Introduction
De bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (BCSFB) is een van de drie plaatsen barrière tussen bloed en hersenen 1. De morfologische correlaat zijn de epitheelcellen van de choroid plexus (CP) 2,3, een endotheel-epitheliale convoluut, die sterk gevasculariseerd en in de ventrikels. De CP dient om de cerebrospinale vloeistof (CSF) te produceren en om deze uit het bloed te scheiden. Om de barrière functie te bereiken, de CP epitheliale cellen vertonen een lage pinocytotic activiteit uitdrukken specifieke transporters, en worden dicht verbonden door een continu netwerk van krappe kruispunten (TJs) 2,3.
Menselijke choroid plexus papilloma (HIBCPP) cellen, afgeleid van een kwaadaardige choroid plexus papilloom van een Japanse vrouw 4, werden gebruikt om een functionele in vitro model van de BCSFB construeren. HIBCPP cellen een aantal karakteristieken van een functionele BCSFB de vorming van TJstrengen, de ontwikkeling van een hoge transepitheliale membraanpotentiaal welke bepaald als transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en geringe permeabiliteit voor macromoleculen. Bovendien HIBCPP cellen brengen karakteristieke transporters, die kunnen dienen tot de ionische micro-omgeving te reguleren, en tonen apicale / basolaterale polariteit 5,6,7.
De BCSFB is aangetoond gefunctioneerd als ingangsplaats voor ziekteverwekkers (bacteriën, virussen en schimmels) in het centrale zenuwstelsel (CNS) 8. De invasie van ziekteverwekkers, waaronder Neisseria meningitidis (N. meningitidis), een Gram-negatieve bacterie kan ernstige ziekten zoals meningitis veroorzaken. Bewijs dat het overwint de beschermende epitheliale barrière van de CP wordt ondersteund door histopathologische observaties bij patiënten met meningokokken ziekte vertonen verhoogde hoeveelheden van meningokokken in de vaten en CP epitheelcellen 9,10. Om binnenkomst in gastheercellen ba te krijgencteria kapen vaak endocytotische mechanismen, die worden gemedieerd of veroorzaakt door specifieke oppervlakte receptoren op de gastheercellen. Aangezien interacties van pathogenen met deze receptoren kunnen soortspecifiek 11, diermodellen kunnen alleen worden geraadpleegd beperkte mate. De HIBCPP cellijn biedt de mogelijkheid om de invasie proces en de onderliggende moleculaire mechanismen in een humaan model te bestuderen. Gebruikmakend van celkweek inserts stelt ons in staat om interacties van pathogenen analyseren gastheercellen uit twee verschillende cel kanten. Veel bacteriën, inclusief N. meningitidis, sterk de invloed van de zwaartekracht tijdens infectie tests onderworpen. Optimale interactie van pathogenen met HIBCPP cellen tijdens de testen worden de bacteriën eerst toegevoegd aan het bovenste compartiment van de celkweek filterinzetstuk systeem. Om infectie inschakelen van het apicale of basolaterale celkant respectievelijk twee varianten van het in vitro systeem zijn established: In het standaardsysteem HIBCPP cellen worden gezaaid in het bovenste compartiment van het filterelement, het nabootsen van de situatie wanneer micro-organismen op het CB-kant en in contact met de apicale zijde van de cellen (Figuur 1 A, C). In tegenstelling tot het gebruik van de HIBCPP cellen in een omgekeerde celcultuur filter insert systeem weerspiegelt de voorwaarden wanneer bacteriën de bloedbaan hebt ingevoerd. Micro-organismen verspreiden in het bloed en ontmoeting CP epitheelcellen van de basolaterale zijde (Figuur 1B, D). Opmerkelijk in dit modelsysteem is aangetoond dat bacteriën tasten HIBCPP cellen in een polair wijze bepaald uit de basolaterale zijde cel 5,7.
