Abstract
Un syndrome comportemental existe lorsque des comportements spécifiques interagissent dans des contextes différents. Zebrafish ont été sujets d'essai dans des études récentes et il est important de normaliser les protocoles pour assurer des analyses et des interprétations appropriées. Dans nos études précédentes, nous avons mesuré l'audace en surveillant une série de comportements (temps près de la surface, la latence dans les transitions, le nombre de transitions, et fléchettes) dans un réservoir de 1,5 L trapézoïdale. De même, nous avons quantifié l'agression par les piqûres d'observation, des écrans latéraux, des fléchettes, et de temps à proximité d'un miroir incliné dans une forme rectangulaire 19 L réservoir. En divisant un réservoir de 76 L en tiers, nous avons également examiné les préférences de shoaling. Le dosage de shoaling est un test hautement personnalisable et peut être adapté pour des hypothèses spécifiques. Cependant, les protocoles pour ce test doivent également être standardisé, mais suffisamment souple pour la personnalisation. Dans des études précédentes, chambres d'extrémité étaient soit vide, contenait 5 ou 10 zebrafish, ou 5 danios perlières (D. albolineatus). Dans le folLowing manuscrit, nous présentons un protocole détaillé et des données représentatives qui accompagnent les applications réussies du protocole, ce qui permettra à la réplication des expériences de syndrome de comportement.
Introduction
Il y a un nombre croissant d'études enquêter sur les associations entre les comportements distincts au sein de chaque animal à partir d'une population donnée. Ces associations sont appelés syndromes de comportement, et les mesures comprennent généralement l' audace, l' agressivité, comportement exploratoire, et la sociabilité 1-5. syndromes comportementaux sont précieux pour les raisons directes et indirectes. Directement, la connaissance des syndromes de comportement peut fournir une vue plus complète de la théorie évolutionniste, la structure de la population et la dynamique des populations 3. Indirectement, les connaissances en ce qui concerne les associations de comportement peut informer les champs qui permettent de quantifier des comportements tels que la pharmacologie 6, toxicologie 7, la génétique du comportement 8,9, et en endocrinologie 10. En raison de ces avantages directs et indirects, une connaissance accrue des syndromes de comportement est particulièrement utile dans des organismes modèles couramment utilisés tels que le poisson zèbre. Les études utilisant zebrafish se trouvent ina variété de disciplines, y compris l'analyse des syndromes comportementaux 11-13. Pour faire progresser les connaissances dans la recherche sur le syndrome de comportement, et parce que d'autres disciplines utilisent également des mesures comportementales pour les tests d'hypothèses, descriptions fiables et succinctes de comportement sont requis pour des analyses et des interprétations valables et des protocoles normalisés facilitera les comparaisons inter-études au sein des espèces. Notre protocole a été développé pour mesurer un syndrome comportemental audace-agression-shoaling dans une population de laboratoire élevés zebrafish 14. Cependant, la base du protocole (suivi individuel des poissons, assurant la randomisation appropriée, et des analyses appropriées) peut être facilement modifié pour une variété de mesures comportementales alternatives. En outre, des tests d'audace, d'agression, ou shoaling peuvent être exécutés individuellement pour les tests d'hypothèses distinctes. Par conséquent, alors que notre objectif est de décrire la façon de mener une étude de syndrome comportemental et le protocole pour la réussite de l individuEvel mesure comportementale, chaque facette de cette procédure peut se tenir seul.
La littérature sur les syndromes de comportement couvre plusieurs groupes taxonomiques, de arthropodes aux humains 4 et, afin de mesurer un syndrome comportemental, au moins deux contextes comportementaux doivent être quantifiés. Malheureusement, il y a souvent peu de cohérence dans les tests qui sont utilisés pour quantifier la mesure du comportement à travers les axes de comportement. Par exemple, chez les poissons, l' audace peut être mesurée en utilisant des essais T-labyrinthe, des essais en plein champ, ou l' introduction d'un roman ou un stimulus étranger 15. Les études de l' agressivité chez les poissons pourraient impliquer des interactions dyade, des analyses vidéo de relance, ou des essais de modèles d'argile 12,16,17. De même, l' analyse du comportement grégaire, qui implique généralement la mesure de préférence shoalmate, peut être réalisée dans différents types de réservoirs, avec des méthodes différentes pour déterminer le temps d'association 21-23. Dans ce protocole, un sous-ensemble spécifique de la overall répertoire de test de comportement est présenté. Plus précisément, ce protocole présente une méthodologie pour suivre les individus à travers l'audace, l'agressivité et des essais de shoaling d'une manière qui facilite les comparaisons entre les individus afin de déterminer si les comparaisons sont uniformes dans tous les individus au sein d'une population. Nous avons effectué ce protocole avec zebrafish et cichlidés bagnes (amatitlania de nigrofasciata) dans des études antérieures 14,18, et il fonctionne avec tous les poissons d'eau douce de taille similaire.
