Abstract
특정 행동이 다른 상황에서 상호 작용할 때 행동 증후군이 있습니다. 제브라 최근 연구에서 피험자왔다하고 적절한 분석 및 해석을 보장하는 프로토콜을 표준화하는 것이 중요하다. 이전 연구에서, 우리는 1.5 L 사다리꼴 탱크 행동 (표면 근처의 시간 천이의 지연, 전환의 수, 다트)의 시리즈를 감시하여 대담을 측정했다. 마찬가지로, 우리는 직사각형 19 L 탱크에 경 사진 거울 옆에 관찰 물린, 측면 디스플레이, 다트, 시간에 의해 침략을 정량화. 분에 76 L 탱크를 분할함으로써, 우리는 또한 천수 환경을 조사 하였다. 천수 분석은 매우 최적화 된 분석하고 특정 가설에 맞게 조정 할 수 있습니다. 그러나,이 분석을위한 프로토콜은 표준화, 아직 사용자 정의를 위해 충분히 유연해야합니다. 이전의 연구에서, 최종 챔버이었다 중 빈, 5 또는 10 제브라 피쉬, 또는 5 진주 danios (D. albolineatus)를 포함. FOL에서원고를 lowing의, 우리는 행동 증후군 실험의 복제를 허용 할 프로토콜의 성공적인 응용 프로그램을 함께 상세한 프로토콜 및 대표 데이터를 제시한다.
Introduction
주어진 인구에서 개별 동물 내에서 서로 다른 행동 사이의 연관성을 조사 문학의 성장 몸이있다. 이 협회는 행동 증후군이라고하고, 측정은 일반적으로 대담, 침략, 탐색 행동 및 사회성 1-5을 포함한다. 행동 증후군은 모두 직접 및 간접 이유로 가치가있다. 직접 행동 신드롬의 지식 진화론 인구 구조 인구 역학 (3)의보다 완전한 뷰를 제공 할 수있다. 간접적, 행동 단체에 대한 지식은 약리학 6, 독성학 7, 행동 유전학 8, 9, 및 내분비학 (10)로 동작을 정량화 필드를 알릴 수있다. 때문에 이러한 직접 및 간접 혜택, 행동 증후군의 증가 지식은 제브라 피쉬와 같은 일반적으로 사용되는 모델 생물에서 특히 유용하다. 제브라 피쉬를 사용하는 연구는 발견 전행동 증후군 11-13의 분석을 포함한 분야의 NA의 다양한. 행동 증후군 연구에 대한 지식을 향상하고, 다른 분야도 가설 검증을위한 행동 측정을 사용하기 때문에 행동의 신뢰성과 간결한 설명은 종 내에서 간 연구의 비교를 용이하게 유효한 분석과 해석과 표준화 된 프로토콜이 필요합니다. 우리의 프로토콜은 실험실에서 사육 제브라 피쉬 (14)의 인구의 대담 - 공격 - 천수 행동 증후군을 측정하기 위해 개발되었다. 그러나, 프로토콜에 기초하여 용이하게 다른 행동 방법의 다양한 변형 될 수있다 (임의 적절한, 적절한 해석을 보장 개별 물고기 추적). 또한, 대담, 침략, 또는 천수의 분석은 별개의 가설의 시험에 대해 개별적으로 실행할 수 있습니다. 따라서, 우리의 목표 동안 행동 증후군 연구 및 성공적인 개인 리터의 프로토콜을 수행하는 방법에 대해 설명합니다레벨 레벨 행동 측정이 절차의 각면 혼자 설 수 있습니다.
행동 증후군에 대한 문헌 행동 증후군을 측정하기 위해, 인간 4 절지 동물에서 여러 분류 학적 그룹 걸쳐 적어도 2 개의 행동 상황을 정량한다. 불행히도, 동작의 축을 가로 지르는 행동 측정을 정량화하는 데 사용되는 분석에서 종종 작은 일관성이있다. 예를 들어, 생선, 대담는 T 검정 미로, 개방 필드를 분석하거나, 신규 또는 외부 자극 (15)의 도입을 이용하여 측정 될 수있다. 물고기의 침략 연구는 다이 애드 상호 작용, 비디오 자극 분석, 또는 점토 모델 분석 12,16,17를 포함 할 수 있습니다. 마찬가지로, 통상적 shoalmate 환경의 측정을 포함 천수 행동 분석, 연관 21-23 시간을 결정하기 위해 다른 방법으로, 탱크의 다른 유형으로 수행 될 수있다. overa의이 프로토콜의 특정 부분 집합LL 행동 분석 레퍼토리가 표시됩니다. 특히,이 프로토콜은 비교가 인구 내의 모든 개인에 걸쳐 일관성이 있는지 여부를 확인하기 위해 개인 내 비교를 용이하게하는 방식으로 대담, 침략, 그리고 천수 분석을 통해 개인을 추적 할 수있는 방법을 제시한다. 우리는 이전 연구 14, 18에 제브라 피쉬와 죄수 시클리드 (Amatitlania의 nigrofasciata)이 프로토콜을 수행하고 그것은 어떤 비슷한 크기의 민물 고기와 함께 작동합니다.
