Introduction
血液脳脊髄液関門（BCSFB）は、血液と脳の1の間に3つのバリアサイトの一つです。その形態学的相関脈絡叢（CP）2,3、強く脳室に血管新生および配置されている内皮上皮回旋の上皮細胞です。 CPは、脳脊髄液（CSF）を生成するだけでなく、血液から後者を分離するのに役立ちます。バリア機能を実現するために、CP上皮細胞は、低飲作用活性を示す特定のトランスポーターを発現し、そして密に密着結合（のTJ）2,3の連続的なネットワークで接続されています。
日本人女性4の悪性脈絡叢乳頭腫由来のヒト脈絡叢乳頭腫（HIBCPP）細胞は、BCSFBのインビトロモデルで機能を構築するために使用しました。 HIBCPP細胞は、TJの形成などの機能BCSFBの特性のいくつかを示してストランド、経上皮電気抵抗（TEER）のように決定することができる高い経上皮膜電位の開発、および高分子のマイナー透過性。また、HIBCPP細胞は、イオン性微小環境を調節するために機能し、基底外側/アピカル極性5,6,7を示すことが特徴的なトランスポーターを発現します。
BCSFBは、中枢神経系（CNS）8への病原体（細菌、ウイルス、および真菌）のための侵入部位として機能することが示されています。 髄膜炎菌 （ 髄膜炎菌 ）、グラム陰性菌、などの病原体の侵入は、髄膜炎などの重篤な病気を引き起こす可能性があります。 それはCPの保護上皮バリアを克服したという証拠は、血管およびCP上皮細胞9,10で髄膜炎菌の増加量を示す髄膜炎菌性疾患を有する患者における組織病 理学的観察によってサポートされています。宿主細胞のBAへの参入を得るために、cteriaは、多くの場合、宿主細胞上にある特定の表面受容体によって媒介またはトリガされるエンドサイトーシス機構を乗っ取ります。これらの受容体と病原体の相互作用は11種特異的であることができるので、動物モデルにのみ制限された範囲に相談することができます。 HIBCPP細胞株は、浸潤プロセスならびにヒトモデル系において根底にある分子メカニズムを研究する機会を提供します。細胞培養インサートを採用するには、2つのセルの側面から宿主細胞と病原体の相互作用を分析することを可能にしています。 N.含む多くの細菌、 髄膜炎菌は 、感染アッセイ中の重力の影響を強く受けます。アッセイ中HIBCPP細胞と病原体の最適な相互作用のために、細菌は、最初に細胞培養フィルターインサートシステムの上部コンパートメントに追加されます。それぞれ、頂端または側底細胞側からの感染を有効にするには、in vitroの系の2つのバリエーションは、ESTAされていますblished：標準システムではHIBCPP細胞は微生物がCSF-側に位置し、細胞（ 図1A、C）の頂端側と接触するように取得されたときの状況を模倣し、フィルタインサートの上部コンパートメントに播種します。対照的に、反転細胞培養フィルターインサートシステムにおいてHIBCPP細胞を使用して細菌が血流に入っている状態を反映しています。微生物は、側底側からの血液との出会いCP上皮細胞（ 図1B、D）に広めます。注目すべきは、このモデル系では、細菌は、基底細胞の側5,7から特に極性様式でHIBCPP細胞に侵入することが示されています。
続いてCPの感染、侵入する病原体パターン認識受容体（PRRは）への連結を介して自然免疫系によって認識され得ます。 PRRのよく説明メンバーは、Toll様受容体（TLR）ファミリーに属します。 TLRは缶ビン病原体関連分子パターン（PAMP）と呼ばれている感染性微生物の特徴構成に、D。受容体のライゲーションは、次にBCSFB 13,14を横切って免疫細胞の遊出を促進するサイトカインおよびケモカイン12の発現を誘発する宿主細胞のシグナル伝達カスケードの活性化をもたらします。 HIBCPP細胞は、mRNAレベルでいくつかのTLRを発現することが示され、N.とその感染されています髄膜炎菌は CXCL1-3、IL6、IL8およびTNFα15,16を含むいくつかのサイトカインおよびケモカインの分泌をもたらします。
ここでは、BCSFBを模倣反転細胞培養インサートシステムで栽培し、ヒト細胞株HIBCPPの感染を記述しています。このモデルシステムは、生体内の関連する側底細胞側だけでなく、その後の細胞応答と病原体の相互作用を研究することができます。
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Protocol
1.倒立モデル系で播種HIBCPP細胞のための細胞培養フィルターインサートを準備します
