Abstract
En adfærdsmæssig syndrom eksisterer, når specifikke adfærd interagerer under forskellige sammenhænge. Zebrafisk har været testpersoner i nyere undersøgelser, og det er vigtigt at standardisere protokoller til at sikre ordentlige analyser og fortolkninger. I vores tidligere undersøgelser, har vi målt dristighed ved at overvåge en række adfærd (tid nær overfladen, latenstid i overgange, antal overgange og dart) i en 1,5 L trapezformet tank. Ligeledes vi kvantificeret aggression ved at observere bid, laterale skærme, dart og tid nær en skrå spejl i en rektangulær 19 L tank. Ved at opdele en 76 L beholder i tredjedele, vi undersøgte også shoaling præferencer. Den shoaling assayet er et meget fleksibelt assay og kan skræddersys til specifikke hypoteser. Men protokoller til denne analyse også skal være standardiseret, men alligevel fleksibel nok til tilpasning. I tidligere undersøgelser, end kamre var enten tomme, indeholdt 5 eller 10 zebrafisk, eller 5 perle Danios (D. albolineatus). I folgende manuskript, præsenterer vi en detaljeret protokol og repræsentative data, der ledsager ansøgninger i protokollen, som vil give mulighed for replikation af adfærdsmæssige syndrom eksperimenter.
Introduction
Der er en voksende mængde litteratur undersøger sammenhængen mellem forskellige adfærd inden for de enkelte dyr fra en given population. Disse foreninger betegnes adfærdsmæssige syndromer, og målingerne omfatter typisk dristighed, aggression, udforskende adfærd, og selskabelighed 1-5. Adfærdsmæssige syndromer er værdifulde for både direkte og indirekte årsager. Direkte, kan viden om adfærdsmæssige syndromer give et mere komplet billede af evolutionsteorien, befolkning struktur, og populationsdynamik 3. Indirekte kan viden om adfærdsmæssige foreninger informere felter, der kvantificerer adfærd såsom farmakologi 6, toksikologi 7, adfærdsmæssige genetik 8,9, og endokrinologi 10. På grund af disse direkte og indirekte fordele, en øget viden om adfærdsmæssige syndromer er især værdifuldt i almindeligt anvendte modelorganismer såsom zebrafisk. Undersøgelser med zebrafisk findes ina række forskellige discipliner, herunder en analyse af adfærdsmæssige syndromer 11-13. At fremme viden i adfærdsmæssige syndrom forskning, og fordi andre discipliner også bruge adfærdsmæssige målinger til hypotesetest, er behov for pålidelige og præcise beskrivelser af adfærd for gyldige analyser og fortolkninger og standardiserede protokoller vil lette inter-undersøgelse sammenligninger inden arter. Vores protokol blev udviklet til at måle en dristighed-aggression-shoaling adfærdsmæssige syndrom i en population af lab-opdrættet zebrafisk 14. Men grundlaget for den protokol (sporing enkelte fisk, sikre korrekt randomisering, og passende analyser) kan let ændres til en række alternative adfærdsmæssige foranstaltninger. Derudover kan dristighed, aggression, eller shoaling assays køres individuelt for afprøvning af forskellige hypoteser. Derfor, mens det er vores mål at beskrive, hvordan man fører en adfærdsmæssig syndrom undersøgelse og protokollen for en vellykket individuelle lEvel adfærdsmæssige målinger, kan hver facet af denne procedure stå alene.
Litteraturen om adfærdsmæssige syndromer spænder over flere taksonomiske grupper, fra arthropoder til mennesker 4 og, for at måle en adfærdsmæssig syndrom, skal mindst to adfærdsmæssige sammenhænge kvantificeres. Desværre er der ofte kun ringe overensstemmelse i assayene, der bruges til at kvantificere adfærdsmæssige måling på tværs af akserne for adfærd. For eksempel i fisk, dristighed kan måles ved anvendelse T-maze assays, open-field assays, eller indførelse af en roman eller udenlandsk stimulus 15. Aggression studier i fisk kan indebære dyade interaktioner, video stimulus assays, eller ler model analyser 12,16,17. Ligeledes analyse af shoaling adfærd, som typisk involverer måling af shoalmate præference, kan udføres i forskellige typer af beholdere, med forskellige metoder til bestemmelse association tid 21-23. I denne protokol en bestemt delmængde af Overall adfærdsmæssige assay repertoire præsenteres. Konkret denne protokol udgør en metode til at spore enkeltpersoner gennem dristighed, aggression, og shoaling analyser på en måde, der letter sammenligninger indenfor den enkelte at afgøre, om sammenligninger er konsistent på tværs af alle individer i en population. Vi har udført denne protokol med zebrafisk og zebracichlider (Amatitlania nigrofasciata) i tidligere undersøgelser 14,18, og det vil arbejde med alle tilsvarende størrelse ferskvandsfisk.
