Abstract
En beteendesyndrom existerar när specifika beteenden interagerar under olika sammanhang. Zebrafisk har varit försökspersoner under de senaste studierna och det är viktigt att standardisera protokoll för att säkerställa korrekt analyser och tolkningar. I våra tidigare studier har vi uppmätt mod genom att övervaka en serie beteenden (tid nära ytan, latens i övergångar, antalet övergångar och dart) i en 1,5 L trapetstanken. Likaså kvantifieras vi aggression genom att observera bett, sido displayer, dart, och tid i närheten av en lutande spegel i en rektangulär 19 L tank. Genom att dela en 76 L tank i tredjedelar, också undersökte vi stim preferenser. Den shoaling analysen är en mycket anpassningsbar assay och kan skräddarsys för specifika hypoteser. Men protokoll för denna analys också måste vara standardiserade, men ändå tillräckligt flexibel för anpassning. I tidigare studier ändkamrarna var antingen tomma, innehöll 5 eller 10 zebrafisk, eller 5 pärla danios (D. albolineatus). I foljande manuskript, presenterar vi ett detaljerat protokoll och representativa uppgifter som följer framgångsrika tillämpningar av protokollet, som kommer att möjliggöra replikering av beteende syndrom experiment.
Introduction
Det finns en växande mängd litteratur som undersöker sambanden mellan olika beteenden inom enskilda djur från en given population. Dessa föreningar kallas beteendesyndrom, och mätningarna innefattar typiskt djärvhet, aggression, undersökande beteende, och sällskaplighet 1-5. Beteendesyndrom är värdefulla för både direkta och indirekta skäl. Direkt, kan kunskap om beteendesyndrom ge en mer fullständig bild av evolutionsteorin, befolkningsstrukturen och populationsdynamik 3. Indirekt, kan kunskap om beteende föreningar informera fält som kvantifiera beteende såsom farmakologi 6, toxikologi 7, beteendegenetik 8,9, och endokrinologi 10. På grund av dessa direkta och indirekta fördelar, är en ökad kunskap om beteendesyndrom särskilt värdefull i vanligen använda modellorganismer såsom zebrafisk. Studier som använder zebrafisk finns ina olika discipliner, bland annat en analys av beteendesyndrom 11-13. Att främja kunskapen i beteendesyndrom forskning, och eftersom andra discipliner använder också beteende mätningar för hypotesprövning, tillförlitliga och koncisa beskrivningar av beteende krävs för giltiga analyser och tolkningar och standardiserade protokoll kommer att underlätta inter-studie jämförelser inom arter. Vår protokoll utvecklades för att mäta en djärvhet-aggression-shoaling beteendesyndrom i en population av labb uppfödda zebrafisk 14. Men med stöd av protokollet (spåra enskilda fiskar, säkerställa en korrekt randomisering, och lämpliga analyser) kan enkelt modifieras för en mängd olika alternativa beteende åtgärder. Dessutom kan djärvhet, aggression, eller stim analyser köras individuellt för testning av distinkta hypoteser. Därför, medan det är vårt mål att beskriva hur man genomför en beteendesyndrom studie och protokollet för framgångsrik individuell lEvel beteende mätning, kan varje aspekt av detta förfarande fristående.
Litteraturen om beteendesyndrom sträcker sig över flera taxonomiska grupper, från leddjur till människor 4 och för att mäta en beteendesyndrom, måste åtminstone två beteende sammanhang kvantifieras. Tyvärr finns det ofta liten konsekvens i analyserna som används för att kvantifiera den beteende mätning över axlarna för beteende. Till exempel, i fisk, modighet kan mätas med användning T-maze analyser, frilands analyser, eller införandet av en roman eller utländsk stimulus 15. Aggression studier i fisk kan innebära dyad interaktioner, video stimulans analyser, eller lera modellanalyser 12,16,17. Likaså analys av shoaling beteende, som typiskt involverar mätning av shoalmate preferens, kan utföras i olika typer av tankar, med olika metoder för att bestämma associationstid 21-23. I detta protokoll en specifik delmängd av Overall beteendeanalys repertoar presenteras. Specifikt utgör detta protokoll en metod för att spåra individer genom djärvhet, aggression, och stim analyser på ett sätt som underlättar jämförelser inom individer för att avgöra om jämförelserna är genomgående i alla individer inom en population. Vi har utfört detta protokoll med zebrafisk och zebraciklider (amatitlania nigrofasciata) i tidigare studier 14,18, och det kommer att fungera med någon liknande storlek insjöfisk.
