Abstract
A síndrome comportamental existe quando comportamentos específicos interagem sob diferentes contextos. Peixe-zebra foram cobaias em estudos recentes e é importante para padronizar protocolos para garantir análises e interpretações adequadas. Em nossos estudos anteriores, temos medido ousadia monitorando uma série de comportamentos (tempo perto da superfície, a latência em transições, número de transições, e dardos) em um tanque trapezoidal 1,5 L. Da mesma forma, nós quantificamos a agressão por mordidas de observação, monitores laterais, dardos e tempo perto de um espelho inclinado em um tanque de 19 L rectangular. Ao dividir um tanque de 76 L em três partes, que também examinou as preferências empolamento. O ensaio shoaling é um ensaio altamente customizável e pode ser adaptado para hipóteses específicas. No entanto, os protocolos para este ensaio também deve ser padronizado, mas suficientemente flexível para personalização. Em estudos anteriores, as câmaras finais eram ou vazio, continha 5 ou 10 peixes-zebra, ou 5 Danios pérola (D. albolineatus). No folmugindo manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado e dados representativos que acompanham aplicações bem sucedidas do protocolo, que irá permitir a replicação de experiências síndrome comportamental.
Introduction
Há um crescente corpo de literatura investigando as associações entre comportamentos distintos dentro animais individuais a partir de uma dada população. Estas associações são denominadas síndromes comportamentais, e as medidas incluem, tipicamente, a ousadia, a agressão, o comportamento exploratório, e sociabilidade 1-5. síndromes comportamentais são valiosos tanto por razões diretos e indiretos. Diretamente, o conhecimento das síndromes comportamentais podem fornecer uma visão mais completa da teoria da evolução, estrutura populacional e dinâmica populacional 3. Indiretamente, o conhecimento sobre as associações comportamentais podem informar campos que quantificam o comportamento tais como farmacologia 6, toxicologia 7, genética comportamental 8,9, e endocrinologia 10. Devido a estes benefícios diretos e indiretos, o aumento do conhecimento das síndromes comportamentais é especialmente valioso em organismos modelo comumente utilizados, tais como o peixe-zebra. Estudos utilizando peixes-zebra são encontrados ina variedade de disciplinas, incluindo a análise das síndromes comportamentais 11-13. Para avançar o conhecimento em pesquisa síndrome comportamental, e por outras disciplinas também usam as medidas comportamentais para o teste de hipóteses, descrições confiáveis e sucintas de comportamento são necessários para análises e interpretações válidas e protocolos padronizados irá facilitar as comparações inter-estudo dentro das espécies. Nosso protocolo foi desenvolvido para medir uma síndrome comportamental ousadia-agressão shoaling em uma população de peixe-zebra criados em laboratório 14. No entanto, a base do protocolo (rastreamento de cada peixe, assegurando randomização apropriada, e análises apropriadas) pode ser facilmente modificado para uma variedade de medidas comportamentais alternativos. Além disso, ensaios de ousadia, agressão ou empolamento pode ser executado individualmente para o teste de hipóteses distintas. Portanto, ao mesmo tempo que é o nosso objetivo para descrever como conduzir um estudo de síndrome comportamental eo protocolo para o sucesso l indivíduoEvel medição comportamental, cada faceta deste procedimento pode ficar sozinho.
A literatura sobre síndromes comportamentais abarca diversos grupos taxonómicos, de artrópodes e para os seres humanos 4, a fim de medir uma síndrome comportamental, pelo menos dois contextos de comportamento tem de ser quantificados. Infelizmente, muitas vezes há pouca consistência nos ensaios que são utilizados para quantificar a medida de comportamento entre os eixos de comportamento. Por exemplo, no peixe, coragem pode ser medida utilizando ensaios de labirinto em T, ensaios de campo aberto, ou a introdução de um novo estímulo ou externa 15. Estudos de agressão em peixes pode envolver interacções díade, ensaios de vídeo de estímulo, ou ensaios modelo de argila 12,16,17. Da mesma forma, a análise do comportamento de empolamento, que tipicamente envolve a medição de preferência shoalmate, pode ser realizada em diferentes tipos de tanques, com diferentes métodos para determinar o tempo de associação 21-23. Neste protocolo de um subconjunto específico do OveraLL repertório comportamental ensaio é apresentado. Especificamente, este protocolo apresenta uma metodologia para rastrear indivíduos através de ousadia, agressão e ensaios de empolamento de uma forma que facilita as comparações dentro dos indivíduos para determinar se as comparações são consistentes em todos os indivíduos dentro de uma população. Efetuamos este protocolo com o peixe-zebra e ciclídeos condenado (Amatitlania nigrofasciata) em estudos anteriores 14,18, e ele vai trabalhar com qualquer peixes de água doce de tamanho similar.
