Abstract
Ein Verhaltenssyndrom besteht, wenn bestimmte Verhaltensweisen unter verschiedenen Kontexten interagieren. Zebrabärblinge wurden in den letzten Studien Testpersonen gewesen, und es ist wichtig, Protokolle zu standardisieren richtigen Analysen und Interpretationen zu gewährleisten. In unseren früheren Untersuchungen haben wir eine Freudigkeit gemessen, indem eine Reihe von Verhaltensweisen, die Überwachung (Zeit nahe der Oberfläche, Latenz bei Übergängen, die Anzahl der Übergänge und Darts) in einem 1,5 L Trapez Tank. Ebenso quantifiziert wir Aggression durch die Beobachtung Stiche, seitliche Displays, Darts, und die Zeit in der Nähe von einem geneigten Spiegel in einem rechteckigen 19 L Tank. ein 76 l-Tank in Drittel Durch die Aufteilung, die wir untersucht auch shoaling Vorlieben. Der shoaling Assay ist ein hochgradig anpassbarer Test und kann für spezifische Hypothesen angepasst werden. Allerdings Protokolle für diesen Test muss auch sein, standardisierte und dennoch flexibel genug, die individuell gestaltet werden. In früheren Studien waren Ende Kammern entweder leer, enthielt 5 oder 10 Zebrabärbling oder 5 Schillerbärbling (D. albolineatus). Im folManuskript genden stellen wir ein detailliertes Protokoll und repräsentative Daten, die erfolgreiche Anwendungen des Protokolls begleiten, die für die Replikation von Verhaltenssyndrom Experimente erlauben.
Introduction
Es gibt eine wachsende Menge an Literatur, die Assoziationen zwischen unterschiedlichen Verhalten in den einzelnen Tieren aus einer gegebenen Population zu untersuchen. Diese Verbände sind Verhaltenssyndrome bezeichnet, und die Messungen typischerweise Kühnheit, Aggression, Erkundungsverhalten und Kontaktfreudigkeit 1-5. Verhaltenssyndrome sind wertvoll für die direkten und indirekten Gründen. Direkt, Wissen über Verhaltenssyndrome kann eine vollständigere Sicht der Evolutionstheorie liefern, Bevölkerungsstruktur und Bevölkerungsdynamik 3. Indirekt Wissen Verhaltens Assoziationen in Bezug auf möglicherweise Felder informieren , dass das Verhalten quantifizieren wie Pharmakologie 6, Toxikologie 7, Verhaltensgenetik 8,9 und Endokrinologie 10. Aufgrund dieser direkten und indirekten Vorteile, ist ein besseres Wissen über Verhaltenssyndrome besonders wertvoll in häufig verwendeten Modellorganismen wie der Zebrabärbling. Studien Zebrabärbling Verwendung gefunden ina Vielzahl von Disziplinen, einschließlich der Analyse von Verhaltenssyndrome 13.11. Um vorab Wissen in Forschung Verhaltenssyndrom, und weil andere Disziplinen auch Verhaltensmessungen zur Überprüfung der Hypothese, zuverlässig und prägnante Beschreibungen des Verhaltens verwenden müssen für gültige Analysen und Interpretationen und standardisierte Protokolle inter Studie Vergleiche innerhalb der Arten erleichtern. Unser Protokoll wurde entwickelt , eine Kühnheit-Aggression-shoaling Verhaltenssyndrom in einer Population von Labor aufgezogen Zebrabärbling 14 zu messen. die Grundlage des Protokolls (Tracking einzelner Fisch, richtige Randomisierung und entsprechende Analysen zu gewährleisten) jedoch für eine Vielzahl von alternativen Verhaltensmaßnahmen leicht modifiziert werden kann. Zusätzlich Kühnheit, Aggression oder shoaling Assays können individuell für die Prüfung von verschiedenen Hypothesen ausgeführt werden. Daher wird, während es unser Ziel ist, zu beschreiben, wie ein Verhaltenssyndrom Studie durchzuführen, und das Protokoll für die erfolgreiche Einzel level Verhaltensmessung, jede Facette dieses Verfahrens kann allein stehen.
Die Literatur über Verhaltenssyndrome mehrere taxonomischen Gruppen umfasst, von Arthropoden auf den Menschen und 4, um ein Verhaltenssyndrom, mindestens zwei Verhaltens Kontexten zu messen müssen quantifiziert werden. Leider gibt es oft wenig Konsistenz in den Assays, die die Verhaltensmessung über den Achsen des Verhaltens verwendet werden, um zu quantifizieren. Zum Beispiel in Fisch kann Kühnheit T-Labyrinth - Tests unter Verwendung von Open-Feld - Assays oder Einführung eines neuen oder fremden Reiz 15 gemessen werden. Aggression Studien bei Fischen könnte Dyade Interaktionen beinhalten, Stimulus Video - Assays oder Tonmodell Assays 12,16,17. Ebenso Analyse shoaling Verhalten, das typischerweise die Messung von shoalmate bevorzugt handelt, kann in verschiedenen Arten von Behältern mit unterschiedlichen Verfahren durchgeführt werden 21-23 Assoziationszeit zu bestimmen. In diesem Protokoll eine bestimmte Teilmenge der Marktpreisefürll Verhaltensrepertoire Assay dargestellt. Insbesondere stellt dieses Protokoll eine Methodik Individuen durch Kühnheit, Aggression und shoaling Assays in einer Weise zu verfolgen, die Vergleiche innerhalb der Individuen erleichtert, um zu bestimmen, ob die Vergleiche in allen Individuen innerhalb einer Population konsistent sind. Wir haben dieses Protokoll mit Zebrabärbling und Sträfling Cichliden ausgeführt (Amatitlania nigrofasciata) in früheren Studien 14,18, und es wird mit jedem ähnlich großen Süßwasserfische arbeiten.