볼드 분석은 탱크의 상부와 하부가 동일한 크기의 영역을 묘사하는 수평선을 갖는 1.5 L 사다리꼴 탱크에서 수행된다. 정량화 동작은 탱크의 상부 및 하부에 각 부, 다트의 수에 소요되는 시간의 시험 물고기 의한 전환의 수, 상부를 입력하는 지연을 포함한다. 침략의 분석을 포함하는 19L 직사각형 탱크에서 수행된다3 인치 × 5 인치 미러는 탱크 (19)의 왼쪽 하단에 위치한 약 22 ° 경사. 테스트 물고기와 그것의 반사 사이의 바이트 수, 측면 디스플레이, 다트 - 정량화 된 행동은 전체 특정 공격 지표와 함께 미러 (20)와 상호 작용하는 대상 물고기 보낸 시간의 양을 포함한다. 이러한 특정 지표의 경우, 물기가 오픈 입으로 거울을 향해 빠르게 달려 들죠로 정의된다, 측면 디스플레이는 거울의 방향 측면, 가슴, 항문과 등 지느러미 지느러미의 플레어로 정의하고, 다트는 어떤 불규칙한 움직임이다 있습니다 거울을 향해 없습니다. 마지막으로, 분석은 천수 트라이 챔버 탱크의 중앙 챔버에서 시험 물고기의 동작을 정량화한다. 탱크 측 챔버 중 비어 또는 생선 "타겟 얕은"를 포함하고, 시험 물고기가 각 사이드 실 근방 소요 시간은 21 ~ 23을 측정한다. 하나의 복합 점수, Stren라고얕아 GTH (SOS)이 상기 특정한 자극에 각 시험 물고기에 대해 계산되고, 하류 측 (14)을 분석에 사용될 수있다. 모든 동작이 JWatcher 24 알려진 자유 행동 정량 소프트웨어를 사용하여 단일 뷰어, 또는 다수의 시청자가 획득된다.
행동 증후군의 존재를 테스트하는 것은 주로 통계 노력하고, Budeav 2010 년 발표로이 지침을 준수하는 것이 바람직하다 (25). 구체적으로는 중심과 NORMED 데이터에 주성분 분석 (PCA)를 수행하는 것이 좋습니다되는에 입력은 여러 행동 측정 (즉, 담대함과 침략)와 분석에 개인의 행동의 벡터이다. 상관 행렬에 대해 수행 PCA는 행동의 측정 차수를 감소시키고, 따라서 변동의 대부분을 설명하는 가장 중요한 기술을 추출한다. 추출 된 성분은 BAS를 해석 할 수있다관심 회귀 점수의 개별 동작 높은 계수 하중에 에드 해설 성분에 기초하여 각 개인에 대해 추출 될 수있다. 이러한 회귀 점수는 다음의 SOS 측정 및 생선 성 크기 또는 다른 다양한 비 행동의 측정과 비교 될 수있다.
이 워크 플로는 대담함과 천수 (14) 사이에 존재하는 섹스 특정 행동 증후군이 발견 된 제브라 피쉬의 행동 증후군의 연구에서 구현되었습니다. 이 상황에서 대담한 제브라 피쉬 남성은 더 큰, 더 공격적 종 (D. albolineatus)와 연관 가능성이 더 높습니다하지만,이 협회는 여성에서 손실됩니다. 이 워크 플로는 행동 증후군이 잠재적 종의 행동 가소성을 나타내는 발견되지 않은에서 청소년 죄수 시클리드 친척 (Amatitlania의 nigrofasciata) (18)의 연구에서 구현되었습니다. 따라서, 다음의 프로토콜 승 제시개인 수준의 행동 증후군 연구의 틀에 세 가지 특정 분석 (대담, 침략, 그리고 천수)의 성격을 서술의 목표 i 번째.
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Protocol
제브라 피쉬의 주거, 관리 및 연구를위한 다음 방법은 세인트 조셉 대학 IACUC에 의해 승인되었습니다.
1. Zebrafish의 주택 및 관리
- 로컬 공급 업체, 또는 자연산 인구의 대상 제브라 피쉬를 얻습니다. 제브라 피쉬 주택 자연산 인구에 필요한 IACUC 지침 및 추가 허가의 적용을받습니다 그 주택을 유의하시기 바랍니다.
- 성별에 따라 확인하고 별도의 제브라 피쉬. 또한,이 단계를 건너 뛰거나 연구 가설에 따라 분리의 다른 방법으로 대체합니다.
참고 : 성별 특성이 특히 여성에서, 제브라 피쉬에서 결정하기가 어렵다. 섹스를 구별하기 위해이 가이드 라인 10 유용한 온라인 설명서를 참조하십시오. - 무작위로 물고기를 자극하는 데 초점 물고기의 적절한 비율로 더 인구를 구분합니다. 참고 : 초점 물고기는 시험 대상이 behavio의 일련의 뒤에 있습니다RAL 분석 및 자극 물고기는 침략과 천수 분석에 자극 챔버를 차지합니다 개인입니다.