Djärvhet analyser genomförs på ett 1,5 L trapetsformad tank som har en horisontell linje avgränsar lika stora områden i de övre och undre delarna av tanken. Kvantifierade beteenden inkluderar antalet övergångar av test fisk mellan den övre och nedre delen av tanken, den tid som tillbringas i varje portion, antalet dart, och latensen att gå in i övre delen. Aggressionen analysen utförs i en 19L rektangulär tank som innehålleren 3 tum x 5 tum spegel lutar med ca 22 ° som ligger i det nedre vänstra hörnet av tanken 19. Kvantifierade beteenden inkluderar den totala mängden tid som målet fisk interagerar med spegeln 20, tillsammans med specifika aggressiva indikatorer - antal bites, sido displayer, dart mellan test fisk och dess reflektion. För dessa specifika indikatorer, bites definieras som snabba utfall mot spegeln med en öppen mynning, är sido displayer definieras som fackling av sido, bröst, anal och ryggfenor i riktningen av spegeln, och dart finns några oregelbundna rörelser som är inte riktad mot spegeln. Slutligen kvantifierar shoaling analysen beteendet hos en test fisk i mittkammare av en tri-chambered tank. Sidokamrar tanken är antingen tom eller innehåller ett "mål stim" av fisk, och den tid testet fisken spenderar nära varje sidokammaren mäts 21-23. En enda sammansatt poäng, kallad Strength av Shoaling (SoS), beräknas för varje enskilt prov fisk, specifika för stimuli, och kan användas i efterföljande analyser 14. Alla beteenden görs av en enda betraktare eller flera tittare med hjälp av gratis beteende kvantifiering programvara som kallas JWatcher 24.
Testa förekomsten av ett beteendesyndrom är i första hand en statistisk strävan, och det är lämpligt att följa de riktlinjer som presenteras av Budeav 2010 25. Specifikt är det rekommenderat att utföra en huvudkomponenter analys (PCA) på centrerade och normerade uppgifter där ingångarna är vektorerna individens beteende i analyser med flera beteende mätningar (dvs mod och aggression). PCA, utförs på en korrelationsmatris, reducerar dimensionalitet av de beteendemässiga mätningar, och därmed extraherar den viktigaste kunskapen som förklarar en majoritet av variationen. De extraherade komponenterna kan sedan tolkas Based på höga faktor för individuellt beteende av ränte och regressions poängen kan extraheras för varje individ på grundval av de förklarande komponenter. Dessa regressions poäng kan sedan jämföras med SOS mätning och andra icke-beteendemätningar såsom fisk storlek eller kön.
Detta arbetsflöde har genomförts i en studie av zebrafisk beteendesyndrom där ett kön specifikt beteendesyndrom som existerar mellan mod och shoaling 14 upptäcktes. I denna situation, djärvare zebrafisk män är mer benägna att associera med en större, mer aggressiva arter (D. albolineatus), men denna förening är förlorad hos kvinnor. Detta arbetsflöde genomfördes också i en studie av unga sebracichlid anhöriga (amatitlania nigrofasciata) 18 i vilken en beteendesyndrom inte upptäcktes, potentiellt indikerar beteende plasticitet av arten. Därför är följande protokoll presenterades wed ett mål avgränsa vilken typ av tre specifika analyser (djärvhet, aggression, och stim) inom ramen för att studera ett beteendesyndrom individnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande metoder för huset, vård och undersökning av zebrafisk har godkänts av Saint Joseph University IACUC.
1. Zebrafish Housing och vård
- Erhållande av angiven zebrafisk från en lokal leverantör, eller från vildfångade populationer. Observera att huset zebrafisk är föremål för IACUC riktlinjer och ytterligare tillstånd krävs för bostäder vildfångade populationer.
- Identifiera och separat zebrafisk beroende på kön. Alternativt, hoppa över detta steg eller ersätta med en annan metod för separation baserad på studien hypotesen.
OBS: Sex egenskaper är svåra att bestämma i zebrafisk, särskilt hos kvinnor. Hänvisa till dessa riktlinjer 10 eller användbara manualer på nätet för att skilja kön. - Slumpmässigt separera populationer längre in i lämpligt förhållande av fokal fisk på stimuli fisk. Obs: Focal fisk är testämnena följt genom serien av behavioral analyser och stimulans fisk är de individer som kommer att ockupera stimulanskamrarna i aggressivitet och stim analyser.
