Abstract
Existe un síndrome de comportamiento cuando los comportamientos específicos interactúan en diferentes contextos. El pez cebra han sido sujetos de prueba en estudios recientes y es importante para estandarizar los protocolos para asegurar análisis e interpretaciones adecuadas. En nuestros estudios anteriores, hemos medido la audacia mediante el control de una serie de comportamientos (tiempo cerca de la superficie, la latencia en las transiciones, el número de transiciones y dardos) en un tanque trapezoidal de 1,5 l. Del mismo modo, se cuantificó la agresión por las picaduras de observación, pantallas laterales, dardos, y el tiempo cerca de un espejo inclinado en un tanque de 19 l rectangular. Al dividir un tanque de 76 L en tres partes, que también examinó las preferencias shoaling. El ensayo de los bancos de arena es un ensayo altamente personalizable y se puede adaptar para las hipótesis específicas. Sin embargo, los protocolos para este ensayo también debe ser estandarizada, pero lo bastante flexible para la personalización. En estudios previos, cámaras extremas eran o vacío, contenían 5 ó 10 peces cebra, o 5 Danios perla (D. albolineatus). En el folLowing manuscrito, se presenta un protocolo detallado y datos representativos que acompañan a las aplicaciones exitosas del protocolo, lo que permitirá la replicación de experimentos síndrome conductual.
Introduction
Hay un creciente cuerpo de literatura que investiga las asociaciones entre los comportamientos distintos dentro de cada animal a partir de una población determinada. Estas asociaciones se denominan síndromes de comportamiento, y las mediciones suelen incluir la audacia, la agresión, la conducta exploratoria, y la sociabilidad 1-5. síndromes conductuales son valiosos por razones tanto directos como indirectos. Directamente, el conocimiento de los síndromes del comportamiento pueden dar una visión más completa de la teoría de la evolución, estructura de la población, y la dinámica de la población 3. Indirectamente, el conocimiento en relación con las asociaciones de comportamiento puede informar a los campos que cuantifican el comportamiento tales como la farmacología 6, 7 toxicología, genética del comportamiento 8,9, 10 y endocrinología. Debido a estos beneficios directos e indirectos, un mayor conocimiento de los síndromes de comportamiento es especialmente valiosa en organismos modelo de uso común como el pez cebra. Los estudios que utilizan el pez cebra se encuentran ina variedad de disciplinas, incluyendo el análisis de los síndromes conductuales 11-13. Para avanzar en el conocimiento en la investigación síndrome conductual, y debido a otras disciplinas también utilizan mediciones de comportamiento para las pruebas de hipótesis, se requieren descripciones sucintas fiables y de comportamiento para los análisis y las interpretaciones válidas y protocolos normalizados que facilitará las comparaciones entre los estudios dentro de las especies. El protocolo fue desarrollado para medir un síndrome conductual audacia-agresión-bancos de arena en una población de pez cebra criados en el laboratorio 14. Sin embargo, la base del protocolo (seguimiento de peces individuales, asegurando la asignación al azar adecuada y análisis apropiados) puede ser modificado fácilmente para una variedad de medidas alternativas de comportamiento. Además, los ensayos de la audacia, la agresión, o de agrupamiento que se pueden ejecutar de forma individual para la verificación de hipótesis distintas. Por lo tanto, si bien es nuestro objetivo para describir cómo llevar a cabo un estudio síndrome conductual y el protocolo para el éxito de l individuoLa medición del comportamiento evel, cada faceta de este procedimiento puede estar solo.
La literatura sobre los síndromes conductuales abarca varios grupos taxonómicos, de artrópodos para los seres humanos y 4, con el fin de medir un síndrome de comportamiento, por lo menos dos contextos de comportamiento deben ser cuantificados. Desafortunadamente, a menudo hay poca consistencia en los ensayos que se utilizan para cuantificar la medición del comportamiento a través de los ejes de comportamiento. Por ejemplo, en los peces, teniendo libertad se puede medir utilizando ensayos de laberinto en T, ensayos de campo abierto, o la introducción de una novela o estímulo exterior 15. Los estudios de agresión en el pescado podrían implicar interacciones diádicas, ensayos de estímulo de vídeo, o ensayos de modelo de arcilla 12,16,17. Del mismo modo, el análisis de comportamiento shoaling, que implica típicamente la medición de preferencia shoalmate, se puede realizar en diferentes tipos de tanques, con diferentes métodos para determinar el tiempo de asociación 21-23. En este protocolo un subconjunto específico de la overase presenta ll repertorio ensayo conductual. En concreto, este protocolo presenta una metodología para realizar un seguimiento de los individuos a través de la audacia, la agresión, y los ensayos de agrupamiento que de una manera que facilita las comparaciones dentro de los individuos para determinar si las comparaciones son coherentes en todos los individuos dentro de una población. Hemos llevado a cabo este protocolo con el pez cebra y cíclidos convictos (Amatitlania nigrofasciata) en estudios previos 14,18, y funcionará con cualquier pez de agua dulce de tamaño similar.