Dristighed assays udføres i en 1,5 I trapezformet tank, der har en vandret linje afgrænse lige store områder i de øvre og nedre dele af tanken. Kvantificerede adfærd omfatter antallet af overgange ved forsøgsfiskene mellem den øvre og nedre del af tanken, tiden tilbragt i hver portion, antallet af dart, og latenstiden til at indtaste den øvre del. Den aggression analysen udføres i en 19L rektangulær tank, der omfatteren 3 tommer x 5 tommer spejl hælder i omkring 22 ° beliggende i nederste venstre hjørne af tanken 19. Kvantificerede adfærd omfatter den samlede tid, målet fisk interagere med spejlet 20, sammen med specifikke aggressive indikatorer - antal bid, laterale skærme, dart mellem testen fisk og sine overvejelser. For disse specifikke indikatorer hænger bites defineres som hurtige lunges mod spejlet med en åben mund, er laterale skærme defineret som flaring af laterale, brystfinner, anal og rygfinner i retning af spejlet, og dart er nogen uregelmæssige bevægelser, der er ikke rettet mod spejlet. Endelig shoaling analysen kvantificerer opførslen af en test fisk i midten kammer i et tri-kamre tank. Den side kamre i tanken er enten tomme eller indeholde en "target stime" af fisk, og den tid forsøgsfiskene bruger nær hver side kammer måles 21-23. En enkelt sammensat score, kaldet StrenGTH af shoaling (SoS), beregnes for hver enkelt test fisk, specifikke for stimuli, og kan anvendes i efterfølgende analyser 14. Alle adfærd er scoret af en enkelt seer, eller flere seere ved hjælp af gratis adfærdsmæssige kvantificering software, der kaldes JWatcher 24.
Test af tilstedeværelsen af en adfærdsmæssig syndrom er primært en statistisk affære, og det er tilrådeligt at følge retningslinjerne som forelagt af Budeav 2010 25. Konkret anbefales det at udføre en principal komponenter analyse (PCA) på centrerede og normerede data, hvor indgange er vektorer for en persons adfærd i analyser med flere adfærdsmæssige målinger (dvs. dristighed og aggression). PCA, udført på en korrelation matrix, reducerer dimensionalitet af de adfærdsmæssige målinger, og dermed trækker den vigtigste viden, der forklarer størstedelen af variationen. De ekstraherede komponenter kan derefter fortolkes based på høj factor loadings for den enkelte adfærd renter og regression scoringer kan udvindes for den enkelte på grundlag af de forklarende komponenter. Disse regression scoringer kan derefter sammenlignes med SoS måling og andre forskellige ikke-adfærdsmæssige målinger såsom fisk størrelse eller køn.
Denne arbejdsgang er implementeret i en undersøgelse af zebrafisk adfærdsmæssige syndromer, hvor en sex specifik adfærdsmæssige syndrom, der eksisterer mellem dristighed og shoaling 14 blev opdaget. I denne situation, federe zebrafisk mænd er mere tilbøjelige til at associere med et større, mere aggressive arter (D. albolineatus), men denne forening er tabt hos kvinder. Denne arbejdsproces blev også implementeret i en undersøgelse af unge straffefange cichlide kin (Amatitlania nigrofasciata) 18, hvor en adfærdsmæssig syndrom ikke blev opdaget, potentielt indikerer adfærdsmæssige plasticitet af arterne. Derfor er den følgende protokol præsenteret wed et mål om at afgrænse arten af tre specifikke analyser (dristighed, aggression, og shoaling) inden for rammerne af at studere individniveau adfærdsmæssige syndrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende metoder til huset, pleje og undersøgelse af zebrafisk er blevet godkendt af Saint Joseph University IACUC.
1. zebrafisk Boliger og pleje
- Anskaf emnet zebrafisk fra en lokal leverandør, eller fra vilde-fanget populationer. Bemærk, at boliger zebrafisk er underlagt IACUC retningslinjer og yderligere tilladelser kræves for boliger vilde-fanget populationer.
- Identificere og separat zebrafisk efter køn. Alternativt, springe dette trin eller udskift med en anden metode til adskillelse baseret på studiet hypotese.
BEMÆRK: Sex karakteristika er vanskeligt at afgøre, i zebrafisk, især hos kvinder. Der henvises til disse retningslinjer 10 eller nyttige online manualer til at skelne køn. - Tilfældigt adskille populationer længere ind i passende forhold af fokal fisk på stimuli fisk. Bemærk: Focal fisk er forsøgspersonerne blev fulgt gennem rækken af behavioral analyser og stimulus fisk er de personer, der vil besætte de stimulerende kamre i aggression og shoaling analyser.
