Medicine

气魄，侵略和浅水测定斑马鱼行为综合征

Published: August 29, 2016 doi: 10.3791/54049

Gregory P. Way^1,2, Maura Southwell¹, Scott P. McRobert¹

¹Department of Biology, Saint Joseph’s University, ²Genomics and Computational Biology, University of Pennsylvania

Abstract

在具体的行为在不同的上下文交互一种行为综合征的存在。斑马鱼已经测试对象中最近的研究和标准化的协议，以确保正确的分析和解释是重要的。在我们以前的研究中，我们通过监测了一系列的1.5升水箱的梯形行为（近地表的时间，潜伏期过渡，过渡的数量和飞镖）的测量气魄。同样，我们在一个长方形19升油箱量化侵略观察叮咬，横向显示，飞镖和时间近一个倾斜的镜子。通过将一个76升罐投入三分，我们还研究了浅水偏好。变浅检测是一个高度可定制的试验和可以为特定的假设进行调整。然而，对于该测定的协议也必须是标准化的，但是定制不够灵活。在以前的研究中，末端腔要么空的，包含5或10的斑马鱼，或5闪电（鱼丹）（D. albolineatus）。在FOL哞哞叫的手稿，我们提出了一个详细的协议，并伴随该协议，该协议将允许的行为综合症实验复制的成功应用的代表性数据。

Introduction

有文献的从一个给定的群体调查个别动物内不同的行为之间的关联越来越多。这些协会被称为行为综合征，并测量通常包括气魄，侵略，探索行为和社交^1-5。行为综合征是直接和间接原因有价值。直接，行为症状的知识，可以提供进化理论，人口结构和人口动态³的更完整视图。间接的，对于行为的关联知识可能通知量化的行为，如药理^{^6，7}毒理学，行为遗传学^8,9，和内分泌^10个字段。因为这些直接和间接的利益，行为症状的知识的增加是常用的模式生物，如斑马鱼特别有价值。使用斑马鱼的研究发现我呐多种学科，包括行为综合征^11-13的分析。为了推进行为综合症的研究知识，因为其他学科也使用行为三围为假设检验，性能可靠，简洁的描述都需要有效的分析和解释，标准化的协议将有利于物种的学习间的比较。我们的协议被开发用于测量实验室饲养的斑马鱼¹⁴人口的气魄侵略，浅水行为综合症。然而，该协议的基础上（跟踪单个鱼，确保适当的随机化，以及适当的分析）可以很容易地修改各种替代行为的措施。此外，气魄，侵略，或浅水测定可单独针对不同的假设进行测试运行。因此，尽管我们的目标是描述如何进行行为综合症的研究和成功的人，微升协议埃维尔行为测量，此过程的每个方面都可以单独存在。

对行为综合征的文献跨越几个分类组，从节肢动物对人类⁴和，以测量一个行为综合症，至少两个行为背景必须量化。不幸的是，在用于量化横跨行为的轴线的行为测量测定法往往很少的一致性。例如，在鱼，粗体可能使用T-迷宫试验，旷场试验中，或引入一种新的或外国的刺激¹⁵的测量。在鱼的侵略研究可能涉及对子互动，视频刺激试验，或粘土模型试验^12,16,17。同样，变浅的行为，这通常涉及shoalmate偏爱的测量分析，可以在不同类型的罐进行的，用不同的方法来确定缔合时间^21-23。在这个协议中的overa的特定子集LL行为分析的剧目呈现。具体而言，该协议提出了一个方法来跟踪通过气魄，侵略和浅水测定个人，有利于个体内比较，以确定比较是否在整个人口中的所有个体一致的方式。我们在以前的研究中^14,18执行该协议与斑马鱼和慈鲷罪犯（Amatitlania nigrofasciata），它可以与任何同样大小的淡水鱼工作。