essais de AUDACE sont conduites dans un réservoir de forme trapézoïdale de 1,5 L qui a une ligne horizontale la délimitation des zones de taille égale dans les parties supérieure et inférieure de la cuve. comportements quantifiées comprennent le nombre de transitions par les poissons d'essai entre la partie supérieure et inférieure de la cuve, le temps passé dans chaque partie, le nombre de fléchettes, et le temps de latence pour entrer dans la partie supérieure. Le dosage de l'agression est réalisée dans un réservoir rectangulaire qui comprend 19Lun miroir de 3 pouces x 5 pouces incliné à environ 22 ° situé dans le coin inférieur gauche de la cuve 19. Comportements quantifiées comprennent le montant total du temps passé par le poisson cible en interaction avec le miroir 20, ainsi que des indicateurs spécifiques agressifs - nombre de piqûres, affiche latérales, fléchettes entre les poissons d'essai et de sa réflexion. Pour ces indicateurs spécifiques, les piqûres sont définis comme des mouvements brusques rapides vers le miroir avec une bouche ouverte, les écrans latéraux sont définis comme le torchage du latéral, pectoraux, nageoires dorsale et anale dans la direction du miroir, et les fléchettes sont des mouvements erratiques qui sont pas dirigé vers le miroir. Enfin, le dosage de shoaling quantifie le comportement d'un poisson d'essai dans la chambre centre d'un réservoir de tri-chambré. Les chambres latérales de la cuve sont soit vide, soit contiennent un "banc cible" de poissons, et le temps du poisson d'essai passe près de chaque chambre latérale est mesurée 21-23. Un score composite unique, dénommé StrenGTH de shoaling (SoS), est calculée pour chaque poisson d'essai individuel, spécifique aux stimuli, et peut être utilisé en aval des analyses 14. Tous les comportements sont marqués par un seul spectateur, ou plusieurs téléspectateurs en utilisant un logiciel de quantification comportementale libre connu sous le nom jWatcher 24.
Test de la présence d'un syndrome comportemental est principalement une entreprise statistique, et il est conseillé de suivre les lignes directrices tel que présenté par Budeav 2010 25. Plus précisément, il est recommandé d'effectuer une analyse en composantes principales (ACP) sur les données centrées et normées dans lequel le les entrées sont les vecteurs des comportements d'un individu dans des essais avec des mesures comportementales multiples (c. -à , l' audace et l' agression). La CPA, réalisée sur une matrice de corrélation, réduit la dimension des mesures comportementales et extrait donc la connaissance la plus importante qui explique la majorité de la variation. Les composants extraits peuvent ensuite être interprétées based sur les charges de facteurs élevés pour le comportement individuel des intérêts et de régression des scores peut être extrait pour chaque individu sur la base des éléments explicatifs. Ces scores de régression peuvent ensuite être comparées à la mesure SoS et diverses autres mesures non-comportementales telles que la taille du poisson ou le sexe.
Ce flux de travail a été mis en œuvre dans une étude des syndromes de comportement de poisson zèbre dans lequel un syndrome comportemental spécifique du sexe qui existe entre l' audace et shoaling 14 a été découvert. Dans cette situation, les hommes plus audacieux de poisson zèbre sont plus susceptibles d'associer à une espèce plus grande, plus agressifs (D. albolineatus), mais cette association est perdue chez les femelles. Ce flux de travail a également été mis en œuvre dans une étude des mineurs condamnés kin cichlidés (amatitlania de nigrofasciata) 18 dans laquelle un syndrome comportemental n'a pas été découvert, ce qui pourrait indiquer la plasticité comportementale de l'espèce. Par conséquent, le protocole suivant est présenté wvec un but de délimiter la nature des trois dosages spécifiques (l'audace, l'agressivité et shoaling) dans le cadre de l'étude d'un syndrome comportemental au niveau individuel.
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Protocol
Les méthodes suivantes pour le logement, les soins, et l'étude de zebrafish ont été approuvés par l'Université IACUC Saint-Joseph.
1. Zebrafish Logement et soins
- Obtenir le sujet zebrafish auprès d'un fournisseur local, ou à partir de populations sauvages capturés. S'il vous plaît noter que le logement du poisson zèbre est soumis à des directives IACUC et des permis supplémentaires sont nécessaires pour les populations sauvages capturés logement.
- Identifier et zebrafish séparés selon le sexe. Sinon, ignorez cette étape ou la remplacer par une autre méthode de séparation basée sur l'hypothèse de l'étude.
REMARQUE: Les caractéristiques du sexe sont difficiles à déterminer chez le poisson zèbre, en particulier chez les femmes. Reportez - vous à ces lignes directrices 10 ou manuels en ligne utiles pour distinguer le sexe. - Aléatoirement séparer les populations plus loin dans le rapport approprié du poisson focal au stimulus poisson. Note: les poissons Focal sont les sujets de test ont suivi à travers la série de behaviodosages ral, et les poissons de relance sont les personnes qui occuperont les chambres de relance à l'agression et shoaling essais.