BEMÆRK: Traditionelt mellem 1 og 5 stimulus fisk pr omdrejningspunkt fisk i shoaling analyser og en 1: 1 stimulus: anvendes omdrejningspunkt fisk forholdet i aggression assays 14,17. Men forskeren skal specifikt designe studiet med hypotesen i tankerne, (dvs., bør stimulus fisk holdes konstant at bevare sammenhængen i fokal fisk adfærd, eller skal stimulus fisk roteres mellem hver analyse for at sikre korrekt randomisering). - Opbevar alle fisk i zebrafisk boliger stativer (27,5-28,5 ° C) under en streng 12:12 lys / mørke cyklus. Feed alle omdrejningspunktet og stimulus fisk flake mad dagligt og artemia ugentligt, på ikke-forskning dag.
- Sørg for, at alle test er udført mellem ZT1 og ZT5 (zeitgeber tid) for at undgå døgnrytme effekter 26.
2. Randomisering og Tank Setup
- Randomize alle personer a priori til en specifik sekvens af adfærdsmæssige assays. Oprette en konsekvent randomiseringsskema hjælp af en online tilfældig sekvensgenerator 27 eller en tilfældig sekvens generator fra en statistisk programpakke (R).
- Mærk hver analyse fra 1 til 3, og holde denne opgave konsekvent. Tildel en vilkårlig sekvens til hver enkelt og kortlægge sekvens ifølge den adfærdsmæssige assay etiket. For eksempel, for tre samlede analyser (1 kortlagt til shoaling, 2 kortlagt til frimodighed, og 3 mappet til Aggression), kan en given person har en randomiseret sekvens af '2,3,1', hvilket vil kræve dem til at udføre den specifikke adfærdsmæssige assays i den angivne rækkefølge.
- Opsæt assay tanke (dristighed, aggression, og shoaling) i laboratoriet på steder, der minimerer muligheden for negative eksterne stimuli og være sikker på at have nok plads til en videokamera til at fange hele tanken. Sørg for, at videokameraet er enough klarhed for at se tanken etiketter samt være i stand til at skelne subtile adfærd af omdrejningspunktet fisk og opsætning videokameraet i denne position.
- Optag alle adfærdsmæssige analyser med kameraet fastholdt i samme position med en fuld visning af den angivne tanken for at minimere utilsigtede forskelle i adfærdsmæssige scoring som følge af differentierede optagelser.
BEMÆRK: Undgå at anbringe tanke i tunge trafikerede områder og ved døre som bevægelse og lyd vil påvirke zebrafisk adfærd. - Etablere unikke JWatcher protokoller 24 for at udføre hver adfærdsmæssige assay. Se JWatcher manualen for at lære at oprette fokale masterfiler at tildele adfærd til tastetryk og fokale analysedatabaser at opsummere data indsamlet.
BEMÆRK: JWatcher er adfærdsmæssige scoring software, der giver mulighed for pålidelig og gentagelig tilpassede adfærdsmæssige scoring 24. - Definer en mærkningsordning til at spore den dato, fisk nummer, og assay nummer for alle adfærdsmæssige analyser (f.eks"F5-B-123.115 'indebærer Fish 5, Dristighed assay, den 31. december st, 2015) og mærke ydersiden af tanken med tape i betragtning og i fokus af kameraet. Hold og registrere disse oplysninger i en lab notebook til hurtig reference og fremtidig kvalitetskontrol.
- Oprette en akklimatisering tank, der skal bruges mellem alle assays samt direkte efter individer fjernes fra huset rack.
BEMÆRK: akklimatisering tanke og terminal tanke er små akvarier (40 cm x 20 cm x 25 cm) med grus og et filter, der ligner huset rack. - Efter analyserne er alle afsluttet, overføre den enkelte i en separat terminal tank, der vil tjene som den endelige destination tank til alle brugte fokale individer. Brug en tank, der er stor nok til at rumme en gruppe af individer for resten af deres liv (fx 25 gallon).
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at opretholde ensartede og lignende vandtemperaturer og vilkår akroers alle tanke. Dette omfatter boliger, akklimatisering, og alle test tanke.
3. Udførelse af Aggression Assay
- Gennemføre aggressionen analysen i en 19 L rektangulært akvarium måler 30 cm x 15 cm x 10 cm. Udstyre tanken i eksterne uigennemsigtige skillevægge omkring tre sider af aggression tank, forlader forsiden udsat til visning, for at reducere uønskede eksterne stimuli. Divider tanken med eksterne markeringer i fire lige store rektangulære kvadranter og løse et spejl permanent (med silikone caulk) i den nedre venstre kvadrant, hældning på 22,5 ° danner en retvinklet trekant mod det yderste venstre side af tanken.
- Sikre, at temperaturen af vandet i akklimatisering tank og aggression tanken ligger inden for 2 ° C af huset rack. For at gøre dette, har frisk, ældet vand pre-opvarmes til 27,5-28,5 ° C klar til at tilføje til aggression tank. Bemærk, at det er vigtigt at skifte vand i mellem hver analyse for at fjerne uberettigedeolfaktoriske tidskoder.
