Introduction
Барьер жидкость кроваво-спинномозговой (BCSFB) является одним из трех барьерных участков между кровью и мозгом 1. Его морфологический коррелят являются эпителиальные клетки сосудистое сплетение (CP) 2,3, эндотелиальный-эпителиальной гофр, который сильно развитую сосудистую сеть и находится в желудочках головного мозга. CP служит для получения цереброспинальной жидкости (CSF), а также для отделения последнего из крови. Для достижения барьерной функции, СР эпителиальные клетки показывают низкую активность pinocytotic, выражают специфические транспортеров, и плотно связаны непрерывной сетью плотных контактов (TJS) 2,3.
Человеческого хориоидпапиллома (HIBCPP) клетки, полученные из злокачественной хориоидпапиллома японской женщины 4, были использованы для построения функционала в пробирке модели BCSFB. HIBCPP клетки показывают пару характеристик функционального BCSFB как образование TJпрядей, развитие высокой трансэпителиальной мембранного потенциала, который может быть определен в качестве трансэпителиальная электрического сопротивления (TEER), а также незначительные проницаемостей для макромолекул. Кроме того, HIBCPP клетки экспрессируют характерные транспортеров, которые могут служить для регулирования ионной микросреду, и показать апикальной / базолатеральная полярности 5,6,7.
BCSFB было показано , использовался в качестве сайта входа для болезнетворных микроорганизмов (бактерий, вирусов и грибов) в центральную нервную систему (ЦНС) 8. Вторжение патогенных микроорганизмов, в том числе менингококк (N.meningitidis , ), грамотрицательные бактерии, может вызвать серьезные заболевания , как менингит. Доказательства того, что он преодолевает защитный барьер эпителиальные СР поддерживается гистопатологических наблюдений у больных с менингококк экспонирование повышенное количество менингококков в сосудах и CP эпителиальных клеток 9,10. Для того, чтобы получить вход в клетки-хозяева баcteria часто угон эндоцитозного механизмы, которые опосредованы или по заданным поверхностными рецепторами, расположенными на клетках-хозяевах. Так как взаимодействия патогенов с этими рецепторами , могут быть виды конкретных моделей 11, животных можно обратиться лишь в ограниченной степени. Клеточная линия HIBCPP дает возможность изучить процесс вторжения, а также лежащие в основе молекулярных механизмов в модельной системе человека. Использование клеточных культур вставок позволяет анализировать взаимодействия патогенов с клетками-хозяевами из двух разных сторон клеток. Многие бактерии, в том числе Н. менингита, сильно подвержены воздействию силы тяжести во время анализов инфекции. Для оптимального взаимодействия патогенов с клетками HIBCPP в ходе теста, бактерии сначала добавлены в верхний отсек системы фильтрующего элемента клеточной культуры. Чтобы включить инфекцию от апикальной или базолатеральной стороне клеток, соответственно, два варианта системы в пробирке был Эстащающие: В стандартной системе HIBCPP клетки высевают в верхний отсек вставки фильтра, имитируя ситуацию , когда микроорганизмы находятся на CSF стороне и войти в контакт с апикальной стороне клеток (Фигура 1А, С). В противоположность этому, используя клетки HIBCPP в перевернутом культивирования клеток системы фильтра вставки отражает условия, когда бактерии попали в кровеносную. Микроорганизмы распространение в крови и столкновение CP эпителиальных клеток от базолатеральной стороны (рис 1B, D). Стоит отметить, что в этой модельной системе , было показано , что бактерии вторгаются клетки HIBCPP в полярном моды конкретно от базолатеральной стороны ячейки 5,7.