魄力测定法中，有一个水平行划定在水箱的上部和下部相等大小的区域一个1.5升梯形罐进行。量化行为包括跃迁受水箱的上部和下部，在各部分，飞镖的数量所花费的时间之间的受试鱼的数目，并进入上部的延迟。侵略测定在一个19L的矩形箱，其包括执行一个3英寸×5英寸的镜面倾斜约22°，位于罐¹⁹的左下角。量化行为包括由目标鱼与镜²⁰相互作用花费的总时间量，具有特定侵略性指标沿-试验鱼和其反射之间叮咬的数目，横向显示，飞镖。对于这些具体指标，叮咬定义为走向张开嘴镜子快速弓步，横向显示被定义为横向，胸鳍，臀鳍和背鳍的在镜子的方向燃烧，和飞镖任何不稳定的运动，是不朝镜子执导。最后，变浅测定量化测试鱼类中的三腔槽的中心腔室中的行为。该储箱的侧室要么空，或者含有鱼的“目标浅滩”，并且测试鱼花费每侧室接近的时间被测量^21-23。单个综合得分称为STREN变浅的GTH（SOS），计算每个单独的测试鱼类，具体到刺激，并且可以在下游分析¹⁴一起使用。所有行为是由一个单一的浏览器，或使用被称为JWatcher ²⁴自由行为量化软件多个观看者得分。

测试行为综合症的存在主要是一个统计的努力，并且在2010年Budeav所提出，建议遵循的准则^25，具体而言，建议在中心和范数据执行主分量分析（PCA），其中输入是一个人的行为与多种行为测量（即气魄和侵略）测定的载体。在PCA上的相关矩阵进行的，减少了行为测量的维数，因此，提取，解释大部分变化的最重要的知识。然后将提取的部件可以被解释浅上高的因子载荷为感兴趣和回归分数个体行为编辑可以提取用于说明组件的基础上，每一个人。然后，这些回归的分数可以比在SOS测量等各种非行为的测量，如鱼的大小或性别。

这个工作流程是在该胆识和浅水¹⁴之间存在特定的性别行为综合征被发现斑马鱼的行为综合征的研究中得到落实。在这种情况下，更大胆的斑马鱼男性更可能具有较大的，更积极的物种（D. albolineatus）相关联，但是这种关联在雌性丢失。该工作流还在其一个行为综合症未发现的，潜在地表明该物种的行为可塑性少年囚犯鲷亲属（Amatitlania ^{nigrofasciata）18}的研究来实现。因此，下面的协议，提出瓦特第i个在研究个人层面的行为综合症的框架划定的三个具体分析（气魄，侵略和浅水）性质的目标。

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Protocol

为住房，保健和斑马鱼的研究以下方法已经批准圣约瑟夫大学IACUC。

1.斑马鱼的居所和照顾

获取主题斑马鱼从本地供应商，还是从野外捕获的人群。请注意，住房斑马鱼是受IACUC的指导方针和额外的许可证都需要住房野生捕捞种群。
根据性别鉴定和独立的斑马鱼。另外，请跳过此步骤或根据研究假设，分离不同的方法进行更换。
注：性别特征是难以确定在斑马鱼，尤其是在女性。参照本指引执行¹⁰或有用的在线手册来区分性别。
随机进一步分离种群成焦鱼的适当比例对刺激鱼。注：焦鱼考试科目随后通过一系列behavio的拉尔测定，并刺激鱼是将占据侵略和浅水实验刺激室的个人。
注意：传统上，1和5之间每焦鱼刺激鱼在浅水测定法和1：1的刺激：用于在侵略测定^14,17焦鱼比。然而，研究人员需要专门设计时考虑的假设研究（即，应该刺激鱼保持不变，保持在焦鱼行为的一致性，还是应该刺激鱼被每个检测之间旋转，以确保适当的随机化）。
严格的12时12分光/暗周期下存储在斑马鱼房架所有的鱼（27.5-28.5℃）。日采食所有重点和激励鱼糜食品和每周一次的丰年虾，对非研究天。
确保所有测试ZT1和ZT5（时间授时）之间进行，以避免昼夜节律的影响^26。