Os ensaios de negrito são conduzidas num tanque trapezoidal 1,5 L que tem uma linha horizontal delinear áreas de igual tamanho das porções superior e inferior do tanque. comportamentos quantificados incluem o número de transições através do teste de peixe entre a parte superior e inferior do tanque, o tempo gasto em cada porção, o número de dardos, e a latência para entrar na porção superior. O ensaio de agressão é realizada num tanque rectangular 19L, que incluium espelho x 5 polegadas 3 polegadas inclinada a cerca de 22 ° situadas no canto inferior esquerdo do tanque 19. Comportamentos quantificados incluem a quantidade total de tempo gasto pelos peixes-alvo interage com o espelho 20, juntamente com indicadores agressivos específicas - número de picadas, displays laterais, dardos entre os peixes de ensaio e de sua reflexão. Para estes indicadores específicos, mordidas são definidos como estocadas rápidas para o espelho com uma boca aberta, displays laterais são definidos como a queima de lateral, peitorais, anal e dorsal barbatanas na direção do espelho, e dardos são quaisquer movimentos erráticos que são não dirigido para o espelho. Finalmente, o ensaio de empolamento quantifica o comportamento de um peixe teste na câmara de centro de um tanque de câmaras-tri. As câmaras laterais do tanque são ou vazio, ou conter uma "cardume target" de peixes, eo tempo o peixe teste gasta perto de cada câmara lateral é medido 21-23. A pontuação composta única, referido como StrenGTH de empolamento (SOS), é calculada para cada peixe de teste individual, específica para os estímulos, e pode ser utilizado em análises a jusante 14. Todos os comportamentos são marcados por um único visor, ou vários espectadores usando software quantificação comportamental livre conhecido como jWatcher 24.
Testando a presença de uma síndrome comportamental é principalmente um esforço estatística, e é aconselhável seguir as orientações tal como apresentado pela Budeav 2010 25. Especificamente, recomenda-se realizar uma análise de componentes principais (PCA) em dados centralizados e normalizados em que o entradas são os vetores de comportamentos de um indivíduo em ensaios com múltiplas medidas comportamentais (ie, ousadia e agressividade). A APC, realizado em uma matriz de correlação, reduz a dimensionalidade das medições comportamentais, e assim extrai o conhecimento mais importante que explica a maioria da variação. Os componentes extraídos podem então ser interpretada based em cargas elevadas de factor para o comportamento individual de interesse e pontuações de regressão pode ser extraído para cada indivíduo na base dos componentes explicativas. Estas pontuações de regressão pode, então, ser comparado com a medição SOS e outras várias medições não-comportamentais, tais como o tamanho do peixe ou sexo.
Esse fluxo de trabalho foi implementado em um estudo das síndromes comportamentais peixe-zebra em que uma síndrome comportamental específica do sexo que existe entre ousadia e shoaling 14 foi descoberto. Nesta situação, ousadas machos de peixe-zebra são mais susceptíveis de se associar com a espécie de maior dimensão, mais agressivos (D. albolineatus), mas esta associação é perdida nas fêmeas. Esse fluxo de trabalho também foi implementado em um estudo de presidiário kin juvenil ciclídeos (Amatitlania nigrofasciata) 18 em que uma síndrome comportamental não foi descoberto, potencialmente indicando plasticidade comportamental da espécie. Portanto, o protocolo seguinte é apresentada Wom um objectivo de delinear a natureza dos três ensaios específicos (coragem, agressão, e de empolamento), no âmbito de um estudo síndrome comportamental nível individual.
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Protocol
Os seguintes metodologias para a habitação, cuidados, e estudo do peixe-zebra foram aprovados pela Universidade IACUC do Saint Joseph.
1. Zebrafish alojamento e cuidados
- Obter o peixe-zebra assunto a partir de um fornecedor local, ou a partir de populações selvagens capturados. Por favor, note que a habitação o peixe-zebra está sujeito às diretrizes IACUC e autorizações adicionais são necessários para as populações selvagens capturados habitacionais.
- Identificar e peixe-zebra em separado de acordo com o sexo. Como alternativa, ignore este passo ou substituir com um método diferente de separação com base na hipótese do estudo.
NOTA: características sexuais são difíceis de determinar no peixe-zebra, especialmente nas fêmeas. Referem-se a estas diretrizes 10 ou manuais on-line úteis para distinguir o sexo. - Aleatoriamente separar as populações mais para dentro da proporção apropriada de peixe peixes focal ao estímulo. Nota: peixes Focal são os assuntos de teste seguido através da série de behavioensaios de RAL, e peixes de estímulo são as pessoas que irão ocupar as câmaras de estímulo nos ensaios agressão e empolamento.