Verwegenheit Assays werden in einem 1,5 L trapezTank durchgeführt, die eine horizontale Linie begrenze gleich große Bereiche in den oberen und unteren Abschnitt des Tanks aufweist. Quantifizierten Verhaltensweisen beinhalten die Anzahl der Übergänge durch den Test Fisch zwischen dem oberen und unteren Abschnitt des Tanks, der Zeit, in jedem Abschnitt, die Anzahl der Pfeile ausgegeben, und die Latenzzeit den oberen Abschnitt ein. Die Aggression Assay wird in einem 19L rechteckigen Behälter durchgeführt, der Folgendes beinhaltetein 3 Zoll x 5 Zoll Spiegel in der unteren linken Ecke des Behälters 19 befindet sich bei ca. 22 ° geneigt ist . Quantifizierte Verhaltensweisen gehören die Gesamtmenge der Zeit durch den Zielfisch verbrachte mit dem Spiegel 20, zusammen mit spezifischen aggressiven Indikatoren interagieren - die Zahl der Bisse, seitliche Displays, Darts zwischen dem Test Fisch und seine Reflexion. Für diese spezifische Indikatoren, Bisse so schnell lunges auf den Spiegel mit offenem Mund definiert sind, werden seitliche Displays als Abfackeln von lateral, Brust, analen und Rückenflossen in Richtung des Spiegels definiert, und Darts sind alle erratische Bewegungen, die sind nicht auf den Spiegel gerichtet ist. Schließlich quantifiziert die shoaling Test das Verhalten eines Versuchsfische in Mittelkammer eines Tri-Kammer-Tank. Die Seitenkammern des Tanks sind entweder leer oder enthält ein "Ziel Schwarm" von Fischen, und die Zeit , die Versuchsfische in der Nähe von jeder Seite Kammer verbringt wird 21-23 gemessen. Eine einzelne Composite-Score, bezeichnet als Strength von Shoaling (SoS), wird für jeden einzelnen Test Fisch, spezifisch auf die Reize , berechnet, und kann in nachfolgenden Analysen 14 verwendet werden. Alle Verhaltensweisen werden von einem einzigen Betrachter hat, oder mehrere Zuschauer frei Verhaltensquantifizierungssoftware bekannt als jWatcher 24 verwendet wird .
Das Vorhandensein eines Verhaltenssyndrom Testen ist in erster Linie ein statistisches Fangen, und es ist ratsam , die Richtlinien zu folgen , wie 25 durch Budeav 2010 vorgelegt. Insbesondere wird empfohlen , eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) auf zentriert und normierter Daten durchzuführen , in denen die Eingänge sind die Vektoren der individuellen Verhaltensweisen in Tests mit mehreren Verhaltensmessungen (dh Kühnheit und Aggression). Der PCA auf einer Korrelationsmatrix durchgeführt wird, reduziert die Dimensionalität der Verhaltensmessungen und damit extrahiert die wichtigste Erkenntnis, dass eine Mehrheit der Variation erklärt. Die extrahierten Komponenten können dann interpretiert werden, based auf hohe Faktorladungen für das individuelle Verhalten von Interesse und Regressions Scores können für jeden einzelnen auf der Grundlage der erläuternden Komponenten extrahiert werden. Diese Regressions Scores können dann auf die SoS Messung und andere verschiedene nicht-Verhaltensmessungen verglichen werden wie Fisch Größe oder Geschlecht.
Dieser Workflow wurde in einer Studie von Zebrabärbling Verhaltenssyndrome , bei dem ein geschlechtsspezifische Verhaltenssyndrom implementiert , die 14 zwischen Kühnheit und shoaling existiert entdeckt wurde. In dieser Situation kühner Zebrabärbling Männchen sind eher mit einem größeren, aggressive Arten (D. albolineatus) zu assoziieren, aber diese Assoziation ist bei Frauen verloren. Dieser Workflow wurde auch in einer Studie von jugendlichen Verurteilten Cichlide kin (Amatitlania nigrofasciata) 18 , in dem ein Verhaltenssyndrom wurde nicht entdeckt, die möglicherweise auf eine Verhaltensplastizität der Spezies umgesetzt. Daher wird das folgende Protokoll vorgestellt wit einem Ziel, die Natur von drei spezifischen Assays von begrenze (Kühnheit, Aggression und shoaling) im Rahmen Verhaltenssyndrom des Studiums eine individuelle Ebene.
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Protocol
Die folgenden Methoden für das Gehäuse, Pflege und Studium der Zebrabärbling wurden von der St.-Josephs-Universität IACUC genehmigt.
1. Zebrabärbling Unterbringung und Pflege
- Beziehen Sie das Thema Zebrabärbling von einem lokalen Anbieter oder von wild gefangenen Populationen. Bitte beachten Sie, dass Gehäuse der Zebrabärbling zu IACUC Richtlinien unterliegt und zusätzliche Genehmigungen für den Wohnungsbau Populationen wild gefangenen erforderlich sind.
- Identifizieren und separater Zebrabärbling nach Geschlecht. Alternativ, diesen Schritt überspringen oder ersetzen Sie sie durch eine andere Methode der Trennung auf der Studie Hypothese basiert.
HINWEIS: Sex Eigenschaften nur schwer in Zebrabärbling, um zu bestimmen, vor allem bei Frauen. Wenden Sie sich an diese Richtlinien 10 oder nützliche Online - Handbücher Sex zu unterscheiden. - trennen Randomly die Bevölkerung weiter in das entsprechende Verhältnis von Brenn Fisch Fisch auf Reize. Hinweis: Focal Fische sind die Probanden durch die Reihe von behavio gefolgtral-Assays und Stimulus Fisch sind die Personen, die die Reizkammern in den Aggressionen und shoaling Tests belegen wird.