NOTE: Traditionnellement, entre 1 et 5 poissons de stimulation par poisson focal dans les essais de shoaling et 1: 1 stimulus: rapport de poissons focal dans des essais d'agression 14,17 sont utilisés. Cependant, le chercheur doit concevoir spécifiquement l'étude avec l'hypothèse à l' esprit (c. -à- devraient stimulus poissons être maintenue constante pour maintenir la cohérence dans le comportement des poissons focal, ou devrait stimulus poissons tourner entre chaque essai pour assurer la randomisation appropriée). - Conservez tous les poissons dans des racks de logement de poisson zèbre (27,5 à 28,5 ° C) sous un cycle strict 12h12 lumière / obscurité. Nourrir tous les aliments focal et stimulus poissons flocons quotidienne et les crevettes de saumure hebdomadaire, les jours non-recherche.
- Assurez - vous que tous les tests sont effectués entre ZT1 et ZT5 (temps de zeitgeber) pour éviter les effets du rythme circadien 26.
2. randomisation et réservoir Setup
- Randomize tous les individus a priori une séquence spécifique de tests comportementaux. Mettre en place un système de randomisation en utilisant un générateur de séquence aléatoire en ligne 27 ou un générateur de séquence aléatoire à partir d' un logiciel statistique (R).
- Etiqueter chaque essai 1-3 et de garder cette affectation cohérente. Attribuer un ordre aléatoire à chaque individu et cartographier la séquence selon l'étiquette d'analyse comportementale. Par exemple, pour trois essais au total (1 mappés à shoaling, 2 mappé à Audace, et 3 mappés à l'agression), un individu donné peut avoir une séquence aléatoire de '2,3,1', ce qui les obligera à effectuer le spécifique tests comportementaux dans la séquence spécifiée.
- Mettre en place les réservoirs d'essai (l'audace, l'agressivité et shoaling) dans le laboratoire dans des endroits qui minimisent la possibilité pour les stimuli externes défavorables et être sûr d'avoir assez de place pour un caméscope pour capturer l'ensemble du réservoir. Assurez-vous que le caméscope a enough de clarté pour afficher les étiquettes de réservoir ainsi que être capable de distinguer les comportements subtiles du poisson focal et la configuration du caméscope dans cette position.
- Enregistrez tous les tests de comportement avec l'appareil photo maintenu dans la même position avec une vue complète du réservoir spécifiée pour minimiser les différences inattendues dans la notation du comportement à la suite d'enregistrements différentiels.
REMARQUE: Évitez de placer les réservoirs dans les zones de circulation lourde et par des portes que le mouvement et le son aura une incidence sur le comportement du poisson zèbre. - Mettre en place des protocoles de jWatcher uniques 24 pour marquer chaque essai de comportement. Reportez-vous au manuel jWatcher pour apprendre comment créer des fichiers maîtres focaux pour affecter des comportements à des frappes et des fichiers d'analyse focaux pour résumer les données recueillies.
NOTE: jWatcher est un logiciel de notation comportementale qui permet de marquer comportemental fiable et reproductible sur mesure 24. - Définir un système d'étiquetage pour suivre la date, le nombre de poissons, et le numéro de test pour tous les tests de comportement (par exemple,'F5-B-123115 »impliquant poisson 5, analyse Audace, sur Décembre 31, 2015) et étiqueter l'extérieur du réservoir avec du ruban adhésif en vue et la mise au point de la caméra. Conserver et enregistrer ces informations dans un cahier de laboratoire pour une référence rapide et futur contrôle de la qualité.
- Mettre en place un réservoir d'acclimatation qui sera utilisé entre tous les essais, ainsi que directement après que les individus sont retirés de la crémaillère du boîtier.
NOTE: Les réservoirs d'acclimatation et de réservoirs terminaux sont de petits aquariums (40 cm x 20 cm x 25 cm) avec du gravier et un filtre qui ressemblent étroitement à la crémaillère du boîtier. - Après les essais sont tous terminés, transférer l'individu dans un réservoir terminal séparé qui servira de réservoir de destination finale pour toutes les personnes focales utilisées. Utiliser un réservoir qui est assez grand pour loger un groupe d'individus pour le reste de leur vie (par exemple 25 gallons).
NOTE: Il est très important de maintenir la température et les conditions d'eau cohérentes et similaires across tous les réservoirs. Cela comprend le logement, l'acclimatation, et tous les réservoirs d'essai.
3. Conduite de l'Assay Agression
- Effectuer le test de l'agression dans un réservoir rectangulaire 19 L mesurant 30 cm x 15 cm x 10 cm. Équiper le réservoir dans les cloisons opaques externes entourant les trois côtés du réservoir d'agression, en laissant la face exposée pour la visualisation, afin de réduire les stimuli extérieurs indésirables. Divisez le réservoir avec des marques externes en quatre quadrants rectangulaires égaux et fixer un miroir en permanence (avec joint de silicone) dans le quadrant inférieur gauche, incliné à 22,5 ° formant un triangle rectangle sur le côté gauche de la cuve.