2.随机化和坦克安装

镭ndomize所有个人先验行为检测的特定序列。设置使用在线随机序列发生器²⁷或从统计软件包（R）的一个随机序列发生器一致随机化方案。
1. 标签1每个检测到3，并保持这个任务是一致的。分配一个随机序列将每个独立的，并根据行为分析标签映射序列。例如，对于总共三个试验（1映射到变浅，2映射到胆识和3映射到侵略），一个给定的个体可以具有'2,3,1'的一个随机序列，这将要求它们执行特定行为检测指定的顺序排列。
设立在实验室试验罐（胆识，侵略和浅水）在尽量减少外界不良刺激的可能性，并确保有足够的空间用于视频摄像机捕捉整个坦克的地方。确保摄像机已enoug^ h清晰查看罐的标签，以及能够区分焦点鱼和安装在这个位置的摄像机的微妙行为。
记录与保持在与指定的箱的全视图，以尽量减少在行为得分作为差分录音的结果意外差别相同位置的相机中的所有行为试验。
注意：避免将坦克重型交通区域和门的动作和声音会影响斑马鱼的行为。
建立独特的JWatcher协议²⁴得分每个行为的检测。请参阅JWatcher手册，了解如何建立联络主文件分配行为，以键盘和焦点分析文件，总结收集到的数据。
注：JWatcher是行为记分软件，允许可靠和可重复的定制行为得分^24。
定义标记方案来跟踪日期，鱼数量，并为所有的行为实验测定编号（如：“F5-B-123115”暗示鱼5，胆识检测，12月31日^日，2015年），并在标签视图和摄像机的焦点罐用胶带之外。保持并记录在实验室笔记本为快速参考和未来的质量控制信息。
设置将所有测定之间使用以及直接在个人从壳体齿条移除之后的驯化槽。
注：驯化槽和终端舱是小的水族馆砾石英寸（40厘米×20厘米×25厘米），并且接近于壳体机架的过滤器。
该实验全部完成后，转移个人到一个单独的终端坦克将作为所有使用焦距个人最终目的地坦克。使用槽是大到足以容纳一组个体的生命（ 例如25加仑）的其余部分。
注：保持一致和相似的水的温度和条件ACROS这是非常重要的一切都坦克。这包括住房，驯化，和所有的测试坦克。

3.开展侵略分析

进行侵略测定在一个19升矩形槽测量30厘米×15厘米×10厘米。装在围绕侵略坦克三面外不透明隔板槽，留，以观看前面，以减少无用的外界刺激。分与外部标记罐分成四个相等的矩形象限并永久固定的反射镜（用硅酮填缝）左下象限内，在22.5°倾斜形成对罐的最左侧一个直角三角形。
确保水在驯化槽和侵略罐中的温度在壳体机架2℃。要做到这一点，有新鲜的，老化水预热至27.5-28.5℃，准备加入到侵略坦克。请注意，以改变水在每个测定之间，以消除无端是重要嗅觉线索。
转移，通过拔罐，焦点鱼从壳体机架到一个单独的驯化槽那里将适应环境10分钟。
注：重要的是要通过降低处理不当引入到鱼的刺激。传输个人如前所述^27。
1. 具体地，手动和小心地将一个小的，透明的塑料杯到感兴趣罐。而不破坏鱼不亚于通过使用净转移，慢慢鱼舀进杯子。
确保视频摄像机准备通过确认试验侵略罐（见步骤3.1）是焦点，并立即个体转移到侵略罐，在设备上按记录之前记录。通过拔罐从顺应坦克侵略罐转移焦点鱼。
注：记录鱼进入坦克侵略跟踪条目的确切时间之前是很重要的。
记录汇聚分裂国家罐10分钟，30秒，然后杯从侵略罐放回驯化槽的焦点的鱼。
在观看录制，等待30秒的鱼已经被引入到罐后的进球行为之前，一个额外的适应期。
使用用于攻击行为限定的JWatcher评分系统，量化为10分钟以下行为：邻近镜花费时间，镜像方法，飞镖的数量，试图叮咬（在反射镜的方向张口）的数目，和横向显示的号码数（背鳍，胸鳍，臀鳍和尾鳍勃起^）9。
分数单侵略试验至少两次，直到检测与迭代之间的一致性高得分。