Vervolgens infectie van de CP, kan de invasie ziekteverwekkers worden herkend door het aangeboren immuunsysteem door middel van ligatie aan receptoren patroonherkenning (PRRS). Goed beschreven leden van het PRRS behoren tot de Toll-achtige receptor (TLR) familie. kan TLRs bind karakteristieke structuren van besmettelijke micro-organismen, die genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zijn. Ligatie van de receptoren leidt tot activatie gastheercel signaaltransductiecascades dat expressie van cytokines en chemokines 12, die op zijn beurt stimuleert transmigratie van immuuncellen in de BCSFB 13,14 activeren. Het is aangetoond dat HIBCPP cellen brengen verschillende TLRs op mRNA-niveau en dat infectie met N. meningitidis resulteert in afscheiding van verschillende cytokinen en chemokinen, waaronder CXCL1-3, IL6, IL8 en TNFa 15,16.
We beschrijven kweek en infectie van de humane cellijn HIBCPP in omgekeerde celkweek insert systeem dat BCSFB nabootst. Dit modelsysteem toelaat om interacties van pathogenen met de in vivo desbetreffende basolaterale celkant en de daaropvolgende cellulaire respons studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid Cultuur van de Cel Filter Voegt Seeding HIBCPP Cellen in een omgekeerde Model System
- Voorverwarmen DMEM / F12 (Ham) gesupplementeerd met 5 ug / ml insuline, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% foetaal kalfsserum (FCS).
- Gebruik een steriel pincet tot 0,33 cm² groeigebied celkweek filter inserts te plaatsen met een poriegrootte van 3 urn op zijn kop in een 12-well plaat (figuur 1E).
- Vul medium in het onderste compartiment van de celkweek filterelement (ongeveer 3 ml) en 100 gl bovenop het filterelement. Overspoelen de plaat en het onderste compartiment medium. Zuig het medium buitensporige zodanig dat het onderste compartiment van het filterelement blijft gevuld (figuur 1E).
Opmerking: Het wordt aanbevolen om een serologische pipet te gebruiken voor deze stap. - Bedek 12-wells plaat met het deksel en breng de bereide celkweek filter inserts in de incubator, 37 ° C,5% CO 2 tot toevoeging van cellen.
2. Teelt en passage van HIBCPP Cells
- Bereid DMEM / F12 (Ham) gesupplementeerd met 5 ug / ml, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% FCS.
- Pre-warm medium en PBS in een 37 ° C waterbad. Aspireren medium van de kolf. Voeg 10 ml PBS aan de kolf en krul. Herhaal deze stap een keer.
- Voeg 3 ml 0,25% trypsine-EDTA aan de kolf en krul. Plaats in de incubator, 37 ° C, 5% CO2.
- Na ongeveer 20 minuten verwijder de kolf uit de incubator. Zorgen dat de cellen losgemaakt van de bodem van de kolf en weer een ronde vorm wanneer onderzocht met de microscoop.
Opmerking: De cellen niet volledig los van elkaar en worden vaak in agglomeraten. Het wordt aanbevolen om de cellen te gebruiken tot passage 38. - Om te stoppen met behandeling met trypsine toe 17 ml medium. Resuspendeer de cellen door en neer te pipetteren en breng de suspensiein een 50 ml buis. Centrifugeer bij 50 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de cellen in een geschikt volume van medium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
Opmerking: De concentratie van geresuspendeerde cellen HIBCPP moet 1 x 10 6 cellen / ml. Voor onderhoud HIBCPP cellen wordt voorgesteld om een hoeveelheid van 1-6 x 10 6 cellen overdragen 10 ml medium aan een T75-kolf. Veranderen medium elke tweede dag.
3. Seeding Omgekeerde Cell Culture Filter wisselplaten met HIBCPP Cells
- Op elkaar omgekeerd filterelement (de onderzijde van het filter) voeg 80 ul celsuspensie (bijv. 8 x 10 4 cellen) (figuur 1E).
Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig in de suspensie worden verdeeld door het omkeren van de buis voor het zaaien. - Bedek de geënte-celkweek filterelementen met het deksel van de 12-well plaat en transfer naar de incubator, 37 ° C, 5% CO 2.
- Op de eerste dag, vul 1 ml medium in de putjes van een 24-wells plaat. Til de celkweek filter inserts met behulp van een tang uit de 12-well plaat, gooi het medium binnen, draai het filter inserts en plaats ze in de standaard oriëntatie in de voorbereide 24-well plaat (figuur 1E).