- Faire en sorte que la température de l'eau dans la cuve d'acclimatation et d'agression réservoir est à 2 ° C de la crémaillère du boîtier. Pour ce faire, ont, l'eau douce d'âge pré-chauffé à 27,5 à 28,5 ° C prêt à ajouter au réservoir d'agression. S'il vous plaît noter qu'il est important de changer l'eau entre chaque essai pour éliminer injustifiéeles signaux olfactifs.
- Le transfert, par les ventouses, un poisson focal de la crémaillère du boîtier dans une cuve d'acclimatation où il sera séparé acclimater pendant 10 min.
NOTE: Il est important de réduire les stimulus introduits dans le poisson par une mauvaise manipulation. Individus de transfert tels que décrits précédemment 27.- Plus précisément, manuellement et soigneusement placer une petite tasse en plastique transparent dans le réservoir d'intérêt. Sans perturber le poisson autant que le transfert à l'aide d'un filet, ramasser lentement le poisson dans la tasse.
- Assurez-vous que le caméscope est prêt à enregistrer en confirmant que le réservoir d'essai de l'agression (voir étape 3.1) est mise au point et immédiatement avant le transfert de l'individu dans le réservoir d'agression, appuyez sur disque sur le périphérique. Transfert poissons focal via les ventouses du réservoir d'acclimatation au réservoir d'agression.
NOTE: Il est important d'enregistrer avant que le poisson entrant dans le réservoir d'agression pour suivre l'heure exacte d'entrée. - Notez le agrréservoir de ession pendant 10 min et 30 sec, puis coupe le poisson focal du réservoir de l'agression dans le réservoir d'acclimatation.
- Lorsque vous regardez l'enregistrement, attendez 30 secondes après que le poisson a été introduit dans le réservoir comme une période d'acclimatation supplémentaire avant les comportements de notation.
- En utilisant le système de notation jWatcher défini pour les comportements agressifs, de quantifier les comportements suivants pour 10 min: Le temps passé près du miroir, nombre d'approches de miroir, nombre de fléchettes, nombre de tentatives de morsures (ouverture bouche en direction du miroir), et nombre d'écrans latéraux (dorsale, pectorale, anal, et l' érection de la nageoire caudale) 9.
- Score un test d'agression unique au moins deux fois, jusqu'à ce que le test est marqué avec une grande entente entre les itérations.
4. Conduite de l'Audace Assay
- Effectuer le test d'audace dans un petit 1,5 L réservoir de forme trapézoïdale, mesurant 15 cm de hauteur x 26,5 cm haut x 22,5 cm de largeur inférieure x 6 cm. Enveloppez papier opaque autour de tous les côtés of le réservoir, mais laisser l'avant exposée pour la visualisation. Placez une seule, mince morceau de ruban adhésif extérieur à la citerne pour délimiter la partie supérieure de la partie inférieure du réservoir.
- Assurez-vous que la température de l'eau dans le réservoir d'audace est à moins de 2 ° C de la crémaillère du boîtier (voir l'étape 3.2)
- Transférer le poisson focal du rack du logement au réservoir d'acclimatation (voir étape 3.3) et laisser acclimater pendant 10 min.
- Assurez-vous que le caméscope est prêt à enregistrer le test d'audace et, une fois prêt à transférer le poisson focal, appuyez sur disque sur le périphérique. Transférez le poisson focal du réservoir d'acclimatation dans le réservoir d'audace et d'enregistrer pendant 8 min et 30 sec.
- Lorsque vous regardez l'enregistrement, prévoir une période supplémentaire d'acclimatation de 30 secondes après que le poisson est introduit dans le réservoir avant de marquer.
- En utilisant le logiciel jWatcher, quantifier les comportements d'audace pendant 8 min. Plus précisément, quantifier les comportements suivants: Temps près de la surface, la latence pour entrer dans la partie supérieure, le nombre de transitions dans la partie supérieure, et le nombre de mouvements erratiques (fléchettes) 29.
- Score un essai d'audace unique au moins deux fois, jusqu'à ce que le test est marqué avec une grande entente entre les itérations.
5. La réalisation du test shoaling
- Procéder à l'essai shoaling dans un réservoir de 76 L qui comporte trois compartiments séparés par deux cloisons de verre scellé avec joint de silicone (les trois compartiments résultants sont constitués de deux zones de stimulation et un compartiment central). Extérieurement, marquer deux zones privilégiées désignées 6,35 cm de chaque verre de diviseur des zones de relance, indicative de deux corps longueurs 30. Appliquer des cloisons opaques à l'extérieur autour de trois côtés de la cuve de shoaling, mais laisser l'avant exposée pour la visualisation.
NOTE: Cette zone de préférence peut être personnalisé pour tester des hypothèses spécifiques pour les espèces de différentes tailles. - Selon la nature de l'étude, sélectionnez les hauts-fonds de relance pour acclimater pendant au moins 12 heures before essai et restent dans le réservoir shoaling tout au long de l'expérience.