참고 : 전통적으로, 천수 분석에 초점 물고기 당 자극 물고기와 1 내지 5 : 1 자극 : 침략 분석 14,17에 초점 물고기 비율이 사용된다. 그러나, 연구자가 특히 마음에 가설과 연구를 설계해야합니다 (즉, 물고기 초점 물고기의 행동의 일관성을 유지하기 위해 일정하게 유지 자극한다, 또는 물고기가 적절한 무작위 배정을 보장하기 위해 각각의 분석 사이에 회전 자극한다). - 엄격한 12시 12분 빛 / 어둠주기에서 제브라 피쉬 주택 랙에있는 모든 물고기 (27.5-28.5 ° C)를 저장합니다. 매일 모든 초점과 자극 물고기 플레이크 음식을 공급 및 비 연구 일에 소금물 새우 매주.
- 모든 테스트 활동 일주기 효과 (26)을 피하기 위해 ZT1 및 ZT5 (zeitgeber 시간) 사이에 수행되어 있는지 확인합니다.
2. 무작위 및 탱크 설치
- 라행동 분석의 특정 시퀀스에있는 모든 개인에게 선험적 ndomize. 온라인 랜덤 시퀀스 생성기 (27) 또는 통계 소프트웨어 패키지 (R)에서 임의의 순서 생성기를 사용하여 일관된 무작위 방식을 설정합니다.
- 3 1에서 각 분석 레이블과 일관성이 할당을 유지합니다. 각 개인에게 임의의 순서를 지정하고 행동 분석 레이블에 따라 순서를 매핑합니다. 예를 들어, (공격성 매핑 대담 매핑 얕아 2에 대응 한, 3) 총 3 분석법 들어 특정 개인의 특정을 수행하도록 요구되는, "2,3,1"의 랜덤 시퀀스를 가질 수있다 지정된 순서에 행동 분석.
- 불리한 외부 자극에 대한 가능성을 최소화하고, 전체 탱크를 캡처 할 수있는 비디오 캠코더를위한 충분한 공간이 반드시 장소에서 실험실에서 분석 탱크 (대담, 침략, 그리고 천수)를 설정합니다. 캠코더가 enoug 있는지 확인시간 선명도는 탱크 라벨을 볼뿐만 아니라 초점 물고기와 설정이 위치에서 캠코더의 미묘한 행동을 구별 할 수 있습니다.
- 차동 기록의 결과로서 행동 점수에 의도하지 않은 차이를 최소화하기 위해 지정된 탱크의 전체보기와 동일한 위치에 유지 카메라 모든 행동 분석을 기록한다.
참고 : 무거운 인신 매매 분야에서 움직임과 같은 문으로 탱크를 배치 피하고 제브라 피쉬의 행동에 영향을 미칠 것입니다 소리. - 각각의 행동 분석을 처치 고유 JWatcher 프로토콜 (24)을 설정합니다. 수집 된 데이터를 요약하는 키 입력과 초점 분석 파일에 동작을 할당 초점 마스터 파일을 작성하는 방법에 대해 알아 보려면 JWatcher 설명서를 참조하십시오.
참고 : JWatcher 사용자 정의 안정적이고 반복적 인 행동 점수 (24)을 허용 행동 채점 소프트웨어입니다. - 예 (모든 행동 분석에 대한 날짜, 생선 번호, 분석 횟수를 추적 라벨 방식을 정의년 12 월 31 일, 2015 년 'F5-B-123115'의미 물고기 5, 대담 분석) 및 뷰에 카메라의 초점 테이프와 탱크의 외부 레이블을 붙입니다. 유지 및 빠른 참조와 미래의 품질 관리 실험실 노트북에이 정보를 기록한다.
- 개인이 주택 랙에서 제거 된 후 가능한 직접뿐만 아니라 모든 분석 사이에 사용되는 것 순응 탱크를 설정합니다.
참고 : 적응 탱크 터미널 탱크는 작은 수족관 자갈 (40cm X 20cm X 25cm)와 밀접하게 주택 랙을 닮은 필터입니다. - 분석법이 모두 완료 한 후 모든 중고 초점 개인에 대한 최종 목적지 탱크 역할을하는 별도의 터미널 탱크에 개인을 전송합니다. 자신의 삶 (예를 들어, 25갤런)의 나머지 부분에 대한 개인의 그룹을 수용하기에 충분히 큰 탱크를 사용합니다.
참고 :이 아 크로스 일관성 및 유사 물 온도와 조건을 유지하는 것이 매우 중요합니다의 모든 탱크. 이것은 주택, 순응, 모든 테스트 탱크를 포함한다.
3. 침략의 분석을 실시
- 30cm X 15cm X 10cm를 측정하는 19 L 직사각형 탱크의 침략 분석을 실시한다. 바람직하지 않은 외부의 자극을 줄이기 위해 볼 수 있도록 노출 앞을 떠나 침략 탱크의 삼면을 둘러싼 외부 불투명 한 파티션에서 탱크를 복장. 네 개의 동일한 직사각형 사분면으로 외부 표시와 탱크를 나누고 탱크의 맨 왼쪽에 대하여 직각 삼각형을 형성 22.5 ° 기울어 왼쪽 하단 사분면 내에서, (실리콘 코킹으로) 영구적으로 거울을 수정합니다.