NOTA: Tradicionalmente, entre 1 e 5 estímulo peixe peixes por focal em ensaios de empolamento e uma mistura 1: estímulo proporção de 1: peixes focal em ensaios de agressão 14,17 são usados. No entanto, o pesquisador precisa projetar especificamente o estudo com a hipótese em mente (ou seja, deve estímulo peixes ser mantida constante para manter a consistência no comportamento dos peixes focal, ou deveria estímulo peixes ser rodado entre cada ensaio para assegurar a randomização adequada). - Armazenar todos os peixes nas prateleiras habitação peixe-zebra (27,5-28,5 ° C) sob uma 00:12 ciclo de luz / escuridão rigorosa. Alimentar todos os alimentos focal e estímulo peixes floco diária e semanal camarão de água salgada, em dias não-investigação.
- Certifique-se de que todos os testes é feito entre ZT1 e ZT5 (hora zeitgeber) para evitar os efeitos do ritmo circadiano 26.
2. A randomização e tanque de Setup
- Randomize todos os indivíduos a priori a uma sequência específica de ensaios comportamentais. Configurar um esquema de randomização consistente usando um gerador de seqüência aleatória on-line 27 ou um gerador de seqüência aleatória de um pacote de software estatístico (R).
- Rotular cada ensaio 1-3 e manter essa atribuição consistente. Atribuir uma sequência aleatória para cada indivíduo e mapear a sequência de acordo com a etiqueta de ensaio comportamental. Por exemplo, para três ensaios totais (1 mapeados para shoaling, 2 mapeado para a ousadia, e 3 mapeados para Agressão), um determinado indivíduo pode ter uma sequência aleatória de '2,3,1', que vai obrigá-los a realizar o específico ensaios comportamentais na seqüência especificada.
- Configurar os tanques de ensaio (ousadia, agressão e empolamento) no laboratório em lugares que minimizam a possibilidade de estímulos externos adversos e certifique-se de ter espaço suficiente para uma câmara de vídeo para capturar todo o tanque. Certifique-se de que a câmara de vídeo enough clareza para ver etiquetas tanque, bem como ser capaz de distinguir comportamentos sutis do peixe focal e configuração da câmara de vídeo nesta posição.
- Grave todos os ensaios comportamentais com a câmera mantida na mesma posição com uma vista completa do tanque especificado para minimizar as diferenças inesperadas na pontuação comportamental, como resultado de gravações diferenciais.
NOTA: Evite colocar tanques nas áreas de tráfico pesadas e por portas como o movimento e som irá afetar o comportamento do peixe-zebra. - Estabelecer protocolos jWatcher únicas 24 por conseguir cada ensaio comportamental. Consulte o manual jWatcher para aprender como criar arquivos mestres focais para atribuir comportamentos a teclas e ficheiros de análise focais para resumir dados coletados.
NOTA: jWatcher é software de pontuação comportamental que permite a pontuação comportamental, confiável e repetível personalizado 24. - Definir um sistema de rotulagem para rastrear a data, número de peixes, e número de ensaio para todos os ensaios comportamentais (por exemplo,'F5-B-123115' implicando Peixe 5, ensaio Ousadia, no dia 31 de dezembro de 2015) e rotular o exterior do tanque com fita em vista e no foco da câmera. Manter e gravar essas informações em um caderno de anotações para referência rápida e controle de qualidade futuro.
- Defina-se um tanque de aclimatação que vai ser utilizada entre todos os ensaios, bem como imediatamente após os indivíduos são retirados da carcaça cremalheira.
NOTA: Os tanques de aclimatação e tanques do terminal estão aquários pequenos (40 cm x 20 cm x 25 cm) com cascalho e um filtro que se assemelham a cremalheira habitação. - Após os ensaios estão todos concluídos, transferir o indivíduo para um tanque de um terminal separado, que servirá como o tanque de destino final para todos os indivíduos focais usados. Use um tanque que é grande o suficiente para abrigar um grupo de indivíduos para o resto de suas vidas (por exemplo, 25 litros).
NOTA: É muito importante para manter as temperaturas e condições consistentes e similares água across todos os tanques. Isso inclui habitação, aclimatação, e todos os tanques de teste.
3. Realização do Ensaio Agressão
- Realizar o ensaio de agressão em um 19 L tanque retangular medindo 30 cm x 15 cm x 10 cm. Equipar o tanque em partições opacas exterior adjacente de três lados do tanque de agressão, deixando exposta a frente para visualização, para reduzir a estímulos exteriores indesejáveis. Divida o tanque com marcações externas em quatro quadrantes iguais retangulares e fixar um espelho permanentemente (com calafetar silicone) no quadrante inferior esquerdo, inclinado a 22,5 ° formando um triângulo direito contra o lado esquerdo do tanque.
