Abstract
Una sindrome comportamentale esiste quando specifici comportamenti interagiscono in diversi contesti. Zebrafish sono stati soggetti di prova in studi recenti ed è importante standardizzare protocolli per garantire analisi adeguate e interpretazioni. Nei nostri studi precedenti, abbiamo misurato coraggio monitorando una serie di comportamenti (tempo in prossimità della superficie, la latenza nelle transizioni, numero di transizioni, e freccette) in una vasca trapezoidale 1.5 L. Allo stesso modo, abbiamo quantificato l'aggressione da punture di osservazione, display laterali, freccette, e il tempo vicino a uno specchio inclinato in una forma rettangolare serbatoio 19 l. Dividendo un serbatoio di 76 L in tre parti, abbiamo anche esaminato le preferenze shoaling. Il saggio shoaling è un test altamente personalizzabile e può essere adattata per specifiche ipotesi. Tuttavia, protocolli per questo test anche devono essere standardizzati, però sufficientemente flessibile per la personalizzazione. In studi precedenti, camere di testa erano o vuoto, conteneva 5 o 10 zebrafish, o 5 danios Pearl (D. albolineatus). Nel following manoscritto, vi presentiamo un protocollo dettagliato e dati rappresentativi che accompagnano applicazioni di successo del protocollo, che permetterà per la replica degli esperimenti sindrome comportamentale.
Introduction
Vi è un crescente corpo di letteratura indagare le associazioni tra comportamenti distinti all'interno dei singoli animali da una data popolazione. Queste associazioni sono denominate sindromi comportamentali, e le misure includono tipicamente coraggio, aggressività, comportamento esplorativo, e la socialità 1-5. sindromi comportamentali sono preziosi per ragioni sia diretti che indiretti. Direttamente, la conoscenza delle sindromi comportamentali in grado di fornire una visione più completa della teoria evoluzionistica, la struttura della popolazione, e la dinamica della popolazione 3. Indirettamente, la conoscenza per quanto riguarda le associazioni di comportamento può informare i campi che quantificano il comportamento, come la farmacologia 6, tossicologia 7, genetica comportamentale 8,9, ed endocrinologia 10. A causa di questi benefici diretti e indiretti, una maggiore conoscenza delle sindromi comportamentali è particolarmente importante in organismi modello di uso comune come il pesce zebra. Gli studi che utilizzano zebrafish si trovano ina varietà di discipline, tra cui l'analisi delle sindromi comportamentali 11-13. Per progredire le conoscenze nel campo della ricerca sindrome comportamentale, e perché altre discipline usano anche misure comportamentali per la verifica di ipotesi, sono necessarie descrizioni affidabili e succinte di comportamento per le analisi e interpretazioni validi e protocolli standardizzati faciliterà il confronto inter-studio all'interno delle specie. Il nostro protocollo è stato sviluppato per misurare una sindrome comportamentale audacia-aggressione-shoaling in una popolazione di zebrafish laboratorio-allevati 14. Tuttavia, in base al protocollo (monitoraggio singoli pesci, garantire una corretta randomizzazione, e le analisi del caso) può essere facilmente modificato per una serie di misure comportamentali alternativi. Inoltre, saggi di audacia, aggressione, o shoaling possono essere eseguiti singolarmente per la verifica delle ipotesi distinte. Pertanto, mentre è il nostro obiettivo di descrivere come condurre uno studio sindrome comportamentale e il protocollo per il successo l individualela misurazione del comportamento evel, ogni aspetto di questa procedura può stare da solo.
La letteratura sulle sindromi comportamentali estende su diversi gruppi tassonomici, da artropodi all'uomo 4 e, per misurare una sindrome comportamentale, almeno due contesti comportamentali devono essere quantificati. Purtroppo, vi è spesso scarsa coerenza nei saggi che vengono utilizzati per quantificare la misura del comportamento di tutti gli assi di comportamento. Ad esempio, nel pesce, l'audacia può essere misurata mediante saggi T-labirinto, test in campo aperto, o l'introduzione di un romanzo o di stimolo stranieri 15. Studi aggressione nei pesci potrebbero comportare interazioni diade, saggi video di stimolo, o saggi modello in creta 12,16,17. Analogamente, l'analisi del comportamento shoaling, che in genere comporta la misurazione di preferenza shoalmate, può essere eseguita in diversi tipi di serbatoi, con metodi differenti per determinare il tempo sezione 21-23. In questo protocollo un sottogruppo specifico del overall comportamento saggio repertorio è presentato. In particolare, questo protocollo presenta una metodologia per monitorare gli individui attraverso l'audacia, l'aggressività, e saggi shoaling in modo da facilitare il confronto all'interno di individui per determinare se i confronti sono coerenti in tutti gli individui all'interno di una popolazione. Abbiamo effettuato questo protocollo con zebrafish e amatitlania nigrofasciata (Amatitlania nigrofasciata) in studi precedenti 14,18, e funzionerà con tutti i pesci d'acqua dolce di dimensioni simili.