OBS: Traditionellt mellan ett och fem stimulans fisk per fokal fisk i stim analyser och en 1: 1 stimulus: bränn fisk förhållandet i aggression analyser 14,17 används. Dock måste forskaren att specifikt utforma studien med hypotesen i åtanke (det vill säga, bör stimulans fisk hållas konstant för att upprätthålla konsekvens i fokus fiskens beteende, eller bör stimulans fisk vridas mellan varje analys för att säkerställa korrekt randomisering). - Förvara all fisk i zebrafisk bostads rack (27,5-28,5 ° C) under en strikt 12:12 ljus / mörker-cykel. Mata alla brännvidd och stimulans fisk flingfoder dagligen och artemia varje vecka, på icke-forsknings dagar.
- Se till att alla tester utförs mellan ZT1 och ZT5 (zeitgeber tid) för att undvika dygnsrytmen effekter 26.
2. Randomisering och Tank Setup
- randomize alla personer a priori till en specifik sekvens av beteendemässiga analyser. Inrätta ett enhetligt slumpschema med hjälp av en online-slumpsekvensgenerator 27 eller en slumpmässig sekvensgenerator från en statistiskt programpaket (R).
- Märk varje analys 1-3 och hålla uppdraget konsekvent. Tilldela en slumpmässig sekvens till varje individ och mappa sekvensen enligt beteendeanalys etikett. Till exempel för tre totalt analyser (1 mappas till Shoaling, 2 mappas till modighet, och 3 mappas till aggression), kan en viss person har en randomiserad sekvens av "2,3,1", vilket kommer att kräva dem att utföra specifika beteendemässiga analyser i den specificerade sekvensen.
- Ställ upp analys tankar (djärvhet, aggression, och stim) i laboratoriet på platser som minimerar möjligheten för negativa externa stimuli och se till att ha tillräckligt med utrymme för en videokamera för att fånga hela tanken. Se till att kameran har enough klarhet för att visa tank etiketter samt kunna skilja subtila beteenden bränn fisk och ställer in kameran i detta läge.
- Registrera alla beteendemässiga analyser med kameran hålls i samma position med en fullständig bild av den specificerade tank att minimera oönskade skillnader i beteende poäng till följd av differential inspelningar.
OBS: Undvik att placera tankar i tunga trafikerade områden och dörrar som rörelse och ljud kommer att påverka zebrafisk beteende. - Upprätta unika JWatcher protokoll 24 för att ha dödat varje beteendeanalys. Hänvisar till JWatcher manualen för att lära hur man skapar bränn master files att tilldela beteenden till tangenttryckningar och bränn analyser att sammanfatta data som samlas in.
OBS: JWatcher är beteende scoring programvara som möjliggör tillförlitlig och repeterbar anpassade beteende scoring 24. - Definiera ett märkningssystem för att spåra datum, fisk nummer och analysnummer för alla beteendemässiga analyser (t.ex."F5-B-123.115 'innebär Fish 5, modighet analys den 31 december st, 2015) och märka utsidan av tanken med bandet i vy och i fokus för kameran. Håll och registrera denna information i ett labb anteckningsbok för snabb referens och framtida kvalitetskontroll.
- Inrätta en acklimatisering tank som ska användas mellan alla analyser samt direkt efter individerna tas bort från huset rack.
OBS: acklimatiseringen tankar och terminal tankar är små akvarier (40 cm x 20 cm x 25 cm) med grus och ett filter som liknar huset rack. - Efter analyserna är slutfört, överföra individen i en separat terminal tank som kommer att fungera som slutdestination tank för begagnade fokus individer. Använda en tank som är stor nog att hysa en grupp av individer för återstoden av deras liv (t.ex., 25 gallon).
OBS: Det är mycket viktigt att upprätthålla konsekventa och liknande vattentemperaturer och villkor across alla tankar. Detta inkluderar bostäder, acklimatisering och alla testlådor.
3. Genomföra Aggression analys
- Genomför aggression analys i en 19 L rektangulär tank mäter 30 cm x 15 cm x 10 cm. Utrusta tanken i yttre ogenomskinliga skiljeväggar som omger tre sidor av aggression tanken, lämnar främre exponeras för visning, att minska oönskade yttre stimuli. Dela tanken med externa markeringar i fyra lika rektangulära kvadranter och fixa en spegel permanent (med silikon täta) i den nedre vänstra kvadranten, lutar med 22,5 ° bildar en rätvinklig triangel mot längst till vänster sida av tanken.
- Se till att temperaturen på vattnet i acklimatisering tanken och aggression tanken ligger inom 2 ° C från höljet rack. För att göra detta, har färska, åldrade vatten förvärmas till 27,5-28,5 ° C redo att lägga till aggression tanken. Observera att det är viktigt att byta vatten mellan varje analys för att eliminera obefogadluktsignaler.