HINWEIS: zwischen 1 und 5 Stimulus Fisch pro Brenn Fisch in shoaling Assays und einem 1 Traditionell: 1 Reiz: sind fokale Fisch Verhältnis in Aggression Assays 14,17 verwendet. Allerdings muss sich die Forscher speziell mit der Hypothese der Studie Design im Auge (dh sollte Reiz Fisch konstant gehalten werden Konsistenz bei fokalen Fischverhalten zu halten, oder sollte Reiz Fisch zwischen jedem Test gedreht werden , um korrekte Randomisierung zu gewährleisten). - Bewahren Sie alle Fische in Zebrabärbling Gehäuse Racks (27,5-28,5 ° C) unter einer strengen 12.12 Hell / Dunkel-Zyklus. Führen Sie alle fokale und Stimulus Fisch Flockenfutter täglich und Artemia wöchentlich, auf Nicht-Forschung Tage.
- Achten Sie darauf , dass alle Tests zwischen ZT1 und ZT5 (Zeitgeber - Zeit) zu vermeiden , zirkadianen Rhythmus - Effekte 26 durchgeführt wird.
2. Die Randomisierung und Tank-Setup
- Randomize alle Individuen , a priori zu einer spezifischen Sequenz von Verhaltenstests. Stellen Sie eine konsistente Randomisierung Schema eines Online - Zufallsgenerator 27 oder einen Zufallsgenerator aus einer statistischen Softwarepaket (R) zu verbrauchen.
- Beschriften Sie jedes Assay von 1 bis 3 und halten diese Zuordnung konsistent. Zuweisen einer Zufallssequenz für jeden einzelnen Karte und die Sequenz entsprechend dem Verhaltenstest Label. Beispielsweise für drei Gesamtassays (1 bis Shoaling kartiert, 2 bis Mut kartiert, und 3 bis Aggression abgebildet), eine bestimmte Person haben eine randomisierte Sequenz von "2,3,1" kann, die sie erfordern die spezifische auszuführen Verhaltenstests in der angegebenen Reihenfolge.
- Stellen Sie die Testtanks (Kühnheit, Aggression und shoaling) im Labor an Orten, die die Möglichkeit für widrige äußere Reize zu minimieren und sicher sein, genug Platz für einen Video-Camcorder haben den gesamten Tank zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass der Camcorder hat enough Klarheit zu sehen Tank Etiketten sowie der Lage sein, den Camcorder in dieser Position subtile Verhaltensweisen des Fokus Fisch und Setup zu unterscheiden.
- Notieren Sie alle Verhaltenstests mit der Kamera in der gleichen Position mit einem vollen Blick auf den angegebenen Tank gehalten unbeabsichtigte Unterschiede in Verhaltensanalyse als Ergebnis unterschiedlicher Aufnahmen zu minimieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie Tanks in schweren Verkehrsflächen und durch Türen als Bewegung setzen und klingen Zebrabärbling Verhalten beeinflussen. - Stellen Sie einzigartige jWatcher Protokolle 24 für jedes Verhaltenstest Scoring. Beachten Sie die jWatcher Handbuch zu lernen, wie fokale Master-Dateien zu erstellen gesammelt zuweisen Verhaltensweisen zu Tastatureingaben und Fokus-Analyse-Dateien zusammenfassen Daten.
HINWEIS: jWatcher ist eine Verhaltensanalyse - Software , die 24 für eine zuverlässige und wiederholbare maßgeschneiderte Verhaltens - Scoring ermöglicht. - Definieren Sie ein Kennzeichnungssystem , das Datum zu verfolgen, Fisch Nummer und Assay - Nummer für alle Verhaltenstests (zB"F5-B-123115" was bedeutet , Fisch 5, mut - Test, am 31. Dezember st, 2015) und die Außenseite des Tanks mit Band im Blick und im Fokus der Kamera kennzeichnen. Halten Sie und notieren Sie diese Informationen in einem Labor-Notebook zum schnellen Nachschlagen und zukünftigen Qualitätskontrolle.
- Richten Sie eine Akklimatisierung Tank, sowie direkt zwischen allen Tests verwendet werden, nachdem die Personen aus dem Gehäuse Rack entfernt werden.
HINWEIS: Die Akklimatisierung Tanks und Klemmen tanks sind kleine Aquarien (40 cm x 20 cm x 25 cm) mit Kies und ein Filter, der eng an die Gehäusegestell ähneln. - Nachdem die Tests alle abgeschlossen sind, übertragen die einzelnen in einem separaten Terminal Tank, der als endgültige Zieltank für alle verwendeten Brenn Personen dienen. Verwenden Sie einen Tank, der groß genug ist , eine Gruppe von Personen für den Rest ihres Lebens zu beherbergen (zB 25 Gallone).
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, konsequent und ähnliche Wassertemperaturen und Bedingungen aufrechtzuerhalten across alle Tanks. Dazu gehören Gehäuse, Akklimatisation, und alle Testtanks.
3. Durchführung der Aggression Assay
- Führen Sie die Aggression Test in einem 19 L rechteckigen Behälter der Größe 30 cm x 15 cm x 10 cm. Ausstatten, den Tank in externen opaque Trennwänden umgeben drei Seiten des Angriffstank, so dass die Vorderseite für Betrachtungs ausgesetzt, um unerwünschte äußere Reize zu reduzieren. Teilen Sie den Tank mit externen Markierungen in vier gleich große rechteckige Quadranten und einen Spiegel fixieren permanent (mit Silikon abdichten) im unteren linken Quadranten, geneigt bei 22,5 ° ein rechtwinkliges Dreieck gegen den äußersten linken Seite des Tanks zu bilden.
- Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Wassers in der Akklimatisierung Tank und Aggression Tank innerhalb von 2 ° C des Gehäuses Rack eingesetzt wird. Dazu haben frisch, im Alter von Wasser vorgewärmt auf 27,5 bis 28,5 ° C bereit zum Angriff Tank hinzuzufügen. Bitte beachten Sie, dass es wichtig ist, das Wasser zwischen den einzelnen Test zu ändern unberechtigt zu beseitigenolfaktorischen Signale.
