מחיצת הזכוכית 'אזורי הגירוי, מעיד על שני גוף אורכי 30. החל מחיצות אטומות חיצונית סביב שלוש דפנות מכל shoaling, אבל להשאיר את החזית החשופה לצפייה.
הערה: אזור עדיפות זה יכול להיות מותאם אישית כדי לבדוק השערות ספציפיות עבור מינים שונים בגודל. - בהתאם לאופי של המחקר, שרטונים גירוי בחר להסתגל לפחות 12 שעות beforדואר בדיקות ולהישאר במיכל shoaling לאורך כל תקופת הניסוי.
הערה: שרטוני Stimulus הם אוספים של דגים בודדים המשמשים להעריך כיצד דגי מוקדים מתנהגים הנוכחות או היעדר של השירטונים אלה. שילובי נחילי גירוי שונים יכולים להיות נבחרים לבדוק מספר שערות shoaling המגוונים. הקפד כי שרטונים גירוי הם מסובבים בין כל אזור הגירוי כדי למנוע הטיה לוואי מותר גם להסתגל לפחות 12 שעות לפני הבדיקה. - מעביר את דג המוקדים לתוך טנק ההסתגלות כפי שתואר לעיל (ראה שלב 3.3)
- העבר, על ידי חופן, דג המוקדים מטנק הסתגלות ביניים לתא המרכזי במכל shoaling.
- לאפשר תקופת הסתגלות 10 דקות לפני תקופת תצפית 10 דקות לחיות בקיע. לחלופין, להקליט את מבחני shoaling וציון מאוחר יותר באמצעות JWatcher. דגים נחושים להיות shoaling כאשר הם בתוך האזור העדיף בתאדיור נחיל היעד.
- לכמת הזמן מושקע בכל אזור עדיף ואת משך זמן בהיקף במרכז.
- כצעד תיאור נוסף, לחשב 'עוצמת shoaling' (SOS). הקצאת ערך בין -1 ו +1 שבו הגודל מתאר את התדירות בה להקות דגים בודדות.
- חשבתי את היחס בין shoaling הזמן מושקע חלק השטח של אזורי shoaling ולחסר את היחס בין משך זמן לא shoaling ואת השטח של האזורים-shoaling שאינו. מניח כמות זו על הסכום של הזמן המושקע בכל האזור המחולק בנפח של כל אזור בנפרד. מידע נוסף על חישוב זה ניתן למצוא במחקר קודם 14.
6. בקרת איכות נתונים
- ניתוח נתונים באמצעות נתונים מסורתיים כלי ניתוח 31-32.
- מבחן שונויות באמצעות הבדיקה של לוין פרמטרית לכל ההתנהגויות. אם התנהגות היא הלא הומוגנית לבצע טרנספורמציה יומן33.
- ודא אין תופעות רצף (כלומר, כי הצו האקראי לא השפיע על התנהגות הפרט) באמצעות ANOVA Kruskal-Wallis על הנתונים הומוגנית 34.
- ודא שאין הטיות צד עבור assay shoaling ידי יצירת מודלים ליניאריים כלליים המבוססים על תוצר על מדדי SOS עם צד כגורם קבוע 35.
הערה: אם יש לא מעט על מנת בעיות עם נתונים, ניתוחים במורד הזרם יכול להתנהל. אם יש בעיות, להתפייס עם טרנספורמציות נוספות, לתרץ עם הסברים מתקבלים על הדעת מבחינה ביולוגית, ו / או להגדיל את גודל מדגם.
7. לנתח נתונים
- חישוב-זנב שני ספירמן דרגה מתאמים 36 לכל ההתנהגויות בנפרד בתוך מבחני תעוזה ותוקפנות.
- חישוב מקדם מתאם intraclass (ICC) כמודל מעורב דו סטרי עם עקביות עבור מבחני התנהגות שנערכו יותר מאחד timדואר למשך 36 פרט נתון. בהגדרה זו, בית הדין הפלילי הבינלאומי, היא מידה איך התנהג דג בעקביות ב assay נתון נמדד יותר מפעם אחת.