- 前加温DMEM / F12（ハム）を5μg/ mlのインスリン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）を補充しました。
- 逆さまに12ウェルプレート（ 図1E）に3ミクロンの細孔サイズで0.33 cm 2の成長領域の細胞培養フィルターインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。
- 細胞培養フィルターインサートの下の区画（約3ml）およびフィルターインサートの上に100μlのにメディアを埋めます。プレートだけでなく、媒体と下の区画をあふれさせます。フィルタインサートの下の区画が（ 図1E）満たされたままになるように、過剰な培地を吸引除去します。
注：このステップのための血清学的ピペットを使用することをお勧めします。 - 蓋で12ウェルプレートをカバーし、インキュベーターに調製した細胞培養用フィルタインサートを転送する、37°C細胞を添加するまで5％CO 2。
2.栽培とHIBCPP細胞の継代
- 5μg/ mlの、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび10％FCSを補充したDMEM / F12（ハム）を準備します。
- 37℃の水槽で予備暖かい媒体とPBS。フラスコから培地を吸引。フラスコやスワールに10mlのPBSを追加します。一度、この手順を繰り返します。
- フラスコやスワールに3ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 、インキュベーターに37℃、5％CO 2を配置します 。
- 約20分後、インキュベーターからフラスコを取り外します。細胞がフラスコの底から切り離されていることを確認し、顕微鏡で調査したときに円形が表示されます。
注：細胞は、互いから完全に切り離しておらず、しばしば凝集体中に見出されます。通路38までのセルを使用することをお勧めします。 - トリプシン処理を停止するには17ミリリットル培地を追加します。上下にピペッティングすることにより細胞を再懸濁し、懸濁液を移します50ミリリットルチューブに。室温で10分間、50×gで遠心分離します。
- 媒体の適切な量で細胞を再懸濁し、血球計数器を使用して細胞を数えます。
注：再懸濁HIBCPP細胞の濃度が1×10 6細胞/ mlであるべきです。 HIBCPP細胞の維持のために、T75フラスコに10 mlの培地中に1-6×10 6細胞の量を転送するために提案されています。一日おきに培地に変更します。
HIBCPP細胞と3シード反転細胞培養フィルターインサート
- （フィルタの底部側すなわち ）それぞれの逆フィルタインサートの上に細胞懸濁液（ すなわち 8×10 4細胞）（ 図1E）の80μlを添加します。
注：細胞が均等に播種する前にチューブを反転させることによって懸濁液中に分散されていることを確認します。 - インキュベーターに12ウェルプレート及び転写の蓋、37°C、5％Cを播種した細胞培養用フィルタインサートをカバーO 2。
- 初日に、24ウェルプレートのウェルに1ミリリットル培地を埋めます。 12ウェルプレートのうち、鉗子を用いて、細胞培養フィルターインサートを持ち上げ、内側の媒体を破棄し、フィルターインサートをオンにして調製した24ウェルプレート（ 図1E）に標準的な向きに配置します。
- 二日毎に新鮮な培地に細胞を配置します。新鮮な培地で24ウェルを準備し、それにフィルターインサートを移します。 0.5ミリリットルの新鮮な培地とインサートを記入してください。セクション4で説明したように、毎日TEERを確認してください。
- HIBCPPのTEER値は、細胞培養インサート上で細胞を播種すると70Ωのx cm 2で（約4日播種後）を超え、その後、1％FCSおよび5μg/ mlのインスリンを含有する培地中で細胞培養を続けます。各ウェルのための培地1ミリリットルで24ウェルプレートを準備します。上部コンパートメントに準備したウェルと交換媒体にフィルターインサートを転送します。
注：この血清除去を密集度は、の形成につながる後高い膜電位。 - フィルタ区画から培地を吸引は、よく準備に転送し、500μlの培地で埋めます。一度、この手順を繰り返します。 、インキュベーターに一晩、37℃、5％CO 2をセルに入れてください。
経上皮電気抵抗の4測定（TEER）