4.开展大胆试验

在开展小1.5升梯形水箱大胆试验，测量15厘米高x26.5厘米顶的X22.5厘米底×6厘米宽。环绕四面不透明的纸ØF中的坦克，但留下暴露观察前方。一个单一的，薄片胶带外部的放置在罐从罐的底部划界的顶部。
确保水在大胆罐中的温度在壳体机架2℃（参见步骤3.2）
从壳体机架驯化槽转移焦点鱼（参见步骤3.3），并让适应环境10分钟。
确保摄像机准备拍摄大胆试验，一旦准备转移焦点鱼，按记录设备。从驯化罐转移焦点鱼的胆量槽和录制了8分30秒的。
当观看记录，允许另外的30秒的适应期的鱼被引入到得分前油箱之后。
使用JWatcher软件，量化大胆行为8分钟。具体来说，量化以下行为：近表面的时间，延迟进入TRA的上部，数nsitions进入上部，和²⁹不稳定的运动（飞镖）的数目。
分数单大胆试验至少两次，直到检测与迭代之间的一致性高得分。

5.开展了浅水分析

进行浅水实验中有三个隔间用硅胶密封填缝两个玻璃隔板分成一个76升罐（所产生的三个室由两个刺激区和一个联络室）。在外部，标记指定每个刺激区'玻璃分隔的6.35厘米双重偏好的区域，表明两种车身长度^30。应用不透明的分区外部周围的浅水坦克的三面，但留下暴露观察前方。
注：此首选项区可进行定制，以测试不同大小的物种的特定假设。
根据研究的性质，选择刺激滩涂适应环境至少12小时beforÈ测试并保留在浅水罐在整个实验过程中。
注：刺激滩涂是用来评估焦点鱼在这些浅滩的存在或不存在的行为鱼个体的集合。不同的刺激浅滩组合可以选择测试多个不同的浅水假设。可以肯定的刺激浅滩各自刺激区域之间旋转，以避免侧偏置，并且也使其适应测试前至少12小时。
如前所述转移焦点鱼入驯化罐（见步骤3.3）
传送，通过从中间驯化槽在浅水罐中央室拔罐，焦点鱼。
允许10分钟的现场得分的观察期前的10分钟适应期。另外，记录浅水试验，然后再使用JWatcher得分。鱼被确定为变浅时，他们在腔室中的优先区域内住房目标浅滩。
量化在中心容积花各人喜好区和时间花费的时间。
作为额外的描述计量，监测“浅水的实力”（SOS）。其中大小描述如何经常单个鱼群分配-1和+1之间的值。
计算由浅水区的面积除以所花费的时间变浅的比率和减去的时间的比例花费不变浅和非浅水区的面积。放置此数量超过由每个区域的体积单独分开的每个区所花费的时间的总和。关于该计算的详细的信息可以在先前的研究中¹⁴中找到。

6，数据质量控制

分析使用传统的数据分析工具^31-32的数据。
测试使用非参数列文的测试的所有行为方差齐性。如果一个行为是不均匀的执行日志变换33。
确认没有顺序的影响（即，随机化为了不影响个人的行为）对同质数据³⁴使用秩和检验方差分析。
确认有与侧固定系数³⁵ SOS的指数创建单变量一般线性模型无副作用偏见的浅水检测。
注意：如果有一点与数据没有问题，下游分析可以进行。如果有问题，调和额外的转换，具有生物合理的解释合理，和/或增加样本量。