NOTE: les hauts-fonds de stimulation sont des collections de poissons individuels qui sont utilisés pour évaluer la façon dont le poisson focal se comporte en présence ou en l'absence de ces hauts-fonds. Différentes combinaisons de relance des hauts-fonds peuvent être sélectionnés pour tester un certain nombre d'hypothèses de shoaling diverses. Assurez-vous que les hauts-fonds de relance sont mis en rotation entre chaque zone de relance pour éviter les biais côté et sont également autorisés à acclimater pendant au moins 12 heures avant le test. - Transférez le poisson focal dans le réservoir d'acclimatation comme décrit précédemment (voir étape 3.3)
- Transfert, par emboutissage, le poisson focal du réservoir d'acclimatation intermédiaire au compartiment central dans le réservoir de shoaling.
- Prévoir une période d'acclimatation de 10 minutes avant un live-scoring période d'observation de 10 min. Vous pouvez également enregistrer les tests de shoaling et marquer plus tard en utilisant jWatcher. Les poissons sont déterminés à être shoaling quand ils sont dans la zone de préférence dans la chambrelogeant le banc cible.
- Quantifier le temps passé dans chaque zone et le temps passé préférence dans le volume central.
- En tant que mesure descriptive supplémentaire, calculer «force de shoaling '(SoS). Attribuer une valeur comprise entre -1 et +1 où l'ampleur décrit comment souvent un bancs de poissons individuels.
- Calculer le rapport du temps passé shoaling divisée par la superficie des zones de shoaling et soustraire le rapport du temps passé pas shoaling et la région des zones non-shoaling. Placez cette quantité sur la somme du temps passé dans chaque zone divisée par le volume de chaque zone individuellement. Plus d' informations sur ce calcul peut être trouvée dans une étude précédente 14.
6. Contrôle de la qualité des données
- Analyser les données en utilisant les données traditionnelles outils d'analyse 31-32.
- Test de l'homogénéité de la variance utilisant le test de nonparametric Levene pour tous les comportements. Si un comportement est non-homogène effectuer une transformation logarithmique33.
- Vérifiez qu'il n'y a pas d' effets de séquence (ie, que l'ordre de randomisation n'a pas d' incidence sur le comportement des individus) en utilisant un Kruskal-Wallis ANOVA sur les données homogènes 34.
- Vérifiez qu'il n'y a pas de biais secondaires pour le dosage de shoaling en créant univariée modèles linéaires généraux sur SoS indices avec le côté comme un facteur fixe 35.
NOTE: S'il y a peu ou pas de problèmes avec les données, les analyses en aval peuvent être menées. S'il y a des problèmes, se réconcilier avec les transformations supplémentaires, rationaliser avec des explications plausibles biologiquement, et / ou d'augmenter la taille des échantillons.
7. Analyser les données
- Rang Spearman Calculer deux queues corrélations 36 pour tous les comportements séparément au sein de l'audace et l' agressivité des essais.
- Calculer les coefficients de corrélation intraclasse (ICC) comme les deux sens modèle mixte avec cohérence pour les tests comportementaux qui ont été menées plus d'un time pour un individu donné 36. Dans ce cadre, la CPI est une mesure de la façon dont toujours un poisson comporté dans un essai donné mesuré plus d'une fois.
- L' audace et l' agressivité des comportements Preprocess par centrage et Norming tous les comportements pour se préparer à l' entrée à une analyse en composantes principales (ACP) 25.
NOTE: Prétraitement les mesures en centrant et Norming est une étape essentielle. Sans ces prétraitements comportements étape qui se produisent avec plus de fréquence et plus variable sera trop influencer les interprétations des composants extraits. Le processus de centrage et Norming va supprimer ce biais. - Effectuer une APC avec une matrice de corrélation pour déterminer si l'audace et l'agressivité sont liées ensemble comme un syndrome comportemental. Interpréter les charges de comportement de chaque composant significatif à> 0,6. Voir Budaev 2010 24 pour un guide complet pour les rapports PCA pour les études comportementales. Une parcelle de pierrier sera informative sur laquelle eigenvecteurs doivent être conservés à l'interprétation.
- Utilisation de logiciel de statistiques telles que R ou SPSS 31,32, extraire les scores pour chaque composant pour chaque individu. Les scores représentent combien le comportement de l'individu donné peut être expliqué par le composant particulier.
- Calculer Spearman corrélations de rang entre les scores de régression des facteurs et la force de shoaling 36.
NOTE: Un syndrome comportemental est considéré comme présent si les comportements de l'audace et l'agressivité se chargent sur le même composant ou, si un composant avec des charges importantes interprétables est en corrélation avec la force de shoaling. Notez également que la force de shoaling ne sont pas inclus dans l'APC pour permettre de meilleures interprétations des quantifications de comportement plus complexes (l'audace et l'agression). L'APC orthogonale effondrement d'audace et d'agression caractéristiques en vecteurs propres à maximiser la quantité de variation expliquée et est bien adapté pour ces mesures complexes. Interprétationvecteurs propres résultant et régressant notre force des mesures de shoaling sur chacun d'eux donne une interprétation beaucoup plus intuitive de la façon dont chacun des comportements complexes (audace et agression) se rapportent à une mesure de shoaling binaire plus bien définie (ie, le poisson est shoaling ou pas shoaling).