- 80％エタノール中で15分間、上皮組織voltohmmeterの電極チップを浸し。ボンネットの下voltohmmeterを移し、一瞬電極乾燥させます。平衡化するための別の15分間の細胞のために使用されるそれぞれの培養液中に電極を配置します。
- それは毎回下部コンパートメントの底に接するように電極の長いアームを配置することによって測定を行う、フィルターインサート区画に短い腕を置きます。
注： - ブランク値（Ω））×フィルタ培地中で細胞を含まない細胞培養フィルターインサートの抵抗値はブランク値（（実測値（Ω）として使用されるべきです表面（ すなわち 0.33 cm 2で））。 - 15分間80％エタノールに電極背面場を測定した後。ドライチューブ内に保管してください。
傍細胞透過性の5決意
- 5μg/ mlのインスリン、1％FCSを補充した200mLの培養培地中で1gのFITC-イヌリンを溶解します。細胞の感染前に、上部フィルタ室への溶液の50μg/ mlのを適用します。
- 感染後多くのイヌリンは、細胞層を介してフィルタ区画から渡される方法を決定するために、下の井戸から培地サンプルを収集。
- FITC-イヌリン標準液を調製し、1行う：2希釈、10倍（100％、50％、25％、12.5％、6.25％3.13％1.56％0.78％0.39％、0.2％及び0％）の。マイクロプレートリーダー内のすべてのサンプルを測定することにより蛍光を決定します。
細胞培養フィルターインサート上HIBCPP細胞の感染のための細菌の6.準備
- 実験前にある日、こすりトン彼冷凍N.髄膜炎菌は Vitoxとチョコレート寒天上でグリセロールストックと連勝をオフ株。 5％CO 2で、37℃で、インキュベーター中で一晩成長します。
- 一晩培養物から20〜30コロニーを抽出し、0.042パーセントのNaHCO 3、0.01 MのMgCl 2および1％Polyvitexを補っ8ミリリットルプロテオースペプトン培地を含むチューブに移します。
- 220rpmで、37℃で1.25時間、細菌を振ります。室温で10分間2,684 gでの遠心分離によって細菌をペレット。上清を捨て、8ミリリットルの無血清培地で細菌ペレットを再懸濁します。でも、サスペンションを確保するための渦。
- 培養密度を決定するために、600nmでの光学密度（OD）で1：10の希釈を測定します。 OD 0.1の600に細菌懸濁液を調整します。
注：この懸濁液を約含まれています。 1×10 8 CFU / mlです。 - 細菌細胞濃度を確認するAまで懸濁液を段階的（1:10）希釈しますチョコレート寒天プレート上に10 -5の希釈およびプレート。
注：同様の連続希釈は、細菌増殖曲線を計算するために実行される必要があります。
二重免疫による細菌の侵入の細胞培養フィルターインサートと決意にHIBCPP細胞の7感染
- 1％FCSおよび5μg/ mlのインスリンを含有する培地中で細胞培養を継続した後、上皮組織voltohmmeterを使用して毎日細胞を測定します。細胞は約500Ωのx cm 2でのTEERに達した場合は、感染を行います。
- 指定された時間が経過し、5％CO 2で、37℃で、10店の感染多重度で準備された細菌懸濁液（MOI）で細胞インキュベーターで感染細胞に感染します。
注：MOIがコンフルエンス（1.21×10 6細胞/ cm 2）で考慮細胞培養フィルターインサートあたりの細胞数を取ることによって計算することができます。 - 未感染を停止1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する500μlの無血清培地で3回洗浄することによってイオン（SFM）は、下部コンパートメントに、フィルタ室1 mlで適用しました。
- 非特異的結合部位に対する抗体の付着を防止するために、1％BSAフィルタ室のバッファと、室温で20分間、下部コンパートメント1 mlを含む500μlのSFMでブロック。
- 100μlの一次抗体抗Nでインキュベートフィルタコンパートメント内、室温で20分間、下の区画で500μlの：meningtidisα-OMP（200 1）。
注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。 - フィルタ区画から培地を吸引して細胞を洗浄し、1％BSAを含有する調製ウェル1 mLのSFMにフィルタインサートを転送し、1％BSAを含有する500μlのSFMで空にフィルタ室を満たします。二回、この手順を繰り返します。
- フィルタのコンパに500μlの4％ホルムアルデヒドで細胞を固定してくださいrtment、室温で10分間、下部コンパートメント1 mlです。