- 순응 탱크와 침략 탱크의 물 온도가 주택 랙 2 ° C 내에 있는지 확인합니다. 이렇게하려면, 신선한, 세 물은 침략 탱크에 추가 할 준비가 27.5-28.5 ℃로 미리 예열했다. 부당한 제거하기 위해 각각의 분석 사이에 물을 변경하는 것이 중요 있습니다후각 단서.
- 이 10 분 동안 적응하는 별도의 적응 탱크에 주택 랙에서, 부항으로, 초점 물고기를 전송합니다.
참고 : 부적절한 처리를 통해 물고기에 도입 자극을 줄이는 것이 중요합니다. 전송 개인은 이전 27 설명했다.- 특히, 수동으로 조심스럽게 관심 탱크에 작은 투명 플라스틱 컵을 배치합니다. 물고기를 방해만큼 그물을 사용하여 전송하지 않고, 천천히 컵에 물고기를 특종.
- 비디오 캠코더는 침략 분석 탱크 (단계 3.1 참조)에 초점이 있음을 확인하여 즉시 장치의 침략 탱크를 눌러 기록에 개인을 전송하기 전에 녹음 할 준비가되어 있는지 확인합니다. 순응 탱크로부터 침략 탱크에 넣는를 통해 초점 물고기를 전송합니다.
주 : 이전 항목의 정확한 시간을 추적 할 수있는 침략 탱크로 유입되는 물고기로 기록하는 것이 중요하다. - AGGR을 기록다음 10 분 30 초와 컵 다시 순응 탱크로 공격 탱크에서 초점 물고기 ession 탱크.
- 기록을 볼 때 물고기가 득점 행동하기 전에 추가로 적응 기간으로 탱크에 도입 된 후, 30 초를 기다립니다.
- 10 분 동안 다음과 같은 동작 정량화, 공격적인 행동에 대해 정의 된 JWatcher 채점 시스템을 사용 : 거울 근처에 소요되는 시간을, 거울 접근, 다트 수, (거울의 방향으로 입을 열고) 시도 바이트 수, 측면 표시의 수의 수 (지느러미, 가슴, 항문, 그리고 꼬리 지느러미 발기) 9.
- 분석이 반복 사이의 동의으로 득점 할 때까지, 적어도 두 번 하나의 침략 분석 점수.
4. 담대함 분석을 실시
- 26.5 cm 위로 X 22.5 cm 바닥 × 6 cm 폭 X 높이 15cm를 측정, 작은 1.5 L 사다리꼴 탱크의 담대함 분석을 실시한다. 모든면 주위에 불투명 한 종이를 감싸 오하지만 탱크 f를 볼 수 있도록 노출 된 전면을 둡니다. 탱크의 바닥 부분에서 상단을 구별하기 위해 탱크의 외부에 테이프를 하나의 얇은 조각을 놓습니다.
- 굵기 탱크 내의 물의 온도는 하우징 랙 2 ℃ 이내인지 (단계 3.2 참조)를 확보
- 순응 탱크로 주택 랙에서 초점 물고기 이동 (단계 3.3 참조), 10 분 동안 적응 할 수 있습니다.
- 캠코더가 장치에 초점 물고기를 눌러 기록을 전송할 번 준비가 대담 분석을 기록 할 준비가되어 있는지 확인합니다. 8 분 30 초 동안 대담 탱크와 기록에 순응 탱크에서 초점 물고기를 전송합니다.
- 기록 시청시 어류가 채점 전에 탱크에 도입 한 후, 추가로 30 초의 적응 기간을 허용한다.
- JWatcher 소프트웨어를 사용하여 8 분 담력 동작을 정량화. 특히, 다음과 같은 동작을 정량화 : 표면에 가까운 시간, 대기 시간은 TRA의 상부, 번호를 입력합니다상부에 nsitions 및 불규칙적 인 움직임 (다트)의 수 29.
- 분석이 반복 사이의 동의으로 득점 할 때까지, 적어도 두 번 하나의 대담 분석 점수.
5. 수준면이 얕아의 분석을 실시
- 실리콘 코킹으로 밀봉이 유리 칸막이로 나눈 세 개의 구획이 76 L 탱크의 천수 분석을 실시 (결과 세 개의 구획이 자극 영역과 하나의 초점 구획으로 구성). 외부, 6.35 cm 자극 존 '유리 분배기의 각에서 지정된 두 개의 기본 영역,이 몸을 나타내는 30을 길이를 표시합니다. 외부 천수 탱크의 세 가지 측면 주위 불투명 한 파티션을 적용하지만,보기에 노출 된 전면을 둡니다.
참고 :이 기본 설정 영역은 다른 크기의 종에 대한 구체적인 가설을 테스트하기 위해 사용자 정의 할 수 있습니다. - 연구의 특성에 따라 선택 자극 떼 적어도 12 시간 befor를위한 적응하기시험 예 및 실험 과정에 걸쳐 천수 탱크 내에 남아있다.
참고 : 자극 떼가 초점 물고기가이 떼의 존재 또는 부재가 동작하는 방법을 평가하는 데 사용되는 개별 물고기의 모음입니다. 다른 자극 얕은 조합은 다양한 천수 가설들을 테스트하기 위해 선택 될 수있다. 자극 떼 측면 편견을 피하기 위해 각각의 자극 영역 사이에 회전도 시험 전에 최소 12 시간 동안 적응 할 수 있는지 확인합니다. - 전술 한 바와 같이 순응 탱크에 초점 물고기를 전송한다 (단계 3.3 참조)
- 천수 탱크의 중앙 구획에 중간 순응 탱크에서, 초점 물고기를 넣는으로 전송합니다.