Впоследствии к заражению СР, инфильтрации патогены могут быть признаны врожденной иммунной системы посредством перевязки с рецепторами распознавания образов (РРСС). Хорошо описанные члены PRRs принадлежат к семейству Toll-подобный рецептор (TLR). может TLRs бинd к характерным структурам инфекционных микроорганизмов, которые называются патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs). Лигирование рецепторов приводит к активации клетки - хозяина сигнальных каскадов , которые вызывают экспрессию цитокинов и хемокинов 12, который в свою очередь стимулирует трансмиграции иммунных клеток поперек BCSFB 13,14. Было показано , что HIBCPP клетки экспрессируют несколько TLRs на уровне мРНК , так и , что заражение N. менингита приводит к секреции ряда цитокинов и хемокинов, включая CXCL1-3, IL6, IL8 и TNF & alpha ; 15,16.
Здесь мы описываем выращивание и заражение линии клеток человека HIBCPP в перевернутой системе вставки клеточной культуры, которая имитирует BCSFB. Эта модель система позволяет исследовать взаимодействия патогенов с в естественных условиях соответствующей стороны базолатеральной клеток, а также последующего клеточного ответа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеточной культуре вставные фильтры для высева HIBCPP клеток в системе перевернутой модели
- Предварительно теплой DMEM / F12 (HAM), дополненной 5 мкг / мл инсулина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS).
- С помощью стерильного пинцета поместить 0,33 кв.см область роста клеточной культуры фильтрующие элементы с размером пор 3 мкм , в перевернутом положении в 12-луночный планшет (рис 1E).
- Наполните среды в нижний отсек вставки фильтра для культивирования клеток (около 3 мл) и добавляли по 100 мкл на верхней части фильтрующего элемента. Затопите пластины, а также нижний отсек со средой. Аспирируйте чрезмерную среду таким образом , что нижний отсек вставки фильтра остается заполненной (рис 1E).
Примечание: Рекомендуется использовать серологические пипетки для этого шага. - Крышка 12-луночный планшет с крышкой и передать Приготовленную культуру клеток фильтрующие элементы в инкубаторе, 37 ° С,5% СО 2 до добавления клеток.
2. Выращивание и пассажи HIBCPP клеток
- Подготовка DMEM / F12 (HAM), дополненную 5 мкг / мл, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10% FCS.
- Предварительно теплая среда и PBS в C водяной бане при 37 °. Отберите среду из колбы. Добавляют 10 мл PBS в колбу и вихрем. Повторите этот шаг один раз.
- Добавить 3 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в колбу и завихрения. Поместите в инкубатор, 37 ° C, 5% CO 2.
- После примерно 20 мин удалить колбу из инкубатора. Убедитесь, что клетки отделяют от дна колбы и отображать круглую форму при обследовании с помощью микроскопа.
Примечание: Ячейки не отделяться полностью друг от друга и часто встречаются в агломераты. Рекомендуется использовать клетки до прохода 38. - Чтобы остановить трипсинизации добавить 17 мл среды. Ресуспендируют клеток с помощью пипетки вверх и вниз и передать подвескув 50 мл пробирку. Центрифуга при 50 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клеток в соответствующем объеме среды и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
Примечание: Концентрация ресуспендировали клеток HIBCPP должна составлять 1 × 10 6 клеток / мл. Для поддержания клеток HIBCPP предлагается перевести сумму в размере 1-6 х 10 6 клеток в 10 мл среды для Т75-колбы. Изменение средней каждый второй день.
3. Посев Перевернутый Cell Culture фильтров Вставки с HIBCPP клеток
- В верхней части каждой перевернутой фильтрующего элемента (то есть нижней стороне фильтра) добавляют 80 мкл клеточной суспензии (то есть. 8 х 10 4 клеток) (рис 1E).
Примечание: Убедитесь, что клетки равномерно распределены в суспензии путем переворачивания пробирки перед посевом. - Накройте отобранный-клеточной культуры фильтрующие элементы с крышкой 12-луночного планшета и передачи в инкубатор, 37 ° C, 5% CO 2.
- В первый день, заполнить 1 мл среды в лунки 24-луночного планшета. Поднимите фильтрующие элементы культуры клеток с помощью щипцов из 12-луночного планшета, выбросьте среды внутри, включить фильтр вставки и поместить их в стандартной ориентации в подготовленную 24-луночного планшета (рисунок 1E).