- Overfør ved cupping, en fokal fisk fra huset rack til en separat akklimatisering tank, hvor den vil akklimatisere i 10 minutter.
BEMÆRK: Det er vigtigt at reducere stimulus introduceret til fisk gennem forkert håndtering. Overfør individer som tidligere beskrevet 27.- Specifikt manuelt og forsigtigt placere en lille, gennemsigtig plast cup i tanken af interesse. Uden at forstyrre fisken så meget som overførsel ved hjælp af et net, langsomt øse op fisken ned i koppen.
- Sørg for, at videokamera er klar til at optage ved at bekræfte, at aggression assay tanken (se trin 3.1) er i fokus, og umiddelbart før overførsel individet i aggression tank, skal du trykke på optage på enheden. Overfør omdrejningspunkt fisk via cupping fra akklimatisering tanken til aggression tank.
BEMÆRK: Det er vigtigt at registrere, inden fisken ind i aggression tanken til at spore det nøjagtige tidspunkt for indrejse. - Optag AGGRession tanken i 10 minutter og 30 sekunder og derefter cup omdrejningspunktet fisk fra aggression tanken tilbage i akklimatisering tank.
- Når du ser optagelsen, vent 30 sek efter at fisken er blevet introduceret til tanken som en yderligere akklimatisering periode før scoring adfærd.
- Brug af JWatcher pointsystem defineret for aggressiv adfærd, kvantificere følgende adfærd for 10 min: Tid brugt nær spejl, antal spejl tilgange, antal dart, antal forsøg bid (åbner munden i retning af spejl), og antallet af laterale skærme (dorsale, brystfinner, anal, og halefinnen erektion) 9.
- Score en enkelt aggression assay mindst to gange, indtil assayet er scoret med høj aftale mellem iterationer.
4. Gennemførelsen af dristighed Assay
- Gennemføre den dristighed analysen i en lille 1,5 L trapezformet tank, måler 15 cm høj x 26,5 cm top x 22,5 cm bund x 6 cm bredde. Wrap uigennemsigtigt papir rundt om alle sider of tanken men lad forsiden udsat for visning. Placer et enkelt, tyndt stykke tape eksternt til tanken for at afgrænse top fra bunddelen af tanken.
- Sikre, at temperaturen af vandet i dristighed tanken ligger inden for 2 ° C af huset rack (se trin 3.2)
- Overfør omdrejningspunktet fisk fra huset rack til akklimatisering tanken (se trin 3.3) og lad akklimatisere i 10 minutter.
- Sørg for, at videokameraet er klar til at optage den dristighed analysen, og når klar til at overføre omdrejningspunktet fisk, tryk rekord på enheden. Overfør omdrejningspunktet fisk fra akklimatisering tanken til dristighed tank og rekord for 8 min og 30 sek.
- Når du ser optagelsen, giver mulighed for yderligere 30 sek akklimatisering periode efter fisken er introduceret til tanken før scoring.
- Brug JWatcher software, kvantificere dristighed adfærd i 8 min. Konkret kvantificere følgende problemer: Time nær overfladen, at latency indtaste øverste del, antal transitions i den øvre del, og antallet af uregelmæssige bevægelser (dart) 29.
- Score en enkelt dristighed assay mindst to gange, indtil assayet er scoret med høj aftale mellem iterationer.
5. Gennemførelsen af shoaling Assay
- Gennemføre den shoaling analysen i en 76 L tank, der har tre rum divideret med to skillevægge i glas forseglet med silikone caulk (de resulterende tre rum består af to stimulus zoner og et kontaktpunkt rum). Eksternt markere to præference zoner udpeget 6,35 cm fra hver af de stimulerende zoner «glas divider, indikerer to karrosserilængder 30. Påfør uigennemsigtige partitioner eksternt omkring tre sider af shoaling tank, men lad den forreste udsat for visning.
BEMÆRK: Denne præference zone kan tilpasses til at teste for specifikke hypoteser for forskellige størrelser arter. - Afhængigt af arten af undersøgelsen, at vælge stimulus shoals akklimatisere i mindst 12 timer before test og forblive i shoaling tanken under hele forsøget.
BEMÆRK: Stimulus shoals er samlinger af enkelte fisk, der anvendes til at vurdere, hvordan det fokale fisk opfører i nærvær eller fravær af disse stimer. Forskellige stimulus stime kombinationer kan vælges til at teste en række forskellige shoaling hypoteser. Sørg for, at de stimulerende stimer roteres mellem hver stimulus zone for at undgå side bias og er også tilladt at akklimatisere i mindst 12 timer før testning. - Overfør omdrejningspunktet fisken i akklimatisering tank som tidligere beskrevet (se trin 3.3)
- Overfør ved cupping, omdrejningspunktet fisk fra den mellemliggende akklimatisering tanken til det centrale rum i shoaling tanken.