- התנהגויות תעוזה ותוקפנות preprocess ע"י מרכוז ו norming כל ההתנהגויות להתכונן קלט לניתוח מרכיבים עיקריים (PCA) 25.
הערה: עיבוד מקדימה את המידות על ידי מרכוז ו norming היא צעד חיוני. ללא התנהגויות צעד עיבוד המקדימה הזה המתרחשים בתדירות יותר ויותר variably ישפיע הפרשנויות מוגזמות של רכיבי חילוץ. תהליך המרכוז norming יסיר את ההטיה. - בצע PCA עם מטריצת מתאם כדי לקבוע אם תעוזה ותוקפנות קשורות יחד תסמונת התנהגותית. לפרש מקדמי התנהגותיים של כל רכיב משמעותי ב> 0.6. ראה Budaev 2010 24 עבור מדריך מקיף לדיווח PCA עבור מחקרים התנהגותיים. עלילת חלוקי הנחלים תהיה אינפורמטיביות שעליו eigenveצריך להישמר ctors לפרשנות.
- באמצעות חבילת תוכנה סטטיסטית כגון R או SPSS 31,32, לחלץ את ניקוד עבור כל רכיב עבור כל אדם. הציונים מייצגים כמה התנהגותו של היחיד הנתון יכולה להיות מוסברת על ידי רכיב המסוים.
- לחשב מתאמים ספירמן בין ציוני רגרסיה גורם ואת הכח של shoaling 36.
הערה: תסמונת התנהגותית נחשבת כיום אם התנהגויות תעוזה והתוקפנות לטעון על אותו הרכיב או, אם רכיב כלשהו עם מקדמים משמעותיים וניתנים לפרשנות בקורלציה עם עוצמת shoaling. כמו כן, יש לציין כי עוצמת shoaling אינה כלולה את PCA כדי לאפשר פרשנויות טובות יותר של quantifications התנהגותיים המורכב יותר (תעוזה ותוקפנות). את PCA orthogonally תקרוס תעוזה ותוקפנות תכונות לתוך עצמי כדי למקסם את כמות הווריאציה סבירה והוא גם מתאים מדידות מורכבות אלה. פרשנותשהתקבל עצמיים ו רגרסיה כוחנו של מדידות shoaling על כל אחד מהם נותן פרשנות הרבה יותר אינטואיטיבי של איך כל אחד ההתנהגויות המורכבות (תעוזה ותוקפנות) מתייחסים מדידת shoaling בינארי יותר מוגדרת היטב (כלומר, הדג shoaling או לא shoaling).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתאם לאופי של המחקר, ופרוטוקול מסוים המועסק, תוצאות ברורות כמה אפשריות בניסוי תסמונות התנהגותיות. הטבלאות הבאות ודמויות, בהם מצוין, מעובדים מנתונים במחקר הקודם שלנו שפורסם בכתב העת ההתנהגות תהליכים 14 וכתב העת דג הזברה 17. כשההצעה (כמתואר לעיל) מתבצעת בשלמותו, שני סטים של תוצאות, 'בתוך מתאמי assay' ו 'בין מתאמי assay,' צפויים (איור 1).