saggi Boldness sono condotti in un serbatoio trapezoidale 1,5 L che ha una linea orizzontale che delimita aree uguali dimensioni in porzioni superiore e inferiore del serbatoio. comportamenti quantificati includono il numero di transizioni dal pesce di prova tra la parte superiore e inferiore del serbatoio, il tempo trascorso in ciascuna porzione, il numero di freccette, e la latenza di entrare nella porzione superiore. Il dosaggio aggressione avviene in una vasca rettangolare 19L che comprendeuno specchio 3 pollici x 5 pollici inclinato di circa 22 ° situato nell'angolo in basso a sinistra della vasca 19. Comportamenti quantificati comprendono la quantità totale di tempo trascorso dai pesci bersaglio interagire con lo specchio 20, insieme a specifici indicatori aggressivi - il numero di punture, schermi laterali, freccette tra i pesci di prova e il suo riflesso. Per questi indicatori specifici, punture sono definiti come affondi rapidi verso lo specchio con una bocca aperta, schermi laterali sono definiti come la svasatura di alette laterali, pettorali, anale e dorsale nella direzione dello specchio, e freccette eventuali movimenti erratici che sono non diretto verso lo specchio. Infine, il saggio shoaling quantifica il comportamento di un pesce di prova nel centro della camera di un serbatoio tri-incamerata. Le camere laterali della vasca sono vuote, o contengono una "target banco" di pesce, e il momento in cui il pesce di prova passa in prossimità di ogni camera laterale viene misurata 21-23. Un unico punteggio composito, denominato Strength di shoaling (SOS), viene calcolato per ogni pesce singolo test, specifico agli stimoli, e può essere usato in analisi valle 14. Tutti i comportamenti sono segnati da un unico spettatore, o più spettatori del software gratuito quantificazione del comportamento noto come JWatcher 24.
Verifica la presenza di una sindrome comportamentale è in primo luogo uno sforzo statistico, e si consiglia di seguire le linee guida così come presentato dal Budeav 2010 25. In particolare, si consiglia di eseguire una analisi delle componenti principali (PCA) in data centrati e normati in cui il gli ingressi sono i vettori di comportamenti di un individuo in analisi con più misure comportamentali (ad esempio, l'audacia e l'aggressione). Il PCA, eseguita su una matrice di correlazione, riduce la dimensionalità delle misure comportamentali, ed estrae quindi la conoscenza più importante che spiega la maggioranza della variazione. I componenti estratti possono quindi essere interpretate based in alti carichi di fattore per il comportamento individuale di interesse e di regressione colonne possono essere estratte per ogni individuo sulla base dei componenti esplicativi. Questi punteggi di regressione possono poi essere confrontati alla misurazione SoS e altre varie misurazioni non-comportamentali come la dimensione del pesce o il sesso.
Questo flusso di lavoro è stato implementato in uno studio delle sindromi comportamentali zebrafish in cui è stato scoperto una sindrome comportamentale specifica il sesso che esiste tra audacia e shoaling 14. In questa situazione, più audaci maschi zebrafish sono più propensi ad associare con, specie più aggressiva grandi (D. albolineatus), ma questa associazione si perde nelle femmine. Questo flusso di lavoro è stata implementata anche in uno studio di giovane detenuto parente ciclidi (Amatitlania nigrofasciata) 18, in cui una sindrome comportamentale non è stato scoperto, potenzialmente indicando la plasticità comportamentale della specie. Pertanto, il seguente protocollo è presentato wesimo un obiettivo di delineare la natura dei tre saggi specifici (coraggio, aggressività, e shoaling) nel quadro di studiare una sindrome comportamentale livello individuale.
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Protocol
Le seguenti metodologie per la custodia, la cura e lo studio di zebrafish sono stati approvati dal di San Giuseppe Università IACUC.
1. Zebrafish alloggio e cure
- Ottenere il pesce zebra soggetto da un fornitore locale, o da popolazioni catturati in natura. Si prega di notare che gli alloggi il pesce zebra è soggetto alle linee guida IACUC e permessi aggiuntivi sono necessari per abitazioni popolazioni catturati in natura.
- Identificare e zebrafish separata a seconda del sesso. In alternativa, saltare questo passaggio o sostituirlo con un diverso metodo di separazione basato sull'ipotesi di studio.
NOTA: caratteristiche sessuali sono difficili da determinare in zebrafish, soprattutto nelle femmine. Fare riferimento a queste linee guida 10 o manuali online utili per distinguere il sesso. - Casualmente separare le popolazioni ulteriormente nel rapporto appropriato di pesci focale allo stimolo di pesce. Nota: i pesci focale sono i soggetti del test hanno seguito attraverso la serie di behaviosaggi RAL, e pesce di stimolo sono le persone che occuperanno le camere di stimolo nei saggi di aggressione e shoaling.