- Übertragen, durch Schröpfen, einen Schwerpunkt Fisch aus dem Gehäuse Rack in einen separaten Akklimatisierung Tank, wo es für 10 Minuten akklimatisieren wird.
HINWEIS: Es ist wichtig, Anreize für die Fische durch unsachgemäße Handhabung eingeführt zu reduzieren. Transfer Individuen wie zuvor beschrieben 27.- Genauer gesagt, manuell und vorsichtig mit einem kleinen, transparenten Plastikbecher in den Tank in der Nähe platzieren. die Fische so viel wie die Übertragung durch ein Netz verwenden, schöpfen langsam den Fisch in die Tasse ohne zu stören.
- Stellen Sie sicher, dass die Video-Camcorder bereit ist, indem bestätigt wird, dass die Aggression Testtank (siehe Schritt 3.1) ist im Fokus und unmittelbar vor der Übertragung des einzelnen in den Angriffstank, drücken Sie Aufzeichnung auf dem Gerät zu speichern. Übertragen Brenn Fisch über Schröpfen von Akklimatisierung Tank Aggression Tank.
HINWEIS: Es ist wichtig, bevor der Fisch zur Aufzeichnung der Aggression Tank Eingabe der genaue Zeitpunkt des Eintritts zu verfolgen. - Notieren Sie sich die aggrITZUNG Tank für 10 Minuten und 30 Sekunden und dann Tasse im Mittelpunkt Fisch aus dem Angriffstank zurück in die Akklimatisierung Tank.
- Wenn die Aufzeichnung beobachten, warten Sie 30 Sekunden nach der Fisch in den Tank als zusätzliche Akklimatisierungszeit vor Scoring Verhaltensweisen eingeführt.
- Mit dem jWatcher Scoring-System für aggressives Verhalten definiert, quantifizieren die folgenden Verhaltensweisen für 10 Minuten: Zeit in der Nähe von Spiegel verbracht, die Anzahl der Spiegel Ansätze, die Anzahl der Pfeile, die Anzahl der versuchten Bissen (Mund in Richtung der Spiegelöffnung) und die Anzahl der Seitenanzeigen (Rücken-, Brust-, analen und Schwanzflosse Erektion) 9.
- Ergebnis eine einzige Aggression Test mindestens zweimal, bis der Test mit hoher Vereinbarung zwischen Iterationen erzielt wird.
4. Die Durchführung der Mut Assay
- Führen Sie die Kühnheit Test in einem kleinen 1,5 l trapez Tank, Mess 15 cm hoch x 26,5 cm x 22,5 cm oben unten x 6 cm Breite. Wickeln Sie undurchsichtiges Papier um alle Seiten of den Tank, aber lassen Sie die Front für die Betrachtung ausgesetzt. Legen Sie eine einzelne, dünne Stück Band außerhalb des Tanks den oberen von dem unteren Abschnitt des Behälters zu demarkieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Wassers in der Kühnheit Tank innerhalb von 2 ° C des Gehäuses Rack ist (siehe Schritt 3.2)
- Übertragen Sie die Brenn Fisch aus dem Gehäuse Rack zur Akklimatisierung Tank (siehe Schritt 3.3) und lassen Sie sich für 10 Minuten akklimatisieren.
- Stellen Sie sicher, dass der Camcorder ist bereit, die Kühnheit Test zu erfassen und, einmal bereit, den Schwerpunkt Fisch, drücken Sie Aufzeichnung auf das Gerät zu übertragen. Übertragen Sie die Brenn Fisch aus dem Akklimatisierung Tank zum Kühnheit Tank und Rekord für 8 Minuten und 30 Sekunden.
- Wenn die Aufzeichnung beobachtet, ermöglichen weitere 30 sec Akklimatisierungszeit nachdem der Fisch in den Tank, bevor scoring eingeführt wird.
- Mit jWatcher Software, zu quantifizieren Dreistigkeit Verhaltensweisen für 8 min. Insbesondere quantifizieren die folgenden Verhaltensweisen: Zeit nahe der Oberfläche, Latenz oberen Bereich, die Anzahl der tra eingebennsitions in den oberen Bereich und die Anzahl der erratischen Bewegungen (Pfeile) 29.
- Ergebnis einen einzigen Kühnheit Test mindestens zweimal, bis der Test mit hoher Vereinbarung zwischen Iterationen erzielt wird.
5. Die Durchführung der Shoaling Assay
- Führen Sie den shoaling Test in einem 76 l-Tank, der drei Kammern, die durch zwei Glasteiler versiegelt mit Silikon abdichten (die resultierenden drei Kammern bestehen aus zwei Reizzonen und ein Brennraum) geteilt hat. Äußerlich kennzeichnen zwei Präferenzzonen 6,35 cm aus jedem der Reizzonen "Glasteiler bezeichnet, was auf zwei Körper 30 Längen. Wenden Sie undurchsichtigen Partitionen außen um drei Seiten des shoaling Tank, aber lassen Sie die Front für die Betrachtung ausgesetzt.
HINWEIS: Diese Präferenzzone für spezifische Hypothesen für unterschiedlich große Arten zu testen gestalten können. - Je nach der Art der Untersuchung, massen select Stimulus für mindestens 12 h vor dem akklimatisierene Testen und bleiben im Verlauf des Experiments im shoaling Tank.
HINWEIS: Stimulus shoals sind Ansammlungen einzelner Fische, die verwendet werden, zu beurteilen, wie die Brenn Fisch verhält, in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Untiefen. Verschiedene Stimulus Schwarm Kombinationen können eine Reihe von unterschiedlichen shoaling Hypothesen zu testen ausgewählt werden. Achten Sie darauf, dass die Reiz Untiefen zwischen jedem Stimulus Zone gedreht Seite um Verzerrungen zu vermeiden und auch für mindestens 12 Stunden vor dem Test akklimatisieren. - Übertragen Sie die Brenn Fisch in die Akklimatisierung Tank, wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 3.3)
- Übertragen, durch Schröpfen, den Schwerpunkt Fisch aus dem Zwischen Akklimatisierung Tank zu der mittleren Kammer im shoaling Tank.