הסט הראשון של תוצאות מתאר בתוך עקביות assay. באופן ספציפי, התוצאות לתאר כיצד התנהגויות מתואמות אחד עם השני בתוך assay התעוזה ואת בתוך assay התוקפנות בנפרד. לוחות 1 ו -2 לתאר מה מתאמים אלה אמורים להיראות עבור התעוזה AGמבחני תוקפנות ואת הנתונים המוצגים מעובדים מנתונים במחקר קודם 14. עבור assay התעוזה, צפוי כי מספר המעברים ואת משך הזמן בחלק העליון של הטנק משיג תוצאות טובות, אבל חביון להיכנס החלק העליון קשורה באופן שלילי. נציג תוצאות ליחידים נמדדו על ציר התעוזה של התנהגות במכל התעוזה (ראו שלב 4.1) ניתנים בטבלת 1. עבור assay התוקפנות, צפוי כי עקיצות, מציג לרוחב, ואת משך זמן ליד המראה כולם מתואמות. נציג תוצאות ליחידים נמדדו על ציר התוקפנות של התנהגות במכל התוקפנות (ראו שלב 3.1) ניתנים בטבלה 2. הטלת חיצים הם בדרך כלל לא מתואמות עם התנהגות תוקפנית אף, במקרים מסוימים, דג אגרסיווי נוטה לנדוד (ומכאן מתאם שלילי ). לבסוף, חוזק Shoaling (SOS) המדידה של assay shoaling מספק אמצעי ברמת הפרט של shoaling tendency. Shoaling היא התנהגות דיר פני מגוון רחב של מבחני shoaling כאשר נמדד באמצעות SOS (ICC = 0.641) 14 וכמה המחקרים הקודמים שלנו אשרו התנהגות shoaling ב 23,38 דג הזברה. מאז כל האדם יימדד לכל אחת מההתנהגויות, נוכל לחשב מתאמי ספירמן פני התנהגויות אלו ומצפים כמה התנהגויות כדי להיות מתואמות, כפי שזוהו על דג זברה בתוצאות הנציג.
החלק השני של התוצאות חוקר את נוכחותו של תסמונת התנהגותית. התוצאות של ניתוח אינטגרטיבי של כל ההתנהגויות לכמת את מבחני התנהגות תעוזה ותוקפנות מסוכמים באמצעות מנהל השקעות ניתוח רכיבי (PCA). רשימה אמור להימשך שנים עד ארבעה מרכיבים וניתנים לפרשנות המבוססת על מתאם גבוה עבור כל התנהגות. אם eigenvector יחיד מסבירים חלק ניכר מהשונות כולל התנהגויות משתי היווצרותו התעוזהמבחני תוקפנות ד, ואז תסמונת התנהגותית נצפתה. עם זאת, אם התנהגויות מן מבחני תעוזה ותוקפנות אינם חופפים על eigenvector יחיד, אז המחקר אינו מתאר תסמונת התנהגותית. תוצאות נציג מוצגים על היעדרו של תסמונת התנהגותית תעוזה-תוקפנות (איור 2). בדוגמא זו, רכיב 1 הוא הכי מייצג מאוד של התנהגויות תוקפנות תוך 2 רכיב קשור באופן חזק ביותר התנהגויות תעוזה. בגלל התנהגויות תוקפנות ותעוזה אינן מיוצגות על ידי אותו הרכיב, ניתן להסיק כי קיים בהעדר תסמונת התנהגותית תעוזה-תוקפנות (וקטורי תעוזה הם בערך מאונך וקטורי תוקפנות). כמו כן, התנהגויות אלו אינן מושפעות ממין משום שדפוס ההפצה זהה בין זכרים ונקבות. כדי לבחון אם התנהגויות נועזות או תוקפנות משויכות shoaling, ציוני רגרסיה החילוץ עבור כל דגים קורבמצב רוח מרומם עם מדידת SOS של הדגים. חשוב להבטיח שכל רכיבים התאמתו למעשה מתארים סט וניתן לפרשנות של התנהגויות. אם יש ערך מוחלט גבוהים מתאמים ספירמן בין כל רכיב ומדידת shoaling, ואז תסמונת התנהגותית shoaling קיימת. לא משנה את התוצאות הספציפיות, חשוב לספק פרשנות ביולוגית ריאלית לכל התצפיות. נציג תוצאות ניתן לתיאור תסמונת התנהגותית-shoaling תעוזה (לוח 3) 14. בעוד הנתונים המוצגים מייצגים תוצאות אופייניות דג זברה, הם לא צריכים להתפרש מדידות של איכות נתונים. ישנן מספר סיבות מדוע הנתונים ייראו אחרים ברחבי ניסויים שונים כגון מינים או בדלי אוכלוסייה.