NOTA: Tradizionalmente, tra 1 e 5 pesci di stimolo per i pesci focale nelle analisi shoaling e un 1: 1 di stimolo: sono utilizzati focale rapporto pesce in saggi aggressione 14,17. Tuttavia, il ricercatore ha bisogno di progettare specificamente allo studio con l'ipotesi in mente (ad esempio, dovrebbe stimolo pesce essere mantenuta costante per mantenere la coerenza nel comportamento dei pesci focale, o dovrebbe stimolo pesce essere ruotato tra ogni test per garantire una corretta randomizzazione). - Conservare tutti i pesci in rack abitative zebrafish (27,5-28,5 ° C) sotto un rigoroso 00:12 ciclo luce / buio. Nutrire tutti gli alimenti focale e di stimolo pesce fiocco giornaliera e settimanale artemie, nei giorni non di ricerca.
- Assicurarsi che tutti i test si fanno tra ZT1 e ZT5 (tempo zeitgeber) per evitare gli effetti del ritmo circadiano 26.
2. Installazione randomizzazione e serbatoio
- RAndomize tutti gli individui a priori una determinata sequenza di test comportamentali. Impostare uno schema di randomizzazione coerente utilizzando un generatore di sequenza casuale linea 27 o un generatore di sequenza casuale da un pacchetto software statistico (R).
- Etichetta ogni saggio 1-3 e mantenere questo incarico coerente. Assegnare una sequenza casuale di ogni individuo e mappare la sequenza secondo l'etichetta test comportamentale. Ad esempio, per tre saggi totali (1 mappati a shoaling, 2 mappato audacia, e 3 mappati per aggressione), un dato individuo può avere una sequenza randomizzata di '2,3,1', che richiederà loro di svolgere la specifica test comportamentali nella sequenza specificata.
- Impostare i serbatoi del test (coraggio, aggressività, e shoaling) in laboratorio in luoghi che riducano al minimo la possibilità di stimoli esterni negativi ed essere sicuri di avere abbastanza spazio per una videocamera per catturare l'intero serbatoio. Assicurarsi che la videocamera è enough chiarezza per visualizzare le etichette del serbatoio così come essere in grado di distinguere sottili comportamenti dei pesci focale e messa a punto la videocamera in questa posizione.
- Registra tutti i test comportamentali con la fotocamera mantenuto nella stessa posizione con una vista completa del serbatoio specificata per minimizzare le differenze indesiderate scoring comportamentale come risultato di registrazioni differenziali.
NOTA: Evitare di posizionare i serbatoi in aree soggette a traffico pesante e da porte come movimento e suono influenzerà il comportamento zebrafish. - Stabilire protocolli JWatcher unici 24 per aver eseguito ogni test comportamentale. Fare riferimento al manuale JWatcher per imparare a creare file master focali per assegnare i comportamenti a combinazioni di tasti e archivi di analisi focali per riassumere i dati raccolti.
NOTA: JWatcher è un software di punteggio comportamentale che permette di scoring comportamentale affidabile e ripetibile misura 24. - Definire un sistema di etichettatura per monitorare la data, il numero di pesci, e il numero di test per tutte le analisi del comportamento (ad esempio,'F5-B-123.115' che implica Pesce 5, saggio di audacia, dicembre 31, 2015) e l'etichetta all'esterno del serbatoio con del nastro in vista e nel fuoco della telecamera. Tenere e registrare queste informazioni in un quaderno di laboratorio per una rapida consultazione e controllo di qualità futuro.
- Impostare un serbatoio di acclimatazione che verrà utilizzato tra tutti i dosaggi e subito dopo gli individui sono rimossi dal rack custodia.
NOTA: I serbatoi di acclimatazione e serbatoi terminali sono piccoli acquari (40 cm x 20 cm x 25 cm) con ghiaia e un filtro che assomigliano da vicino il rack custodia. - Dopo che i test sono tutti completati, trasferire l'individuo in un serbatoio terminale separato che servirà come il serbatoio di destinazione finale per tutti gli individui focali utilizzate. Utilizzare un serbatoio che è grande abbastanza per ospitare un gruppo di individui per il resto delle loro vite (ad esempio, 25 litri).
NOTA: E 'molto importante per mantenere le temperature e le condizioni dell'acqua coerenti e simili Across tutti i serbatoi. Questo include l'alloggio, acclimatazione, e tutti i serbatoi di test.
3. Lo svolgimento del saggio Aggressione
- Eseguire il test aggressione in una vasca rettangolare 19 L misura 30 cm x 15 cm x 10 cm. Outfit il serbatoio in pareti opache esterne circostanti tre lati del serbatoio aggressione, lasciando il fronte esposto per la visualizzazione, per ridurre stimoli esterni indesiderati. Dividere il serbatoio con una marcatura esterna in quattro quadranti rettangolari uguali e fissare uno specchio permanente (con mastice silicone) all'interno del quadrante inferiore sinistro, inclinata di 22,5 ° formando un triangolo rettangolo contro all'estrema sinistra del serbatoio.
- Assicurarsi che la temperatura dell'acqua nel serbatoio serbatoio di acclimatazione e aggressività è a 2 ° C del rack custodia. Per farlo, hanno acqua fresca età pre-riscaldato a 27,5-28,5 ° C pronti ad aggiungere al serbatoio aggressione. Si prega di notare che è importante per cambiare l'acqua tra ogni test per eliminare ingiustificatistimoli olfattivi.