ensayos de Intrepidez se llevan a cabo en un tanque trapezoidal 1,5 L que tiene una línea horizontal delimitar las zonas de igual tamaño en las partes superior e inferior del tanque. comportamientos cuantificados incluyen el número de transiciones por los peces del ensayo entre la parte superior e inferior del tanque, el tiempo de cada porción, el número de dardos, y la latencia para entrar en la parte superior. El ensayo se lleva a cabo la agresión en un tanque rectangular 19L que incluyeun espejo de 3 pulgadas x 5 pulgadas inclinada en unos 22 ° situados en la esquina inferior izquierda del depósito 19. Cuantificados comportamientos incluyen la cantidad total de tiempo dedicado por los peces objetivo interactuar con el espejo 20, junto con los indicadores específicos agresivos - número de picaduras, pantallas laterales, dardos entre los peces del ensayo y su reflejo. Para estos indicadores específicos, las picaduras se definen como estocadas rápidas hacia el espejo con la boca abierta, pantallas laterales se definen como el aleteo de las aletas laterales, pectorales, dorsal y anal en la dirección del espejo, y dardos son los movimientos erráticos que son no se dirige hacia el espejo. Por último, el ensayo shoaling cuantifica el comportamiento de un pez de ensayo en cámara central de un tanque de tri-cámaras. Las cámaras laterales del tanque son o vacío, o contienen una "diana de bajo fondo" de los peces, y el tiempo de los peces del ensayo pasa cerca de cada cámara lateral se mide 21-23. Una puntuación compuesta única, conocida como StrenGTH de Shoaling (SOS), se calcula para cada pez de ensayo individual, específica a los estímulos, y se puede utilizar en los análisis de aguas abajo 14. Todos los comportamientos son calificadas por un solo espectador, o múltiples espectadores utilizando el software de cuantificación del comportamiento libre conocido como JWatcher 24.
Prueba de la presencia de un síndrome conductual es ante todo un esfuerzo estadístico, y es aconsejable seguir las pautas que se presenta por Budeav 2010 25. En concreto, se recomienda realizar un análisis de componentes principales (PCA) en los datos centrados y normados en la que el insumos son los vectores de los comportamientos de un individuo en ensayos con las mediciones de comportamiento múltiples (es decir, la audacia y la agresión). La PCA, se realiza en una matriz de correlación, reduce la dimensionalidad de las mediciones de comportamiento, y por lo tanto extrae el conocimiento más importante que explica la mayoría de la variación. Los componentes extraídos a continuación, pueden ser interpretados based en altas cargas de factor para el comportamiento individual de las puntuaciones de interés y de regresión se puede extraer para cada individuo sobre la base de los componentes explicativas. Estas puntuaciones de regresión pueden ser comparados con la medición de SOS y otras diversas mediciones no conductuales tales como el tamaño del pez o el sexo.
Este flujo de trabajo se ha aplicado en un estudio de los síndromes de comportamiento del pez cebra en el que se descubrió un síndrome específico de comportamiento sexual que existe entre la audacia y bancos de arena 14. En esta situación, más audaz machos de pez cebra son más propensos a asociarse con una especie más grande, más agresivos (D. albolineatus), pero esta asociación se pierde en las mujeres. Este flujo de trabajo también se llevó a cabo en un estudio de convicto familiares menores de cíclidos (Amatitlania nigrofasciata) 18 en la que no fue descubierto un síndrome conductual, lo que podría indicar la plasticidad de comportamiento de la especie. Por lo tanto, el siguiente protocolo se presenta won un objetivo de delinear la naturaleza de tres ensayos específicos (audacia, la agresión y shoaling) en el marco del estudio de un síndrome de comportamiento a nivel individual.
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Protocol
Las siguientes metodologías para la vivienda, la atención, y el estudio de pez cebra han sido aprobados por la Universidad CICUAL de San José.
1. El pez cebra vivienda, la asistencia
- Obtener el pez cebra objeto de un proveedor local, o de poblaciones silvestres capturados. Tenga en cuenta que el pez cebra vivienda está sujeta a las directrices del IACUC y permisos adicionales son necesarios para las poblaciones silvestres capturados vivienda.
- Identificar y pez cebra por separado en función del sexo. Alternativamente, omita este paso o reemplazar con un método diferente de la separación basada en la hipótesis de estudio.
NOTA: Las características sexuales son difíciles de determinar en el pez cebra, sobre todo en las mujeres. Consulte estas directrices 10 o manuales en línea útiles para distinguir el sexo. - Aleatoriamente separar las poblaciones más lejos en la proporción adecuada de peces focal a los estímulos de pescado. Nota: los peces focal son los sujetos de prueba siguieron a través de la serie de behavioLos ensayos ral, y peces de estímulo son las personas que van a ocupar las cámaras de estímulo en los ensayos de la agresión y los cardúmenes.