- Transfer, genom koppning, en samlingspunkt fisk från huset rack till en separat acklimatisering tank där det kommer att acklimatisera sig under 10 minuter.
OBS: Det är viktigt att minska stimulans som införts till fisken genom felaktig hantering. Överför individer som tidigare beskrivits 27.- Specifikt manuellt och försiktigt placera en liten, genomskinlig plast kopp i tanken av intresse. Utan att störa fisken så mycket som överförs med hjälp av ett nät, långsamt ösa upp fisken i koppen.
- Se till att videokameran är redo att spela genom att bekräfta att den aggression analystanken (se steg 3,1) är i fokus och omedelbart innan de överförs individen i aggression tanken, trycka på inspelningsknappen på enheten. Överföra fokus fisk via koppning från acklimatisering tank till aggression tank.
OBS: Det är viktigt att spela innan fisken in i aggression tanken att spåra den exakta tidpunkten för inträde. - Anteckna aggression tank för 10 min och 30 sekunder och sedan kopp bränn fisk från angrepp tanken tillbaka in i acklimatisering tanken.
- När du tittar på inspelningen, vänta 30 sekunder efter fisken har införts till tanken som en extra acklimatiseringsperiod innan scoring beteenden.
- Använda JWatcher poängsystem som definieras för aggressiva beteenden, kvantifiera följande beteenden för 10 min: Tid nära spegel, antal spegel metoder, antal pilar, antal försök bites (öppnings mun i riktning mot spegeln), och antalet sido skärmar (rygg, bröst, anal och stjärtfenan erektion) 9.
- Poäng en enda aggression assay åtminstone två gånger, tills analysen drog på hög överenskommelse mellan iterationer.
4. Genomföra Djärvhet analys
- Genomför djärvhet analysen i en liten 1,5 L trapetstank, som mäter 15 cm hög x 26,5 cm top x 22,5 cm botten x 6 cm bredd. Wrap ogenomskinligt papper runt alla sidor of tanken men lämna den främre exponeras för visning. Placera en enda, tunn bit tejp på utsidan av tanken för att avgränsa toppen från bottenpartiet av tanken.
- Se till att temperaturen på vattnet i djärvhet tanken ligger inom 2 ° C från höljet kuggstången (se steg 3.2)
- Överföra bränn fisk från höljet rack till acklimatisering tanken (se steg 3.3) och låt acklimatisera sig under 10 min.
- Se till att kameran är redo att spela in djärvhet analysen och när redo att överföra bränn fisk, trycka på inspelningsknappen på enheten. Överför bränn fisk från acklimatisering tanken till djärvhet tanken och rekord för 8 minuter och 30 sekunder.
- När du tittar på inspelningen möjliggöra en ytterligare 30 sek acklimatiseringsperiod efter fisken förs till tanken innan poäng.
- Med användning JWatcher programvara, kvantifiera mod beteenden i 8 min. Specifikt kvantifiera följande beteenden: Tid nära ytan, att latens ange övre delen, antal transitions i den övre delen, och antalet oregelbundna rörelser (dart) 29.
- Poäng en enda mod assay åtminstone två gånger, tills analysen drog på hög överenskommelse mellan iterationer.
5. Genomföra Shoaling analys
- Genomför shoaling analys i en 76 L tank som har tre avdelningar dividerat med två glasväggar förseglade med silikon täta (de resulterande tre fack består av två stimulanszoner och en kontaktpunkt fack). Externt markera två preferenszoner betecknade 6,35 cm från var och en av de stimulans zoner glas avdelare, som indikerar två chassilängder 30. Tillämpa ogenomskinliga partitioner utvändigt runt tre sidor av shoaling tanken, men lämna den främre exponeras för visning.
OBS: Den här inställningen zon kan anpassas för att testa specifika hypoteser för olika stora arter. - Beroende på vilken typ av studien, att välja stimulans stim acklimatisera sig under åtminstone 12 timmar before testning och kvar i shoaling tanken under loppet av experimentet.
OBS: Stimulans stim är samlingar av enskilda fiskar som används för att bedöma hur bränn fisk beter sig i närvaro eller frånvaro av dessa stim. Olika stimulus stim kombinationer kan väljas för att testa ett antal olika stim hypoteser. Vara säker på att stimulans stim roteras mellan varje stimulus zon för att undvika sido partiskhet och är också tillåtet att acklimatisera sig under åtminstone 12 timmar före testning. - Överföra bränn fisken i acklimatisering tanken såsom tidigare beskrivits (se steg 3.3)
- Transfer, genom koppning, bränn fisk från mellan acklimatisering tanken till den centrala avdelningen i shoaling tanken.