איור 1. הצעהזרימת עבודה עבור תעוזה, תוקפנות, shoaling ניסוי תסמונות התנהגותיות. מדידות אופייניות מפורטות עבור כל assay. מתווה של איך לנתח את המבחנים בנפרד ולאחר מכן כיצד לשלב את הניתוחים גם מופיע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תוצאות נציג של PCA המציין כי תסמונת התנהגותית תעוזה-תוקפנות נעדרת. הווקטורים האדומים עולות התנהגויות אשר תורמות עשרות הרכיב (משמאל וגרזנים למטה) ואת נקודות represent ציוניות בודדים לאורך כל רכיב (מימין וגרזנים העליונים ). זכרים מיוצגים על ידי נקודות כחולות ונקבות מיוצגות על ידי נקודות ירוקות. שים לב "התנהגות לא יציבה 'מתייחס' חצים 'ו'שיעור תוקפנות "יכול להיות מחושב על ידי הוספת מספר העקיצות ומציג לרוחב חלקי הזמן הכולל אינטראקציה עם המראה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מעברים | חֶבִיוֹן | דַארטס | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| זמן Surface | 0.65 | <0.001 * | -0.68 | <0.001 * | 0.42 | 0.007 * |
| מעברים | -0.40 | 0.012 * | 0.33 | 0.041 * | ||
| חֶבִיוֹן | -0.47 | 0.002 | ||||
| * Α <0.05 |
טבלה 1:. מתאמי דרגה בהעזה ספירמן ב assay טנק רומן טבלה זו הייתה שונה מן הדרך et al, 2015..
| מציג לרוחב | דַארטס | מראה זמן | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| עקיצה | 0.69 | <0.001 * | -0.10 | .547 | 0.63 | <0.001 * |
| מציג לרוחב | -0.06 | .735 | 0.66 | <0.001 * | ||
| דַארטס | -0.18 | 0.285 | ||||
| * Α <0.05 | ||||||
טבלה 2:. תוקפנות ספירמן מתאמי דרגה ב assay טנק רומן טבלה זו הייתה שונה מן הדרך et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| רכיבי PCA | ||
| נוֹעָזוּת | .339 | 0.035 * |
| תוֹקפָּנוּת | 0.075 | 0.65 |
| חץ | -0.012 | .944 |
T מסוגל 3:. בעזרת מרכיבי PCA כדי לאשר את קיומו של תסמונת התנהגותית shoaling והתעוזה נוכחית באוכלוסייה זו טבלה זו הייתה שונה מן הדרך et al, 2015..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול יקבע אם יש עמותות עקביות תעוזה, תוקפנות, והתנהגויות shoaling דג הזברה. אם יש עמותות עקביות באוכלוסייה נתונה בין כל ההתנהגויות האלה, ואז תסמונת התנהגותית היא הווה. על ידי לימוד תסמונת התנהגותית הטבעי של האוכלוסייה, החוקרים יכולים לקבל הבנה מלאה יותר של דינמי שלה התנהגותי, מבנה האוכלוסייה, ואולי ההיסטוריה האבולוציונית 3. יתר על כן, מניפולציה של הסביבה המשפיעה תסמונות התנהגותיות אלה, כמו בפרמקולוגיה 6, טוקסיקולוגיה 7, גנטיקה התנהגותית 8,9, ו אנדוקרינולוגיה 10 מחקרים, יכול לשפוך אור על איך גורמים שונים עשויים להשפיע על עמותות התנהגותי. הרכב הספציפי של תסמונת תוקפנות-תעוזה-shoaling התנהגותי נמצא בפרוטוקול זה מקיף התנהגויות נפוצות גם למד דג הזברה אורגניזם מודל 11-13. בעוד מתודולוגיה זויכול להיות מיושם על כל מיני דגים, היישום הרחב לשימוש דג זברה עשוי לעזור עם סטנדרטיזציה בינתחומי של פרוטוקול זה. כל assay שתואר לעיל ניתן לשלוט בקלות רבה יותר מניפולציות מאשר טכניקות אחרות דומות. לדוגמא, assay התוקפנות משתמש במראה נוטה לעורר מגוון רחב של תגובות תוקפנות ולא באמצעות מודל חי או חימר, גירוי וידאו, או תמונת ראי אנכי גירוי 17. ההתנהגויות נמדדות assay תעוזה הן לכמת ביתר קלות מאשר חולצת מבוך או בדיקת שדה פתוח גדול 15. לבסוף, assay shoaling לתאר בקלות לעקוב אחר אדם, שהוא חיוני ללימוד תסמונות התנהגותיות ברמת הפרט, ויכולים לאפשר שילובים בלתי מוגבל של שרטונים היעד לשאול שאלות ניסיוניות הרומן. בעוד פרוטוקול זה ניתן לשינוי כדי להתאים מגוון של שאלות התנהגותיות, סטנדרטיזציה של זה עלולה להוביל תובנה נוספת על איך DNA, מנגנון תאיים, פיתוח הסלולר, והציג כימיקלים יכולים להשפיע תסמונות התנהגותיות פרט ואוכלוסייה.