- Certifique-se de que a temperatura da água no tanque de depósito de aclimatação e agressão está dentro de 2 ° C da cremalheira habitação. Para fazer isso, ter água fresca e em idade pré-aquecido a 27,5-28,5 ° C pronto para adicionar ao tanque de agressão. Por favor, note que é importante para mudar a água entre cada ensaio para eliminar injustificadapistas olfactivas.
- Transferir, por escavação, um peixe focal da cremalheira carcaça para um tanque de aclimatação separada onde ele vai aclimatar durante 10 min.
NOTA: É importante para reduzir estímulos introduzidos para o peixe através do manuseio inadequado. Indivíduos de transferência como descrito anteriormente 27.- Especificamente, manualmente e com cuidado colocar um copo de plástico pequena, transparente para o tanque de interesse. Sem interromper o peixe, tanto quanto a transferência usando uma rede, lentamente recolher o peixe no copo.
- Certifique-se de que a câmara de vídeo está pronta para gravar, confirmando que o tanque de ensaio de agressão (veja o passo 3.1) está em foco e imediatamente antes de transferir o indivíduo para o tanque de agressão, pressione registro no dispositivo. Transfira o peixe focal através de escavação a partir do tanque para o tanque de aclimatação agressão.
NOTA: É importante registrar antes de o pescado que entra no tanque agressão para controlar o tempo exato de entrada. - Grave a aggrESSÃO tanque durante 10 min e 30 seg e em seguida, o copo de peixe focal do tanque de agressão de volta para o tanque de aclimatação.
- Ao assistir a gravação, espere 30 segundos depois de o peixe foi introduzido para o tanque como um período de aclimatação adicional antes de comportamentos de pontuação.
- Usando o sistema de pontuação jWatcher definido para comportamentos agressivos, quantificar os seguintes comportamentos para 10 min: O tempo gasto perto do espelho, o número de abordagens espelho, número de dardos, número de tentativas de picadas (abertura da boca na direção do espelho), e número de monitores laterais (dorsal, peitoral, anal, e montagem barbatana caudal) 9.
- Marcar um ensaio de agressão única, pelo menos, duas vezes, até que o ensaio é marcado com alta concordância entre as iterações.
4. Realização da Ousadia Assay
- Conduzir o ensaio ousadia em um pequeno 1.5 L tanque trapezoidal, medindo 15 cm de altura x 26,5 cm x 22,5 cm topo inferior x 6 cm de largura. Enrole papel opaco em torno de todos os lados of do tanque, mas deixar a frente expostos para visualização. Colocar uma peça única, fina de fita externa ao tanque para demarcar o topo da porção inferior do tanque.
- Assegurar que a temperatura da água no tanque é coragem dentro de 2 ° C da cremalheira caixa (ver passo 3.2)
- Transferir o peixe focal da cremalheira carcaça para o tanque de aclimatação (ver passo 3.3) e deixe aclimatar durante 10 min.
- Certifique-se de que a câmera está pronta para gravar o ensaio ousadia e, uma vez pronto para transferir o peixe focal, pressione registro no dispositivo. Transfira o peixe focal do tanque de aclimatação para o tanque de ousadia e recorde de 8 min e 30 seg.
- Ao assistir a gravação, permitir um período adicional de aclimatação de 30 segundos depois de o peixe é introduzido no tanque antes de marcar.
- Usando o software jWatcher, quantificar comportamentos ousadia para 8 min. Especificamente, quantificar os seguintes comportamentos: Tempo perto da superfície, a latência para entrar porção superior, o número de transitions para a parte superior, e número de movimentos erráticos (dardos) 29.
- Marcar um ensaio audácia única, pelo menos, duas vezes, até que o ensaio é marcado com alta concordância entre as iterações.
5. A realização do Ensaio shoaling
- Conduzir o ensaio shoaling em um tanque de 76 L que tem três compartimentos divididos por dois divisores de vidro selados com silicone calafetar (as resultantes três compartimentos consistem em duas zonas de estímulo e um compartimento focal). Externamente, marcar duas zonas preferenciais designados 6,35 cm de cada uma divisória de vidro nas zonas de estímulo ", indicativo de dois corpos comprimentos 30. Aplicar divisórias opacas externamente em torno de três lados do tanque shoaling, mas deixe a frente expostos para visualização.
NOTA: Esta zona de preferência pode ser personalizado para testar hipóteses específicas para diferentes espécies de tamanho. - Dependendo da natureza do estudo, seleccione cardumes de estímulo a aclimatar durante pelo menos 12 horas antes da suae testar e permanecem no tanque empolamento durante todo o decurso da experiência.