- Plaats de cellen in vers medium elke tweede dag. Bereid 24-wells met vers medium en de overdracht van de filter inserts aan. Vul wisselplaten met 0,5 ml vers medium. Controleer TEER elke dag zoals beschreven in hoofdstuk 4.
- Wanneer TEER waarden van HIBCPP gezaaid-cellen op celkweek inserts hoger is dan 70 Ω x cm² (ongeveer 4 dagen na het zaaien), ga dan verder celkweek in medium dat 1% FCS en 5 ug / ml insuline. Bereid 24-well platen met 1 ml medium voor elk putje. Transfer filter inserts aan de voorbereide putten en uitwisseling medium in het bovenste compartiment.
Opmerking: Dit serum herroeping na confluentie leidt tot de vorming vaneen hogere membraanpotentiaal. - Aspireren medium van filter compartiment, over te dragen aan het goed voorbereid en vul met 500 pl medium. Herhaal deze stap een keer. Zet de cellen een nacht in de incubator, 37 ° C, 5% CO2.
4. Meting van Transepitheliaal elektrische weerstand (TEER)
- Dompel de elektrode tips van epitheelweefsel voltohmmeter gedurende 15 minuten in 80% ethanol. Transfer voltohmmeter onder de motorkap en laat de elektrode drogen voor een moment. Plaats elektrode in respectievelijke kweekmedium voor de cellen gedurende nog 15 min equilibreren.
- Metingen uitvoeren door het zo langere arm van de elektrode zodat het raakt de bodem van het onderste compartiment telkens plaats de kortere arm in het filter insteekopening.
Opmerking: Weerstand waarden van celkweek filter inserts zonder cellen in medium moeten worden gebruikt als blanco-waarden ((gemeten waarde (Ω) - blanco waarde (Ω)) x filteroppervlak (dwz 0,33 cm²)). - Na meting Elektrode terug in 80% ethanol gedurende 15 minuten. Bewaren in een droge buis.
5. Vaststelling van Paracellulaire permeabiliteit
- Los 1 g FITC-inuline in 200 ml kweekmedium gesupplementeerd met 5 ug / ml insuline 1% FCS. Toepassen 50 ug / ml van de oplossing in het bovenste filtercompartiment voor infectie van de cellen.
- Na infectie verzamelen mediummonsters van de onderste put te bepalen hoeveel Inuline overgedragen van het filtercompartiment door de cellaag.
- Bereid een FITC-inuline standaardoplossing en uitvoeren 1: 2 verdunningen, 10 keer (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% en 0%) . Bepaal fluorescentie door meting van monsters microplate reader.
6. Voorbereiding van Bacteriën voor Infectie van HIBCPP Cellen op Cell Culture Filter Voegt
- Een dag voorafgaand aan het experiment, schrapen thij bevroren N. meningitidis stammen uit een glycerol-voorraad en streak op Chocolate Agar met Vitox. Grow 's nachts in de incubator bij 37 ° C, met 5% CO 2.
- Extract 20-30 kolonies van de overnachtkweek en over in een buis met 8 ml proteosepepton gesupplementeerd met 0,042% NaHCO3, 0,01 M MgCl2 en 1% Polyvitex.
- Schud de bacteriën gedurende 1,25 uur bij 220 rpm, 37 ° C. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 2684 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet met 8 ml serumvrij medium. Vortex om een gelijkmatige suspensie.
- Om kweekdichtheid bepalen, meten een verdunning van 1:10 in een optische densiteit (OD) van 600 nm. Stel de bacteriële suspensie om een OD 600 van 0,1.
Opmerking: Deze suspensie bevat ong. 1 x 10 8 CFU / ml. - De bacteriële celconcentratie bevestigen Verdun de suspensie stapsgewijs (1:10) tot eenverdunning van 10 -5 en plaat op Chocolate Agar platen.
Opmerking: dezelfde seriële verdunningen moeten worden uitgevoerd om bacteriële groeicurven berekenen.