7.分析数据

计算双尾Spearman秩相关性³⁶分开内的胆略和侵略检测所有行为。
计算组内相关系数（ICC），为与行为分析稠度进行了一个以上的添双向混合模型E对于一个给定的个人^36。在这一背景下，国际刑事法院是在给定的实验乖鱼如何衡量持续超过一次的测量。
由中心和拉平所有行为预处理魄力和侵略行为，以输入准备一个主成分分析^{（PCA）25。}
注：由中心和拉平预处理测量是一个重要的步骤。如果没有可变更多的次数多，会出现过度影响提取成分的解释这个预处理步骤的行为。居中和拉平的过程中会删除此偏差。
执行与相关矩阵PCA一，以确定是否魄力和侵略是作为行为综合症联系在了一起。在> 0.6诠释每个组件显著的行为负荷。见2010 Budaev ²⁴报告PCA的行为学研究的综合指南。一个碎石图将知识性上eigenve构建函数应保持解释。
使用统计软件包如R或SPSS ^31,32，提取得分为每个单独的每个组件。该分数代表多少给定的个人的行为可以由特定的组件进行说明。
计算因素回归分数和不冻³⁶的强度之间的Spearman等级相关。
注：行为综合症被视为存在，如果魄力和侵略行为加载相同的组件上，或者，如果有显著可解释的负载任何组件与浅水的实力相关。另外，还要注意浅水的实力不包含在PCA，以允许更多复杂的行为quantifications（胆略和侵略）更好的解释。该PCA将正交崩溃魄力和侵略特性引入特征向量，最大限度的变化说明，并非常适用于这些复杂的测量量。解读所产生的特征向量和回归我们的浅水测量强度对他们每个人给出了每个复杂的行为（胆略和侵略）涉及到一个更明确的二进制浅水测量一个更加直观的解释（即鱼是不冻或不不冻）。

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Representative Results

根据研究的性质，和所用的具体协议，几种不同的结果在一个行为综合征实验是可能的。下面的表格和数字，其中指出，改编自我们以前的杂志上发表的研究行为流程¹⁴和斑马鱼杂志^17。当提案（如上所述）将其整体，两组结果，“测定法相关'内，并进行”测定法相关之间，“预期（ 图1）。

所述第一组结果描述测定一致性内。具体来说，结果描述了如何使用行为大胆试验中对方和侵略试验中分别。表1和表 2描述了这些关系应该是什么样子的气魄和Ag相关回归分析和提出的数据是改编自先前的研究^14。对于大胆测定中，预计数转换，并在罐的上部花是正相关的时间的，但延迟进入上部负相关。对在大胆罐行为的大胆轴线测量的个体的代表性结果（参见步骤4.1）在表1中给出。对于侵略测定中，因此预计叮咬，横向显示和时间镜附近花费都相关。对在侵略罐行为的侵略轴线测量的个体的代表性结果（参见步骤3.1）在表2中给出。飞镖通常不与攻击行为相关，尽管在某些情况下，病名鱼倾向于镖（因此负相关）。最后，浅水（SOS）测量的浅水检测实力提供了浅水t的个人层面的措施endency。使用SOS（ICC = ^{0.641），14}测量，我们几个以前的研究已经证实在斑马鱼^23,38浅水行为时，浅水是跨越各种浅滩实验的高重复性的行为。由于所有个人将每个行为来衡量，我们可以计算出在这些行为斯皮尔曼相关性，并希望一些行为被相关，如确定为代表结果斑马鱼。

结果的第二部分探讨一个行为综合症的存在。在大胆和侵略行为测定量化所有行为的综合分析的结果是使用主成分分析（PCA）总结了。应该基于高负载为每种行为是两到四个可解释组件。如果解释的变化相当一部分的单一特征向量包括来自两个大胆的行为ð侵略测定，然后一个行为综合症已经观察到。但是，如果从胆略和侵略行为检测不单一特征向量重叠，那么该研究没有描述的行为综合征。代表性的成果是提出了缺乏胆略侵略行为综合症（ 图2）。在本例中，部件1是最有代表性的攻击行为的强烈而元件2被最强烈地大胆行为相关联。由于侵略和大胆行为不受相同的组件表示，可以得出结论，有没有一个大胆侵略行为综合征（大胆向量大致正交侵略矢量）。此外，这些行为不受性别，因为分布图案是男性和女性之间的相同影响。观察如果大胆或侵略行为与浅水关联，提取的回归分数每条鱼都科尔兴高采烈的与鱼的SoS的测量。确保任何相关分量实际上描述可解释组行为是很重要的。如果有任何组分和变浅测量之间的高绝对值斯皮尔曼相关，然后一个不冻行为综合症存在。不管具体的结果，以提供可行生物解释到所有观察是很重要的。代表性的结果提供了一种用于魄力-不冻行为综合症（ 表^3）14的描述。而提供的数据代表了斑马鱼的典型结果，但不应被解释为数据质量的测量。有几个原因的数据看起来在不同的实验不同，如物种或种群的差异。