- フィルタ区画から培地を吸引して細胞を洗浄し、1mlのPBSでよく準備し、500μlのPBSで空にフィルタ室を埋めるために、フィルタインサートを移します。一度、この手順を繰り返します。
注：サンプルを4℃でPBS中に一晩保存することができます。 - 切断インサートの外細胞培養フィルターを固定し、250μlのPBS、1％BSAを含有する洗浄します。細胞外細菌を染色するために：標識された250μlの蛍光（励起波長594 nm）を二次抗体ニワトリ抗ウサギ（500 1）を用いて室温で15分間、細胞をインキュベートします。
注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。 - 250μlのPBSを室温で1時間、1％BSAおよび0.5％トリトンX-100を含有する細胞透過性。 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。
- 250μlの一次抗体抗Nでインキュベート髄膜炎菌
- （1：500）、蛍光標識した（励起波長660 nm）をファロイジン（1：250）および4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）（蛍光標識を250μl（励起波長488 nm）を二次抗体を適用します。 1：50,000）を室温で1時間細胞外および細胞内細菌、アクチン細胞骨格と核を染色しました。
注：必要に応じて、抗体濃度を滴定する必要があります。 - 250μlのPBS、1％BSAを含有する細胞を3回洗浄します。顕微鏡を介して、検査まで4℃でメディアや店舗を実装する際に細胞を埋め込みます。
- 事前に定義されたフィールドごとに侵入した細菌の数を決定します。フィルター膜当たり20フィールドをカウントすることによってこれを行います。侵入した細菌の割合を計算します。
注：エリアcoefficと20の顕微鏡視野の平均細菌数を掛けient。結果は、0.33 cm 2の細胞培養フィルターインサート中に存在する全細菌の量を表します。感染期間中に培地中で増殖させた細菌の量によって、この値を割ります。
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Representative Results
ここでは、反転し、細胞培養インサートシステムでHIBCPP細胞の培養および感染を説明します。このモデルは、私たちは（ 図1）を普及し、血流を介して上皮細胞に侵入する細菌の生理学的状況を再現、側底細胞側から侵入メカニズムとその下にある分子のシグナル伝達経路を研究することができます。
HIBCPP細胞は最低レベルに分子交換を制限することを可能に特定のバリア機能を、表示します。これは、接着結合（AJ）とタイトジャンクション（TJ）タンパク質の発現によって達成されます。 TJ関連タンパク質オクルディン、クローディンおよびZO-1の免疫蛍光分析は、細胞がのTJの連続ストランド（ 図2A、B、C）によって相互接続されていることを実証し、細胞-細胞接触の部位に中断されないシグナルを明らかにしました。トンの詳細な印象彼TJの形態は、送信（ 図2D）によって得られるとのTJは、セル間に位置し、広い、噛合ケーブル様構造を形成していることを示している破断電子顕微鏡検査（ 図2E）を 、凍結されています。
上皮細胞ののTJもありますので、携帯極性に貢献し、頂端および側底膜ドメインを分離するフェンスとして働きます。 図3に免疫蛍光分析によって示されるようにHIBCPP細胞の基底細胞側に排他的に発現されるタンパク質のうち、AJタンパク質E-カドヘリン（ECAD）と肝細胞増殖因子受容体（HGF / MET）である、を指し極性のあるレベル。
適切な条件下で培養するとHIBCPP細胞はまた、膜電位の形成のようなBCSFBの典型的なバリア機能だけでなく、macromoleのための低透過性を示しますcules。膜電位の決意をvoltohmmeterを使用してTEERを測定することによって達成することができます。細胞層の透過性は、FITC標識イヌリン、傍細胞的に層を通過する砂糖の適用によって定量されます。ここでは、これらのバリア機能が安定したままで、ジメチルスルホキシド（DMSO）、細胞刺激の化学物質のための一般的な溶剤の標準濃度によって全く影響を示さないことを実証している代表的な実験の結果を示します。 図4Aに見られるように、TEER値は、DMSOにHIBCPP細胞の曝露の前および後に記録しました。