7. Infectie van HIBCPP Cells over Cell Culture Filter Inserts en Bepaling van bacteriële invasie van Double Immunofluorescentie
- Na aanhoudende celkweek in medium dat 1% FCS en 5 ug / ml insuline, het meten van de cellen elke dag met behulp van een epitheelweefsel voltohmmeter. Als cellen een TEER van ongeveer 500 Ω x cm² hebben bereikt, het uitvoeren van de infectie.
- Infecteren de cellen met de bereide bacteriesuspensie bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10. Bewaar de geïnfecteerde cellen in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de aangegeven tijdsduur.
Opmerking: De MOI kan worden berekend door rekening te houden met het aantal cellen per celkweek filterelement bij samenloop (1,21 x 10 6 cellen / cm2). - Stop de infection door driemaal wassen met 500 gl serumvrij medium (SFM) die 1% runderserumalbumine (BSA) aangebracht op het filtercompartiment, 1 ml tot het onderste compartiment.
- Blok met 500 gl SFM bevattende 1% BSA buffer in het filtercompartiment en 1 ml in het onderste compartiment gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om hechting van antilichamen tegen niet-specifieke bindingsplaatsen te voorkomen.
- Incuberen met 100 gl primair antilichaam anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) in het filtercompartiment en 500 ul in het onderste compartiment gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Indien nodig kan de antilichaamconcentratie moet worden getitreerd. - Was de cellen door het opzuigen van het medium uit het filtercompartiment, de overdracht van het filterelement naar een goed voorbereid met 1 ml SFM met 1% BSA en vul de geleegde filter compartiment met 500 ul SFM met 1% BSA. Herhaal deze stap twee keer.
- Fix cellen met 500 pi 4% formaldehyde in het filter bedrijrtment, 1 ml in het onderste compartiment gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen door het opzuigen van het medium uit het filtercompartiment, de overdracht van het filterelement naar een goed voorbereid met 1 ml PBS en vul de geleegde filter compartiment met 500 pi PBS. Herhaal deze stap een keer.
Noot: Monsters kunnen overnacht worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C. - Cut vaste celcultuur filtert uit de inserts en wassen met 250 ul PBS met 1% BSA. Incubeer cellen gedurende 15 min bij kamertemperatuur met 250 pl fluorescent gelabelde (excitatiegolflengte 594 nm) secundair antilichaam kip anti konijn (1: 500) om extracellulaire bacteriën kleuren.
Opmerking: Indien nodig kan de antilichaamconcentratie moet worden getitreerd. - Doorlaatbaar cellen met 250 ul PBS met 1% BSA en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de cellen drie maal met 250 ul PBS met 1% BSA.
- Incuberen met 250 ui primaire antilichaam anti N. meningitidis
- Toepassen 250 pl fluorescent gelabelde (excitatiegolflengte 488 nm) secundair antilichaam (1: 500), fluorescent gemerkte (excitatiegolflengte 660 nm) Phalloidin (1: 250) en 4', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) ( 1: 50.000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur extra- en intracellulaire bacteriën, actine cytoskelet en kernen vlek.
Opmerking: Indien nodig kan de antilichaamconcentratie moet worden getitreerd. - Was de cellen drie maal met 250 ul PBS met 1% BSA. Insluiten cellen in fixeermiddel en bewaar bij 4 ° C totdat zij onderzocht via microscoop.
- Bepaal aantal binnengedrongen bacteriën per vooraf gedefinieerde gebied. Doe dit door het tellen van 20 velden per filter membraan. Bereken het percentage van binnengedrongen bacteriën.
Let op: Vermenigvuldig het gemiddelde aantal bacteriën in de 20 microscopische velden met een oppervlakte coefficseerde. Het resultaat drukt de totale hoeveelheid bacteriën in een 0,33 cm² celkweek filter insert. Verdeel deze waarde door de hoeveelheid bacteriën gekweekt in media tijdens de duur van de infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we kweken en infectie van HIBCPP cellen in een omgekeerde celkweek insert systeem. Dit model stelt ons invasie mechanismen en de onderliggende moleculaire signaalwegen bestuderen van de basolaterale celkant reproduceren van een fysiologische toestand van bacteriën te verspreiden en die epitheelcellen via de bloedbaan (figuur 1).