NOTA: cardumes estímulo são colecções de peixes individuais que são usados para avaliar a forma como o peixe focal comporta-se na presença ou na ausência desses bancos de areia. Diferentes combinações estímulo cardume pode ser seleccionado para testar um número de diversas hipóteses de empolamento. Certifique-se de que os cardumes de estímulo são rodados entre cada zona de estímulo para evitar viés de lado e também estão autorizados a aclimatar durante pelo menos 12 horas antes do teste. - Transferir o peixe focal para dentro do tanque de aclimatação como previamente descrito (ver passo 3.3)
- Transferir, por escavação, o peixe focal do tanque de aclimatação intermédia para o compartimento central do tanque de empolamento.
- Permitir para um período de aclimatação de 10 minutos antes de um período de observação live-scoring 10 min. Alternativamente, gravar os ensaios de empolamento e marcar mais tarde usando jWatcher. Os peixes são determinado a ser shoaling quando estão dentro da zona de preferência na câmaraabrigando o cardume alvo.
- Quantificar o tempo gasto em cada zona de preferência e tempo gasto no volume central.
- Como medida descritivas adicionais, calcule 'força da shoaling' (SOS). Atribuir um valor entre -1 e +1, onde a magnitude descreve quantas vezes um cardumes de peixes individuais.
- Calcula-se a razão entre o tempo gasto empolamento dividida pela área das zonas de empolamento e subtrair a percentagem de tempo gasto não empolamento e a área das regiões não-empolamento. Coloque esta quantidade através da soma do tempo gasto em cada zona, dividido pelo volume de cada zona individual. Mais informações sobre este cálculo pode ser encontrado em um estudo anterior 14.
6. Controle de Qualidade de Dados
- Analisar dados usando dados tradicionais ferramentas de análise de 31-32.
- Teste de homogeneidade de variância por meio do teste não paramétrico de Levene para todos os comportamentos. Se um comportamento é não homogênea executar uma log-transformação33.
- Confirmar que não há nenhum efeito de sequência (ou seja, que a ordem de randomização não afectou o comportamento dos indivíduos), utilizando um ANOVA de Kruskal-Wallis nos dados homogéneas 34.
- Confirmar que não há desvios laterais para o ensaio de empolamento criando modelos lineares gerais univariadas em índices SoS com o lado como um fator fixo 35.
NOTA: Se houver pouca ou nenhuma problemas com os dados, as análises a jusante pode ser conduzida. Se houver problemas, conciliar com transformações adicionais, racionalizar com explicações biologicamente plausível, e / ou aumentar o tamanho das amostras.
7. Analisar dados
- Calcule bicaudal de Spearman correlações 36 para todos os comportamentos separadamente nos ensaios de ousadia e agressividade.
- Calcule os coeficientes de correlação intraclasse (CCI) como um modelo misto de duas vias com consistência para ensaios comportamentais que foram realizados mais de um time para um determinado indivíduo 36. Neste cenário, o TPI é uma medida de como consistentemente um peixe comportou-se de um dado ensaio mediu mais de uma vez.
- Preprocess ousadia e agressividade comportamentos de centragem e normatização todos os comportamentos para se preparar para a entrada para a análise de componentes principais (PCA) 25.
NOTA: Pré-processamento das medições pela centralização e normatização é um passo vital. Sem este passo de pré-processamento comportamentos que ocorrem com mais frequência e mais variável irá influenciar excessivamente as interpretações dos componentes extraídos. O processo de centralização e normatização irá remover esse viés. - Execute um APC com uma matriz de correlação para determinar se a ousadia e agressividade estão ligadas entre si como uma síndrome comportamental. Interpretar cargas comportamentais de cada componente significativo em> 0,6. Veja Budaev 2010 24 para um guia completo para relatar PCA para estudos comportamentais. A trama scree vai ser informativo em que eigenvectors deve ser mantido para a interpretação.
- Usando software estatístico, como R ou SPSS 31,32, extrair pontuações para cada componente para cada indivíduo. As contagens representam a quantidade de comportamento do indivíduo dado pode ser explicado por o componente em particular.
- Calcule Spearman correlações entre os escores de regressão de fatores e a força de empolamento 36.
NOTA: A síndrome comportamental é considerado presente se ousadia e agressividade comportamentos carregar no mesmo componente ou, se algum componente com cargas interpretáveis significativas correlaciona-se com a força de empolamento. Além disso, observe que a força de shoaling não está incluído no PCA para permitir melhores interpretações das quantificações comportamentais mais complexos (ousadia e agressividade). A APC ortogonalmente colapso ousadia e agressividade apresenta em vectores próprios para maximizar a quantidade de variação explicada e é bem adequado para estas medições complexas. interpretaçãoo que resulta autovetores e regredindo a nossa força de medições empolamento em cada um deles dá uma interpretação muito mais intuitiva de como cada um dos comportamentos complexos (ousadia e agressividade) referem-se a uma medição shoaling binário mais bem definida (ou seja, o peixe é empolamento ou não shoaling).