- Trasferimento, da cupping, un pesce focale dalla rastrelliera custodia ad un serbatoio acclimatazione separata dove sarà acclimatarsi per 10 min.
NOTA: E 'importante ridurre lo stimolo introdotte per il pesce attraverso un uso improprio. Individui di trasferimento come precedentemente descritto 27.- In particolare, manualmente e con attenzione inserire un piccolo, bicchiere di plastica trasparente nel serbatoio di interesse. Senza interrompere il pesce tanto quanto il trasferimento, utilizzando una rete, lentamente raccogliere il pesce nella tazza.
- Assicurarsi che la videocamera è pronta a registrare confermando che il serbatoio di dosaggio aggressione (vedi punto 3.1) è a fuoco e subito prima di trasferire l'individuo nel serbatoio aggressione, premere RECORD sul dispositivo. Trasferire il pesce focale tramite coppa dal serbatoio di acclimatazione al serbatoio aggressione.
NOTA: E 'importante registrare prima che il pesce entrare nel serbatoio di aggressione per monitorare l'ora esatta di entrata. - Registrare il AggrSerbatoio ESSIONE per 10 min e 30 sec e poi tazza il pesce focale dal serbatoio aggressioni nel serbatoio acclimatazione.
- Durante la visione della registrazione, attendere 30 secondi dopo che il pesce è stato introdotto al serbatoio come un periodo di acclimatazione supplementare prima comportamenti di punteggio.
- Utilizzando il sistema di punteggio JWatcher definito per comportamenti aggressivi, quantificare i seguenti comportamenti per 10 minuti: tempo trascorso vicino a specchio, serie di approcci specchio, il numero di freccette, il numero di tentativi di morsi (apertura della bocca in direzione dello specchio), e il numero di schermi laterali (dorsale, pettorali, anale e caudale erezione fin) 9.
- Segna un singolo test aggressione almeno due volte, fino a quando il test viene segnato con alto accordo tra le iterazioni.
4. L'esecuzione L'audacia Assay
- Effettuare il test coraggio in un piccolo serbatoio trapezoidale 1.5 L, che misura 15 cm di altezza x 26,5 centimetri sopra x 22,5 cm di larghezza inferiore x 6 cm. Avvolgere carta opaca su tutti i lati of serbatoio ma lasciare il fronte esposto per la visualizzazione. Posizionare un unico pezzo sottile di nastro esterna al serbatoio per delimitare all'inizio dalla parte inferiore del serbatoio.
- Garantire che la temperatura dell'acqua nel serbatoio coraggio è a 2 ° C del rack dell'alloggiamento (vedi punto 3.2)
- Trasferire il pesce focale dal rack custodia al serbatoio acclimatazione (vedi punto 3.3) e lasciare acclimatare per 10 min.
- Assicurarsi che la videocamera è pronta a registrare il test audacia e, una volta pronti a trasferire il pesce focale, premere RECORD sul dispositivo. Trasferire il pesce focale dal serbatoio di acclimatazione al serbatoio audacia e record per 8 min e 30 sec.
- Quando si guarda la registrazione, consentire un ulteriore periodo di acclimatazione 30 sec dopo il pesce viene introdotto nel serbatoio prima di punteggio.
- Utilizzando il software JWatcher, quantificare i comportamenti audacia per 8 min. In particolare, quantificare i seguenti comportamenti: Tempo vicino alla superficie, la latenza di entrare parte superiore, il numero di Transitions nella parte superiore, e il numero di movimenti erratici (freccette) 29.
- Segna un singolo test audacia almeno due volte, fino a quando il test viene segnato con alto accordo tra le iterazioni.
5. L'esecuzione del saggio shoaling
- Effettuare il test shoaling in un serbatoio 76 L che ha tre scomparti divisi da due divisori di vetro sigillate con mastice siliconico (conseguenti tre scomparti sono costituiti da due zone di stimolo e uno scomparto focale). Esternamente, segnare due zone di preferenza designati 6.35 cm da ciascuno dei divisori in vetro delle zone di stimolo ", indicativo di due lunghezze corpo 30. Applicare pareti opache esternamente attorno a tre lati del serbatoio shoaling, ma lasciare il fronte esposto per la visualizzazione.
NOTA: Questa zona preferenza può essere personalizzato per verificare ipotesi specifiche per le specie di dimensioni diverse. - A seconda della natura dello studio, selezionare banchi stimolo per acclimatare per almeno 12 ore before testare e rimanere nel serbatoio shoaling tutto il corso dell'esperimento.