De HIBCPP cellen vertonen bepaalde barrière functies, die hen in staat stellen moleculaire uitwisseling tot een minimaal niveau te beperken. Dit wordt bereikt door de expressie van adherens junction (AJ) en tight junction (TJ) eiwitten. Immunofluorescentie analyse van de TJ-geassocieerde eiwitten Occludin, Claudin en ZO-1 onthulde een ononderbroken signaal op de plaatsen van cel-cel contact, waaruit blijkt dat de cellen onderling verbonden door continue strengen TJs (figuur 2A, B, C). Een gedetailleerde impressie van tHij TJ morfologie verkregen door overbrenging (figuur 2D) en vries breuk elektronenmicroscopie (figuur 2E), waaruit blijkt dat TJS zich tussen de cellen en vormen brede mazen kabelachtige structuren.
TJs van epitheelcellen ook fungeren als een hek om apicale en basolaterale membraan domeinen te scheiden en zo bijdragen tot de cellulaire polariteit. Onder de proteïnen, die uitsluitend tot expressie gebracht op het basolaterale celzijde van HIBCPP cellen, zijn de AJ-eiwit E-cadherine (Ecad) en de hepatocyte groeifactorreceptor (HGF / Met) zoals getoond door immunofluorescentie analyse in figuur 3, wat wijst op een zekere polariteit.
Wanneer gekweekt onder geschikte omstandigheden HIBCPP cellen vertonen ook typisch barrièrefunctie van de BCSFB formatie van een membraanpotentiaal en een lage permeabiliteit voor macromolecules. Bepaling van de membraanpotentiaal kan worden bereikt door meting van de TEER met behulp van een voltohmmeter. De permeabiliteit van de cellaag wordt gekwantificeerd door toepassing van FITC-gelabeld inuline, een suiker dat de laag in een paracellulaire wijze passeert. Hier tonen we de resultaten van een representatief experiment dat aantoont dat deze barrièrefunctie stabiel en vertonen geen aandoening bij standaardconcentraties dimethylsulfoxide (DMSO), een gemeenschappelijk oplosmiddel voor celstimulerende chemicaliën. Zoals te zien in Figuur 4A, werden TEER waarden gemeten vóór en na blootstelling van de cellen aan DMSO HIBCPP.
De cellen vertoonde een hoge membraanpotentiaal die reikte tot ongeveer 500 Ω x cm² aan het begin van het experiment alle voorwaarden. De gemeten TEER veranderde niet na 2 uur voor cellen behandeld met tot 0,2 vol% DMSO. Daarentegen TEER waarden verminderd op een dosis-afhankelijke wijze when hogere volumes werden toegepast (figuur 4A). Deze vermindering van membraanpotentiaal samenviel met een verhoogde permeabiliteit voor macromoleculen. Dat toevoeging van DMSO HIBCPP cellen tot 0,5 vol% resulteerde niet in een toename permeabiliteit voor Inuline, 1 vol% en 2% vol weergegeven effect, zij het in beperkte mate (figuur 4B). Verder controleerde de invloed van cytochalasine D, een krachtige remmer van actine polymerisatie op membraanpotentiaal en permeabiliteit van HIBCPP cellen. Behandeling van de cellen met 1 ug / ml cytochalasine D leidt tot een significante daling van TEER waarden en een toename van FITC-Inuline flux (figuur 4A, B). Dit effect kan verklaard worden door de opening van TJs veroorzaakt door cytochalasine D.
De HIBCPP cellijn als een model van het BCSFB kan worden toegepast om interacties van pathogenen en de barrière-vormende epitheelcellen bestuderen. Er zijn aanwijzingendat de bacterie N. meningitidis krijgt binnenkomst in het CNS door het oversteken van de BCSFB. Het is aangetoond dat Neisseria binnendringen HIBCPP cellen specifiek de basolaterale celkant relevante in vivo. Tijdens dit proces speelt de bacteriële capsule een belangrijke rol:-Capsule ontbreekt mutanten vertonen verhoogde invasie in HIBCPP cellen 5. In de volgende vergeleken we basolaterale invasie van de MC58 stam 17, zijn isogene mutant MC58siaD - deficiënt voor capsule productie 17 en de ingekapselde vervoerder isoleren α14 19,20. HIBCPP cellen werden geïnfecteerd met bovengenoemde gedurende een tijdsverloop van 4 uur bij een MOI van 10. Immunofluorescentie analyse onthulde significante stammen invasie van de twee pathogène stammen MC58 en MC58siaD -, terwijl slechts kleine invasie werden waargenomen voor de pathogene stam α14 ( figuur 5A). Een representatief beeld van de dubbele immunofluorescence microscopie van HIBCPP cellen geïnfecteerd met de respectieve stam wordt getoond in figuur 5A, B en C.