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Representative Results
Dependendo da natureza do estudo, e protocolo específico empregue, vários resultados distintos são possíveis através de uma experiência síndromes comportamentais. As tabelas e figuras, onde indicado a seguir, são adaptados de nosso estudo anterior publicado na revista Behavioural Processes 14 e do jornal Zebrafish 17. Quando a proposta (como descrito acima) é levada a cabo na sua totalidade, dois conjuntos de resultados, "dentro de correlações de ensaio" e "entre as correlações de ensaio, 'são esperados (Figura 1).
O primeiro conjunto de resultados descreve dentro de consistência ensaio. Especificamente, os resultados descrevem como comportamentos são correlacionados entre si dentro do ensaio de ousadia e o dentro do ensaio de agressão separadamente. Tabelas 1 e 2 descrevem o que essas correlações deve ser semelhante para a ousadia e agensaios de regressão e os dados apresentados são adaptados a partir de um estudo anterior 14. Para o ensaio de coragem, espera-se que o número de transições e o tempo gasto na porção superior do tanque estão positivamente correlacionados, mas a latência para entrar na porção superior está negativamente correlacionada. Os resultados representativos para os indivíduos medido no eixo dureza do comportamento no tanque coragem (ver passo 4.1) são dadas na Tabela 1. Para o ensaio de agressão, espera-se que picadas, exibe laterais, e o tempo gasto perto do espelho são correlacionados. Os resultados representativos para os indivíduos medida no eixo de agressão de comportamento no tanque de agressão (ver passo 3.1) são dadas na Tabela 2. Setas não são geralmente correlacionada com o comportamento agressivo, embora, em alguns casos, os peixes não agressivos tendem a DART (portanto, uma correlação negativa ). Por último, uma força de empolamento medição (SOS) para o ensaio de empolamento fornece uma medida de nível individual de empolamento tendency. Shoaling é um comportamento altamente repetitivo através de uma variedade de ensaios empolamento quando medido usando SoS (ICC = 0,641) 14 e vários de nossos estudos anteriores confirmaram o comportamento shoaling no peixe-zebra 23,38. Uma vez que todos os indivíduos serão medidos para cada um dos comportamentos, podemos calcular correlações de Spearman entre esses comportamentos e esperar alguns comportamentos a serem correlacionados, conforme identificado por peixe-zebra nos resultados representativos.
A segunda porção dos resultados investiga a presença de uma síndrome comportamental. Os resultados da análise integrativa de todos os comportamentos quantificados nos ensaios de ousadia e agressividade comportamental estão resumidos usando uma Análise de Componentes Principais (PCA). Deve haver duas a quatro componentes interpretáveis baseado em altas cargas para cada comportamento. Se um único vector próprio que explica uma boa parte da variação inclui comportamentos de ambos os uma ousadiaOs ensaios de agressão d, em seguida, uma síndrome comportamental tem sido observada. No entanto, se os comportamentos dos ensaios ousadia e agressividade não se sobrepõem em um único autovetor, então o estudo não descreve uma síndrome comportamental. Os resultados representativos são apresentados para a ausência de uma síndrome comportamental coragem-agressão (Figura 2). Neste exemplo, o componente 1 é mais fortemente representativa de comportamentos agressão enquanto que o componente 2 é mais fortemente associado com comportamentos de negrito. Porque agressão e coragem comportamentos não são representados pelo mesmo componente, pode concluir-se que não é a ausência de uma síndrome comportamental coragem-agressão (vectores de negrito são aproximadamente ortogonal à agressão vectores). Além disso, esses comportamentos não são influenciados pelo sexo, porque o padrão de distribuição é o mesmo entre machos e fêmeas. Para observar se arrojo ou agressão comportamentos estão associados com shoaling, as pontuações de regressão extraído para cada peixes são correufórico com medição SoS do peixe. É importante garantir que todos os componentes correlacionando estão realmente descrevendo um conjunto de comportamentos interpretável. Se há grandes absolutos correlações valor de Spearman entre qualquer componente ea medição shoaling, então uma síndrome comportamental shoaling está presente. Independentemente dos resultados específicos, é importante fornecer interpretações biológicos possíveis para todas as observações. Os resultados representativos são fornecidos para uma descrição de uma síndrome comportamental-empolamento coragem (Tabela 3) 14. Embora os dados apresentados representam os resultados típicos para peixe-zebra, eles não devem ser interpretados como medições da qualidade dos dados. Existem várias razões pelas quais os dados serão diferentes em diferentes experimentos, como espécies ou diferenças populacionais.