- 10 분 라이브 점수 관찰 기간 전에 10 분의 적응 기간 동안 허용합니다. 대안 적으로, 천수 세이를 기록 JWatcher를 사용하여 나중에 점수. 들은 챔버 내의 설정 영역 내에있는 경우 생선 천수이어야 결정된대상 떼를 수용.
- 중앙 볼륨에서 보낸 각 환경 영역과 시간에 소요되는 시간을 정량화.
- 추가 설명이 조치로, '천수의 힘'(SOS)를 계산한다. 크기가 얼마나 자주 개별 물고기 떼를 설명 곳 -1과 +1 사이의 값을 할당합니다.
- 천수 영역의 면적으로 나눈 시간 소요 천수의 비율을 계산하는 시간의 비율을 감산하지 천수과 비 천수 영역의 면적을 썼다. 개별적으로 각 영역의 볼륨으로 나누어 각 영역에서 보낸 시간의 합 이상이 양을 넣습니다. 이 계산에 대한 자세한 내용은 이전의 연구 (14)에서 찾을 수 있습니다.
6. 데이터 품질 관리
- 기존의 데이터 분석 도구 31 ~ 32을 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다.
- 모든 행동에 대한 비모수하는 Levene의 테스트를 사용하여 분산의 동질성에 대한 테스트. 행동이 비 균일 경우, 로그 변환을 수행33.
- 균일 한 데이터 (34)에 크루스 칼 - 월리스 ANOVA를 사용하여 어떤 순서 효과 (즉, 랜덤 순서가 개인의 행동에 영향을 미치지 않았 음)이 없는지 확인합니다.
- 고정 요소 (35)로면 조난 신호 인덱스에 단 변량 일반 선형 모델을 생성하여 천수 분석에 대한 측면 편견이 없는지 확인합니다.
주 : 데이터를 문제없이 거의 존재하는 경우, 하류의 분석이 수행 될 수있다. 문제가있는 경우, 추가 변환과 화해 생물학적으로 그럴듯한 설명으로 합리화 및 / 또는 샘플 크기를 증가시킨다.
7. 데이터 분석
- 계산이 꼬리 스피어 만 순위는 별도로 담대함과 침략 분석 내의 모든 행동에 대한 36 상관 관계.
- 둘 이상의 팀을 수행 하였다 행동 적 분석을위한 일관성과 양방향 혼합 모델 개체 간 상관 계수 (ICC)를 계산특정 개인 (36)에 대한 전자. 이 설정에서, ICC는 주어진 분석에서 행동 물고기 번 이상 꾸준히 측정 방법의 측정이다.
- 모든 행동을 중심으로하고 규준에 의해 전처리 담대함과 침략 행동은 주성분 분석 (PCA) (25)에 입력을 준비합니다.
참고 : 중심과 규준에 의해 측정 전처리는 중요한 단계입니다. 과도하게 추출 성분의 해석에 영향을 미칠 것이다 가변적으로 더 많은 주파수보다 발생이 전처리 단계 행동없이. 중심과 규준의 과정은이 편견을 제거합니다. - 대담함과 침략이 행동 증후군으로 서로 연결되어 있는지 확인 상관 행렬과 PCA를 수행합니다. 0.6>에서 각 구성 요소에 중요한의 행동 하중 해석. 행동 연구에 PCA를보고 포괄적 인 가이드에 대한 Budaev 2010 (24)을 참조하십시오. 돌 더미 플롯하는 eigenve 정보가 될 것입니다ctors는 해석 유지되어야한다.
- 이러한 R 또는 SPSS (31, 32)로 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 각 개인에 대한 각 구성 요소에 대한 점수를 추출합니다. 점수는 주어진 개인의 행동이 특정 구성 요소에 의해 설명 될 수 있는지 얼마 나타냅니다.
- 요인 회귀 점수와 36 천수의 강도 사이의 스피어 만 순위 상관 관계를 계산합니다.
참고 : 중요한 해석 부하와 구성 요소가 천수의 강도와 상관 관계가있는 경우 담대함과 침략 행위는, 동일한 구성 요소에로드하거나 경우 행동 증후군이 존재하는 것으로 간주됩니다. 또한, 천수의 강도는 더 복잡한 행동 정량화 (담대함과 침략)의 더 나은 해석이 가능하도록 PCA에 포함하지 않는다. PCA에 직교 담대함을 축소하고 침략을 설명하고 복잡한 측정에 적합하다 변화의 양을 최대화하기 위해 고유 벡터에 있습니다. 통역고유 벡터를 생성하고 복잡한 동작 (대담 공격성) 각각은 더 잘 정의 된 이진 천수 측정에 관한 방법을 더욱 직관적 해석을 제공 그들 각각 천수 측정 우리 강도 회귀 (즉, 물고기 천수 또는 ) 천수 없습니다.