NOTA: Tradicionalmente, entre el 1 y el 5 de estímulo peces por peces focal en ensayos shoaling y una mezcla 1: 1 de estímulo: se usa una relación focal de pescado en los ensayos de agresión 14,17. Sin embargo, el investigador necesita diseñar específicamente el estudio con la hipótesis en mente (es decir, debe estímulo pescado se mantiene constante para mantener la consistencia en el comportamiento de los peces focal, o debería estímulo puede girar peces entre cada ensayo para asegurar la aleatorización adecuada). - Almacenar todos los peces en bastidores de vivienda de pez cebra (27,5-28,5 ° C) bajo una estricta 12:12 ciclo luz / oscuridad. Alimentar a todos los alimentos focal y estímulo peces de escamas diario y semanal artemia, en días no investigación.
- Asegúrese de que todas las pruebas se realiza entre ZT1 y ZT5 (tiempo zeitgeber) para evitar los efectos del ritmo circadiano 26.
2. La asignación al azar y del tanque de instalación
- Real academia de bellas artesndomize todas las personas a priori a una secuencia específica de ensayos de comportamiento. Establecer un sistema de aleatorización coherente utilizando un generador de secuencia aleatoria línea 27 o un generador de secuencias al azar de un paquete de software estadístico (R).
- Etiqueta de cada ensayo de 1 a 3 y mantener esta asignación consistente. Asignar una secuencia aleatoria de cada individuo y un mapa de la secuencia de acuerdo con la etiqueta de ensayo de conducta. Por ejemplo, para los tres ensayos totales (1 asignadas a Shoaling, 2 asignada a la audacia, y 3) asignados a la agresión, un individuo dado puede tener una secuencia aleatoria de '2,3,1', lo que les obligará a realizar la específica ensayos de comportamiento en la secuencia especificada.
- Configurar los tanques de ensayo (audacia, la agresión y shoaling) en el laboratorio en lugares que reduzcan al mínimo la posibilidad de que los estímulos externos adversos y asegúrese de tener suficiente espacio para una cámara de vídeo para capturar todo el tanque. Asegúrese de que la videocámara ha enough claridad para ver etiquetas en los tanques, así como ser capaz de distinguir los comportamientos sutiles de los peces focal y la configuración de la videocámara en esta posición.
- Registrar todos los ensayos de comportamiento con la cámara se mantiene en la misma posición con una vista completa del depósito especificada para minimizar las diferencias no intencionadas en la puntuación de comportamiento como resultado de las grabaciones diferenciales.
NOTA: Evite colocar los tanques en zonas de tráfico pesado y por puertas como el movimiento y el sonido afectará el comportamiento del pez cebra. - Establecer protocolos únicos JWatcher 24 al eliminar cada ensayo conductual. Consulte el manual de JWatcher para aprender cómo crear archivos maestros focales para asignar comportamientos a las pulsaciones del teclado y los ficheros de análisis focales para resumir los datos recogidos.
NOTA: JWatcher es un software que permite scoring de comportamiento para la puntuación del comportamiento fiable y repetible personalizado 24. - Definir un sistema de etiquetado para realizar un seguimiento de la fecha, el número de peces, y el número de ensayo para todos los ensayos de comportamiento (por ejemplo,Fish 5, ensayo Audacia, 'F5-B-123115 ", sugiriendo que en el 31 de Diciembre de 2015) y la etiqueta de la parte exterior del tanque con cinta adhesiva a la vista y en el enfoque de la cámara. Mantener y registrar esta información en un cuaderno de laboratorio para una referencia rápida y el control de calidad futura.
- Establecer un tanque de aclimatación que se utilizará entre todos los ensayos, así como directamente después de que los individuos se quitan del bastidor de la vivienda.
NOTA: Los tanques de aclimatación y tanques terminales son pequeños acuarios (40 cm x 20 cm x 25 cm) con grava y un filtro que se parecen mucho a la rejilla de la vivienda. - Después de los ensayos se encuentren todos completos, transferir al individuo en un tanque de terminal separada, que servirá como el tanque de destino final para todos los individuos focales utilizados. Utilice un tanque que es lo suficientemente grande para alojar un grupo de individuos para el resto de su vida (por ejemplo, 25 galones).
NOTA: Es muy importante para mantener la temperatura y las condiciones del agua consistentes y similares Across todos los tanques. Esto incluye la vivienda, la aclimatación, y todos los tanques de prueba.
3. Llevar a cabo el ensayo de Agresión
- Llevar a cabo el ensayo de la agresión en un tanque rectangular 19 L medir 30 cm x 15 cm x 10 cm. Equipar el tanque en particiones opacas externo que rodea tres lados del tanque agresión, dejando la parte delantera expuesta para la visión, para reducir los estímulos externos indeseables. Se divide el tanque con marcas externas en cuatro cuadrantes rectangulares iguales y fijar un espejo de forma permanente (con masilla de silicona) en el cuadrante inferior izquierdo, inclinada a 22,5 ° formando un triángulo rectángulo contra el extremo izquierdo de la cisterna.