細胞はすべての条件のために、実験の開始時に約500Ωのx cm 2で最大に達し、高い膜電位を示しました。測定されたTEERは、最大0.2体積％のDMSOで処理した細胞のための2時間後に変化しませんでした。対照的に、TEER値は、用量依存的にWHに減少しました高いボリュームが適用されたエン（ 図4A）。膜電位の減少は、巨大分子のための透過性の増大に付随しました。 0.5体積％のHIBCPP細胞にDMSOを添加するまではイヌリンのための浸透性の増加をもたらさなかったのに対し、1容量％と2体積％は、制限された範囲（ 図4B）にあるが、効果を示しました。さらに、我々はHIBCPP細胞の膜電位及び透過性に、サイトカラシンD、アクチン重合の強力な阻害剤の影響を調べました。 1 / mlのサイトカラシンDでの細胞の処理は、TEER値の有意な低下だけでなく、FITC-イヌリンフラックスの増加（ 図4A、B）を引き起こします。この効果は、サイトカラシンDによって引き起こさのTJの開口によって説明することができます
BCSFBのモデルとしてHIBCPP細胞株は、病原体および障壁形成上皮細胞の相互作用を研究するために使用することができます。証拠があります細菌N.こと髄膜炎菌は BCSFBを交配することによって、CNSへの参入を得ます。 ナイセリアが インビボで関連する基底細胞側から特にHIBCPP細胞に侵入することが示されています。このプロセスの間に細菌カプセルが重要な役割を果たしている：カプセル-欠いた変異体はHIBCPPセル5内に侵入増加を示します。以下では、我々はMC58株17の側底侵入を比較し、その同質遺伝子変異MC58siaD -カプセル製造17とカプセル化されていないキャリアのための欠損は、α1419,20を分離します 。わずかな侵入率は（非病原性α14株について観察されたのに対し、 - HIBCPP細胞は10免疫蛍光分析のMOIで4時間の時間経過にわたって、上記の株を感染させた2病原株MC58とMC58siaDのための重要な侵略を明らかにしました図5A）。ダブルimmunofluの代表画像それぞれの株に感染HIBCPP細胞のorescence顕微鏡は、 図5A、BおよびCに示されています。
図1：標準および反転細胞培養システムは、 標準的な細胞培養系において、CP上皮細胞と細菌の（A、C）の相互作用は、微絨毛によって示される頂端細胞側で調査することができます。反転細胞培養系（B、D）は、私たちがCNSへの血流を介した細菌の侵入の際に関与している側底細胞膜と細菌の相互作用を研究することができます。 反転され、細胞培養のための（E）HIBCPP細胞がフィルタインサートの底面上に播種されます。下部ウェルフィルターインサートの内部区画を含む培地が殺到しています。 Subsequまったく別、過度のメディアは、フィルタインサートの内部区画を充填ままになるように吸引します。播種後の最初の日に、細胞培養フィルターインサートがひっくり返され、培地で満たした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図2：HIBCPP細胞のTJの連続ストランドを表示 TJタンパク質ZO-1（A）、オクルディン（B）と、クローディン1（C）は HIBCPP細胞で検出されました。パネルA〜CはApotomeの画像を示します。各パネルのセンター：細胞の顔ビュー専用のxy。 z -planeを通じていくつかの光学切片の断面：上部と右側。スケールバーは10μmで示しています。 HIBCPP細胞のTJ構造はtransmisにより分析しましたシオン電子顕微鏡。細胞は、矢印（D）によって示されているのTJによって相互接続されています。スケールバーは1μmのを示しています。フリーズフラクチャー電子顕微鏡研究は密接TJストランド（E）噛み合っ視覚化します。 = 0.5μmのスケールバー。この図の画像は、もともとSchwerk らに掲載された、PLOS One 7：e30069、DOI：10.1371 / journal.pone.0030069（2012）;再印刷権限を持つ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：HIBCPP細胞内細菌の侵入の間に関与する受容体タンパク質の発現基底外側セル側のECAD（A）およびMet（B）の免疫蛍光分析を表示し表現。 picturesがApotomeの画像を示します。各パネルのセンター：細胞の顔ビュー専用のxy。上部と右側： のz -planeを通じていくつかの光学切片の断面図。 