NOTA: banchi di stimolo sono raccolte di singoli pesci che vengono utilizzati per valutare come il pesce focale si comporta in presenza o in assenza di questi banchi. Diverse combinazioni di stimolo del banco possono essere selezionati per testare una serie di diverse ipotesi shoaling. Assicurarsi che i banchi di stimolo sono ruotati tra ogni zona di stimolo per evitare distorsioni lato e sono anche permesso di acclimatare per almeno 12 ore prima del test. - Trasferire il pesce focale nel serbatoio acclimatazione come descritto in precedenza (vedi punto 3.3)
- Trasferimento, da cupping, il pesce focale dal serbatoio acclimatazione intermedio al compartimento centrale nel serbatoio shoaling.
- Lasciare per un periodo di acclimatazione 10 minuti prima di un periodo di osservazione dal vivo di punteggio 10 min. In alternativa, registrare i saggi shoaling e segnare in seguito utilizzando JWatcher. I pesci sono determinato a essere shoaling quando sono all'interno della zona di preferenza nella cameraospita il banco di destinazione.
- Quantificare il tempo trascorso in ogni zona preferenza e il tempo trascorso nel volume centrale.
- Come misura descrittivo, il calcolo 'la forza di shoaling' (SOS). Assegnare un valore compreso tra -1 e +1 in cui la grandezza descrive come spesso un individuo banchi di pesci.
- Calcolare il rapporto fra tempo dedicato shoaling divisa per l'area delle zone shoaling e sottrarre la proporzione di tempo trascorso non shoaling e l'area delle zone non shoaling. Inserire questa quantità rispetto alla somma del tempo trascorso in ciascuna zona divisa per il volume di ogni singola zona. Maggiori informazioni su questo calcolo può essere trovato in uno studio precedente 14.
6. Controllo di qualità dei dati
- Analizzare i dati utilizzando i dati tradizionali strumenti di analisi 31-32.
- Test per l'omogeneità della varianza con il test non parametrico di Levene per tutti i comportamenti. Se un comportamento è non omogenea effettuare un log-trasformazione33.
- Verificare che non vi sono effetti sequenza (ad esempio, che l'ordine randomizzazione non ha influenzato il comportamento degli individui) utilizzando un Kruskal-Wallis ANOVA sui dati omogenei 34.
- Verificare che non vi siano pregiudizi laterali per il dosaggio shoaling creando modelli lineari generali univariati su indici sos con lato come un fattore fisso 35.
NOTA: Se non ci sono poco o nessun problema con i dati, le analisi possono essere condotte a valle. Se ci sono problemi, riconciliarsi con le trasformazioni aggiuntive, razionalizzare con spiegazioni biologicamente plausibile, e / o aumentare le dimensioni del campione.
7. Analisi dei dati
- Calcolare a due code di Spearman correlazioni 36 per tutti i comportamenti a parte all'interno dei saggi audacia e aggressione.
- Calcolare i coefficienti di correlazione intraclasse (ICC) come un modello misto a due vie con coerenza per i test comportamentali che sono stati condotti più di un time per un dato individuo 36. In questo contesto, la Corte penale internazionale è una misura di quanto costantemente un pesce comportato in un determinato dosaggio misurato più di una volta.
- Pre-elaborazione audacia e aggressione comportamenti di centraggio e norming tutti i comportamenti di prepararsi per l'ingresso ad una analisi delle componenti principali (PCA) 25.
NOTA: Pre-elaborazione delle misure per la centratura e norming è un passo fondamentale. Senza questa pre-elaborazione comportamenti passo che si verificano con maggiore frequenza e più variabile sarà eccessivamente influenzare le interpretazioni dei componenti estratti. Il processo di centraggio e norming rimuoverà questo pregiudizio. - Eseguire un PCA con una matrice di correlazione per determinare se l'audacia e l'aggressione sono collegati tra loro da una sindrome comportamentale. Interpretare carichi comportamentali di ogni significativa componente a> 0,6. Vedere Budaev 2010 24 per una guida completa per la segnalazione PCA per studi comportamentali. Un grafico decrescente sarà informativo su cui eigenvectors dovrebbero essere tenuti per l'interpretazione.
- Utilizzando software statistico, come R o SPSS 31,32, estrarre i punteggi per ogni componente per ogni individuo. Le colonne rappresentano quante comportamento dell'individuo proposta può essere spiegato dal componente particolare.
- Calcola Spearman correlazioni rango tra i punteggi di regressione dei fattori e la forza del shoaling 36.
NOTA: una sindrome comportamentale è considerato presente se audacia e aggressione comportamenti caricare sullo stesso componente o, se qualsiasi componente con notevoli carichi interpretabili si correla con la forza di shoaling. Si noti inoltre che la forza di shoaling non è incluso nel PCA per consentire una migliore interpretazione delle quantificazioni comportamentali più complessi (audacia e aggressività). La PCA si ortogonalmente crollare coraggio e aggressività caratteristiche in autovettori per massimizzare la quantità di variazione spiegata ed è adatto per queste misure complesse. Interpretazionela conseguente autovettori e regressione la nostra forza di misurazioni shoaling su ciascuno di loro dà un'interpretazione molto più intuitivo di come ciascuno dei comportamenti complessi (coraggio e aggressività) si riferiscono ad una misurazione shoaling binario più ben definito (ad esempio, il pesce è shoaling o non shoaling).