- Muliggøre en 10 min akklimatiseringsperiode før en 10 min levende scoring observationsperiode. Alternativt registrere shoaling analyser og score senere bruge JWatcher. Fiskene bestemt til at være shoaling, når de er inden for præference zone i kammerethuser mål-stime.
- Kvantificer tid tilbragt i hver præference zone og tid brugt i midten volumen.
- Som en ekstra beskrivende foranstaltning, beregne 'styrke shoaling «(SoS). Tildel en værdi mellem -1 og +1, hvor størrelsen beskriver, hvor ofte en individuel fiskestimer.
- Beregne forholdet af tid brugt shoaling divideret med arealet af shoaling zoner og subtrahere forholdet af tid brugt ikke shoaling og området af de ikke-shoaling zoner. Placer denne mængde over summen af tid tilbragt i hver zone divideret med volumenet af hver zone individuelt. Mere information om denne beregning kan findes i en tidligere undersøgelse 14.
6. Data Quality Kontrol
- Analysere data ved hjælp af traditionelle data analyseværktøjer 31-32.
- Test for varianshomogenitet hjælp parametrisk Levene test for alle adfærd. Hvis en adfærd er uensartet udføre en log-transformation33.
- Bekræft, at der ikke er nogen sekvens effekter (dvs., at randomisering ordre ikke påvirkede den enkeltes adfærd) med en Kruskal-Wallis ANOVA på de homogene data 34.
- Bekræft, at der ikke er nogen bivirkninger bias for shoaling analysen ved at skabe univariate generelle lineære modeller på SoS indeks med side som en fast faktor 35.
BEMÆRK: Hvis der er lidt at ingen problemer med data, kan gennemføres downstream analyser. Hvis der er problemer, forene med yderligere transformationer, rationalisere med biologisk plausible forklaringer, og / eller øge stikprøvestørrelser.
7. Analyser af data
- Beregn tosidede Spearman rang sammenhænge 36 for alle adfærd separat inden for dristighed og aggression analyser.
- Beregn intraclass korrelationskoefficienter (ICC) som en to-vejs blandet model med konsekvens for adfærdsmæssige analyser, der blev gennemført mere end én time for en given person 36. I denne indstilling, ICC er en måling af, hvor konsekvent en fisk opførte sig i en given assay målt mere end én gang.
- Preprocess dristighed og aggression adfærd ved centrering og Norming alle adfærd for at forberede sig til input til en principal komponenter analyse (PCA) 25.
BEMÆRK: forbehandling målingerne ved centrering og Norming er et afgørende skridt. Uden denne forbehandling step handlinger, der forekommer med mere frekvens og mere variabelt vil overdrevent påvirke fortolkninger af de ekstraherede komponenter. Processen med centrering og Norming vil fjerne denne skævhed. - Udfør en PSA med en korrelationsmatrix at afgøre, om mod og aggression er bundet sammen som en adfærdsmæssig syndrom. Fortolke adfærdsmæssige belastninger på hver komponent signifikant på> 0,6. Se Budaev 2010 24 for en omfattende guide til indberetning PCA for adfærdsmæssige undersøgelser. En urer plot vil være informativ på hvilke eigenvectors bør holdes for fortolkning.
- Brug statistisk programpakke såsom R eller SPSS 31,32, udtrække scores for hver komponent for den enkelte. Scorerne repræsenterer, hvor meget det givne enkeltes adfærd kan forklares med den pågældende komponent.
- Beregn Spearman rank korrelationer mellem faktor regression scoringer og styrken af shoaling 36.
BEMÆRK: En adfærdsmæssig syndrom anses stede, hvis dristighed og aggression adfærd indlæse på den samme komponent eller, hvis en komponent med betydelige fortolkelige belastninger korrelerer med styrken af shoaling. Bemærk også, at styrken af shoaling ikke er inkluderet i PCA at give mulighed for bedre fortolkninger af de mere komplekse adfærdsmæssige kvantificeringer (dristighed og aggression). PSA vil ortogonalt kollapse mod og aggression funktioner i egenvektorer at maksimere mængden af variationen forklaret og er velegnet til disse komplekse målinger. Tolkningden resulterende egenvektorer og regression vores styrke shoaling målinger på hver af dem giver en meget mere intuitiv fortolkning af, hvordan hver af de komplekse adfærd (dristighed og aggression) vedrører en mere veldefineret binær shoaling måling (dvs. fiskene shoaling eller ikke shoaling).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhængigt af arten af undersøgelsen, og specifik anvendte protokol, flere særskilte resultater er mulige i en adfærdsmæssig syndromer eksperiment. Nedenstående tabeller og figurer, hvor der er angivet, er tilpasset fra vores tidligere undersøgelse offentliggjort i tidsskriftet Behavioural Processer 14 og tidsskriftet Zebrafisk 17. Når forslaget (som beskrevet ovenfor) udføres i sin helhed, to sæt resultater, »inden assay korrelationer" og "mellem assay korrelationer,« forventes (figur 1).