- Lassen Sie für 10 Minuten Eingewöhnungszeit vor 10 Minuten Live-Scoring-Beobachtungszeitraum. Alternativ notieren Sie die shoaling Assays und später jWatcher mit punkten. Die Fische werden bestimmt shoaling zu sein, wenn sie innerhalb der Präferenzzone in der Kammer sindGehäuse, das Ziel Schwarm.
- Quantifizieren Zeit in jeder Präferenzzone und Zeitaufwand in der Mitte Volumen ausgegeben.
- Als zusätzliche beschreibende Messung, Berechnung 'Stärke von shoaling "(SoS). Weisen Sie einen Wert zwischen -1 und +1, wenn der Betrag, wie oft eine einzelne Fischschwärmen beschreibt.
- Berechnen Sie das Verhältnis von Zeit verbrachte shoaling durch den Bereich der shoaling Zonen und subtrahieren das Verhältnis von Zeit geteilt verbrachte nicht shoaling und den Bereich der nicht-shoaling Zonen. Legen Sie diese Menge über die Summe der Zeit in jeder Zone verbracht durch das Volumen jeder Zone aufgeteilt einzeln. Weitere Informationen zu dieser Berechnung kann 14 in einer früheren Studie gefunden werden.
6. Datenqualitätskontrolle
- Analysieren von Daten unter Verwendung von traditionellen Datenanalysetools 31-32.
- Test auf Homogenität der Varianz nichtparametrischer Levene-Test für alle Verhaltensweisen verwenden. Wenn ein Verhalten nicht homogen ist eine Log-Transformation durchführen33.
- Bestätigen Sie, dass es keine Sequenzeffekte (dh, dass die Randomisierung um nicht die individuellen Verhaltensweisen nicht beeinträchtigte) 34 einen Kruskal-Wallis ANOVA auf den homogenen Daten.
- Bestätigen Sie, dass es keine Neben Vorurteile für die shoaling Assay sind durch univariate allgemeine lineare Modelle auf SoS - Indizes mit Seiten als festen Faktor 35 zu schaffen.
HINWEIS: Wenn es zu keinen Problemen mit der Daten wenig sind, können Downstream-Analysen durchgeführt werden. Wenn es Probleme gibt, versöhnen mit zusätzlichen Transformationen, rationalisieren mit biologisch plausible Erklärungen und / oder Stichprobengrößen zu erhöhen.
7. Analysieren von Daten
- Berechnen two-tailed Spearman Rangkorrelation 36 für alle Verhaltensweisen separat innerhalb der Kühnheit und Aggression Assays.
- Berechnen Intrakorrelationskoeffizienten (ICC) als Zwei-Wege-Mischmodell mit Konsistenz für Verhaltenstests, die mehr als ein tim durchgeführt wurden,e für eine gegebene Einzel 36. Bei dieser Einstellung ist das ICC ein Maß dafür, wie konsequent ein Fisch in einem gegebenen Assay artig gemessen mehr als einmal.
- Preprocess Kühnheit und Aggression Verhaltensweisen durch Zentrieren und Normierungs alle Verhaltensweisen zur Eingabe in einen Hauptkomponentenanalyse (PCA) 25 vorzubereiten.
HINWEIS: Vorverarbeitung der Messungen durch das Zentrieren und Normierungs ist ein wichtiger Schritt. Ohne diese Vorverarbeitung Verhaltensweisen, die mit mehr Frequenz auftreten und unterschiedlich stark die Interpretationen der extrahierten Komponenten beeinflussen. Der Prozess der Zentrierung und Normierungs wird dieses Vorurteil zu entfernen. - Durchführen einer PCA mit einer Korrelationsmatrix, um zu bestimmen, ob Mut und Aggression miteinander verbunden sind, als ein Verhaltenssyndrom. Interpretieren Verhaltens Belastungen der einzelnen Komponenten signifikant bei> 0,6. Siehe Budaev 2010 24 für einen umfassenden Leitfaden für die PCA Berichterstattung für Verhaltensstudien. Ein Screeplot wird informativ sein, auf dem eigenvectors sollte für die Interpretation gehalten werden.
- Mit Hilfe statistischer Software - Paket wie R oder SPSS 31,32, extrahieren Scores für jede Komponente für jeden Einzelnen. Die Noten repräsentieren, wie viel der gegebenen individuellen Verhalten von der speziellen Komponente erklärt werden kann.
- Berechnen Spearman Rangkorrelationen zwischen Faktor Regression Scores und der Stärke von 36 shoaling.
HINWEIS: Ein Verhaltenssyndrom ist vorhanden betrachtet, wenn Mut und Aggression Verhalten auf der gleichen Komponente geladen werden oder, falls ein Bauteil mit einer signifikanten interpretierbar Beladungen mit einer Stärke von shoaling korreliert. Beachten Sie auch, dass die Festigkeit von shoaling nicht im PCA enthalten für eine bessere Interpretation der komplexeren Verhaltens Quantifizierungen (Kühnheit und Aggression) zu ermöglichen. Die PCA wird orthogonal kollabieren Kühnheit und Aggression Funktionen in Eigenvektoren die Variations zu maximieren erklärt und ist gut geeignet für diese komplexen Messungen. Dolmetschendie resultierende Eigenvektoren und unsere Stärke shoaling Messungen regredieren auf jedem von ihnen eine viel intuitiver Interpretation, wie jede der komplexen Verhaltensweisen (Kühnheit und Aggression) beziehen sich auf eine gut definierte binäre shoaling Messung (dh der Fisch shoaling oder shoaling nicht).