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Representative Results
A seconda della natura dello studio e protocollo specifico impiegato, diversi risultati distinte sono possibili in un esperimento sindromi comportamentale. Le tabelle e le figure, nei casi indicati di seguito, sono adattati dal nostro precedente studio pubblicato sulla rivista Behavioural Processes 14 e la rivista Zebrafish 17. Quando la proposta (come descritto sopra) è condotta nella sua interezza, due serie di risultati, 'entro correlazioni dosaggio' e 'tra correlazioni dosaggio,' sono attesi (Figura 1).
La prima serie di risultati descrive all'interno consistenza dosaggio. In particolare, i risultati descrivono come i comportamenti sono correlati tra loro all'interno del saggio audacia e la all'interno del saggio aggressione separatamente. Tabelle 1 e 2 descrivono ciò che queste correlazioni dovrebbe essere simile per l'audacia e agsaggi di progressione ei dati presentati sono adattati da uno studio precedente 14. Per il saggio coraggio, si prevede che il numero di transizioni e il tempo trascorso nella porzione superiore del serbatoio sono positivamente correlati, ma la latenza di entrare nella porzione superiore è correlato negativamente. Risultati rappresentativi per individui misurati sull'asse coraggio del comportamento nel serbatoio coraggio (vedi punto 4.1) sono riportati nella tabella 1. Per il saggio aggressione, si prevede che morsi, schermi laterali, e il tempo trascorso vicino allo specchio sono tutti correlati. Risultati rappresentativi per individui misurati sull'asse aggressione di comportamento nel serbatoio aggressione (vedi punto 3.1) sono riportati nella tabella 2. Freccette solito non sono correlate con comportamento aggressivo anche se, in alcuni casi, i pesci non aggressivi tendono a dardo (quindi una correlazione negativa ). Infine, una forza di misura shoaling (SOS) per il saggio shoaling fornisce una misura-livello individuale di shoaling tendency. Shoaling è un comportamento altamente ripetibile attraverso una varietà di saggi shoaling misurati con SoS (ICC = 0,641) 14 e molti dei nostri studi precedenti hanno confermato il comportamento shoaling in zebrafish 23,38. Dal momento che tutti gli individui saranno misurati per ciascuno dei comportamenti, possiamo calcolare le correlazioni Spearman attraverso questi comportamenti e si aspettano alcuni comportamenti per essere correlati, come identificato per zebrafish nei risultati rappresentativi.
La seconda porzione dei risultati accerta la presenza di una sindrome comportamentale. I risultati dell'analisi integrativa di tutti i comportamenti quantificati nei saggi di coraggio e aggressività comportamentale sono riassunti utilizzando un Analisi delle Componenti Principali (PCA). Ci dovrebbero essere due a quattro componenti interpretabili in base a carichi elevati per ogni comportamento. Se un singolo autovettore che spiega una buona parte della variazione comprende comportamenti sia dal un'audaciasaggi di aggressione d, quindi una sindrome comportamentale è stata osservata. Tuttavia, se i comportamenti di saggi coraggio e aggressività non si sovrappongano una singola autovettore, quindi lo studio non descrive una sindrome comportamentale. Risultati rappresentativi sono presentati per l'assenza di una sindrome comportamentale coraggio aggressione (Figura 2). In questo esempio, il componente 1 è più fortemente rappresentativo di comportamenti di aggressione mentre componente 2 è più fortemente associato con comportamenti audacia. Poiché i comportamenti aggressione e coraggio non sono rappresentati dallo stesso componente, si può concludere che non vi è l'assenza di una sindrome comportamentale coraggio aggressione (vettori audacia sono approssimativamente ortogonale vettori aggressione). Inoltre, questi comportamenti non sono influenzate dal sesso perché il modello di distribuzione è la stessa tra maschi e femmine. Per osservare se i comportamenti audacia o aggressione sono associati con shoaling, i punteggi di regressione estratte per ogni pesce sono corresaltato con la misura SOS del pesce. È importante garantire che tutti i componenti di correlazione sono effettivamente descrivendo un insieme interpretabile di comportamenti. Se ci sono alte correlazioni assoluto valore Spearman tra qualsiasi componente e la misurazione shoaling, quindi una sindrome comportamentale shoaling è presente. Indipendentemente dai risultati specifici, è importante fornire interpretazioni biologiche possibili per tutte le osservazioni. I risultati rappresentativi sono forniti per la descrizione di un coraggio-shoaling sindrome comportamentale (Tabella 3) 14. Mentre i dati presentati rappresentano risultati tipici per zebrafish, non dovrebbero essere interpretate come misure della qualità dei dati. Ci sono diversi motivi per cui i dati avrà un aspetto diverso in diversi esperimenti, come specie o le differenze di popolazione.