- Поместите клетки в свежую среду каждый второй день. Подготовка 24-х скважин со свежей средой и передачи фильтра вставки к нему. Наполните вкладыши с 0,5 мл свежей среды. Проверьте TEER каждый день, как это описано в разделе 4.
- Когда значения Teer из HIBCPP посеянных клеток на клеточной культуре вставками превышает 70 Ω х см² (примерно через 4 дня после посева), а затем продолжить культуру клеток в среде, содержащей 1% FCS и 5 мкг / мл инсулина. Подготовка 24-луночные планшеты с 1 мл среды для каждой лунки. Передачи фильтра вставки на подготовленные лунки и обменной среды в верхнем отсеке.
Примечание: Этот вывод сыворотки после сплошности приводит к образованиюболее высокий мембранный потенциал. - Отберите среду из фильтра отсека, трансфер в хорошо подготовились и залить 500 мкл среды. Повторите этот шаг один раз. Помещенный клеток в течение ночи в инкубаторе, 37 ° C, 5% CO 2.
4. Измерение трансэпителиальная электрического сопротивления (TEER)
- Погрузитесь электрода кончики voltohmmeter эпителиальной ткани в течение 15 мин в 80% этаноле. Передача voltohmmeter под капотом и дайте высохнуть электрода на мгновение. Поместите электрод в соответствующей культуральной среде, используемой для клеток в течение еще 15 мин для уравновешивания.
- Провести измерения, расположив более длинную руку электрода так, чтобы он касался нижней части нижнего отсека каждый раз, поместите более короткую руку в фильтр вставки отсека.
Примечание: значения сопротивления клеточных культур фильтрующих вставок без клеток в среде следует использовать в качестве пустых значений ((измеренное значение (Ω) - пустое значение (Ω)) х фильтрповерхность (т.е. 0,33 кв.см) , ). - После того, как место для измерения электрод обратно в 80% этаноле в течение 15 мин. Хранить в сухом трубке.
5. Определение парацеллюлярная Проницаемость
- Растворить 1 г FITC-инулин в 200 мл культуральной среды, дополненной 5 мкг / мл инсулина 1% FCS. Применяют 50 мкг / мл раствора в верхний отсек фильтра перед заражением клеток.
- После заражения собирают средние пробы из нижней лунки, чтобы определить, сколько Инулин переходил из фильтрующего отсека через слой клеток.
- Готовят стандартный раствор FITC-инулин и выполнить 1: 2 разбавленные в 10 раз (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% и 0%) , Определение флуоресценции путем измерения всех образцов в планшет-ридере.
6. Подготовка бактерий для инфекции HIBCPP клеток на клеточной культуре вставные фильтры
- За один день до эксперимента, царапанье тон замороженное Н. Штаммы от менингита глицерина на складе и полоса на шоколадный агар с Vitox. Расти в течение ночи в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2.
- Извлечение 20-30 колоний из ночной культуры и переносят в пробирку , содержащую 8 мл протеоза пептон , дополненную 0,042% NaHCO 3, 0,01 М MgCl 2 и 1% Polyvitex.
- Взболтать бактерии в течение 1,25 ч при 220 оборотах в минуту, 37 ° С. Гранул бактерий путем центрифугирования при 2684 г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и ресуспендируют бактериальных гранул с 8 мл не содержащей сыворотки среде. Вихревой для обеспечения однородной суспензии.
- Для определения плотности культуры, измеряют разведение 1:10 при оптической плотности (OD) на длине волны 600 нм. Отрегулировать бактериальной суспензии на OD 600 0,1.
Примечание: Эта суспензия содержит ок. 1 х 10 8 КОЕ / мл. - Для подтверждения концентрации бактериальной клетки, развести подвески ступенчато (1:10) вплоть доразведение 10 -5 и пластины на шоколадный агар пластин.