- Möjliggöra en 10 min acklimatiseringsperiod innan en 10 min levande scoring observationsperioden. Alternativt registrera stim analyser och göra senare med hjälp JWatcher. Fisk är fast beslutna att vara shoaling när de är inom inställningszonen i kammarenbostäder mål stim.
- Kvantifiera tid i varje preferens zon och tid i centrum volymen.
- Som en ytterligare beskrivande mått, beräkna "styrka shoaling" (SoS). Tilldela ett värde mellan -1 och 1, där storleken beskriver hur ofta en enskild fiskstim.
- Beräkna förhållandet mellan tid shoaling dividerad med arean av de stimzonerna och subtrahera kvoten av tiden som upptas inte shoaling och området av de icke-stim zoner. Placera denna kvantitet över summan av tid som tillbringas i varje zon delat med volymen av varje zon individuellt. Mer information om denna beräkning kan hittas i en tidigare studie 14.
6. Data Kvalitetskontroll
- Analysera data med hjälp av traditionella verktyg för dataanalys 31-32.
- Test för homogenitet av varians med användning av icke-parametrisk Levene test för alla beteenden. Om ett beteende är icke-homogen utföra en log-transformation33.
- Kontrollera att det inte finns några sekvenseffekter (dvs att randomisering ordning inte påverkade individernas beteende) med en Kruskal-Wallis ANOVA på enhetliga uppgifter 34.
- Kontrollera att det inte finns några sido fördomar för shoaling analysen genom att skapa univariata allmänna linjära modeller på SoS index med sidan som en fast faktor 35.
OBS: Om det inte finns lite att inga problem med data kan analyser nedströms genomföras. Om det finns problem, förena med ytterligare transformationer, rationalisera med biologiskt rimliga förklaringar, och / eller öka urvalsstorlekar.
7. Analysera data
- Beräkna tvåsidiga Spearman rank korrelationer 36 för alla beteenden separat inom djärvhet och aggression analyser.
- Beräkna intraclass korrelationskoefficienter (ICC) som en tvåvägs blandad modell med konsekvens för beteendeanalyser som genomfördes mer än en time för en given individ 36. I denna inställning är ICC ett mått på hur konsekvent en fisk uppträtt i en given analys mätas mer än en gång.
- Förbehandla djärvhet och aggressivitet beteenden genom centrering och norme alla beteenden för att förbereda för inmatning till en huvudkomponenter analys (PCA) 25.
OBS: Förbehandling mätningarna genom centrering och normering är ett viktigt steg. Utan denna förbehandling steg beteenden som förekommer med mer frekvens och mer variabelt kommer drivet påverka tolkningar av de extraherade komponenterna. Processen för centrering och normering kommer att ta bort denna bias. - Utföra en PCA med en korrelationsmatris för att bestämma om mod och aggression är kopplade tillsammans som ett beteendesyndrom. Tolka beteende laddningar av varje komponent signifikant vid> 0,6. Se Budaev 2010 24 för en omfattande guide för rapportering PCA för beteendestudier. En rasbranter tomt kommer att vara informativ som eigenvectors bör hållas för tolkning.
- Med hjälp av statistiskt programpaket såsom R eller SPSS 31,32, extrahera poäng för varje komponent för varje individ. Betygsättning representerar hur mycket den givna individens beteende kan förklaras av den speciella komponenten.
- Beräkna Spearman rank korrelationer mellan faktorregressionsresultat och styrkan i stim 36.
OBS: En beteendesyndrom anses närvarande om djärvhet och aggressivitet beteenden ladda på samma komponent, eller om någon komponent med betydande tolkningsbara belastningar korrelerar med styrka shoaling. Observera också att styrkan i shoaling inte ingår i PCA för att möjliggöra bättre tolkningar av de mer komplexa beteende kvantifieringar (djärvhet och aggression). PCA kommer ortogonalt kollapsa djärvhet och aggressivitet funktioner i egenvektorer för att maximera mängden av variation förklaras och är väl lämpad för dessa komplexa mätningar. tolkaden resulterande egenvektorer och regression vår styrka stim mätningar på var och en av dem ger en mycket mer intuitiv tolkning av hur var och en av de komplexa beteenden (djärvhet och aggressivitet) avser en mer väldefinierad binär shoaling mätning (dvs fisken stim eller inte stim).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beroende på naturen av studien, och specifikt protokoll som används, flera distinkta resultat är möjliga i ett beteendesyndrom experiment. Följande tabeller och figurer, där så anges, är anpassade från vår tidigare studie publicerad i tidskriften beteendeprocesser 14 och tidskriften zebrafisk 17. När förslaget (som beskrivits ovan) utförs i sin helhet, två uppsättningar av resultat "inom analys korrelationer" och "mellan analys korrelationer," förväntas (Figur 1).