图1.建议工作流的气魄，侵略和不冻的行为综合征的实验。典型的测量列出每个检测。如何单独再怎么整合分析也列分析试验大纲。请点击此处查看该图的放大版本。

这表明一个大胆侵略行为综合症不存在一个PCA图2.代表性的成果，红色矢量表示这有助于成分得分（左和底部轴）和点代表沿着每个组件个人得分（右和上轴的行为）。男性由蓝点来表示，女性用绿色点表示。需要注意的是“错误行为”是指“飞镖”和“侵略率”可以通过增加叮咬和横向显示的总时间与镜子互动划分的数量来计算。请点击此处查看该图的放大版本。

	全视线	潜伏	飞镖
	ᴩ	p	ᴩ	p	ᴩ	p
表面时间	0.65	<0.001 *	-0.68	<0.001 *	0.42	0.007 *
全视线			-0.40	0.012 *	0.33	0.041 *
潜伏					-0.47	0.002

*α<0.05

表1：在一个新颖槽测定胆识Spearman等级相关该表已经从路等人，2015年修改。

	横向显示		飞镖		密勒时间
	ᴩ	p	ᴩ	p	ᴩ	p
咬伤	0.69	<0.001 *	-0.10	0.547	0.63	<0.001 *
横向显示			-0.06	0.735	0.66	<0.001 *
飞镖					-0.18	0.285

*α<0.05

表2：在一个新颖槽测定侵略性Spearman等级相关该表已经从路等人，2015年修改。

	ᴩ	p
PCA组件
魄力	0.339	0.035 *
侵略	0.075	0.65
镖	-0.012	0.944

Ť 能够3：使用PCA分量，以确认存在于该人群变浅和勇气行为综合症的存在下该表已经从路等人在2015年修改。

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Discussion

该协议将确定是否有在魄力，侵略一致协会，和在斑马鱼变浅的行为。如果有一致的关联的任何这些行为之间的给定人群中，然后一个行为综合症存在。通过研究人口的自然行为综合症，研究人员可以有它的行为的动态的一个更完整的理解，种群结构，以及可能的进化史^3。此外，操纵影响这些行为综合征，像在药理学^6，毒理学^7，行为遗传学^8,9的环境中，和内分泌学¹⁰的研究中，可以在不同的因素可能会如何影响行为关联线索。在该协议中发现的侵略，胆略，浅水行为综合症的具体组成包括在模式生物斑马鱼^11-13很好的研究的一般行为。虽然这种方法可以适用于任何种类的鱼，使用斑马鱼中的广泛应用可能有助于该协议的跨学科标准化。上述每个测定，可以更容易地控制，比其它可比的技术操作。例如，侵略测定使用倾斜镜引出的侵略响应更宽阵列，而不是使用一个活或粘土模型，视频的刺激，或垂直镜像刺激^17。在大胆测定法测量的行为更容易比在叔迷宫或大旷场试验¹⁵定量。最后，浅水分析描述可以轻松地跟踪一个人，这是在个人层面上研究行为综合征必不可少的，可以允许目标滩涂的无限组合提出新的实验问题。虽然这个协议可以改变以适应各种行为的问题，它的标准化可能导致在如何的DNA，细胞机制进一步了解S，手机的发展，并介绍了化学物质会影响个人和群体行为综合征。