- Asegúrese de que la temperatura del agua en el tanque de depósito de aclimatación y la agresión está dentro de 2 ° C de la cremallera de la vivienda. Para ello, se han pre-calentado, agua fresca edad de 27,5 a 28,5 ° C listo para añadir al tanque de agresión. Tenga en cuenta que es importante cambiar el agua entre cada ensayo para eliminar injustificadaseñales olfativas.
- Transferencia, ahuecando, un pez focal del bastidor vivienda a un tanque de aclimatación separada donde se aclimaten durante 10 min.
NOTA: Es importante reducir el estímulo introducidas a los peces a través de una manipulación incorrecta. Individuos transferencia descritos anteriormente 27.- En concreto, manualmente y con cuidado coloque un vaso de plástico pequeña y transparente en el tanque de interés. Sin interrumpir el pescado tanto como la transferencia mediante el uso de una red, cucharada lentamente por el pescado en la taza.
- Asegúrese de que la cámara de vídeo está listo para grabar al confirmar que el depósito de ensayo de la agresión (véase el paso 3.1) está en el foco e inmediatamente antes de la transferencia de la persona en el tanque de la agresión, registro de prensa en el dispositivo. Transferir peces focal a través de ventosas del tanque de depósito de aclimatación a la agresión.
NOTA: Es importante registrar antes de que el pescado que entra en el tanque de la agresión para controlar el tiempo exacto de la entrada. - Registre el aggrtanque ESIÓN de 10 min y 30 seg y luego taza el pescado focal desde el tanque de la agresión de nuevo en el tanque de aclimatación.
- Cuando se ve la grabación, espere 30 segundos después de que el pescado ha sido introducido en el tanque como un período de aclimatación adicional antes de comportamientos de puntuación.
- Usando el sistema de puntuación JWatcher definido para los comportamientos agresivos, cuantificar los siguientes comportamientos durante 10 minutos: El tiempo pasado cerca de espejo, serie de enfoques espejo, número de dardos, número de intentos de picaduras (boca de apertura en la dirección del espejo), y el número de pantallas laterales (dorsal, pectoral, anal, y la erección de la aleta caudal) 9.
- Anotar un solo ensayo de la agresión al menos dos veces, hasta que el ensayo se anotó con un alto acuerdo entre iteraciones.
4. Llevar a cabo el ensayo de Audacia
- Llevar a cabo el ensayo de confianza en un pequeño tanque trapezoidal de 1,5 l, que mide 15 cm de alto x 26.5 cm x 22.5 cm de la parte superior de ancho de fondo x 6 cm. Envuelve el papel opaco alrededor de todos los lados of del tanque, pero dejan la parte delantera expuesta para su visualización. Colocar una sola pieza, delgada de cinta externa al tanque para demarcar la parte superior de la parte inferior del tanque.
- Asegúrese de que la temperatura del agua en el tanque de la audacia es de 2 ° C de la cremallera de vivienda (véase el paso 3.2)
- Transferir el pescado focal del bastidor vivienda al tanque de aclimatación (véase el paso 3.3) y dejar que se aclimaten durante 10 min.
- Asegúrese de que la videocámara está lista para grabar el ensayo audacia y, una vez listo para transferir los peces focal, registro de prensa en el dispositivo. Transferir el pescado focal desde el tanque de aclimatación al tanque de audacia y grabar durante 8 min y 30 seg.
- Cuando se ve la grabación, permitirá por un período adicional de aclimatación de 30 segundos después de que el pescado se introduce en el tanque antes de anotar.
- El uso de software JWatcher, cuantificar los comportamientos audacia durante 8 minutos. En concreto, cuantificar los siguientes comportamientos: Tiempo cerca de la superficie, la latencia para entrar en la parte superior, el número de transitions en la parte superior, y el número de movimientos erráticos (dardos) 29.
- Anotar un solo ensayo osadía al menos dos veces, hasta que el ensayo se anotó con un alto acuerdo entre iteraciones.
5. Llevar a cabo el ensayo Shoaling
- Llevar a cabo el ensayo de los bancos de arena en un tanque de 76 L que tiene tres compartimientos divididos por dos divisores de vidrio sellado con masilla de silicona (los tres compartimentos resultantes consisten en dos zonas de estímulo y un compartimiento central). Externamente, marcar dos zonas designadas de preferencia de 6,35 cm de cada una de divisor de vidrio de las zonas de estímulo ', indicativo de dos largos de cuerpo 30. Aplicar tabiques opacos externamente en torno a tres lados del tanque de los bancos de arena, pero dejando la parte delantera expuesta para su visualización.
NOTA: Esta zona de preferencia se puede personalizar para probar la hipótesis específicas para las diferentes especies de tamaño. - Dependiendo de la naturaleza del estudio, seleccione Shoals de estímulo que se aclimaten durante al menos 12 horas se acabene probar y permanecer en el tanque de shoaling durante todo el curso del experimento.