Den första uppsättningen av resultat beskriver inom analys konsistens. Specifikt resultaten beskriva hur beteenden är korrelerade med varandra inom djärvhet analysen och i aggression analysen separat. Tabellerna 1 och 2 beskriver vad dessa korrelationer ska se ut för djärvhet och agsion analyser och de data som presenteras är anpassade från en tidigare studie 14. För mod-analysen, kan det förväntas att antalet övergångar och tid i den övre delen av tanken är positivt korrelerade, men latens att gå in i övre delen är negativt korrelerade. Representativa resultat för individer som uppmätts på djärvhet axel beteende i djärvhet tanken (se steg 4,1) ges i tabell 1. För aggression analysen förväntas bett, sido skärmar, och tid nära spegeln är alla korrelerade. Representativa resultat för individer som uppmätts på aggression axel beteende i aggression tanken (se steg 3,1) ges i tabell 2. Dart är vanligtvis inte korrelerade med aggressivt beteende, även om det i vissa fall, icke aggressiva fisk brukar dart (därav en negativ korrelation ). Slutligen en styrka av Shoaling (SoS) mätning för shoaling analysen ger en individnivå mått på stim tendency. Shoaling är en hög repeterbarhet beteende över en mängd olika stim analyser mätt med SoS (ICC = 0,641) 14 och flera av våra tidigare studier har bekräftat shoaling beteende i zebrafisk 23,38. Eftersom alla personer kommer att mätas för vart och ett av de beteenden, kan vi beräkna Spearman korrelationer över dessa beteenden och förvänta sig vissa beteenden kan korreleras, som identifierats för zebrafisk i de representativa resultat.
Den andra delen av de resultat som undersöker närvaron av ett beteendesyndrom. Resultaten av den integrerande analys av alla beteenden kvantifierats i de djärvhet och aggression beteende analyser sammanfattas med användning av en Principal Components Analysis (PCA). Det bör finnas två till fyra tolknings komponenter baserade på höga belastningar för varje beteende. Om en enda egenvektor som förklarar en stor del av variationen innefattar beteenden från både djärvhet end aggression analyser, då en beteendesyndrom har observerats. Men om beteenden från djärvhet och aggressivitet analyser inte överlappar på en enda egenvektor, då studien beskriver inte en beteendesyndrom. Representativa resultat presenteras för frånvaron av en mod-aggressionsbeteendesyndrom (Figur 2). I det här exemplet, är komponent 1 starkast representativa för aggression beteenden medan komponent 2 är starkast förknippad med djärvhet beteenden. Eftersom aggression och djärvhet beteenden inte representeras av samma komponent, kan man dra slutsatsen att det är avsaknaden av en mod-aggression beteendesyndrom (djärvhet vektorer är ungefär vinkelrät mot aggression vektorer). Dessutom är dessa beteenden påverkas ej av kön eftersom fördelningsmönstret är detsamma mellan hanar och honor. Att observera om djärvhet eller aggression beteenden är förknippade med shoaling, de extraherade regressions poängen för varje fisk är corrupprymd med fiskens SoS mätning. Det är viktigt att se till att eventuella korrelerande komponenter faktiskt beskriver en tolkningsbar uppsättning beteenden. Om det finns höga absoluta värde Spearman korrelationer mellan någon komponent och shoaling mätning då en stimbeteendesyndrom förekommer. Oberoende av de specifika resultat, är det viktigt att ge möjliga biologiska tolkningar alla observationer. Representativa resultat ges för en beskrivning av en mod-Shoaling beteendesyndrom (tabell 3) 14. Medan de uppgifter som presenteras representerar typiska resultat för zebrafisk, bör de inte tolkas som mätningar av datakvaliteten. Det finns flera anledningar till varför uppgifterna kommer att se annorlunda i olika experiment såsom arter eller populationsskillnader.