Примечание: необходимо выполнить для расчета кривых роста бактерий Подобные серийные разведения.
7. Инфекция HIBCPP клеток на клеточной культуре вставные фильтры и определение бактериального вторжения двойной иммунофлуоресценции
- Продолжив культуры клеток в среде, содержащей 1% FCS и 5 мкг / мл инсулина, измеряют клетки каждый день, используя voltohmmeter эпителиальной ткани. Если клетки достигли TEER составляет около 500 Ω х cm², осуществляют инфекцию.
- Инфицировать клетки с приготовленной бактериальной суспензии при множественности инфекции (MOI) из 10. Хранить инфицированных клеток в инкубатор при 37 ° C, 5% CO 2 в течение указанного периода времени.
Примечание: MOI можно рассчитать с учетом количества клеток на клеточной культуры фильтрующего элемента при слиянии (1.21 х 10 6 клеток / см 2). - Прекратить Infectиона трижды промывали 500 мкл не содержащей сыворотки среде (SFM), содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), подаваемую на фильтровальной отсек, 1 мл в нижний отсек.
- Блок с 500 мкл SFM, содержащую 1% буфера BSA в фильтрующем отсеке и 1 мл в нижнем отделении в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы предотвратить прилипание антител к неспецифических сайтов связывания.
- Инкубируйте 100 мкл первичного антитела анти N. meningtidis α-OMP (1: 200) в фильтрующем отделении и 500 мкл в нижнем отделении в течение 20 мин при комнатной температуре.
Примечание: При необходимости, концентрация антитела должно быть титруют. - Промывают клетки аспирацией среды из фильтровальной камеры, передавать фильтрационную вставку к подготовленному хорошо с 1 мл SFM, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина и заполнить опустели фильтр отсек с 500 мкл SFM, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Повторите этот шаг дважды.
- Fix клеток с 500 мкл 4% формальдегида в фильтре комrtment, 1 мл в нижнем отделении в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Промывают клетки аспирацией среды из фильтровальной камеры, передавать фильтрационную вставку к подготовленному хорошо с 1 мл PBS и заполнить опустели фильтр отсек с 500 мкл PBS. Повторите этот шаг один раз.
Примечание: Образцы могут храниться в течение ночи в PBS при 4 ° С. - Вырезать культуры фиксированной ячейки отфильтровывает вставок и промывают 250 мкл PBS, содержащим 1% BSA. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре с помощью 250 мкл флуоресцентной меченой (длина волны возбуждения 594 нм) вторичного куриного антитела против кролика (1: 500), чтобы окрасить внеклеточных бактерий.
Примечание: При необходимости, концентрация антитела должно быть титруют. - Проницаемыми клеток с 250 мкл PBS, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,5% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре. Мыть клетки три раза с 250 мкл PBS, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина.
- Инкубируют 250 мкл первичного антитела против N. менингита
- Применить 250 мкл флуоресцентного меченого (длина волны возбуждения 488 нм) вторичным антителом (1: 500), флуоресцентный маркированы (длина волны возбуждения 660 нм) фаллоидином (1: 250) и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) ( 1: 50000) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы окрасить внеклеточном и внутриклеточном бактерии, актинового цитоскелета и ядра.
Примечание: При необходимости, концентрация антитела должно быть титруют. - Мыть клетки три раза с 250 мкл PBS, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Вставить клетки в среду не монтажа и хранить при температуре 4 ° С до обследования с помощью микроскопа.
- Определить количество вторгшихся бактерий на предопределенное поле. Сделайте это путем подсчета 20 полей в фильтрующую мембрану. Вычислить процент вторгшихся бактерий.