NOTA: bancos de arena de estímulo son colecciones de peces individuales que se utilizan para evaluar cómo los peces focal se comporta de la presencia o ausencia de estos bancos de arena. Las diferentes combinaciones de estímulo bajío se pueden seleccionar para probar un número de diversas hipótesis shoaling. Asegúrese de que los bancos de arena de estímulo se rotan entre cada zona de estímulo para evitar el sesgo lateral y también se dejan aclimatar durante al menos 12 horas antes de la prueba. - Transferir el pescado focal en el tanque de aclimatación como se describe anteriormente (véase el paso 3.3)
- Transferir, ahuecando, el pescado focal desde el tanque intermedio para la aclimatación del compartimiento central en el depósito de los bancos de arena.
- Permitir un periodo de aclimatación de 10 minutos antes de un periodo de observación en vivo de puntuación 10 min. Como alternativa, registrar los ensayos shoaling y la puntuación más tarde usando JWatcher. Los peces se determinó que los bancos de arena cuando están dentro de la zona de preferencia en la cámaraque alberga el bajo fondo blanco.
- Cuantificar el tiempo empleado en cada zona de preferencia y el tiempo invertido en el volumen central.
- Como una medida descriptiva adicional, calcular 'fuerza de los bancos de arena' (SOS). Asignar un valor entre -1 y +1, donde la magnitud describe cómo a menudo una bancos de peces individuales.
- Calcular la relación entre los bancos de arena tiempo empleado dividido por el área de las zonas shoaling y restar la proporción de tiempo dedicado no shoaling y el área de las zonas no shoaling. Coloque esta cantidad sobre la suma del tiempo transcurrido en cada zona dividida por el volumen de cada zona individualmente. Más información acerca de este cálculo se puede encontrar en un estudio previo 14.
6. Control de Calidad de los Datos
- Analizar los datos utilizando los datos tradicionales herramientas de análisis de 31-32.
- Prueba de homogeneidad de varianza utilizando la prueba no paramétrica de Levene para todos los comportamientos. Si un comportamiento es no homogénea realizar una transformación logarítmica33.
- Confirman que no hay efectos de secuencia (es decir, que la orden de asignación al azar no afectó el comportamiento de los individuos) utilizando un ANOVA de Kruskal-Wallis en los datos homogéneos 34.
- Confirman que no hay sesgos laterales para el ensayo de los bancos de arena mediante la creación de modelos lineales generales en los índices univariados SoS con la cara como un factor fijo 35.
NOTA: Si hay poco que no hay problemas con los datos, los análisis posteriores se pueden realizar. Si hay problemas, reconciliarse con transformaciones y racionalizar con explicaciones plausibles biológicamente, y / o aumentar el tamaño de las muestras.
7. Análisis de datos
- Rangos de Spearman calcular las correlaciones de dos colas 36 para todos los comportamientos por separado dentro de los ensayos de audacia y agresividad.
- Calcular los coeficientes de correlación intraclase (CCI) como un modelo mixto de dos vías con coherencia para los ensayos de comportamiento que se llevaron a cabo más de un time para un determinado individuo 36. En esta configuración, la CPI es una medida de qué tan consistentemente un pez comportado de un mismo ensayo mide más de una vez.
- Preprocess audacia y agresividad comportamientos de centrado y normalizar todos los comportamientos que se preparan para la entrada a un análisis de componentes principales (ACP) 25.
NOTA: Preprocesamiento de las mediciones realizadas por el centrado y normalizar es un paso vital. Sin este paso de preprocesamiento de los comportamientos que se producen con más frecuencia y más variable influirá en exceso las interpretaciones de los componentes extraídos. El proceso de centrado y normalizar eliminará este sesgo. - Realizar un PCA con una matriz de correlación para determinar si la audacia y la agresión están unidos entre sí como un síndrome conductual. Interpretar cargas de comportamiento de cada componente significativo en> 0,6. Ver Budaev 2010 24 para una guía completa para informar PCA para los estudios de comportamiento. Un gráfico de sedimentación será informativo en el que eigenvectors deben mantenerse para la interpretación.
- El uso de software estadístico, como SPSS o R 31,32, extraer las puntuaciones para cada componente para cada individuo. Las puntuaciones representan la cantidad de comportamiento del individuo dado puede ser explicada por el componente particular.
- Calcular correlaciones de rangos de Spearman entre las puntuaciones de regresión de los factores y la fortaleza de los bancos de arena 36.
NOTA: Un síndrome conductual se considera presente si la audacia y la agresión comportamientos se cargan en el mismo componente o, si algún componente con cargas significativas interpretables se correlaciona con la fuerza de los bancos de arena. Además, tenga en cuenta que la fuerza de los bancos de arena no está incluido en el PCA para dar mejores interpretaciones de las cuantificaciones de comportamiento más complejos (audacia y la agresión). El PCA ortogonalmente colapsar audacia y agresividad características en vectores propios para maximizar la cantidad de variación explicada y es muy adecuado para estas mediciones complejas. Interpretaciónla resultante vectores propios y la regresión de nuestra fuerza de las mediciones de agrupamiento que en cada uno de ellos da una interpretación mucho más intuitiva de cómo cada uno de los comportamientos complejos (audacia y agresión) se refieren a una medida shoaling binaria más bien definido (es decir, los peces se shoaling o no shoaling).