Det første sæt resultater beskriver inden assay konsistens. Konkret resultaterne beskrive, hvordan adfærd er korreleret med hinanden inden for dristighed analysen og i aggression analysen separat. Tabel 1 og 2 beskriver, hvad disse sammenhænge skal se ud for dristighed og aggression assays og data præsenteret er tilpasset fra en tidligere undersøgelse 14. For dristighed assay forventes det, at antallet af overgange og tid tilbragt i den øvre del af tanken er positivt korreleret, men latenstid til at indtaste den øvre del er negativt korreleret. Repræsentative resultater for enkeltpersoner målt på dristighed akse adfærd i dristighed tanken (se trin 4.1) er angivet i tabel 1. For aggression analysen, forventes det, at bid, laterale skærme, og tid brugt i nærheden af spejlet er alle korreleret. Repræsentative resultater for målte individer på aggression akse for adfærd i aggression tanken (se trin 3.1) er angivet i tabel 2. Dart er normalt ikke korreleret med aggressiv adfærd, selv om der i nogle tilfælde, ikke-aggressive fisk har tendens til dart (dermed en negativ korrelation ). Endelig en styrke shoaling (SoS) måling for shoaling analysen giver et individuelt niveau mål for shoaling tendency. Shoaling er en meget gentagelig adfærd på tværs af en bred vifte af shoaling analyser målt ved hjælp SoS (ICC = 0,641) 14 og flere af vores tidligere undersøgelser har bekræftet shoaling adfærd i zebrafisk 23,38. Eftersom alle personer vil blive målt for hvert af den adfærd, kan vi beregne Spearman korrelationer på tværs af disse adfærdsmønstre og forventer nogle adfærd for at være korreleret, som identificeret for zebrafisk i de repræsentative resultater.
Den anden del af resultaterne undersøger tilstedeværelsen af en adfærdsmæssig syndrom. Resultaterne af den integrerende analyse af alle adfærd kvantificeret i dristighed og aggression adfærdsmæssige analyser er sammenfattet ved hjælp af en Principal Components Analysis (PCA). Der bør være to til fire fortolkelige komponenter baseret på høje belastninger for hver adfærd. Hvis en enkelt egenvektor der forklarer en god del af variationen omfatter adfærd fra både dristighed end aggression analyser, så en adfærdsmæssig syndrom er blevet observeret. Men hvis adfærd fra dristighed og aggression analyser ikke overlapper på en enkelt egenvektor, så undersøgelsen beskriver ikke en adfærdsmæssig syndrom. Repræsentative resultater er præsenteret for fravær af en dristighed-aggression adfærdsmæssige syndrom (figur 2). I dette eksempel, komponent 1 er stærkest repræsentativ for aggression adfærd, mens komponent 2 er stærkest forbundet med frimodighed adfærd. Fordi aggression og dristighed adfærd ikke er repræsenteret ved den samme komponent, kan det konkluderes, at der er fraværet af en dristighed-aggression adfærdsmæssige syndrom (dristighed vektorer er nogenlunde vinkelret på aggression vektorer). Desuden er disse adfærdsmønstre påvirkes ikke af sex, fordi fordelingen mønster er det samme mellem mænd og kvinder. At observere hvis dristighed eller aggression adfærd er forbundet med shoaling, de udpakkede regression scores for hver fisk er corropstemt med fiskens SoS måling. Det er vigtigt at sikre, at eventuelle korrelerende komponenter faktisk beskriver en fortolkelige sæt af adfærd. Hvis der er høje absolutte værdi Spearman korrelationer mellem nogen komponent og den shoaling måling, så en shoaling adfærdssyndrom er til stede. Uanset de konkrete resultater, er det vigtigt at give mulige biologiske fortolkninger til alle observationer. Repræsentative resultater er fastsat en beskrivelse af en dristighed-shoaling adfærdsmæssige syndrom (tabel 3) 14. Mens data præsenteret repræsenterer typiske resultater for zebrafisk, bør de ikke fortolkes som målinger af datakvaliteten. Der er flere grunde til, at de data, vil se anderledes på tværs af forskellige eksperimenter, såsom arter eller population forskelle.