Figur 1. Föreslagenarbetsflöde för en djärvhet, aggression, och stimbeteendesyndrom experiment. Typiska mätningar listas för varje analys. En översikt över hur man analyserar analyserna individuellt och sedan hur man kan integrera analyserna anges också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa resultat av en PCA indikerar att en mod-aggression beteendesyndrom är frånvarande. De röda vektorer indikerar beteenden som bidrar till poängen komponent (vänster och nedre axlar) och punkter representerar poängen längs varje komponent (höger och uppifrån axlar ). Hanar representeras av blå punkter och honor representeras av gröna punkter. Observera att "oberäkneligt beteende" avser "dart" och"aggression rate" kan beräknas genom att addera antalet bett och sido skärmar dividerat med den totala tiden interagera med spegeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| övergångar | Latens | Dart | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| yta Tid | 0,65 | <0,001 * | -0,68 | <0,001 * | 0,42 | 0,007 * |
| övergångar | -0,40 | 0,012 * | 0,33 | 0,041 * | ||
| Latens | -0,47 | 0,002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabell 1:. Djärvhet Spearman rang korrelationer i en ny tank analys Denna tabell hade ändrats från Way et al, 2015..
| laterala displayer | Dart | spegel Tid | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| bites | 0,69 | <0,001 * | -0,10 | 0,547 | 0,63 | <0,001 * |
| laterala displayer | -0,06 | 0,735 | 0,66 | <0,001 * | ||
| Dart | -0,18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabell 2:. Aggression Spearman rang korrelationer i en ny tank analys Denna tabell hade ändrats från Way et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| PCA komponenter | ||
| Djärvhet | 0,339 | 0,035 * |
| Aggression | 0,075 | 0,65 |
| Pil | -0,012 | 0,944 |
T kunna 3. Använda PCA komponenter för att bekräfta närvaron av en shoaling och djärvhet beteendesyndrom förekommer i denna patientgrupp Denna tabell hade ändrats från Way et al, 2015..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet kommer att avgöra om det finns konsekventa föreningar i djärvhet, aggression och stim beteenden hos zebrafisk. Om det finns överensstämmande föreningar i en given population mellan någon av dessa beteenden, då ett beteendesyndrom är närvarande. Genom att studera en befolkning naturliga beteendesyndrom, kan forskarna ha en mer fullständig förståelse av dess beteende dynamisk, befolkningsstrukturen, och möjligen evolutionära historia 3. Dessutom manipulera omgivningen som påverkar dessa beteendesyndrom, som i farmakologi 6, toxikologi 7, beteendegenetik 8,9, och endokrinologi 10 studier kan belysa hur olika faktorer kan påverka beteende associationer. Den specifika sammansättningen av aggression-mod-shoaling beteendesyndrom som finns i detta protokoll omfattar vanliga beteenden väl studerade i modellorganismen zebrafisk 11-13. Medan denna metodkan tillämpas på alla fiskarter, kan brett tillämpningsområde för att använda zebrafisk hjälpa till med det tvärvetenskapliga standardisering av detta protokoll. Varje analys som beskrivits ovan kan mer lätt kontrolleras och manipuleras än andra jämförbara metoder. Till exempel använder aggression analysen lutande spegeln för att framkalla ett bredare utbud av aggression svar snarare än med ett levande eller lera modell, video stimulans, eller vertikal spegelbild stimulans 17. De beteenden som mäts i mod-analysen är lättare kvantifieras än i en t-labyrint eller stora öppna fälttest 15. Slutligen shoaling analysen beskriven kan enkelt spåra en individ, vilket är nödvändigt för att studera beteendesyndrom på individnivå, och kan göra det möjligt att obegränsade kombinationer av mål stim att ställa nya experimentella frågor. Medan detta protokoll kan ändras för att rymma en mångfald beteendefrågor kan standardisering av det leda till ytterligare insikt om hur DNA, cellulära mekanismens, cellulär utveckling, och introducerade kemikalier kan påverka enskilda och befolkningsbeteendesyndrom.
För att vara säker på att de observerade föreningar är sanna, måste protokollet följas noggrant. För det mesta, är protokollet modifieras beroende på den specifika hypotesen; Men det finns flera steg som måste utföras för att skapa förtroende för resultaten. För det första är det viktigt att de individer är inrymda i en lämplig tank, vid optimala betingelser (se protokoll) och matas på rätt sätt. De vattenförhållanden bör vara konsekvent i bostads rack, Acklimatisering tankar och test tankar. Om vattnet är inte konsekvent, kommer fisken att ta längre tid att acklimatisera sig till de villkor och beteendemätningar kommer inte riktigt fångas. Det är också viktigt att vatten recirkuleras mellan mod och aggression tankar så att konstgjorda lukter inte överföras mellan analyser. För det andra, är det av yttersta vikt att alla Behaviors är ordentligt scored. För att säkerställa detta är alla analyser videofilmas för att möjliggöra för flera visningar, och flera utbildningsmöjligheter. En enda utbildad målskytt kan noggrant mäta fiskens beteende, men utbildning tar lite tid. Om en noggrann träningsperiod ignoreras, då förtroendet för resultaten av beteende studien är låg. En noggrann undersökning med storlekar låg prov utförs av en välutbildad observatör är mer kraftfull än en studie med hög provstorleken som utförs av en dåligt utbildad observatör. Slutligen är också kritisk kvalitetskontroll av insamlade data. De åtgärder som vidtas för att slumpa individer och ta bort fördomar bör resultera i användbara, tillförlitliga uppgifter, och datatransformationer rekommenderas för förbehandling beroende på den specifika statistiskt test (se protokollet). Om dessa åtgärder inte är noggrant gjort, kan produktionen av analyserna inte vara tillförlitligt tolkningsbar.