Figura 1. propostode fluxo de trabalho para uma audácia, agressividade e shoaling experimento síndromes comportamentais. medições típicas são listadas para cada ensaio. Um esboço de como analisar os ensaios individualmente e depois como integrar as análises também está na lista. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os resultados representativos de um PCA, indicando que uma síndrome comportamental ousadia-agressão está ausente. Os vetores vermelhos indicam comportamentos que contribuam para os escores dos componentes (eixos esquerdo e inferior) e os pontos representam pontuações individuais ao longo de cada componente (direita e de cima eixos ). Os machos são representados por pontos azuis e as fêmeas estão representadas por pontos verdes. Observe que o comportamento errático 'Consulte' dardos "e'taxa de agressão "pode ser calculado somando o número de picadas e monitores laterais dividido pelo tempo total interação com o espelho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| transições | Latência | Dardos | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Tempo de superfície | 0,65 | <0,001 * | -0.68 | <0,001 * | 0,42 | 0,007 * |
| transições | -0.40 | 0,012 * | 0,33 | 0,041 * | ||
| Latência | -0.47 | 0,002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabela 1:. Correlações de ordem Ousadia Spearman em um ensaio romance tanque Esta tabela tinha sido modificado a partir Way et al, 2015..
| Displays laterais | Dardos | espelho Tempo | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| mordidas | 0,69 | <0,001 * | -0.10 | 0,547 | 0,63 | <0,001 * |
| ecrãs laterais | -0.06 | 0,735 | 0.66 | <0,001 * | ||
| Dardos | -0.18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabela 2:. Agressão Spearman correlações em um ensaio romance tanque Esta tabela tinha sido modificado a partir Way et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| Componentes PCA | ||
| Ousadia | 0,339 | 0,035 * |
| Agressão | 0,075 | 0,65 |
| Dardo | -0,012 | 0,944 |
T abela 3:. Usando os componentes do APC para confirmar a presença de um empolamento e coragem síndrome comportamental presente nessa população Esta tabela havia sido modificado de maneira et ai, 2015..
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Discussion
O protocolo irá determinar se existem associações consistentes em ousadia, agressão e comportamentos empolamento em peixes-zebra. Se existem associações consistentes numa dada população entre qualquer um destes comportamentos, em seguida, uma síndrome comportamental está presente. Ao estudar a síndrome comportamental de uma população, os pesquisadores podem ter uma compreensão mais completa da sua dinâmica comportamental, estrutura populacional e história evolutiva, possivelmente, 3. Além disso, manipulando o ambiente que afeta essas síndromes comportamentais, como em farmacologia 6, toxicologia 7, genética comportamental 8,9 e endocrinologia 10 estudos, podem lançar luz sobre como diferentes fatores podem afetar as associações comportamentais. A composição específica da síndrome comportamental agressão-coragem-shoaling encontrados neste protocolo abrange comportamentos comuns bem estudados no organismo modelo peixe-zebra 11-13. Embora esta metodologiapode ser aplicado a qualquer espécie de peixe, de uma ampla aplicação para a utilização de peixe-zebra pode ajudar com a normalização interdisciplinar deste protocolo. Cada ensaio acima descrito pode ser mais facilmente controlado e manipulado do que outras técnicas comparáveis. Por exemplo, o ensaio de agressão usa o espelho inclinado a provocar uma ampla gama de respostas de agressão em vez de usar uma imagem de espelho vertical, modelo vivo ou argila, estímulo vídeo ou estímulo 17. Os comportamentos medidos no ensaio ousadia são mais facilmente quantificado do que em uma t-labirinto ou o teste grande campo aberto 15. Por último, o ensaio shoaling descrito pode controlar facilmente um indivíduo, que é essencial para o estudo de síndromes comportamentais no nível individual, e pode permitir para combinações ilimitadas de cardumes alvo a fazer novas perguntas experimentais. Embora este protocolo pode ser modificado para acomodar uma variedade de questões comportamentais, a normalização do que pode levar a uma maior compreensão sobre a forma de ADN, mecanismo celulars, de desenvolvimento celular, e introduziu produtos químicos podem afetar síndromes comportamentais individuais e populacionais.