Figur 1. Foreslåetworkflow for en dristighed, aggression, og shoaling adfærdsmæssige syndromer eksperiment. Typiske målinger er angivet for hver analyse. En oversigt over hvordan man analyserer analyserne individuelt og derefter hvordan man kan integrere analyserne er også opført. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative resultater af en PCA indikerer, at en dristighed-aggression adfærdssyndrom er fraværende. De røde vektorer indikerer adfærd, der bidrager til de indgående scorer (venstre og nederste akser), og punkterne repræsenterer individuelle scores langs hver komponent (højre og top akser ). Hannerne er repræsenteret ved blå punkter og hunner er repræsenteret af grønne point. Bemærk, at "uregelmæssig adfærd" refererer til »dart 'og"aggression rate" kan beregnes ved at addere antallet af bid og laterale skærme divideret med den samlede tid interagere med spejlet. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Overgange | Latency | dart | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Surface Time | 0,65 | <0,001 * | -0,68 | <0,001 * | 0,42 | 0,007 * |
| Overgange | -0,40 | 0,012 * | 0,33 | 0,041 * | ||
| Latency | -0,47 | 0,002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabel 1:. Dristighed Spearman rang korrelationer i en roman akvarium assay Denne tabel var blevet ændret fra Way et al, 2015..
| Lateral Displays | dart | Mirror Time | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| bites | 0,69 | <0,001 * | -0,10 | 0,547 | 0,63 | <0,001 * |
| Lateral skærme | -0,06 | 0,735 | 0,66 | <0,001 * | ||
| dart | -0,18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabel 2:. Aggression Spearman rang korrelationer i en roman akvarium assay Denne tabel var blevet ændret fra Way et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| PCA Components | ||
| dristighed | 0,339 | 0,035 * |
| Aggression | 0,075 | 0,65 |
| Dart | -0,012 | 0,944 |
T abel 3:. Brug af PCA komponenter til at bekræfte tilstedeværelsen af en shoaling og dristighed adfærdsmæssige syndrom til stede i denne population Denne tabel var blevet ændret fra Way et al, 2015..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen vil afgøre, om der er konsistente foreninger i dristighed, aggression og shoaling adfærd i zebrafisk. Hvis der er konsistente sammenslutninger i en given population mellem nogen af disse adfærdsmønstre, derefter en adfærdsmæssig syndrom er til stede. Ved at studere en befolkning naturlige adfærdsmæssige syndrom, kan forskerne få en mere fuldstændig forståelse af dens adfærdsmæssige dynamik, befolkning struktur, og muligvis evolutionære historie 3. Desuden manipulere miljøet, der påvirker disse adfærdsmæssige syndromer, ligesom i farmakologi 6, toksikologi 7, adfærdsmæssige genetik 8,9, og endokrinologi 10 studier, kan kaste lys over, hvordan forskellige faktorer kan påvirke adfærdsmæssige foreninger. Den specifikke sammensætning af aggression-dristighed-shoaling adfærdsmæssige syndrom findes i denne protokol omfatter fælles adfærd godt undersøgt i modellen organisme zebrafisk 11-13. Mens denne metodekan anvendes til enhver fiskearter, kan den brede ansøgning om at bruge zebrafisk hjælpe med den tværfaglige standardisering af denne protokol. Hver ovenfor beskrevne assay kan lettere kontrolleres og manipuleres end andre sammenlignelige teknikker. For eksempel aggression assayet anvender den skrå spejl til at fremkalde en bredere vifte af aggression responser snarere end at bruge en levende eller ler model, video stimulus, eller lodret spejlbillede stimulus 17. Den adfærd målt i dristighed assay lettere kvantificeres end i en t-labyrint eller store åbne field test 15. Endelig beskrev shoaling analysen kan nemt spore en person, som er afgørende for at studere adfærdsmæssige syndromer på det individuelle plan, og kan give mulighed for ubegrænsede kombinationer af target stimer at stille nye eksperimentelle spørgsmål. Mens denne protokol kan ændres til at rumme en række adfærdsmæssige spørgsmål, kan standardisering af det føre til en indsigt i, hvordan DNA, cellulære mekanismes, cellulære udvikling, og indførte kemikalier kan påvirke individuelle og befolkningens adfærdsmæssige syndromer.
For at være sikker på, at de observerede foreninger er sande, skal protokollen følges nøje. For det meste, protokollen kan ændres afhængigt af de særlige hypotese; Men der er flere trin, der skal udføres for at sikre tillid til resultaterne. For det første er det vigtigt, at de personer, huses i et passende tank, ved optimale betingelser (se protokol) og fodres korrekt. De vandforhold skal være konsekvent i boliger reoler, akklimatisering kampvogne og test tanke. Hvis vandet ikke er i overensstemmelse, vil fisken tager længere tid at akklimatisere sig til de betingelser, og de adfærdsmæssige målinger vil ikke fanges korrekt. Det er også vigtigt, at vand recirkuleres mellem dristighed og aggression tanke, så kunstige lugte ikke gennemføres over mellem analyser. For det andet er det af yderste vigtighed, at alle Behaviors bedømmes korrekt. For at sikre dette, er alle assays videofilmet at muliggøre flere viewings, og i flere uddannelsesmuligheder. En enkelt uddannet målscorer kan præcist måle fiskenes adfærd, men uddannelse tager tid. Hvis en omhyggelig træningsperiode ignoreres, derefter tillid til resultaterne af den adfærdsmæssige undersøgelse er lav. En omhyggelig undersøgelse med lave stikprøvestørrelser udføres af en veluddannet iagttager er mere kraftfuld end et studie med høj stikprøvestørrelse udføres af en dårligt uddannet observatør. Endelig kvalitetskontrol af de indsamlede data er også kritisk. De skridt, der er taget for at randomisere enkeltpersoner, og fjern bias bør resultere i anvendelige, pålidelige data, og data transformationer anbefales til forbehandling i henhold til den specifikke statistisk test (se protokol). Hvis disse trin ikke er omhyggeligt udført, kan produktionen af analyserne ikke være pålideligt fortolkelige.