Som tidigare nämnts, är tekniken mycket modifierbara According till de specifika testa hypoteser. Det finns andra beteendemätningar som kan undersökas vara relaterade i ett beteendesyndrom bland ett antal olika fiskarter 39-41. Medan principerna i protokollet förblir desamma, kan de specifika frågor lätt ändras för att möjliggöra för olika hypotesprövning. Till exempel kan en forskare använder nämnda protokollet för att undersöka förekomsten av en aggression och utforskande aktivitet beteendesyndrom i zebraciklider (amatitlania nigrofasciata). Frågan är besläktade, men studien organismen skiljer sig från den som beskrivs av protokollet. De allmänna stegen i stort sett densamma. Individer måste randomiserade och spåras genom en rad analyser med acklimatiseringsperioden i mellan analyser, måste vattnet vara konsekvent och färskt och forskare bör vara väl utbildade. En stor skillnad är de beteenden som håller mäts är sannolikt att ändras beroende på det särskildafic analys och beteende föreningar kan ändras beroende på den specifika arten och ursprungliga miljö.
Begränsningarna i protokollet är kopplade till några av de traditionella osäkerheten i beteendestudier. Speciellt om analyserna gjorde otillförlitligt då är det troligt tolkningarna av resultaten är felaktiga, och det skulle vara svårt att identifiera detta fel. För att övervinna denna begränsning, är det möjligt att två välutbildade scorersna observera beteenden. För att bedöma deras tillförlitlighet, beräkna intraclass korrelationskoefficienter på mätningar som tillämpas på samma fisk, och, vid behov justera för olikheter. Alternativt, om sådana finns, automatisk spårning program som Ethovision kan genomföras och godkännas av en välutbildad observatör att öka genomströmningen och noggrannhet 42. Vidare finns det olika möjliga tolkningar för namngivning och poängsättning av de "mod" beteenden. andra studierhar benämnt det beteende som beskrivs 43 och andra har beskrivit beteende som "undersökande" 44,45. I vårt arbete beteendet beskrevs som "mod", som det mäta beteendet i en miljö som inte känner till sambands individen. Men medan termen kan bli föremål för alternativa tolkningar, detta påverkar inte protokollet eller analysen. Dessutom, medan vi förväntar mätningar inom mod och aggression analyser för att vara starkt korrelerade inom en population, kommer det troligtvis att vara en del fall med låg eller ingen korrelation av vissa beteenden. Denna begränsning övervinns av styrkan i PCA, eftersom det nycklar i viktiga källor till variabilitet och, även om mätningar inte korrelerade kommer analysen extrahera beteende variation konsekvent i de insamlade uppgifterna. Slutligen, såsom är fallet med alla vetenskapliga metoder, om protokollet är allmänt antagits och är konsekvent genomförs av flera labs, och det finns vissaoförutsedd, unmeasured confounding infördes genom protokollet, då denna potential skadliga inslag kvarstår i litteraturen, och det blir svårt att demontera. Farmakologiskt bekräftar att ett representativt urval av analyser framkalla den avsedda beteendesvaret kräver en mer grundlig förståelse av beteende, neurologiska och hormonella svar. Beteendesyndrom kan hjälpa till att förklara grunden för beteende, men detta laboratorium begränsning kanske kan vara mer regelbundet upp i framtida studier. Ändå har resultaten lämnats som bekräftar användningen av detta protokoll i zebrafisk, och med rätta modifikationer, kan protokollet utökas till en mängd olika hypoteser i ett antal olika fiskarter. Genom att noga följa ett detaljerat protokoll för huset, urval och provning av olika beteendeparametrar gör det möjligt för forskare att göra mer specifika jämförelser inom ett brett spektrum av studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