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Representative Results
상기 연구의 성격과 고용 특정 프로토콜에 따라 몇 가지 뚜렷한 결과는 행동 증후군 실험에서 가능하다. 다음 표와 표시 수치는, 저널에 발표 된 우리의 이전 연구에서 적응 행동은 (14)와 저널 Zebrafish의 17를 처리합니다. 제안 (위 설명 참조)는 "상관 관계 분석 내의 '전체 결과 두 세트 및 수행되면'분석 상관 관계 사이에서 '예상된다 (도 1).
결과의 첫 번째 세트는 분석의 일관성에서 설명한다. 특히, 결과는 각 대담 분석 내의 다른과 침략 분석 내에서 별도. 표 1 및 표 2는 이러한 상관 관계는 대담함과 AG에 대해 어떻게 보일지 설명과 상관되는 방법을 행동 설명gression 분석 및 제시된 데이터는 이전의 연구 (14)에서 적응하고 있습니다. 굵기 분석 들어, 음의 상관 관계가 상부를 입력하는 긍정적 상관 관계가 탱크의 상부에서 소요 시간 천이의 수 있지만, 대기 시간이 예상된다. 굵기 탱크 행동 대담 축 측정 개인 대표적인 결과를 표 1에 나타낸다 (단계 4.1 참조). 침략 분석의 경우, 상기 거울 옆 소비 물린, 측면 표시, 시간 모두 상관 것으로 예상된다. 공격성 탱크 거동의 공격성 축 측정 개인에 대한 대표적인 결과는 표 2에 제시되어있다 (단계 3.1 참조). 다트 보통 공격적인 행동과 상관되지 않는 경우에 공격적 물고기 (따라서 음의 상관 관계를 다트 경향이 있지만 ). 마지막으로, 천수 분석에 대한 얕아 (SOS) 측정의 강도는 천수의 t의 개별 수준의 측정을 제공합니다endency. 조난 신호 (ICC = 0.641) (14)를 이용하여 측정하고 우리의 이전 연구의 몇 가지가 제브라 피쉬 23,38에서 천수 동작을 확인했다 때 천수는 천수 분석의 다양한에서 높은 반복 동작입니다. 모든 개인은 행동의 각 측정되기 때문에, 우리는 이러한 행동에 걸쳐 스피어 만 상관 관계를 계산하고 대표적인 결과에 제브라 피쉬에 대한 식별 어떤 행동이, 상관 될 것으로 예상 할 수있다.
결과의 제 2 부분은 행동 증후군의 존재를 조사한다. 대담함과 침략 행동 분석에서 정량 모든 행동의 통합 분석의 결과는 주성분 분석 (PCA)를 사용하여 요약되어있다. 각 동작에 대한 높은 하중에 따라 2 ~ 4 해석 구성 요소가 있어야합니다. 변화의 좋은 부분을 설명하는 하나의 고유 벡터는 대담함의 모두에서 동작을 포함하는 경우D 공격 분석법은 다음 행동 증후군이 관찰되었다. 대담함과 침략 분석에서 행동이 하나의 고유 벡터에 중복되지 않는 경우, 다음 연구는 행동 증후군을 설명하지 않습니다. 대표 결과는 대담 - 침략 행동 증후군 (그림 2)의 부재에 대해 제공됩니다. 부품 (2)이 가장 강하게 대담 동작과 연관되는 동안,이 예에서, 컴포넌트 1은 공격 행동의 가장 강하게 나타낸다. 공격성 볼드 동작이 동일한 성분으로 표현되지 않기 때문에 그것이 대담 침략 행동 증후군의 부재가 있다고 결론 지을 수있다 (대담 벡터 침략 벡터 대략 직교). 분포 패턴은 남성 및 여성의 동일하므로 또한, 이러한 동작은 성별에 의해 영향을받지 않는다. 대담 또는 침략 행위가 천수와 관련된 경우 관찰하기 위해 각 물고기의 추출 회귀 점수는 CORR 있습니다물고기의 조난 신호 측정을 의기 양양. 어떤 상관 관계 구성 요소가 실제로 행동의 해석 세트를 기술하고 있는지 확인하는 것이 중요하다. 모든 성분 및 천수 측정 사이의 높은 절대치 스피어 만 상관 관계가있는 경우, 다음 천수 행동 증후군 존재한다. 관계없이 특정 결과, 모든 관측 가능한 생물학적 해석을 제공하는 것이 중요하다. 대표 결과는 대담 - 천수 행동 증후군 (표 3) (14)에 대한 설명이 제공됩니다. 제시된 데이터 지브라 피쉬의 전형적인 결과를 나타내는 반면, 데이터 품질을 측정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 데이터는 종이나 인구의 차이로 다른 실험에서 다르게 보일 것입니다 몇 가지 이유가 있습니다.