Som tidligere nævnt, at teknikken er stærkt modificerbare according til de specifikke afprøve hypoteser. Der findes andre adfærdsmæssige målinger, som kan undersøges for at være relateret i en adfærdsmæssig syndrom blandt en række forskellige fiskearter 39-41. Mens læresætninger protokollen forbliver de samme, kan de specifikke spørgsmål let ændret for at tillade forskellige hypotese test. For eksempel kan en forsker bruge den førnævnte protokol til at teste for tilstedeværelsen af en aggression og udforskende aktivitet adfærdsmæssige syndrom i zebracichlider (Amatitlania nigrofasciata). Spørgsmålet er beslægtet, men undersøgelsen organisme er forskellig fra den beskrevet af protokollen. Imidlertid er de generelle trin er stort set den samme. Enkeltpersoner skal blive randomiseret og spores gennem en række analyser, med Akklimatiseringsperioden i mellem analyser, skal vandet være konsekvent og frisk, og videnskabsmand skal være ordentligt uddannet. En væsentlig forskel er den adfærd, der bliver målt sandsynligvis ændre sig i henhold til den specifikkefic assay, og de adfærdsmæssige foreninger kan ændres i henhold til de specifikke arter og oprindelige miljø.
Begrænsningerne i protokollen er knyttet til nogle af de traditionelle usikkerheder adfærdsmæssige undersøgelser. Specielt hvis analyserne er scoret unreliably så er det sandsynligt de fortolkninger af resultaterne er fejlagtige, og det ville være vanskeligt at identificere denne fejl. For at overvinde denne begrænsning, er det muligt, at to veluddannede scorer observere adfærd. For at vurdere deres pålidelighed, beregne intraclass korrelationskoefficienter på målinger anvendes på samme fisk, og om nødvendigt, justeres for forskelle. Alternativt, hvis tilgængelig, automatisk tracking software som Ethovision kan gennemføres og valideret af en veluddannet observatør til at øge throughput og nøjagtighed 42. Desuden er der forskellige mulige fortolkninger vedrørende navngivning og scoring af "dristighed" adfærd. andre undersøgelserhar kaldt opførslen beskrevet 43 og andre har beskrevet den adfærd som "sonderende" 44,45. I vores arbejde adfærden blev beskrevet som "dristighed", som det var at måle adfærd i et miljø ukendte for den fokale individ. Men mens udtrykket kan være genstand for alternative fortolkninger, dette påvirker ikke den protokol eller analysen. Derudover, mens vi forventer målinger inden dristighed og aggression assays at være stærkt korreleret i en population, der sandsynligvis vil være nogle tilfælde af lav til ingen korrelation af nogle former for adfærd. Denne begrænsning er overvundet af styrken af partnerskabs- og samarbejdsaftalen, fordi det nøgler i på vigtige kilder til variabilitet, og selv om målinger ikke er korrelerede, vil analysen udtrække adfærdsmæssige variation konsekvent i de indsamlede data. Endelig som det er tilfældet med alle videnskabelige metoder, hvis protokollen universelt vedtages og er konsekvent udføres af flere laboratorier, og der er en visuforudset, ikke målt confounding indført ved protokollen, så dette potentiale skadelig element fortsætter i litteraturen, og det bliver svært at afmontere. Farmakologisk bekræfter, at et repræsentativt sæt analyser fremkalde den tilsigtede adfærdsmæssige reaktion kræver en mere grundig forståelse af adfærdsmæssige, neurologiske og hormonelle reaktioner. Adfærdsmæssige syndromer kan hjælpe med at forklare grundlaget for adfærd, men dette laboratorium begrænsning kan være i stand til at være mere regelmæssigt behandlet i fremtidige studier. Ikke desto mindre har resultater blevet forudsat at validerer brugen af denne protokol i zebrafisk, og, med ordentlig modifikationer, kan protokollen udvides til en række hypoteser i en række forskellige fiskearter. Ved omhyggeligt at følge en detaljeret protokol for huset, udvælgelse og afprøvning af forskellige adfærdsmæssigt parametre vil gøre det muligt for forskerne at gøre mere specifikke sammenligninger på tværs af en bred vifte af undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