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Representative Results
Je nach der Art der Untersuchung, und die spezifischen Protokoll verwendet wird, sind mehrere unterschiedliche Ergebnisse möglich, in einem Experiment Verhaltenssyndrome. Die folgenden Tabellen und Abbildungen, in denen angegeben ist , aus unserer früheren Studie angepasst sind , veröffentlicht in der Zeitschrift Behavioral Prozesse 14 und die Zeitschrift Zebrabärbling 17. Wenn der Vorschlag (wie oben beschrieben) ist in seiner Gesamtheit durchgeführt, zwei Sätze von Ergebnissen, "im Test Korrelationen 'und' zwischen Test - Korrelationen, 'erwartet (Abbildung 1).
Der erste Satz von Ergebnissen beschreibt im Test Konsistenz. Insbesondere beschreiben die Ergebnisse , wie Verhaltensweisen miteinander innerhalb der Kühnheit Assay und der innerhalb der Aggression Assay getrennt korreliert sind. Die Tabellen 1 und 2 beschreiben , was diese Korrelationen wie für die Kühnheit und ag aussehen sollteSchreiten Assays und die Daten präsentiert werden aus einer früheren Studie 14 angepasst. Für die Verwegenheit Assay wird die Zahl der Übergänge und der Zeit in dem oberen Teil des Tanks verbracht erwartet positiv korreliert sind, aber Latenz den oberen Abschnitt eintreten negativ korreliert. Repräsentative Ergebnisse für auf der Kühnheit Achse des Verhaltens in der Kühnheit Tank gemessen Individuen (siehe Schritt 4.1) sind in Tabelle 1 angegeben. Für die Aggression Test wird erwartet , dass beißt, seitliche Displays, und die Zeit in der Nähe des Spiegels ausgegeben werden alle korreliert. Repräsentative Ergebnisse für auf die Aggression Achse des Verhaltens in der Aggression Tank gemessen Individuen (siehe Schritt 3.1) sind in Tabelle 2 angegeben. Darts sind in der Regel nicht mit aggressivem Verhalten korreliert , obwohl in einigen Fällen, nicht aggressive Fische neigen (daher eine negative Korrelation zu dart ). Schließlich sieht eine Stärke von Shoaling (SoS) Messung für den shoaling Assay eine individuelle Ebene Maß für shoaling tendency. Shoaling ist ein höchst wiederholbare Verhalten in einer Vielzahl von shoaling Assays bei SoS gemessen (ICC = 0.641) 14 und mehrere unserer früheren Studien haben shoaling Verhalten in Zebrabärbling 23,38 bestätigt. Da alle Individuen für jeden der Verhaltensweisen gemessen werden, können wir Spearman Korrelationen zwischen diesen Verhaltensweisen berechnen und einige Verhaltensweisen erwarten korreliert werden, wie für Zebrabärbling in den repräsentativen Ergebnissen identifiziert.
Der zweite Teil der Ergebnisse untersucht, um das Vorhandensein eines Verhaltenssyndrom. Die Ergebnisse der integrativen Analyse aller Verhaltensweisen in der Kühnheit und Aggression Verhaltenstests quantifiziert werden eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) fasste mit. Es sollte für jedes Verhalten basierend auf hohen Belastungen zwei vor vier interpretierbare Komponenten sein. Wenn ein einzelner Eigenvektor, die einen guten Teil der Variation erklärt beinhaltet Verhaltensweisen sowohl von der Kühnheit eind Aggression Assays, dann ein Verhaltenssyndrom beobachtet. wenn Verhaltensweisen von den Mut und Aggression Tests jedoch nicht auf einem einzigen Eigenvektor überlappen, dann enthält die Studie keine Verhaltenssyndrom beschreiben. Repräsentative Ergebnisse sind für das Fehlen einer Kühnheit Angriffsverhaltenssyndrom (Abbildung 2) dargestellt. In diesem Beispiel Komponente 1 ist am stärksten Vertreter der Aggression Verhalten während die Komponente 2 ist am stärksten mit Kühnheit Verhalten in Verbindung gebracht. Da Aggression und Kühnheit Verhaltensweisen sind nicht durch die gleiche Komponente dargestellt, kann der Schluss gezogen werden, dass es das Fehlen einer Kühnheit Angriffsverhaltenssyndrom (Kühnheit Vektoren sind in etwa orthogonal zu Aggressionen Vektoren). Außerdem sind diese Verhaltensweisen nicht nach Geschlecht beeinflusst, da das Verteilungsmuster das gleiche zwischen Männern und Frauen ist. Zu beobachten, wenn Kühnheit oder Aggression Verhaltensweisen mit shoaling verbunden sind, sind die extrahierten Regressions Scores für jeden Fisch korrbeschwingt mit der SoS Messung des Fisches. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle korrelierenden Komponenten eine interpretierbare Reihe von Verhaltensweisen tatsächlich zu beschreiben. Bei hohen absoluten Wert Spearman Korrelationen zwischen jeder Komponente und der shoaling Messung sind, dann ist ein shoaling Verhaltenssyndrom vorliegt. Unabhängig von den spezifischen Ergebnissen, ist es wichtig, machbar biologische Interpretationen zu allen Beobachtungen zur Verfügung zu stellen. Repräsentative Ergebnisse sind für eine Beschreibung einer Dreistigkeit-shoaling Verhaltenssyndrom (Tabelle 3) 14 vorgesehen. Während die präsentierten Daten typische Ergebnisse für Zebrabärbling darstellen, sollten sie nicht als Messungen der Datenqualität interpretiert werden. Es gibt mehrere Gründe, warum die Daten unterschiedlich in den verschiedenen Experimenten aussehen wie Art oder Population Unterschiede.