על מנת להיות בטוחים כי העמותות נצפו נכונות, הפרוטוקול חייב להיות מלווה בזהירות. על פי רוב, הפרוטוקול הוא לשינוי על פי השערה הספציפית; עם זאת, ישנם מספר צעדים שיש לבצע על מנת להבטיח ביטחון בתוצאות. ראשית, חשוב כי האנשים הם שוכנו טנק מתאים, על תנאים אופטימליים (ראה פרוטוקול) ו ניזונים כראוי. תנאי המים צריכים להיות עקביים מתל דיור, טנקי הסתגלות, וטנקי בדיקה. אם המים אינו עולה בקנה אחד, הדגים ייקח זמן רב יותר כדי להסתגל לתנאים, והמדידות התנהגותי לא ליפול בפח כמו שצריך. כמו כן, חשוב כי מים ממוחזרים בין טנקי תעוזה ותוקפנות כך ריחות מלאכותיים אינם מועברים בין מבחנים. שנית, זה הוא בעל חשיבות עליונה שכל behaviors הבקיע כראוי. כדי להבטיח זאת, כל המבחנים בוידאו כדי לאפשר הצגות מרובות, ועל הזדמנויות הכשרה שונות. מלך שערים מאומנים יחיד יכולים למדוד במדויק התנהגות דגים, אבל אימון לוקח קצת זמן. אם תקופת הכשרה זהירה הוא התעלם, אז את האמון של תוצאות המחקר ההתנהגותי הוא נמוך. עיון מדוקדק עם גודל מדגם נמוך מבוצע על ידי צופה מאומן היטב הוא יותר חזק מאשר מחקר עם מדגם גבוה בביצוע משקיף מאומן היטב. לבסוף, בקרת איכות של הנתונים שנאספו הוא גם קריטי. הצעדים ננקטים כדי באקראי אנשים, ולהסיר הטיות אמורים לגרום נתונים שמישים, אמינים, טרנספורמציות נתונים המומלצים עיבוד מקדים על פי המבחן הסטטיסטי הספציפי (ראה פרוטוקול). אם צעדים אלה אינם להיעשות בזהירות, את הפלט של הניתוחים לא יכול להיות וניתן לפרשנות באופן מהימן.
כאמור, הטכניקה היא accordi לשינוי בכבדותng אל שערות בדיקה הספציפיות. קיימות מדידות התנהגותיות אחרות שניתן לחקור כקשור ב תסמונת התנהגותית בין מספר מיני דגים המגוונים 39-41. בעוד לעיקרי הפרוטוקול להישאר זהים, השאלות הספציפיות ניתן לשנות בקלות על מנת לאפשר בחינת השערות מגוונת. לדוגמה, חוקר יכול להשתמש בפרוטוקול האמור לבדוק את הימצאותם של תוקפנות תסמונת התנהגותית פעילות אקספלורציה ב ציקלידים להרשיע (Amatitlania nigrofasciata). השאלה היא בנושא, אך האורגניזם המחקר הוא שונה מזה המתואר על-ידי הפרוטוקול. עם זאת, הצעדים הכלליים נותרו במידה רבה את אותו הדבר. עובדים חייבים להיות אקראיים מסומן באמצעות סדרה של מבחנים, עם תקופות הסתגלות בין מבחנים, המים חייבים להיות עקביים ורעננים, והמדען צריך להיות מאומן כראוי. אחד הבדלים עיקריים הם ההתנהגויות נמדדות עשויות להשתנות בהתאם הספציפיassay FIC, ואת העמותות התנהגותי עשויים להשתנות בהתאם מינים הספציפיים סביבה מקורית.