Figuur 1:. Standard en omgekeerde celkweek systeem in de standaard celcultuur (A, C) interactie van bacteriën met de CP epitheliale cellen kunnen worden onderzocht op de apicale celkant die wordt aangeduid met microvilli. De omgekeerde celkweeksysteem (B, D) kunnen we bacterie interacties met de basolaterale celmembraan, die betrokken is bij het binnendringen van bacteriën via de bloedbaan in het CZS te bestuderen. Voor de omgekeerde celkweek (E) HIBCPP cellen gezaaid op de onderzijde van het filter inserts. Hoe lager goed met inbegrip van het binnenste compartiment van het filterelement worden overspoeld met medium. Subsequently, wordt het medium opgezogen buitensporige zodanig dat de binnenste compartiment van het filterelement blijft gevuld. Op de eerste dag na het zaaien, worden celkweek filter inserts omgedraaid en gevuld met medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. HIBCPP cellen vertonen continue strengen van TJs De TJ eiwitten ZO-1 (A), Occludin (B) en Claudin-1 (C) werden HIBCPP cellen gedetecteerd. Panelen AC tonen apotome beelden. Midden van elk paneel: xy en gezichtsmening van de cellen; bovenzijde en rechterzijde: dwarsdoorsneden van verschillende optische schijfjes door de z -vlak. Schaal balken geven 10 urn. TJ structuur van HIBCPP cellen werd geanalyseerd door transmisSion elektronenmicroscopie. Cellen zijn onderling verbonden door TJS die zijn aangegeven met pijlen (D). De schaal balk geeft 1 micrometer. Freeze breuk elektronenmicroscopie studies visualiseren nauw mazen TJ strengen (E). De Schaal bar = 0,5 micrometer. De beelden in deze figuur werden oorspronkelijk gepubliceerd in Schwerk et al, PLoS ONE 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); re-print met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Expressie van receptoreiwitten betrokken bij invasie van bacteriën in HIBCPP Cells Immunofluorescentie analyse geeft uitdrukking van Ecad (A) en Met (B) aan de basolaterale cel kant.. de picturen laten zien apotome beelden. Midden van elk paneel: xy en gezichtsmening van de cellen; bovenzijde en rechterzijde: doorsnede van verschillende optische schijfjes door de z -vlak. Het apicale membraan van de HIBCPP cellen (met pijlen aangegeven) gepositioneerd aan de bovenkant van het bovenste gedeelte en naar rechts van de rechter zijde respectievelijk van elk frame. Schaalbalken = 10 urn. De gegevens in dit cijfer werden eerder gepubliceerd in Gründler et al, Microben Infect 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); re-print met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Invloed van DMSO en cytochalasine D op de barrièrefunctie van HIBCPP Cells Effecten op barrière func.tie worden bepaald door meting van TEER waarden en FITC-Inuline-Flux. Resultaten worden getoond voor één representatief experiment, dat werd uitgevoerd in drievoud. HIBCPP cellen werden behandeld met DMSO als Cytochlalasin D in de aangegeven hoeveelheden gedurende 2 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Wanneer toegepast in concentraties tot 0,2 vol% DMSO heeft geen invloed membraanpotentiaal (Figuur 4A). Concentraties van 0,1 vol% tot 0,5 vol% DMSO tonen geen invloed paracellulaire permeabiliteit van de cellen (Figuur 4B). Daarentegen 1 ug / ml cytochalasine D veroorzaakt een afname in TEER gelijktijdig met een verhoging van FITC-Inuline-flux door de cellaag (Figuur 4A, B).