Abbildung 1. VorgeschlageneWorkflow für eine Kühnheit, Aggression und Verhaltenssyndrome Experiment shoaling. Typische Messungen werden für jeden Test aufgeführt. Ein Überblick, wie die Tests einzeln und dann zu analysieren , wie die Analysen zu integrieren ist ebenfalls aufgeführt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse eines PCA darauf hinweist , dass eine Dreistigkeit Angriffsverhaltenssyndrom fehlt. Die roten Vektoren zeigen Verhaltensweisen , die entlang jeder Komponente (rechts und von oben Achsen auf die Komponentenwerte (links und unten Achsen) und die Punkte stellen einzelne Noten beitragen ). Männer sind durch blaue Punkte dargestellt und Weibchen sind durch grüne Punkte dargestellt. Beachten Sie, dass "unberechenbares Verhalten" beziehen sich auf "Darts" und"Aggression Rate" kann durch die gesamte Zeit mit dem Spiegel die Interaktion geteilt durch Addieren der Zahl der Bisse und seitlichen Displays berechnet werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Transitions | Latenz | Darts | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Oberflächenzeit | 0,65 | <0,001 * | -0,68 | <0,001 * | 0,42 | 0.007 * |
| Transitions | -0,40 | 0.012 * | 0,33 | 0.041 * | ||
| Latenz | -0,47 | 0,002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabelle 1:. Mut Spearman Rangkorrelation in einem neuartigen Tank Assay Diese Tabelle aus Weise modifiziert worden war , et al, 2015..
| Lateral Displays | Darts | Spiegel Zeit | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Bites | 0,69 | <0,001 * | -0,10 | 0,547 | 0,63 | <0.001 * |
| Lateral-Displays | -0,06 | 0,735 | 0,66 | <0,001 * | ||
| Darts | -0,18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabelle 2:. Aggression Spearman Rangkorrelation in einem neuartigen Tank Assay Diese Tabelle aus Weise modifiziert worden war , et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| PCA-Komponenten | ||
| Mut | 0,339 | 0.035 * |
| Aggression | 0,075 | 0,65 |
| Pfeil | -0,012 | 0,944 |
T können . 3: Mit Hilfe der PCA - Komponenten das Vorhandensein eines shoaling und Kühnheit Verhaltenssyndrom in dieser Population dieser Tabelle von Way et al modifiziert worden war , um zu bestätigen, 2015..
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Discussion
Das Protokoll wird entscheiden, ob es im Einklang Vereinigungen in Kühnheit, Aggression und shoaling Verhaltensweisen in Zebrabärbling. Wenn es konsistente Verbände in einer bestimmten Population zwischen diesen Verhaltensweisen sind, dann ist ein Verhaltenssyndrom vorhanden. Bevölkerung eines natürlichen Verhaltenssyndrom Durch das Studium können die Forscher ein besseres Verständnis ihrer Verhaltens dynamisch, Bevölkerungsstruktur, und möglicherweise Evolutionsgeschichte 3. Darüber hinaus die Umwelt zu manipulieren , dass diese Verhaltenssyndrome wirkt, wie in der Pharmakologie 6, Toxikologie 7, Verhaltensgenetik 8,9 und Endokrinologie 10 Studien können, geben Aufschluss darüber , wie verschiedene Faktoren Verhaltens Verbände auswirken könnten. Die spezifische Zusammensetzung des Aggressions Kühnheit-shoaling Verhaltens in diesem Protokoll gefunden Syndrom umfasst gemeinsame Verhaltensweisen auch im Modellorganismus Zebrabärbling studierte 13.11. Während diese Methodikkann auf alle Fischarten angewendet werden, die eine breite Anwendung Zebrabärbling für die Verwendung kann mit der interdisziplinären Standardisierung dieses Protokoll unterstützen. Jeder Test oben beschrieben kann leichter kontrolliert und manipuliert als andere vergleichbare Techniken. Zum Beispiel verwendet die Aggression Test der geneigten Spiegel ein breiteres Spektrum von Aggression Antworten zu entlocken , anstatt ein Live- oder Ton - Modell, Video - Stimulus oder vertikales Spiegelbild Stimulus 17. Das Verhalten in Kühnheit Test gemessen werden leichter quantifiziert als in einem T-Labyrinth oder großen offenen Feldtest 15. Schließlich beschrieb der shoaling Assay leicht eine individuelle verfolgen können, die für das Studium Verhaltenssyndrome auf der individuellen Ebene von wesentlicher Bedeutung ist, und kann für eine unbegrenzte Kombinationen von Ziel Untiefen erlauben neuartige experimentelle Fragen zu stellen. Während dieses Protokoll geändert werden, können eine Vielzahl von Verhaltens Fragen aufzunehmen, um weitere Einblicke die Standardisierung davon führen kann, wie DNA, zelluläre Mechanismuss, Zellentwicklung und eingeführt Chemikalien können Verhaltenssyndrome individuelle und Bevölkerung betreffen.
Um sicher zu sein, dass die beobachteten Assoziationen wahr sind, muss das Protokoll sorgfältig beachtet werden. In den meisten Fällen ist das Protokoll modifizierbar entsprechend der spezifischen Hypothese; jedoch gibt es mehrere Schritte, die ausgeführt werden müssen, das Vertrauen in die Ergebnisse zu gewährleisten. Erstens ist es wichtig, daß die Individuen in einem geeigneten Behälter untergebracht sind, bei optimalen Bedingungen (siehe Protokoll) und ordnungsgemäß zugeführt. Die Wasserbedingungen sollten in Gehäuse Racks, Akklimatisierung Tanks und Testtanks im Einklang stehen. Wenn das Wasser nicht konsistent ist, wird die Fische länger auf die Bedingungen zu akklimatisieren und die Verhaltensmessungen nicht richtig erfasst werden. Es ist auch wichtig, dass das Wasser zwischen Kühnheit und Aggression Tanks zurückgeführt wird, so dass künstliche Gerüche zwischen Assays nicht übertragen. Zweitens ist es von größter Bedeutung, dass alle behavIORs richtig erzielt. Um dies zu gewährleisten, werden alle Tests auf Video aufgezeichnet für mehrere Viewings zu ermöglichen, und für mehrere Ausbildungsmöglichkeiten. Eine einzige ausgebildete Torschütze kann Fischverhalten genau zu messen, aber Training dauert einige Zeit. Wenn eine sorgfältige Ausbildung Zeit ignoriert wird, dann wird das Vertrauen der Ergebnisse der Verhaltensstudie ist gering. Eine sorgfältige Untersuchung mit geringen Probengrößen von einem gut ausgebildeten Beobachter ausgeführt ist mächtiger als eine Studie mit hohem Probengröße durch einen schlecht ausgebildeten Beobachter durchgeführt. Schließlich Qualitätskontrolle der gesammelten Daten ist ebenfalls kritisch. Die Schritte, die ergriffen werden, um Individuen zu randomisieren und spannt entfernen in nutzbare, zuverlässige Daten führen sollte, und Datentransformationen werden zur Vorverarbeitung entsprechend der spezifischen statistischen Test (siehe Protokoll) empfohlen. Wenn diese Schritte nicht sorgfältig durchgeführt werden, kann die Ausgabe der Analysen können nicht zuverlässig interpretierbar.