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Representative Results
En fonction de la nature de l'étude, et d'un protocole spécifique utilisé, plusieurs résultats distincts sont possibles dans une expérience de syndromes comportementaux. Les tableaux et les figures, lorsque cela est indiqué ci - après, sont adaptés de notre précédente étude publiée dans la revue Behavioural Processes 14 et la revue Zebrafish 17. Lorsque la proposition (comme décrit ci - dessus) est réalisée dans son intégralité, deux séries de résultats, «dans des corrélations de dosage» et «entre corrélations de dosage», sont prévus (figure 1).
La première série de résultats décrit au sein de cohérence du dosage. Plus précisément, les résultats décrivent comment les comportements sont corrélés les uns aux autres dans le dosage de l' audace et l'intérieur de l'analyse de l' agression séparément. Les tableaux 1 et 2 décrivent ce que ces corrélations devraient ressembler pour l'audace et l' agdes essais de régression et les données présentées sont adaptées à partir d' une étude précédente 14. Pour le dosage de l'audace, il est prévu que nombre de transitions et le temps passé dans la partie supérieure du réservoir sont corrélés positivement, mais la latence pour entrer dans la partie supérieure est corrélée négativement. Les résultats représentatifs pour les individus mesurés sur l'axe de l' audace du comportement dans le réservoir d'audace (voir l' étape 4.1) sont donnés dans le tableau 1. Pour le dosage de l' agression, il est prévu que les piqûres, les écrans latéraux, et le temps passé près du miroir sont tous corrélés. Les résultats représentatifs pour les individus mesurés sur l'axe de l' agressivité du comportement dans le réservoir d'agression (voir l' étape 3.1) sont donnés dans le tableau 2. Fléchettes ne sont généralement pas en corrélation avec le comportement agressif , bien que, dans certains cas, les poissons non agressifs ont tendance à darder ( d' où une corrélation négative ). Enfin, une force de shoaling (SoS) mesure pour le dosage de shoaling fournit une mesure de niveau individuel de shoaling tendency. Shoaling est un comportement hautement reproductible à travers une variété d'essais de shoaling lorsque mesuré à l' aide SoS (ICC = 0,641) 14 et plusieurs de nos études antérieures ont confirmé le comportement grégaire chez le poisson zèbre 23,38. Étant donné que tous les individus seront mesurés pour chacun des comportements, nous pouvons calculer les corrélations de Spearman entre ces comportements et attendent certains comportements à corréler, identifiés pour zebrafish dans les résultats représentatifs.
La deuxième partie des résultats sur la présence d'un syndrome comportemental. Les résultats de l'analyse intégrative de tous les comportements quantifiées dans l'audace et l'agressivité comportementale des essais sont résumés à l'aide d'une analyse en composantes principales (ACP). Il devrait y avoir deux à quatre composants interprétables sur la base des charges élevées pour chaque comportement. Si un seul vecteur propre qui explique une bonne partie de la variation comprend les comportements à la fois l'un de l'audaced essais d'agression, un syndrome comportemental a été observée. Toutefois, si les comportements de l'audace et l'agressivité des essais ne se chevauchent pas sur un seul vecteur propre, l'étude ne décrit pas un syndrome comportemental. Les résultats représentatifs sont présentés pour l'absence d'un syndrome comportemental audace-agression (Figure 2). Dans cet exemple, le composant 1 est le plus fortement représentatif des comportements d'agression tandis que la composante 2 est le plus fortement associé à des comportements d'audace. Parce que les comportements d'agressivité et l'audace ne sont pas représentés par le même composant, on peut conclure qu'il ya l'absence d'un syndrome comportemental audace-agression (vecteurs d'audace sont sensiblement orthogonale aux vecteurs d'agression). En outre, ces comportements ne sont pas influencés par le sexe parce que le modèle de distribution est le même entre les mâles et les femelles. Pour observer si les comportements de l'audace ou l'agressivité sont associés à shoaling, les scores de régression extraites pour chaque poisson sont correxalté avec la mesure SoS du poisson. Il est important de veiller à ce que tous les composants sont en fait une corrélation entre la description d'un ensemble de comportements interprétable. S'il y a des absolus corrélations élevées valeur Spearman entre un composant et la mesure de shoaling, puis un syndrome comportemental shoaling est présent. Indépendamment des résultats spécifiques, il est important de fournir des interprétations biologiques possibles pour toutes les observations. Les résultats représentatifs sont fournis pour une description d'une audace-shoaling syndrome comportemental (tableau 3) 14. Bien que les données présentées représentent les résultats typiques pour zebrafish, ils ne devraient pas être interprétées comme des mesures de la qualité des données. Il y a plusieurs raisons pour lesquelles les données seront différentes dans les différentes expériences telles que les espèces ou les différences de population.