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Representative Results
Dependiendo de la naturaleza del estudio, y el protocolo específico empleado, varios resultados diferentes son posibles en un experimento de síndromes del comportamiento. Las siguientes tablas y figuras, donde se indica, son una adaptación de nuestro estudio anterior publicado en la revista Behavioural Processes 14 y 17 de la revista de pez cebra. Cuando la propuesta (como se describió anteriormente) se lleva a cabo en su totalidad, dos conjuntos de resultados, 'dentro de correlaciones de ensayo "y" entre correlaciones de ensayo,' se espera (Figura 1).
El primer conjunto de resultados se describen en la consistencia de ensayo. En concreto, los resultados describen cómo los comportamientos están correlacionados entre sí en el ensayo de la audacia y el ensayo dentro de la agresión por separado. Las tablas 1 y 2 describen lo que estas correlaciones debe ser similar a la audacia y agLos ensayos de regresión y los datos que se presentan son una adaptación de un estudio previo 14. Para el ensayo de audacia, se espera que el número de transiciones y el tiempo invertido en la parte superior del depósito están correlacionados positivamente, pero la latencia para entrar en la parte superior presenta una correlación negativa. Los resultados representativos para los individuos medidos en el eje audacia de comportamiento en el tanque audacia (véase el paso 4.1) se dan en la Tabla 1. Para el ensayo de la agresión, se espera que las picaduras, pantallas laterales, y el tiempo pasado cerca del espejo están correlacionados. Los resultados representativos para los individuos medidos en el eje de la agresión de la conducta en el tanque de la agresión (véase el paso 3.1) se dan en la Tabla 2. Dardos no están generalmente correlacionados con el comportamiento agresivo, aunque, en algunos casos, los peces no agresivos tienden a DART (por lo tanto una correlación negativa ). Por último, una fuerza de Shoaling medición (SOS) para el ensayo de los bancos de arena proporciona una medida del nivel individual de los bancos de arena tendency. Shoaling es un comportamiento altamente repetible a través de una variedad de ensayos de agrupamiento que cuando se mide utilizando SoS (ICC = 0,641) 14 y varios de nuestros estudios previos han confirmado el comportamiento de los bancos de arena en el pez cebra 23,38. Dado que todas las personas serán medidos para cada uno de los comportamientos, podemos calcular las correlaciones de Spearman a través de estos comportamientos y esperar algunos comportamientos para ser correlacionados, como se identifica por el pez cebra en los resultados representativos.
La segunda parte de los resultados investiga la presencia de un síndrome de comportamiento. Los resultados del análisis integrador de todos los comportamientos cuantificados en los ensayos de audacia y agresividad conductual se resumieron mediante un Análisis de Componentes Principales (PCA). No debe haber dos a cuatro componentes interpretables en base a altas cargas para cada comportamiento. Si un solo vector propio que explica una buena parte de la variación incluye los comportamientos tanto de la una audaciaensayos de agresión D, entonces se ha observado un síndrome de comportamiento. Sin embargo, si los comportamientos de los ensayos de la audacia y la agresión no se superponen en un único vector propio, entonces el estudio no describe un síndrome conductual. Los resultados representativos se presentan para la ausencia de un síndrome de comportamiento audacia agresión (Figura 2). En este ejemplo, el componente 1 es más fuertemente representativo de los comportamientos de agresión, mientras que el componente 2 está más fuertemente asociado con comportamientos audacia. Debido a que las conductas de agresión y la audacia no están representados por el mismo componente, se puede concluir que no es la ausencia de un síndrome conductual osadía agresión (vectores audacia son aproximadamente ortogonal a los vectores de agresión). Además, estos comportamientos no están influenciados por el sexo porque el patrón de distribución es la misma entre machos y hembras. Observar si los comportamientos audacia o la agresión están asociados con los bancos de arena, la regresión extraídos calificaciones de cada pez son correufórico con la medición SoS del pez. Es importante asegurarse de que cualquier componente que correlacionan en realidad están describiendo un conjunto de comportamientos interpretables. Si hay altas correlaciones absolutas valor de Spearman entre cualquiera de los componentes y la medición de los bancos de arena, a continuación, un síndrome conductual shoaling está presente. Independientemente de los resultados específicos, es importante para proporcionar interpretaciones biológicas viables para todas las observaciones. Se proporcionan resultados representativos para una descripción de una audacia-shoaling síndrome conductual (Tabla 3) 14. Aunque los datos presentados representan los resultados típicos para el pez cebra, que no deben interpretarse como mediciones de la calidad de los datos. Hay varias razones por las cuales los datos se verá diferente en los distintos experimentos tales como las especies o las diferencias de población.