Wie bereits erwähnt, ist die Technik schwer modifizierbaren according auf die spezifischen Test Hypothesen. Es existieren andere Verhaltensmessungen , die 39-41 in einem Verhaltenssyndrom unter einer Anzahl von verschiedenen Fischarten bezogen werden können untersucht werden. Während die Grundsätze des Protokolls gleich bleiben, können die spezifischen Fragen leicht für verschiedene Hypothesentests zu ermöglichen, verändert werden. Zum Beispiel kann ein Forscher die oben genannte Protokoll für das Vorhandensein einer Aggression und explorative Aktivität Verhaltenssyndrom in Sträflings Cichliden (Amatitlania nigrofasciata) zu testen. Die Frage ist, verwandt, aber die Studie Organismus unterscheidet sich von dem von dem Protokoll beschrieben. Jedoch bleiben die allgemeinen Schritte weitgehend gleich. Der Einzelne muss durch eine Reihe von Tests randomisiert und verfolgt werden, mit Eingewöhnungszeiten zwischen Assays, das Wasser muss konsequent und frisch sein, und der Wissenschaftler sollte entsprechend geschult werden. Ein wichtiger Unterschied ist die Verhaltensweisen, die gemessen werden, sind wahrscheinlich nach dem spezifischen zu ändernFic-Test und die Verhaltens Verbände können nach den spezifischen Arten und ursprünglichen Umgebung verändern.
Die Einschränkungen des Protokolls sind mit einigen der traditionellen Unsicherheiten von Verhaltensstudien verknüpft. Insbesondere dann, wenn die Tests unzuverlässig erzielt werden, dann ist es wahrscheinlich, die Interpretationen der Ergebnisse falsch sind, und es wäre schwierig, diesen Fehler zu identifizieren. Um diese Einschränkung zu überwinden, ist es möglich, dass zwei gut ausgebildete scorers Verhaltensweisen beobachten. Zur Beurteilung der Zuverlässigkeit berechnen Intrakorrelationskoeffizienten auf Messungen auf der gleichen Fisch aufgetragen und gegebenenfalls anzupassen, um Unterschiede. Alternativ kann , falls vorhanden, automatische Tracking - Software wie Ethovision kann durch eine gut ausgebildete Beobachter implementiert und validiert werden 42 Durchsatz und Genauigkeit zu erhöhen. Darüber hinaus gibt es verschiedene mögliche Interpretationen in Bezug auf die Benennung und Scoring der "Kühnheit" Verhaltensweisen. Andere Studiengenannt haben beschrieben das Verhalten 43 und andere haben das Verhalten als "explorative" 44,45 beschrieben. In unserer Arbeit wurde das Verhalten als "Kühnheit" beschrieben, wie es war das Verhalten in einer Umgebung nicht vertraut mit dem Schwerpunkt individuelle Messung. Während jedoch der Begriff auf alternative Interpretationen unterliegen können, dies beeinträchtigt nicht das Protokoll oder die Analyse. Darüber hinaus, während wir Messungen innerhalb Kühnheit und Aggression Assays erwarten stark innerhalb einer Population korreliert zu sein, gibt es wahrscheinlich keine Korrelation einiger Verhaltensweisen einige Fälle von niedrig zu sein. Diese Einschränkung wird durch die Stärke des PCA zu überwinden, weil es Schlüssel in auf wichtige Quellen für Variabilität, und selbst wenn Messungen nicht korreliert sind, wird die Analyse Verhaltens Variation konsistent in den gesammelten Daten zu extrahieren. Schließlich ist, wie bei allen wissenschaftlichen Methoden ist, wenn das Protokoll allgemein angenommen und wird konsequent von mehreren Labors durchgeführt, und es gibt einigeunvorhergesehene, ungemessene verwirrende durch das Protokoll eingeführt, dann ist dieses Potential schädlichen Element besteht in der Literatur, und es wird schwierig zu demontieren. Pharmakologisch bestätigt, dass eine repräsentative Gruppe von Assays, die die beabsichtigte Verhaltensreaktion erfordert ein gründliches Verständnis der Verhaltens, neurologische und hormonelle Reaktionen hervorrufen. Verhaltenssyndrome kann helfen, die Grundlagen des Verhaltens erklären, aber das Labor Einschränkung der Lage sein, kann in zukünftigen Studien mehr regelmäßig angegangen werden. Dennoch wurden Ergebnisse bereitgestellt, die die Verwendung dieses Protokolls in Zebrabärbling validiert, und, mit der richtigen Modifikationen kann das Protokoll auf eine Vielzahl von Hypothesen in einer Reihe von verschiedenen Fischarten erweitert werden. Durch die sorgfältige ein detailliertes Protokoll für das Gehäuse, Auswahl und Prüfung verschiedener behaviorally folgende Parameter ermöglichen es den Forschern präziser Vergleiche in einer breiten Palette von Studien zu machen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
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