그림 1. 제안대담, 침략에 대한 워크 플로우, 행동 증후군 실험 천수. 일반적인 측정은 각 분석에 대해 나열되어 있습니다. 개별적으로 다음 방법 분석을 통합하는 방법도 나와있는 분석을 분석하는 방법의 개요가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대담 - 침략 행동 증후군이 존재하지 않는 것을 나타내는 PCA 그림 2. 대표 결과입니다. 빨간 벡터 구성 요소 점수 (왼쪽 아래 축) 및 지점에 기여하는 각 구성 요소에 따라 개별 점수 (오른쪽 상단 축을 나타내는 동작을 나타냅니다 ). 남성은 파란색 점으로 표시되고, 여성은 녹색 점으로 표시됩니다. '산만 한 행동이'에서 '다트'를 참조하고 있습니다'공격 속도'는 물기와 미러와 상호 작용하는 총 시간으로 나눈 측면 표시의 수를 추가하여 계산 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 전환 | 숨어 있음 | 다트 | ||||
| ᴩ | 피 | ᴩ | 피 | ᴩ | 피 | |
| 표면 시간 | 0.65 | <0.001 * | -0.68 | <0.001 * | 0.42 | 0.007 * |
| 전환 | -0.40 | 0.012 * | 0.33 | 0.041 * | ||
| 숨어 있음 | -0.47 | 0.002 | ||||
| * α <0.05 |
표 1 :.. 새로운 탱크 분석에서 대담 스피어 만 순위 상관이 표는 방법 등, 2015에서 수정되었다.
| 측면 표시 | 다트 | 미러 시간 | ||||
| ᴩ | 피 | ᴩ | 피 | ᴩ | 피 | |
| 바이 츠 | 0.69 | <0.001 * | -0.10 | 0.547 | 0.63 | <0.001* |
| 측면 표시 | -0.06 | 0.735 | 0.66 | <0.001 * | ||
| 다트 | -0.18 | 0.285 | ||||
| * α <0.05 | ||||||
표 2 :.. 새로운 탱크 분석에서 침략 스피어 만 순위 상관이 표는 방법 등, 2015에서 수정되었다.
| ᴩ | 피 | |
| PCA 구성 요소 | ||
| 대담 | 0.339 | 0.035 * |
| 침략 | 0.075 | 0.65 |
| 다트 | -0.012 | 0.944 |
T 수 3 :..이 인구에 존재하는 천수와 담대함 행동 증후군의 존재를 확인하기 위해 PCA 구성 요소를 사용하여이 표는 방법 등, 2015에서 수정되었다.
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Discussion
제브라 피쉬의 일관성 대담, 침략에 연결하고, 천수 행동이있는 경우 프로토콜은 결정합니다. 일관된 연관성이있는 행동과 주어진 집단에서 존재하는 경우, 다음 행동 증후군 존재한다. 인구의 자연적인 행동 증후군을 연구함으로써, 연구진은보다 완벽한 그 행동 동적 이해, 인구 구조, 그리고 아마도 진화의 역사 3을 가질 수 있습니다. 또한, 약리학 (6), 독성 (7), 행동 유전학 8,9처럼,이 행동 증후군에 영향을 미치는 환경, 내분비학 (10) 연구를 조작, 다른 요인은 행동 협회에 영향을 줄 수있는 방법에 대해 밝혀 줄 수 있습니다. 이 프로토콜에있는 침략 - 대담 - 천수 행동 증후군의 구체적인 조성은 물론 모델 생물의 제브라 피쉬 11-13에서 연구의 공통 동작을 포함한다. 이 방법 동안어떠한 어류 종에 적용될 수 지브라 피쉬를 사용하는 폭 넓은 응용이 프로토콜의 표준화 학제 도울 수있다. 상기 각 분석은보다 쉽게 제어 및 기타 유사한 기술보다 조작 될 수있다. 예를 들어, 공격 분석법 오히려 17 자극 라이브 또는 클레이 모델 비디오 자극 또는 수직 미러 이미지를 사용하는 것보다 공격성 응답의 넓은 배열을 유도하기 위해 경 사진 거울을 사용한다. 대담 분석에서 측정 된 행동은 더 쉽게 t 미로 또는 대형 오픈 필드 테스트 (15)보다 정량화된다. 마지막으로, 천수 분석은 쉽게 개인 수준에서 행동 증후군을 연구하는데 필수적이며, 새로운 실험적인 질문을 대상 떼의 무제한 조합을 허용 할 수있는 개인을 추적 할 수 있습니다 설명했다. 이 프로토콜은 행동 다양한 질문을 수용하도록 변경 될 수 있지만, 표준화 방법 DNA 세포기구에 추가적인 통찰력의 원인의 세포 개발 및 도입 된 화학 물질은 개인과 집단 행동 증후군에 영향을 줄 수 있습니다.