Figuur 5: Invasie van N. meningitidis in HIBCPP Cells. Dubbele immunofluorescentie microscopie shows binnengevallen (groen) en nageleefd (geel) bacteriën. Witte dozen in afbeeldingen vertegenwoordigen de vergrote afbeelding detail aan de rechterkant. Basolaterale invasie werd waargenomen voor de N. meningitidis-stammen MC58 (A) en MC58siaD -, deficiënt capsuleproductie (B), terwijl slechts een geringe invasie werd bepaald voor α14 (C). Het diagram toont dat de invasie tarieven van MC58 en MC58siaD - zeer significant in vergelijking met α14 (**, p <0,01). Uitermate belangrijk wordt weergegeven als MC58 of MC58siaD - respectievelijk, werden vergeleken met α14 (*** p <0,001) en MC58siaD - vergeleken met MC58 (###, p <0,001). Schaal bars Indicate 10 urn. . Het schema in D werd oorspronkelijk gepubliceerd in Borkowski et al, J. Neuroinflammation 11: 163, doi: 10,1186 / s12974-014-0163-x (2014); re-print met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De epitheelcellen van de CP vormen de BCSFB dat de CSF uit het bloed 2,3 scheidt. We hebben onlangs vestigde de HIBCPP cellijn als een functioneel humaan model van de BCSFB. De cellen vertonen belangrijke barrièrefunctie van de BCSFB in vitro, waaronder de ontwikkeling van een hoge membraanpotentiaal, een lage permeabiliteit voor macromoleculen, alsmede de aanwezigheid van continue strengen TJs 5. TJ eiwitten dragen bij aan een apicale / basolaterale polariteit van de cellen. De polariteit van groot belang voor een gerichte lokalisatie van membraanreceptoren en specifieke transporteiwitten. We hebben aangetoond polaire lokalisatie van de receptoren Ecad en Met als lid van de ATP-bindende cassette (ABC) transporter familie die een sterk gecontroleerde micro-omgeving binnen het CNS 6,7 handhaaft.
Er zijn verschillende micro-organismen die in staat zijn om de toegang tot de CNS winnen door het overwinnen van de BCSFB zijn, leading tot ernstige ziekte, waaronder meningitis 8. Een van de pathogenen die in staat zijn tot invasie CP epitheliale cellen is de mensspecifieke Gram-negatieve bacterie N. 9,10 meningitidis, waarbij is aangetoond dat HIBCPP cellen voeren in een polair wijze bepaald uit de basolaterale celkant 5. Dit is de fysiologisch relevante richting voor infectie van de hersenen in de BCSFB wanneer bacteriën tijdens meningitis verspreiden en ontmoeting CP epitheelcellen uit het bloed. Om deze situatie in vitro geven, worden HIBCPP cellen gekweekt op de onderzijde van het filter. In tegenstelling tot de standaard filterelement model, waarin cellen worden gezaaid in het bovenste compartiment, het opzetten van een omgekeerde kweeksysteem maakt epitheelcellen specifiek infecteren van de cel basolaterale zijde 5,21.
Basolaterale invasie in HIBCPP cellen is waargenomen voor de twee pathogene N. meningitidis -, terwijl de niet-pathogene carrier isoleren α14 alleen weergegeven marginale invasie 15. Dit illustreert dat de HIBCPP cel model geeft de mogelijkheid om beschikbare mutant bibliotheken voor nieuwe virulentiefactoren betrokken bij de invasieproces scannen. Opmerkelijk is aangetoond dat andere pathogenen waaronder L. monocytogenes en Streptococcus suis (S. suis) binnenvallen HIBCPP cellen in een polaire mode 5,7.
Om te herkennen en reageren op binnendringende micro-organismen in het centraal zenuwstelsel, de epitheelcellen van de CP drukken PRRS 22,23. TLRs vormen een belangrijke familie in het PRRS. Kwalitatieve RT-PCR-analyses toonden aan dat HIBCPP cellen brengen verschillende TLRs evenals gerelateerde co-receptoren en de adapter molecule MyD88 15. Waargenomen is dat de receptoren TLR2 en TLR4 zijn betrokken bij de cellulaire afweerreactie tegen N. meningitidis kapselpolysacchariden 24. Verdere resultaten van een microarray benadering bleek dat HIBCPP cellen geïnfecteerd met N. meningitidis weer een inductie van signaaloverdracht, naast andere factoren, waarbij ook de transcriptie regulator IκBζ 15, verplicht voor expressie van bepaalde target genen zoals IL6 25,26, een pro-inflammatoire cytokine.