A fim de ter certeza de que as associações observadas são verdadeiras, o protocolo deve ser seguido com atenção. Para a maior parte, o protocolo pode ser modificado de acordo com a hipótese específica; no entanto, existem várias etapas que devem ser executadas para garantir a confiança nos resultados. Em primeiro lugar, é importante que os indivíduos estão alojados num tanque adequado, em condições óptimas (ver protocolo) e são alimentadas correctamente. As condições da água deve ser consistente em racks de habitação, tanques de aclimatação, e tanques de teste. Se a água não é consistente, o peixe vai demorar mais tempo para se aclimatar às condições e as medidas comportamentais não vai ser devidamente capturado. É também importante que a água é reciclada entre tanques ousadia e agressividade para que odores artificiais não são transportados entre os ensaios. Em segundo lugar, é de extrema importância que todos behavIORs são marcados corretamente. Para garantir isso, todos os ensaios são gravadas em vídeo para permitir múltiplas visões, e por várias oportunidades de formação. Um único marcador treinado pode medir com precisão o comportamento dos peixes, mas o treinamento faz demorar algum tempo. Se um período de treino é ignorado cuidado, em seguida, a confiança dos resultados do estudo de comportamento é baixo. Um estudo cuidadoso com tamanhos baixas amostra realizados por um observador bem treinado é mais poderoso do que um estudo com tamanho número elevado de amostras realizadas por um observador mal treinados. Finalmente, o controle da qualidade dos dados recolhidos também é crítico. As medidas que são tomadas para randomizar indivíduos, e remover preconceitos deve resultar em dados utilizáveis, de confiança, e transformações de dados são recomendados para pré-processamento de acordo com o teste estatístico específico (ver protocol). Se estas medidas não forem cuidadosamente feito, a saída das análises podem não ser fiavelmente interpretável.
Como mencionado anteriormente, a técnica é accordi fortemente modificávelng com as hipóteses de teste específicos. Existem outras medidas comportamentais que podem ser investigados para ser relacionado em uma síndrome comportamental entre um número de diversas espécies de peixes 39-41. Embora os princípios do protocolo de continuar a ser o mesmo, as questões específicas pode ser facilmente alterado para permitir os testes de hipóteses diversificada. Por exemplo, um pesquisador pode usar o protocolo acima referido para testar a presença de uma agressão e atividade exploratória síndrome comportamental em ciclídeos condenado (Amatitlania nigrofasciata). A questão é relacionada, mas o organismo estudo é diferente do descrito pelo protocolo. No entanto, os passos gerais permanecem em grande parte o mesmo. Os indivíduos devem ser randomizados e acompanhados por uma série de ensaios, com períodos de aclimatação em entre ensaios, a água deve ser consistente e fresco, eo cientista deve ser devidamente treinado. Uma diferença importante é os comportamentos que estão sendo medidos são susceptíveis de mudar de acordo com a especificidadeensaio fic, e as associações comportamentais podem mudar de acordo com as espécies específicas e ambiente original.
As limitações do protocolo estão ligados com algumas das incertezas tradicionais de estudos comportamentais. Especificamente, se os ensaios são pontuados unreliably então é provável que as interpretações dos achados são erradas, e seria difícil identificar esse erro. Para superar esta limitação, é possível que dois marcadores bem treinados observar comportamentos. Para avaliar a sua fiabilidade, calcular os coeficientes de correlação intraclasse em medidas aplicadas no mesmo peixes, e, se necessário, ajustar as diferenças. Alternativamente, se disponível, o software de rastreamento automático, como Ethovision pode ser implementada e validada por um observador bem treinado para aumentar o rendimento e precisão 42. Além disso, existem diferentes interpretações possíveis relativas ao nome e pontuação dos comportamentos "ousadia". outros estudosdenominaram o comportamento descrito 43 e outros descreveram o comportamento como "exploratória" 44,45. Em nosso trabalho o comportamento foi descrito como "audácia", como era medir o comportamento em um ambiente estranho para o indivíduo focal. No entanto, enquanto que o termo pode ser sujeita a interpretações alternativas, isto não afecta o protocolo ou a análise. Além disso, enquanto esperamos medições dentro ensaios de ousadia e agressividade a ser fortemente correlacionada dentro de uma população, não é provável que seja alguns casos de baixa ou nenhuma correlação de alguns comportamentos. Esta limitação é superada pela força do APC, uma vez que as chaves na em importantes fontes de variabilidade e, mesmo que as medidas não são correlacionados, a análise irá extrair variação comportamental consistente nos dados coletados. Por fim, como é o caso de todos os métodos científicos, se o protocolo é universalmente adoptada e é consistentemente realizada por vários laboratórios, e há algunsimprevista confusão, não medida introduzida pelo protocolo, então este potencial elemento deletério persiste na literatura, e torna-se difícil de desmontar. Farmacologicamente confirmando que um conjunto representativo de ensaios de eliciar a resposta comportamental destina requer uma compreensão mais completa das respostas comportamentais, neurológicos e hormonais. síndromes comportamentais podem ajudar a explicar a base do comportamento, mas esta limitação de laboratório pode ser capaz de ser mais regularmente abordada em estudos futuros. No entanto, os resultados têm sido desde que valida a utilização deste protocolo no peixe-zebra, e, com modificações adequadas, o protocolo pode ser estendido para uma variedade de hipóteses de um número de diferentes espécies de peixes. Seguindo cuidadosamente um protocolo detalhado para a habitação, selecção e controlo dos vários parâmetros comportamentalmente permitirá que os investigadores a fazer comparações mais específicas através de uma ampla gama de estudos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
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