Figure 1. Propositionflux de travail pour une audace, d' agression et shoaling expérience de syndromes de comportement. mesures typiques sont répertoriées pour chaque essai. Un aperçu de la façon d'analyser les essais individuellement et ensuite la façon d'intégrer les analyses est également indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les résultats représentatifs d'un PCA indiquant qu'un syndrome comportemental audace-agression est absente. Les vecteurs rouges indiquent des comportements qui contribuent à les scores de composants (gauche et inférieur axes) et les points représentent les scores individuels le long de chaque composante (droite et de haut axes ). Les mâles sont représentés par des points bleus et les femmes sont représentés par des points verts. Notez que «comportement erratique» se réfèrent à des «fléchettes» et«taux d'agression» peut être calculée en additionnant le nombre de piqûres et affiche latéraux , divisé par le temps total d' interagir avec le miroir. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Transitions | Latence | jeu de fléchettes | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Temps de surface | 0,65 | <0,001 * | -0.68 | <0,001 * | 0,42 | 0,007 * |
| Transitions | -0.40 | 0,012 * | 0,33 | 0,041 * | ||
| Latence | -0.47 | 0,002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tableau 1:. Audace Spearman corrélations de rang dans un essai roman réservoir Ce tableau avait été modifié par Way et al 2015..
| Affiche latérales | jeu de fléchettes | Miroir Temps | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Bites | 0.69 | <0,001 * | -0.10 | 0,547 | 0,63 | <0.001* |
| affiche latéraux | -0.06 | 0,735 | 0,66 | <0,001 * | ||
| jeu de fléchettes | -0.18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tableau 2:. Agression Spearman corrélations de rang dans un essai roman réservoir Ce tableau avait été modifié par Way et al 2015..
| ᴩ | p | |
| Composants PCA | ||
| Audace | 0,339 | 0,035 * |
| Agression | 0,075 | 0,65 |
| Dard | -0,012 | 0,944 |
T able 3:. Utilisation des composants de l' APC pour confirmer la présence d'un syndrome comportemental grégaire et l' audace présente dans cette population Ce tableau avait été modifié par Way et al 2015..
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Discussion
Le protocole déterminera s'il existe des associations cohérentes dans l'audace, l'agressivité et les comportements de shoaling chez le poisson zèbre. S'il existe des associations cohérentes dans une population donnée entre l'un de ces comportements, un syndrome comportemental est présent. En étudiant le syndrome comportemental naturel de la population, les chercheurs peuvent avoir une compréhension plus complète de sa dynamique comportementale, la structure de la population, et peut - être l' histoire évolutive 3. De plus, la manipulation de l'environnement qui affecte ces syndromes comportementaux, comme en pharmacologie 6, toxicologie 7, la génétique du comportement 8,9 et endocrinologie 10 études, peut faire la lumière sur la façon dont les différents facteurs susceptibles d' affecter les associations de comportement. La composition spécifique du syndrome comportemental agression-hardiesse-shoaling trouvé dans ce protocole englobe des comportements communs bien étudiés dans l'organisme modèle zebrafish 11-13. Bien que cette méthodologiepeut être appliqué à toutes les espèces de poissons, la large application pour l'utilisation du poisson zèbre peut aider à la normalisation interdisciplinaire de ce protocole. Chaque essai décrit ci-dessus peut être plus facilement contrôlée et manipulée que d'autres techniques comparables. Par exemple, le dosage de l' agression utilise le miroir incliné pour susciter un plus large éventail de réponses d'agression plutôt que d' utiliser un modèle vivant ou d' argile, vidéo stimulus, ou une image miroir vertical stimulus 17. Les comportements mesurés dans l' essai de l' audace sont plus facilement quantifiables que dans un labyrinthe en T ou un test grand champ ouvert 15. Enfin, le dosage de shoaling décrit peut facilement suivre un individu, ce qui est essentiel pour l'étude des syndromes de comportement au niveau individuel, et peut permettre des combinaisons illimitées de bancs de cibles à poser de nouvelles questions expérimentales. Bien que ce protocole peut être modifié pour accueillir une variété de questions comportementales, la normalisation de celui-ci peut conduire à un meilleur aperçu sur la façon dont l'ADN, mécanisme cellulaires, le développement cellulaire, et introduit des produits chimiques peuvent affecter les syndromes comportementaux individuels et de la population.