המגבלות של פרוטוקול מקושרים עם כמה גורמי אי הוודאות המסורתית של מחקרים התנהגותיים. באופן ספציפי, אם מבחני בקיע unreliably אז סביר להניח הפרשנויות של הממצאים שגויות, וזה יהיה קשה לזהות את השגיאה הזו. כדי להתגבר על מגבלה זו, יתכן כי שני ציונים מאומנים היטב להתבונן התנהגויות. כדי להעריך את אמינותם, לחשב את מקדמי המתאם intraclass על מדידות להחיל על אותו דג, ובמידת הצורך, להתאים להבדלים. לחלופין, אם הוא זמין, תוכנת מעקב אוטומטי כגון Ethovision ניתן ליישם ומאומתים על ידי משקיף מאומן היטב כדי להגדיל את התפוקה ואת הדיוק 42. יתר על כן, יש פירושים אפשריים שונים לגבי השמות והניקוד של התנהגויות "תעוזה". מחקרים אחריםכינו את ההתנהגות המתוארת 43 ואחרים תיארו את התנהגות כמו "גישוש" 44,45. בעבודתנו התנהגות תוארה "תעוזה" כפי למדידת התנהגות בסביבה לא מוכרת לפרט מוקדים. עם זאת, בעוד הטווח עשוי להיות כפוף לפרשנויות חלופיות, זו אינה משפיעה על הפרוטוקול או בניתוח. בנוסף, בעוד אנו מצפים מדידות בתוך מבחני תעוזה ותוקפנות להיות מתואמות חזקות בתוך אוכלוסייה, שם צפוי להיות כמה מקרים של נמוך ללא מתאם של התנהגויות מסוימות. מגבלה זו היא להתגבר על ידי הכח של PCA, כי זה מפתחות על מקורות חשובים של השתנות, גם אם מדידות אינן בקורלציה, הניתוח יהיה לחלץ וריאציה התנהגותי עקבית הנתונים שנאספו. לבסוף, כפי שקורה עם כל השיטות המדעיות, אם הפרוטוקול לאימוץ גורף מתבצע באופן עקבי על ידי מעבדות כמה, ויש כמהבלבול בלתי צפוי, באופן שאינו ניתן למדידה הוצג על ידי הפרוטוקול, אז אלמנט מזיקות פוטנציאל נמשך בספרות, והוא הופך להיות קשה לפרק. פרמקולוגית המאשר כי יש לקבוע נציג של מבחנים לעורר את התגובה ההתנהגותית המיועדת דורש הבנה מעמיקה יותר של תגובות התנהגותיות, נוירולוגיות הורמונלית. תסמונות התנהגותית יכולות להסביר את הבסיס של התנהגות, אך הגבלה במעבדה זו תוכל להתייחס יותר בקביעות במחקרים עתידיים. אף על פי כן, תוצאות היו ובלבד מאמתת את השימוש בפרוטוקול זה בדג זברה, ו, עם שינויים נכונים, הפרוטוקול יכול להתארך עד מגוון של שערות מספר מיני דגים שונים. על ידי ביצוע בזהירות פרוטוקול מפורט עבור דיור, סינון ובדיקות של פרמטרים התנהגותית שונים יאפשר לחוקרים לערוך השוואות ספציפיות יותר על פני מגוון רחב של מחקרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