Figura 1. Propostaflusso di lavoro per un coraggio, aggressività, e shoaling esperimento sindromi comportamentali. misurazioni tipici sono elencati per ogni dosaggio. Una descrizione di come analizzare i test individualmente e poi come integrare le analisi è anche elencato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Risultati rappresentativi di un PCA che indicano che una sindrome comportamentale coraggio aggressione è assente. I vettori rossi indicano i comportamenti che contribuiscono ai punteggi dei componenti (assi a sinistra e in basso) ei punti rappresentano punteggi individuali lungo ciascun componente (asse destra e dall'alto ). I maschi sono rappresentati da punti blu e femmine sono rappresentati da punti verdi. Si noti che 'il comportamento irregolare' fare riferimento a 'freccette' e'tasso di aggressione' può essere calcolato sommando il numero di morsi e display laterali diviso per il tempo totale di interagire con lo specchio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| transizioni | Latenza | Freccette | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Tempo di superficie | 0.65 | <0,001 * | -0.68 | <0,001 * | 0.42 | 0.007 * |
| transizioni | -0.40 | 0.012 * | 0,33 | 0.041 * | ||
| Latenza | -0.47 | 0.002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabella 1:. Audacia Spearman correlazioni rango in un saggio romanzo serbatoio Questo tavolo era stato modificato da Way et al 2015..
| Displays laterali | Freccette | Specchio Tempo | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| morsi | 0.69 | <0,001 * | -0.10 | 0,547 | 0.63 | <0.001 * |
| schermi laterali | -0.06 | 0,735 | 0.66 | <0,001 * | ||
| Freccette | -0.18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabella 2:. Aggressione Spearman correlazioni rango in un saggio romanzo serbatoio Questo tavolo era stato modificato da Way et al 2015..
| ᴩ | p | |
| Componenti PCA | ||
| Audacia | 0,339 | 0.035 * |
| Aggressione | 0.075 | 0.65 |
| Dardo | -0,012 | 0,944 |
T grado 3:. Usando i componenti PCA per confermare la presenza di una sindrome comportamentale shoaling e coraggio presente in questa popolazione Questa tabella era stato modificato da Way et al 2015..
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Discussion
Il protocollo determinerà se ci sono associazioni coerenti in coraggio, aggressività e comportamenti shoaling in zebrafish. Se vi sono associazioni consistenti in una data popolazione tra uno di questi comportamenti, quindi una sindrome comportamentale è presente. Studiando sindrome comportamentale naturale di una popolazione, i ricercatori possono avere una comprensione più completa della sua dinamica comportamentale, struttura della popolazione, e la storia evolutiva possibilmente 3. Inoltre, manipolando l'ambiente che colpisce queste sindromi comportamentali, come in farmacologia 6, tossicologia 7, genetica comportamentale 8,9, e endocrinologia 10 studi, in grado di far luce su come diversi fattori possono influire associazioni comportamentali. La composizione specifica della sindrome comportamentale aggressione-coraggio-shoaling trovato in questo protocollo comprende comportamenti comuni ben studiati nella organismo modello zebrafish 11-13. Mentre questa metodologiapuò essere applicato a qualsiasi specie di pesci, la vasta applicazione per l'utilizzo di zebrafish può aiutare con la standardizzazione interdisciplinare di questo protocollo. Ciascun test sopra descritto può essere facilmente controllata e manipolata rispetto ad altre tecniche analoghe. Ad esempio, il saggio aggressione utilizza lo specchio inclinato per suscitare una gamma più ampia di risposte aggressione piuttosto che utilizzare un modello dal vivo o argilla, il video stimolo, o immagine specchio verticale stimolo 17. I comportamenti misurati in test audacia sono più facilmente quantificabili rispetto a una t-labirinto o test di grande campo aperto 15. Infine, il test shoaling descritto può facilmente monitorare un individuo, che è essenziale per lo studio sindromi comportamentali a livello individuale, e può consentire combinazioni illimitate di banchi di destinazione per porre nuove domande sperimentali. Anche se questo protocollo può essere modificato per accogliere una serie di domande comportamentali, la standardizzazione di esso può portare ad una visione più su come il DNA, meccanismo cellulares, sviluppo cellulare, e introdotte sostanze chimiche possono influenzare sindromi comportamentali individuali e di popolazione.