Afin d'être sûr que les associations observées sont vraies, le protocole doit être suivi attentivement. La plupart du temps, le protocole est modifiable en fonction de l'hypothèse spécifique; Cependant, il y a plusieurs étapes qui doivent être effectuées pour assurer la confiance dans les résultats. Tout d'abord, il est important que les personnes qui sont logés dans un réservoir approprié, dans des conditions optimales (voir le protocole) et sont alimentés correctement. Les conditions de l'eau doivent être compatibles dans les racks de logement, des réservoirs d'acclimatation, et les réservoirs d'essai. Si l'eau est non conforme, le poisson va prendre plus de temps pour acclimater aux conditions, et les mesures de comportement ne sera pas correctement capturé. Il est également important que l'eau est recyclée entre les réservoirs d'audace et l'agressivité de telle sorte que les odeurs artificielles ne sont pas reportés entre les dosages. Deuxièmement, il est de la plus haute importance que tous les behavIOR sont notés correctement. Pour ce faire, tous les tests sont filmés pour permettre plusieurs visionnements, et plusieurs possibilités de formation. Un marqueur formé unique peut mesurer avec précision le comportement des poissons, mais la formation prend un certain temps. Si une période de formation minutieuse est ignorée, la confiance des résultats de l'étude comportementale est faible. Une étude attentive de faible taille des échantillons effectuées par un observateur bien formé est plus puissant qu'une étude avec la taille de l'échantillon élevé effectué par un observateur mal formé. Enfin, le contrôle de la qualité des données collectées est également critique. Les mesures qui sont prises pour randomisent individus, et de supprimer les préjugés devrait se traduire par des données utilisables, fiables, et les transformations de données sont recommandées pour prétraiter selon le test statistique spécifique (voir protocole). Si ces mesures ne sont pas effectuées avec précaution, la sortie de l'analyse peut ne pas être fiable interprétable.
Comme mentionné précédemment, la technique est largement modifiable according à des hypothèses de test spécifiques. Il existe d' autres mesures comportementales qui peuvent être étudiés pour être liés à un syndrome de comportement chez un certain nombre d'espèces de poissons divers 39-41. Bien que les principes du protocole restent les mêmes, les questions spécifiques peuvent être facilement modifiées pour permettre des tests d'hypothèses diverses. Par exemple, un chercheur peut utiliser le protocole mentionné ci - dessus pour tester la présence d'une agression et l' activité exploratoire syndrome comportemental dans cichlidés bagnes (amatitlania de nigrofasciata). La question est liée, mais l'organisme d'étude est différente de celle décrite par le protocole. Toutefois, les étapes générales restent en grande partie les mêmes. Les individus doivent être randomisés et suivis par une série d'essais, avec des périodes d'acclimatation entre les deux essais, l'eau doit être cohérente et fraîche, et le scientifique devraient être formés adéquatement. Une différence majeure est les comportements qui sont mesurés sont susceptibles de changer en fonction de la spécificitédosage fic, et les associations de comportement peuvent changer en fonction des espèces spécifiques et de l'environnement d'origine.
Les limitations du protocole sont liées à certaines des incertitudes traditionnelles des études comportementales. Plus précisément, si les essais sont marqués unreliably alors il est probable que les interprétations des conclusions sont erronées, et il serait difficile d'identifier cette erreur. Pour contourner cette limitation, il est possible que deux buteurs bien formés observent les comportements. Pour évaluer leur fiabilité, calculer les coefficients de corrélation intraclasse sur des mesures appliquées sur le même poisson, et, si nécessaire, ajuster les différences. Alternativement, le cas échéant, le logiciel de suivi automatique tels que Ethovision peut être réalisée et validée par un observateur bien formé pour augmenter le débit et la précision 42. En outre, il existe différentes interprétations possibles en ce qui concerne la nomination et la notation des comportements «d'audace». D'autres étudesont appelé le comportement décrit 43 et d' autres ont décrit le comportement comme «exploratoire» 44,45. Dans notre travail, le comportement a été décrit comme «l'audace», comme il mesurait le comportement dans un environnement inconnu à l'individu focal. Cependant, alors que le terme peut être soumis à d'autres interprétations, cela n'a aucune incidence sur le protocole ou l'analyse. De plus, alors que nous nous attendons à des mesures au sein de l'audace et l'agressivité des essais pour être fortement corrélées au sein d'une population, il est susceptible d'avoir des cas de faible à aucune corrélation de certains comportements. Cette limitation est vaincue par la force de l'APC, car elle touches sur des sources importantes de la variabilité et, même si des mesures ne sont pas corrélées, l'analyse extrairont variation de comportement cohérent dans les données recueillies. Enfin, comme cela est le cas avec toutes les méthodes scientifiques, si le protocole est universellement adopté et est systématiquement réalisée par plusieurs laboratoires, et il y a un certainimprévue, confondant sans mesure introduite par le protocole, cet élément délétère potentiel persiste dans la littérature, et il devient difficile de démanteler. confirmant que pharmacologiquement un ensemble représentatif de tests susciter la réponse comportementale destinée nécessite une compréhension plus approfondie des réponses comportementales, neurologiques et hormonaux. syndromes comportementaux peuvent aider à expliquer la base du comportement, mais cette limitation de laboratoire peuvent être en mesure d'être plus régulièrement abordé dans les études futures. Néanmoins, les résultats ont été fournis qui valide l'utilisation de ce protocole dans zebrafish, et, avec les modifications appropriées, le protocole peut être étendu à une variété d'hypothèses dans un certain nombre d'espèces de poissons différentes. En suivant scrupuleusement un protocole détaillé pour le logement, la sélection et l'essai de divers paramètres comportemental permettra aux chercheurs de faire des comparaisons plus spécifiques à travers un large éventail d'études.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