为了确信所观察到的关联是真实的，该协议必须认真遵守。在大多数情况下，该协议根据具体的假设是可修改的;但是，也有必须进行，以确保结果的可信度几个步骤。首先，重要的是该个人被容纳在合适的罐中，在最佳条件下（见协议），并适当地送入。水条件应在住房架，坦克驯化和测试坦克是一致的。如果水是不一致的，将鱼需要更长的时间来适应环境条件，和行为的测量将不能正确捕获。同样重要的是将水大胆和侵略箱之间循环，使得人工气味未测定之间结转。其次，它是最重要的是所有behavIOR中正确评分。为了确保这一点，所有的试验都录像为允许多个收看，并为一些培训机会。一个单一的训练有素的射手能准确地测量鱼的行为，但确实培养需要一定的时间。如果仔细训练期间被忽略，那么行为研究结果的信心低落。由训练有素的观察者进行低样本量的仔细研究比由缺乏训练的观察者进行高样本量的研究更加强大。最后，所收集的数据的质量控制也很关键。所采取的步骤，以随机的个人，并移除偏差应导致可用的，可靠的数据，和数据转换被推荐用于预处理根据具体统计检验（见协议）。如果这些步骤都没有认真做的，分析的输出可能不可靠可解释的。

如前所述，该技术在很大程度上修改according到具体的测试假设。存在能够调查在当中的一些不同的鱼种^39-41的行为综合症是相关的其他行为的测量。虽然协议的原理保持相同，具体的问题，能够容易地改变以允许不同的假设检验。例如，研究人员可以使用上述协议测试的侵略和罪犯慈鲷的探究活动行为综合症（Amatitlania nigrofasciata）的存在。问题是相关的，但在研究生物是从由协议所描述的不同。但是，一般的步骤仍然大致相同。个人必须是随机的，并跟踪通过一系列的试验，在试验之间，水必须是一致的和新鲜的驯化期，和科学家应该进行适当的培训。一个主要的差别是正在测量的行为很可能根据特定改变FIC测定法，和行为的关联可根据具体的物种和原来的环境改变。

该协议的限制与某些行为研究的传统的不确定性的链接。具体地，如果试验是不可靠计分则很可能的结果的解释是错误的，这将是难以确定这个错误。为了克服这一限制，但是可能两个训练有素得分观察的行为。评估其可靠性，计算组内相关系数上施加相同的鱼的测量，并且，如果需要的话，调整的差异。可替代地，如果有的话，自动跟踪软件如Ethovision可以实现和由一个训练有素的观察者验证，以增加吞吐量和精确度^42。此外，还有关于“魄力”行为的命名和得分的不同的可能的解释。其他研究称之为行为描述⁴³和其他人描述的行为为“试探性^”44,45。在我们的工作行为被描述为“大胆”，因为它是在陌生的焦点单独的环境中测试的行为。然而，虽然该术语可能会受到不同的解释，这并不影响协议或分析。此外，虽然我们希望大胆和侵略测定内测量，以人口内强烈相关，有可能是低的一些实例没有一些行为的相关性。此限制是由在PCA的强度克服的，因为它在上和可变性的重要来源，即使测量不相关的键，该分析将提取行为变化在所收集的数据是一致的。最后，由于与所有的科学方法的情况下，如果该协议被普遍采用，并始终被几个实验室中进行，并有一些由协议引入不可预见的，未测量的混杂，那么这种潜在的有害元素仍然存在于文献中，并且变得难以拆除。药理学上确认一组代表性测定的引起的预期行为反应要求的行为，神经和激素反应更透彻的理解。行为症状可以帮助解释行为的依据，但这个实验室限制可能能够在未来的研究中更经常地解决。尽管如此，结果已被提供了验证在斑马鱼中使用这种协议的，并且，具有适当的修改，该协议可以在许多不同的鱼种可以扩展到多种假设。通过仔细以下的住房，选择和行为上的各种参数，测试一个详细的协议将使研究人员能够跨越广泛的研究，提出更加具体的比较。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Rack System	Aquaneering Inc	Cat. # ZS550
Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g	Pet Valu	Cat. # 31700
Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz	Brine Shrimp Direct
1.5 L Trapezoidal Tank	Pentair Aquatic Ecosystems	Cat. # itsts-a
19 L rectangular tank	That Fish Place	211932
76 L rectangular tank	That Fish Place	212180
Hitachi KP-D20A CCD Camera	Prescott's, Inc.
Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens	Nikon Corporation
ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3"	Michaels	Cat. # 10334162
Jwatcher
SPSS Statistics Base	IBM
R	The R Foundation