Figura 1. Propuestaflujo de trabajo para una audacia, la agresión y los bancos de arena experimento síndromes de comportamiento. Las medidas típicas se listan para cada ensayo. Un esquema de cómo analizar los ensayos de forma individual y luego la manera de integrar los análisis también está en la lista. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los resultados representativos de un PCA que indican que un síndrome conductual osadía agresión está ausente. Los vectores rojos indican las conductas que contribuyen a las puntuaciones de los componentes (ejes izquierdo e inferior) y los puntos representan las puntuaciones individuales a lo largo de cada componente (derecha y de arriba ejes ). Los varones están representados por puntos azules y las mujeres están representadas por puntos verdes. Recuerde que el "comportamiento errático 'se refiere a' dardos 'y'tasa de agresión "se puede calcular sumando el número de picaduras y pantallas laterales dividido por el tiempo total de la interacción con el espejo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| transiciones | Estado latente | Dardos | ||||
| ᴩ | pag | ᴩ | pag | ᴩ | pag | |
| Tiempo de superficie | 0.65 | <0,001 * | -0.68 | <0,001 * | 0.42 | 0,007 * |
| transiciones | -0.40 | 0,012 * | 0.33 | 0,041 * | ||
| Estado latente | -0.47 | 0,002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabla 1:. La audacia de Spearman correlaciones de rangos en un ensayo de novela del tanque Este cuadro se había modificado de manera et al, 2015..
| Muestra laterales | Dardos | Tiempo espejo | ||||
| ᴩ | pag | ᴩ | pag | ᴩ | pag | |
| picaduras | 0.69 | <0,001 * | -0.10 | 0,547 | 0.63 | <0.001 * |
| pantallas laterales | -0.06 | 0,735 | 0.66 | <0,001 * | ||
| Dardos | -0.18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabla 2:. Agresión Spearman correlaciones de rangos en un ensayo de novela del tanque Este cuadro se había modificado de manera et al, 2015..
| ᴩ | pag | |
| componentes PCA | ||
| Audacia | 0,339 | 0,035 * |
| Agresión | 0,075 | 0.65 |
| Dardo | -0,012 | 0,944 |
T abla 3:. El uso de los componentes de PCA para confirmar la presencia de un síndrome conductual bancos de arena y audacia presente en esta población Este cuadro se había modificado de manera et al, 2015..
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Discussion
El protocolo determinará si existen asociaciones consistentes en la audacia, la agresión y los comportamientos de agrupamiento que en el pez cebra. Si hay asociaciones consistentes en una población dada entre cualquiera de estos comportamientos, a continuación, un síndrome de comportamiento está presente. Mediante el estudio de síndrome de comportamiento natural de una población, los investigadores pueden tener una comprensión más completa de su dinámica de comportamiento, estructura de la población, y, posiblemente, la historia evolutiva 3. Por otra parte, la manipulación del entorno que afecta a estos síndromes conductuales, como en farmacología 6, 7 toxicología, genética del comportamiento 8,9, y 10 estudios de endocrinología, puede arrojar luz sobre cómo diferentes factores pueden afectar a las asociaciones de comportamiento. La composición específica del síndrome conductual-agresión audacia-bancos de arena que se encuentra en este protocolo abarca comportamientos comunes bien estudiados en el organismo modelo de pez cebra 11-13. Si bien esta metodologíapuede ser aplicado a cualquier especie de pescado, la amplia aplicación para el uso de pez cebra puede contribuir a estandarizar interdisciplinario de este protocolo. Cada ensayo descrito anteriormente puede ser más fácilmente controlada y manipulada que otras técnicas comparables. Por ejemplo, el ensayo de la agresión utiliza el espejo inclinado para producir una gama más amplia de respuestas agresión en lugar de utilizar una imagen espejo vertical modelo en vivo o arcilla, estímulo de vídeo, o estímulo 17. Los comportamientos medidos en el ensayo de la audacia son más fáciles de cuantificar que en un laberinto en T o una prueba de gran campo abierto 15. Por último, el ensayo shoaling descrito puede seguir fácilmente un individuo, que es esencial para el estudio de los síndromes de comportamiento a nivel individual, y puede permitir combinaciones ilimitadas de bancos de arena de destino para solicitar nuevas preguntas experimentales. Si bien este protocolo puede ser modificado para dar cabida a una variedad de cuestiones de comportamiento, la estandarización de los que puede conducir a una mayor comprensión de cómo el ADN, mecanismo celulars, desarrollo celular, e introducidas químicos pueden afectar síndromes de comportamiento individual y poblacional.