관찰 된 단체에 해당하는지 확신하기 위해, 프로토콜은주의 깊게 따라야합니다. 대부분의 경우, 프로토콜은 특정한 가설에 따라 변경 가능하다; 그러나, 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 수행해야하는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 개인이 최적의 조건 (프로토콜 참조)에서 적절한 탱크 내에 수용되어 적절히 공급하는 것이 중요하다. 물 조건은 주택 랙, 적응 탱크 및 테스트 탱크에 일치해야합니다. 물이 일치하지 않는 경우, 물고기는 조건에 적응하는 데 시간이 더 걸릴 것이며, 행동 측정이 제대로 촬영되지 않습니다. 인공적인 냄새가 분석 사이에 이월되지 않도록 물이 담대함과 침략 탱크 사이에 재활용하는 것도 중요하다. 둘째, 가장 중요한 모든 behav이다IOR의 적절하게 획득된다. 이를 보장하기 위해 모든 분석은 여러 viewings 수 있도록 녹화 및 여러 교육 기회를합니다. 하나의 훈련을 득점 한 선수는 정확하게 물고기의 행동을 측정 할 수 있지만, 훈련 시간이 좀 걸릴 않습니다. 조심 훈련 기간이 무시된다면, 행동 연구의 결과의 신뢰성은 낮다. 잘 훈련 된 관찰자에 의해 수행 낮은 샘플 크기와주의 깊은 연구는 제대로 훈련 된 관찰자에 의해 수행 높은 샘플 크기의 연구보다 더 강력하다. 마지막으로 수집 된 데이터의 품질 관리도 중요하다. 촬영 단계는 개인을 무작위하고, 가능한, 신뢰할 수있는 데이터가 발생한다 편견을 제거하고 데이터 변환은 특정 통계 테스트에 따라 (프로토콜 참조) 전처리을 권장합니다. 다음 단계에 신중하지 않으면, 분석의 출력은 확실하게 해석 될 수 없다.
앞서 언급 한 바와 같이,이 기술은 크게 수정할 accordi은특정 테스트 가설에 ng를. 다양한 어종 39 ~ 41의 숫자 중 행동 증후군에 관련이있는 것으로 조사 할 수있는 다른 행동 측정이 존재한다. 프로토콜의 원칙은 동일하게 유지되지만, 특정 질문 쉽게 다양한 가설 검증을 허용하도록 변경 될 수있다. 예를 들어, 연구원은 침략과 죄수 시클리드의 탐구 활동 행동 증후군 (Amatitlania의 nigrofasciata)의 존재를 테스트하기 위해 상기 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 문제는 관련 있지만 연구 유기체는 프로토콜에 의해 설명 된 것과 상이하다. 그러나, 일반적인 단계는 거의 동일하게 유지됩니다. 개인은 무작위 및 추적 분석의 시리즈를 통해, 분석 사이에 물이 일관되고 신선한해야합니다에 순응 기간으로하고, 과학자가 제대로 훈련을해야해야합니다. 하나의 주요 차이는 측정되고있는 행동이 정시에 따라 변경 가능성이 있습니다FIC 분석 및 행동 협회는 특정 종과 원래의 환경에 따라 변경 될 수 있습니다.
프로토콜의 제한은 행동 연구의 전통적인 불확실성의 일부와 연결되어 있습니다. 분석법은 비 신뢰 얻었 경우 즉, 그런 다음 결과의 해석에 오류있는 가능성이며, 오류를 식별하는 것이 곤란하다. 이러한 한계를 극복하기 위해 두 개의 잘 훈련 득점이 행동을 관찰하는 것이 가능하다. 필요한 경우 차이를 조정, 같은 물고기에 적용 측정에 급내 상관 계수를 계산하고, 신뢰성을 평가합니다. 다르게는, 가능한 경우, 그러한 Ethovision 같은 자동 추적 소프트웨어로 구현 될 수 있고 처리 속도 및 정확도 (42)을 증가시키는 잘 훈련 된 관찰자에 의해 검증. 또한, "대담"행동의 이름과 점수에 대한 다른 가능한 해석이있다. 다른 연구라고 한 행동은 43 설명 등은 44, 45 "탐색"으로 동작을 설명했다. 그것은 초점 개인에게 익숙하지 않은 환경에서 동작을 측정되었을 때 우리의 작업에서 문제는 "대담"이라고 설명했다. 용어 대체 해석의 대상이 될 수 있지만 그러나이 프로토콜 또는 분석에 영향을 미치지 않는다. 우리가 담대함과 침략 분석에서 측정이 강하게 인구 내에서 상관 관계를 기대하면서 또한, 어떤 행동의 어떤 상관 관계가 낮은 일부 인스턴스가 될 가능성이있다. 측정치가 상관되지 않은 경우에도, 중요한 변화의 소스와에에서 키, 분석은 수집 된 데이터의 일관성 행동 변화를 추출하기 때문에 이러한 제한은 PCA의 힘에 의해 극복된다. 프로토콜은 보편적으로 채택된다 일관 여러 실험실에서 수행되는 경우 및 모든 과학적 방법의 경우에서와 같이 마지막가 일부프로토콜에 의해 도입 예기치, 측정되지 않은 교란은,이 잠재적 인 유해 요소는 문헌에 계속하고, 철거하는 것이 곤란해진다. 약리학 적, 행동 신경 및 호르몬 반응의보다 철저한 이해는 분석의 대표 세트가 의도 된 행동 반응을 유도하는 것이 필요합니다 확인. 행동 증후군 동작의 기본을 설명 할 수 있지만,이 실험 제한보다 규칙적 향후 연구에서 해결 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 결과는 적절한 수정하여, 제브라이 프로토콜의 사용의 유효성을 검사하고, 그 구비 된 프로토콜은 다른 어류의 여러 가설 다양한 확장 될 수있다. 신중 하우징 선택과 다양한 행동 적 파라미터 테스트를위한 구체적인 프로토콜에 따라 연구 다양한 통해 구체적인 비교를 위해 연구를 가능하게 할 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
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