Om deze bevindingen te bevestigen, HIBCPP cellen geïnfecteerd met N. meningitidis in een omgekeerde kweeksysteem werden gebruikt om de afgifte van cytokinen en chemokinen te onderzoeken. Bekend is dat deze werkwijze beoogt een ontstekingsreactie door activering van het aangeboren immuunsysteem 13,14 aanzetten. HIBCPP cellen produceren en cytokinen en chemokinen, waaronder CXCL1-3, IL6, IL8 en TNFa 15,16, die zijn beschreven neutrofielen en monocyten 27 trekken. Door het gebruik van ons model systeem dat wevond dat polymorphnuclear neutrofielen, monocyten en ook T-lymfocyten migreren door HIBCPP cellen 16,28, benadrukken dat HIBCPP cellen die geschikt zijn voor het ontcijferen van de mechanismen van transepitheliaal migratie van immuuncellen.
De hier gepresenteerde model systeem biedt ook de mogelijkheid voor wijzigingen. HIBCPP cellen kunnen worden voorbehandeld met antilichamen of chemische remmers te identificeren receptoren en signaaltransductie routes betrokken bij infectie. DMSO, een gemeenschappelijk oplosmiddel voor celstimulerende reagentia kunnen worden toegepast in geschikte hoeveelheden tot de HIBCPP cellen, die stabiel barrièrefunctie die niet worden beïnvloed door de chemische gehele onderzochte tijdsverloop weergegeven. Deze eigenschap is ook relevant voor het gebruik van het model in de farmaceutische studies.
Hoewel we hebben aangetoond dat HIBCPP cellen vertonen een zekere mate van polariteit, zullen ze niet natuurlijk zo alle details van een in vivo model. <em> Bijvoorbeeld de lokalisatie van ABC transporter familieleden slechts gedeeltelijk overeenkomt met de verwachte patronen 6, waarom farmaceutische toepassingen kan waarschijnlijk alleen worden toegepast op een beperkte mate. Ook, de HIBCPP cellen geen CSF produceren (gegevens niet getoond). Wij hebben echter gevonden dat HIBCPP cellen brengen de eiwitten Transthyretine, insuline-achtige groeifactor 2 (IGF2) en forkhead box J1 (FOXJ1) op RNA-niveau 5, die kenmerkend merkereiwitten CP epitheelcellen 29,30,31,32 zijn . Deze waarneming ondersteunt dat HIBCPP cellen typische eigenschappen van CP epitheelcellen hebben behouden. Belangrijk, moet worden opgemerkt dat HIBCPP cellen presenteren geen contactremming. Het is daarom van cruciaal belang om de cellen te gebruiken voor experimenten waar nodig TEER waarden worden bereikt. Bovendien moet de HIBCPP cellen niet worden gebruikt na doorgang 38, omdat de kans op een barrièrefunctie ontwikkelen lijkt zakken bij hogere passages. Tot slot, om de imp bestuderendaad van cel-cel interacties tijdens infecties op de BCSFB een co-cultuur model bestaande uit CP epitheliale en endotheelcellen van groot belang zou zijn, maar een dergelijk model moet nog worden ontwikkeld.
Concluderend kan de HIBCPP celkweek model worden gebruikt om belangrijke invasiewegen en onderliggende signaaltransductie routes, met name van menselijke specifieke pathogenen op BCSFB onthullen. Aangezien het bekend is dat de epitheelcellen van de CP ook betrokken zijn bij degeneratieve neurologische ziekten waaronder de ziekte van Alzheimer en multiple sclerose 2, en ook in de hersenen metastase van tumorcellen 33, biedt het systeem in het algemeen een grote verscheidenheid aan mogelijkheden voor onderzoek ziektegerelateerde mechanismen die de potentie om nieuwe therapeutische doelstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