Con el fin de estar seguros de que las asociaciones observadas son verdaderas, el protocolo debe seguirse cuidadosamente. En su mayor parte, el protocolo es modificable según la hipótesis específica; Sin embargo, hay varios pasos que se deben realizar para asegurar la confianza en los resultados. En primer lugar, es importante que los individuos se encuentran en un tanque adecuado, en condiciones óptimas (véase el protocolo) y son alimentados correctamente. Las condiciones del agua deben ser consistentes en bastidores de vivienda, tanques de aclimatación, y los tanques de prueba. Si el agua no es constante, los peces se necesitará más tiempo para aclimatarse a las condiciones, y las mediciones de comportamiento no será capturado correctamente. Es también importante que el agua se recicla entre los tanques audacia y agresividad de manera que los olores artificiales no se transfieren entre los ensayos. En segundo lugar, es de suma importancia que todos behavtamientos se anotan correctamente. Para asegurar esto, todos los ensayos se grabaron en vídeo para permitir múltiples visionados, y por varias oportunidades de entrenamiento. Un anotador entrenado solo puede medir con precisión el comportamiento de los peces, pero el entrenamiento lo hace tomar algún tiempo. Si se tiene en cuenta un período de entrenamiento cuidado, entonces la confianza de los resultados del estudio del comportamiento es baja. Un estudio cuidadoso con el pequeño tamaño de las muestras realizadas por un observador bien entrenado es más poderoso que un estudio con un tamaño de muestra de alta realizada por un observador poco cualificada. Por último, el control de calidad de los datos recogidos también es fundamental. Las medidas que se toman para aleatorizar los individuos, y eliminar sesgos debería resultar en datos utilizables y fiables, y se recomiendan las transformaciones de datos para el procesamiento previo de acuerdo con la prueba estadística específica (ver protocolo). Si estos pasos no son cuidadosamente hecho, la salida de los análisis puede no ser fiable interpretable.
Como se mencionó anteriormente, la técnica es Accordi fuertemente modificableng a las hipótesis de prueba específicos. Existen otras medidas de comportamiento que pueden investigarse estar relacionada en un síndrome de comportamiento entre un número de diversas especies de peces 39-41. Si bien los principios del protocolo siguen siendo los mismos, las preguntas específicas se pueden modificar fácilmente para permitir la diversidad de hipótesis. Por ejemplo, un investigador puede utilizar el protocolo mencionado para comprobar la presencia de una agresión y síndrome conductual actividad exploratoria en cíclidos convictos (Amatitlania nigrofasciata). La pregunta es relacionada, pero el organismo estudio es diferente de la descrita por el protocolo. Sin embargo, los pasos generales siguen siendo en gran parte la misma. Los individuos deben ser asignados al azar y seguimiento a través de una serie de ensayos, con períodos de aclimatación de entre ensayos, el agua debe ser constante y fresca, y el científico, adecuadamente formadas. Una diferencia importante es el comportamiento que se están midiendo son propensos a cambios de acuerdo a la especificaciónensayo de FIC, y las asociaciones de comportamiento pueden cambiar de acuerdo a las especies específicas y ambiente original.
Las limitaciones del protocolo están vinculados con algunas de las incertidumbres tradicionales de estudios de comportamiento. En concreto, si los ensayos se calificó como poco fiable, entonces es probable que las interpretaciones de los hallazgos son erróneas, y sería difícil identificar este error. Para superar esta limitación, es posible que dos goleadores bien entrenados observan comportamientos. Para evaluar su fiabilidad, el cálculo de los coeficientes de correlación intraclase en medidas aplicadas en el mismo pez, y, si es necesario, ajustar las diferencias. Como alternativa, si está disponible, el software de seguimiento automático como Ethovision puede ser implementado y validado por un observador bien entrenado para aumentar el rendimiento y la precisión 42. Además, hay distintas interpretaciones posibles en relación con el nombramiento y la puntuación de los comportamientos "libertad". otros estudioshan denominado el comportamiento descrito 43 y otros han descrito el comportamiento como "exploratoria" 44,45. En nuestro trabajo el comportamiento fue descrito como "libertad", como se estaba midiendo el comportamiento en un entorno desconocido para el individuo focal. Sin embargo, mientras que el término puede estar sujeto a interpretaciones alternativas, esto no afecta el protocolo o el análisis. Además, mientras esperamos mediciones en ensayos de audacia y agresividad que se correlacionan fuertemente dentro de una población, no es probable que sea algunos casos de baja o nula correlación de algunos comportamientos. Esta limitación es superada por la fuerza de la PCA, porque las llaves en el importante fuente de variabilidad e, incluso si las mediciones no están correlacionadas, el análisis va a extraer la variación del comportamiento constante en los datos recogidos. Por último, como es el caso con todos los métodos científicos, si el protocolo es universalmente adoptado y se lleva a cabo constantemente por varios laboratorios, y hay algo deimprevista de confusión, no medida introducida por el protocolo, entonces este elemento nocivo potencial persiste en la literatura, y se hace difícil de desmontar. Farmacológicamente confirmando que un conjunto representativo de ensayos de provocar la respuesta conductual prevista requiera una comprensión más profunda de las respuestas de comportamiento, neurológicos y hormonales. síndromes conductuales pueden ayudar a explicar la base de la conducta, pero esta limitación de laboratorio pueden ser capaces de ser abordado con mayor regularidad en los estudios futuros. Sin embargo, se han proporcionado resultados que valida el uso de este protocolo en el pez cebra, y, con las modificaciones apropiadas, el protocolo se puede extender a una variedad de hipótesis en un número de diferentes especies de peces. Siguiendo cuidadosamente un protocolo detallado para la vivienda, la selección y comprobación de los distintos parámetros de comportamiento permitirá a los investigadores para hacer comparaciones más específicas a través de una amplia gama de estudios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
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