Per essere sicuri che le associazioni osservate sono vere, il protocollo deve essere seguita con attenzione. Per la maggior parte, il protocollo è modificabile secondo l'ipotesi specifica; tuttavia, ci sono diversi passaggi che devono essere eseguite per assicurare la fiducia nei risultati. In primo luogo, è importante che gli individui sono alloggiati in un apposito serbatoio, in condizioni ottimali (vedi protocollo) e sono alimentati correttamente. Le condizioni dell'acqua devono essere coerenti in rack abitazioni, serbatoi di acclimatazione, e serbatoi di prova. Se l'acqua non è coerente, il pesce ci vorrà più tempo per acclimatarsi alle condizioni, e le misure comportamentali non saranno correttamente catturata. E 'anche importante che l'acqua viene riciclata tra serbatoi coraggio e aggressività modo che gli odori artificiali non vengono riportati tra saggi. In secondo luogo, è della massima importanza che tutti BehavIORS sono segnati in modo corretto. Per garantire questo, tutti i saggi sono videoregistrate per consentire visioni multiple, e per diversi opportunità di formazione. Un singolo marcatore addestrato può misurare con precisione il comportamento dei pesci, ma la formazione fa prendere un po 'di tempo. Se un periodo di formazione attenta viene ignorato, allora la fiducia dei risultati dello studio comportamentale è basso. Uno studio attento con i formati bassi a campione eseguite da un osservatore ben addestrato è più potente di uno studio con la dimensione elevata del campione eseguito da un osservatore poco preparato. Infine, il controllo della qualità dei dati raccolti è anche critico. Le misure che vengono prese per randomizzare individui, e rimuovere pregiudizi dovrebbe portare a dati utilizzabili, affidabile, e le trasformazioni dei dati sono raccomandati per pre-elaborazione secondo il test statistico specifico (vedi protocollo). Se questi passaggi non sono accuratamente fatto, l'uscita delle analisi può non essere affidabile interpretabile.
Come accennato in precedenza, la tecnica è Accordi pesantemente modificabileng alle specifiche ipotesi di prova. Esistono altre misure comportamentali che possono essere studiati per essere legati in una sindrome comportamentale tra un certo numero di diverse specie di pesci 39-41. Mentre i principi del protocollo rimangono gli stessi, le domande specifiche possono essere facilmente modificati per consentire la verifica di ipotesi diverse. Ad esempio, un ricercatore può utilizzare il protocollo di cui sopra per verificare la presenza di un'aggressione e l'attività esplorativa sindrome comportamentale in amatitlania nigrofasciata (Amatitlania nigrofasciata). La domanda è correlata, ma l'organismo studio è diversa da quella descritta dal protocollo. Tuttavia, i passaggi generali rimangono in gran parte la stessa. Gli individui devono essere randomizzati e monitorati attraverso una serie di test, con periodi di acclimatazione in mezzo saggi, l'acqua deve essere coerente e fresco, e lo scienziato devono essere adeguatamente formati. Una differenza importante è i comportamenti che vengono misurate possono cambiare a seconda della specisaggio fic, e le associazioni di comportamento possono cambiare a seconda delle specie specifiche e l'ambiente originale.
Le limitazioni del protocollo sono collegati con alcune delle incertezze tradizionali di studi comportamentali. In particolare, se i test sono segnati inaffidabile, allora è probabile che le interpretazioni dei risultati sono erronee, e sarebbe difficile identificare questo errore. Per superare questa limitazione, è possibile che due marcatori ben addestrati osservano comportamenti. Per valutare la loro affidabilità, calcolare i coefficienti di correlazione intraclasse sulle misure applicate sullo stesso pesce, e, se necessario, regolare le differenze. In alternativa, se disponibile, il software automatico di monitoraggio come Ethovision può essere implementato e convalidato da un osservatore ben addestrato per aumentare la produttività e la precisione 42. Inoltre, ci sono diverse interpretazioni possibili per quanto riguarda la denominazione e il punteggio dei comportamenti "franchezza". altri studihanno definito il comportamento descritto 43 e altri hanno descritto il comportamento come "esplorativo" 44,45. Nel nostro lavoro il comportamento è stato descritto come "coraggio", come veniva misurando il comportamento in un ambiente non familiare per l'individuo focale. Tuttavia, mentre il termine può essere soggetto a interpretazioni alternative, questo non pregiudica il protocollo o l'analisi. Inoltre, mentre ci aspettiamo che le misurazioni all'interno di saggi di coraggio e aggressività per essere fortemente correlati all'interno di una popolazione, non è probabile che sia alcuni casi di bassa per alcuna correlazione di alcuni comportamenti. Questa limitazione viene superata dalla forza della PCA, perché esso chiavi in su importanti fonti di variabilità e, anche se le misure non sono correlati, l'analisi estrarranno variazione comportamentale coerente nei dati raccolti. Infine, come è il caso con tutti i metodi scientifici, se il protocollo è universalmente adottata e viene costantemente effettuata da diversi laboratori, e c'è qualcheimprevisto, confusione non misurato introdotto dal protocollo, allora questo potenziale elemento deleterio persiste in letteratura, e diventa difficile da smontare. Farmacologicamente conferma che un insieme rappresentativo di saggi di suscitare la risposta comportamentale destinato richiede una comprensione più approfondita delle risposte comportamentali, neurologici e ormonali. sindromi comportamentali possono aiutare a spiegare la base del comportamento, ma questa limitazione di laboratorio possono essere in grado di essere affrontate con maggiore regolarità negli studi futuri. Tuttavia, sono stati forniti risultati che convalida l'uso di questo protocollo in zebrafish, e, con opportune modifiche, il protocollo può essere esteso ad una varietà di ipotesi in diverse specie ittiche. Con attenzione a seguito di un protocollo dettagliato per l'alloggiamento, la selezione e la sperimentazione di vari parametri comportamentale permetterà ai ricercatori di fare confronti più specifici in una vasta gamma di studi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