HIBCPP細胞（矢印で示される）の頂端膜は、各フレームの、それぞれ、上部の上の方だけでなく、右側の右側に配置されています。スケールバー=10μmです。 。この図のデータもグリュントラーらに以前に公開された、 微生物が感染する 15：291-301、DOI：10.1016 / j.micinf.2012.12.005（2013）;。再印刷権限を持つ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：HIBCPP細胞のバリア機能にDMSOおよびサイトカラシンDの影響バリアFUNCへの影響。ンは、TEER値およびFITC - イヌリン - フラックスを測定することによって決定されます。結果は、三連で実施した代表的な一実験のために示されています。 HIBCPP細胞は2時間示された量でDMSOならびにCytochlalasin Dで処理した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
0.2体積％までの濃度で適用された場合、DMSOは、膜電位（ 図4A）には影響しません。 0.1体積％アップからDMSOの0.5体積％の範囲の濃度は、細胞（ 図4B）の傍細胞透過性に影響を及ぼしません。対照的に、1 / mlのサイトカラシンDは細胞層（ 図4A、B）を介してFITC-イヌリン、フラックスの増加にTEERの付随の減少を引き起こします。
図5：Nの侵攻 HIBCPP細胞への 髄膜炎菌 。二重免疫蛍光顕微鏡ショー侵攻（緑）及び付着（黄色）の細菌。画像内のホワイトボックスが右側に拡大画像細部を表します。基底外側侵攻はNのために観察されました髄膜炎菌株MC58（A）及びMC58siaD - 、カプセルの製造（B）欠損、わずかな浸潤率はα14（C）を求めたのに対し。 α14（**、P <0.01）と比較したときに非常に重要である-図は、MC58とMC58siaDの侵入率があることを示しています。 、それぞれ、α14（***はp <0.001）と比較したとMC58siaD - -エクストリーム意義はMC58またはMC58siaDがときに表示されるMC58（###、P <0.001）と比較しました。スケールはインディカバーTEは10μm。 。Dでの図は、もともとBorkowskiに掲載されたら 、J神経炎症 11：163、DOI：10.1186 / s12974-014-0163-X（2014）;再印刷権限を持つ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
CPの上皮細胞は、血液2,3からCSFを分離BCSFBを形成します。我々は最近、BCSFBの機能性ヒトモデルとしてHIBCPP細胞株を確立しました。細胞は、高い膜電位の開発、巨大分子のための低透過性、ならびにのTJ 5の連続ストランドの存在を含むin vitroでの BCSFBの重要なバリア機能を表示します。 TJ蛋白質は、細胞の基底外側/頂端の極性に寄与する。極性は、表面受容体ならびに特定のトランスポータータンパク質の指向局在のため非常に重要です。私たちは、極性受容体ECADおよびMetの局在ならびにCNS 6,7内の高度に制御された微小環境を維持し、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターファミリーのメンバーを示しています。
いくつかのBCSFBを克服することによって、CNSへのエントリーを獲得することができます微生物、最先端レベルがあります。髄膜炎8を含む重篤な疾患にグラム。 CP上皮細胞に侵入することが可能な病原体の一つは、ヒト特異的グラム陰性菌Nです。特に基底細胞側5から極性様式でHIBCPP細胞に入ることが示された髄膜炎菌 9,10。細菌が髄膜炎の経過中に普及し、血液からCP上皮細胞に遭遇したとき、これはBCSFB全体の脳の感染の生理学的に関連する方向です。 インビトロでのこのような状況を反映するために、HIBCPP細胞がフィルタの下側に成長させます。細胞を上部コンパートメントに播種され、標準的なフィルタインサートモデルとは対照的に、反転培養系のこのセットアップは、特に基底細胞側5,21からの上皮細胞に感染することができます。
HIBCPP細胞への基底外側侵入は2病原N.のために観察されています髄膜炎菌 -非病原性キャリアが分離するのに対し、α14はごくわずか侵略15を表示しました。これはHIBCPP細胞モデルが侵入プロセス中に関与する新規病原因子の利用可能な突然変異体のライブラリーをスキャンする可能性を提供することを示しています。注目すべきは、これは、Lを含む他の病原体が実証されていますモノサイトゲネスおよびストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）（S. のsuisのは ）極性ファッション5,7にHIBCPP細胞に侵入します。
認識し、CNSへの微生物の侵入に対応するため、CPの上皮細胞はPRRの22,23を発現します 。 TLRはPRRの中で重要な家族を表します。定性RT-PCRはHIBCPP細胞は、いくつかのTLRだけでなく、関連する共受容体とアダプター分子MyD88に15を発現することを実証した分析します。受容体、TLR2およびTLR4はNに細胞防御反応に関与していることが観察されていますmeningitidis莢膜多糖24。マイクロアレイアプローチのさらなる結果はHIBCPP細胞がNで感染させたことを明らかにしました髄膜炎菌はまた、25,26 IL6を含む特定の標的遺伝子の発現のために必須の転写調節因子IκBζ15、炎症性サイトカインが関与する他の因子の中で、シグナル伝達経路の誘導を示します。
これらの知見を確認するために、HIBCPP細胞はNに感染し反転培養系における髄膜炎菌は、サイトカインおよびケモカインの放出を調べるために使用されています。なお、この処理は、自然免疫系13,14の活性化によって炎症反応を引き起こすことを目的とすることが知られています。 HIBCPP細胞 生産し、好中球および単球27を誘致するために記載されているCXCL1-3、IL6、IL8およびTNFα15,16、などのサイトカインおよびケモカインを分泌します。我々のモデルシステムの我々を採用することによりpolymorphnuclear好中球、単球とはまた、Tリンパ球はHIBCPP細胞が免疫細胞の経上皮移動のメカニズムを解読するのに適していることを強調し、HIBCPPセル16,28を通って移動することを見出しました。
本明細書に提示モデル系はまた、変更のための機会を提供しています。 HIBCPP細胞は、受容体と感染の間に関与するシグナル伝達経路を同定するために、抗体または化学阻害剤で前処理することができます。 DMSOは、細胞刺激試薬のための共通溶媒を検討し、時間経過を通して化学によって影響されない安定したバリア機能を表示HIBCPP細胞に適切なボリュームにも適用することができます。このプロパティはまた、医薬研究におけるモデルの使用に関連します。
我々はHIBCPP細胞は極性の一定のレベルを示すことが実証されているが、それらは自然にin vivoモデルの一つ一つの細部に反映されません。 <医薬用途は、おそらく唯一の制限された範囲に適用することができる理由のem>例えば、ABCトランスポーターファミリーメンバーの局在化が部分的にのみ、期待値パターン6と一致します 。また、HIBCPP細胞（データは示していない）CSFを産生していないようです。それにもかかわらず、我々はHIBCPP細胞はCP上皮細胞29,30,31,32をするための特性マーカータンパク質であるRNAレベル5上のタンパク質トランスサイレチン、インスリン様成長因子2（IGF2）とフォークヘッドボックスJ1（FOXJ1）を、発現することを発見しました。この観察はHIBCPP細胞がCP上皮細胞の典型的な特性を保持していることを支持しています。重要なことにはHIBCPP細胞が存在する接触阻害をしないことに留意すべきです。適切なTEER値に達したときに実験のために細胞を使用することが重要です。バリア機能を開発する可能性が高い通路に落下するようですので、また、HIBCPP細胞は、通路38を超えて使用することはできません。最後に、IMPを勉強しますCP上皮および内皮からなる共培養モデルは、高い関心があるであろうBCSFBにおける感染の間の細胞 - 細胞相互作用の行為が、そのようなモデルは、まだ開発される必要があります。
結論として、HIBCPP細胞培養モデルは、特にBCSFBにおけるヒト特異的病原体の主要な侵入経路と、基礎となるシグナル伝達経路を明らかにするために使用することができます。 CPの上皮細胞はまた、アルツハイマー病などの神経変性疾患ならびに多発性硬化症2に関与し、そしてまた、腫瘍細胞33の脳転移において、システムは、機会の一般的な多種多様に提供されることが知られているよう疾患関連機構の調査のため、新たな治療標的を発見する可能性を提供します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
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