Примечание: Умножьте среднее количество бактерий 20 микроскопических полей с площадью coefficнике,. В результате выражает количество присутствующих в 0,33 см ² для культивирования клеток фильтрующего элемента в общей бактерии. Разделите эту величину количества бактерий, выращенных в среде во время продолжительности инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы опишем культивирование и инфицирование клеток HIBCPP в перевернутом системе вставки клеточной культуры. Эта модель позволяет изучать механизмы вторжения и основные пути передачи сигналов от молекулярного базолатеральной стороне клеток, воспроизводя физиологическую ситуацию бактерий и распространителей , входящих в эпителиальные клетки через кровоток (Рисунок 1).
Клетки HIBCPP присущи определенные барьерные функции, которые позволяют им ограничивать молекулярный обмен на минимальном уровне. Это достигается за счет экспрессии адгезионные контакты (AJ) и плотный узел (TJ) белков. Иммунофлуоресценции анализ TJ-ассоциированных белков Occludin, Claudin и ZO-1 показали непрерывный сигнал в местах межклеточных контактов, демонстрируя , что клетки соединены между собой непрерывными нитями TJs (рис 2A, B, C). Подробный впечатление от тон TJ морфология была получена путем передачи (рис 2D) и замораживают электронной микроскопии разрушения (рис 2E), который показывает , что TJs расположены между клетками и образуют широкие, кабельные сети сложных топологий-подобных структур.
TJs эпителиальных клеток также выступать в качестве забора к сегрегации апикальные и базолатеральной мембране доменов, способствуя таким клеточной полярности. Среди белков, которые выражаются исключительно на базолатеральной стороне клеток , клеток HIBCPP, являются белок AJ Е-кадгерин (ECAD) и фактор роста гепатоцитов рецептор (HGF / Met) , как это показано с помощью иммунофлуоресцентного анализа на рисунке 3, указывая на определенный уровень полярности.
При культивировании в соответствующих условиях HIBCPP клетки также демонстрируют типичные барьерные функции BCSFB как формирование мембранного потенциала, а также низкой проницаемостью для macromoleкул. Определение мембранного потенциала может быть достигнуто путем измерения TEER с использованием voltohmmeter. Проницаемость слоя клеток количественно путем применения FITC-меченого инулин, сахар, который передает слой в парацеллюлярной моды. Здесь мы приводим результаты типичного эксперимента, что свидетельствует, что эти функции барьера остаются стабильными и не проявляют привязанность с помощью стандартных концентраций диметилсульфоксида (ДМСО), общий растворитель для клеточным стимулирующим химических веществ. Как можно видеть на рисунке 4A, значения Teer были записаны до и после воздействия на клетки HIBCPP в ДМСО.
Клетки продемонстрировали высокий трансмембранный потенциал, который доходил до около 500 Ω х см ² в начале эксперимента для всех условий. Измеренная ТЭЭУ не изменяется после 2 часов для клеток, обработанных до 0,2 об% ДМСО. В отличие от этого, значения Teer уменьшились в дозо-зависимым образом КНан были применены более высокие объемы (рис 4А). Это снижение мембранного потенциала было сопутствующее с повышенной проницаемостью для макромолекул. В то время как добавление ДМСО к клеткам HIBCPP до 0,5% по объему , не приведет к увеличению проницаемости для инулин, 1% по объему и 2% по объему отображается эффект, хотя и в ограниченной степени (фиг.4В). Кроме того, мы проверили влияние Цитохалазин D, сильным ингибитором полимеризации актина, на мембранный потенциал и проницаемость клеток HIBCPP. Лечение клеток с 1 мкг / мл Цитохалазин D приводит к существенному уменьшению значений Тир, а также увеличение потока ФИТЦ-Инулин (фиг.4А, В). Этот эффект можно объяснить открытием TJs вызванного Цитохалазин D.
Клеточная линия HIBCPP в качестве модели BCSFB могут быть использованы для изучения взаимодействия болезнетворных организмов и барьерные формирования эпителиальных клеток. Существует доказательство того,что бактерия N. получает запись менингита в ЦНС путем пересечения BCSFB. Было показано , что клетки Neisseria вторжению HIBCPP специфически от базолатеральной стороне клеток, которая имеет отношение в естественных условиях. Во время этого процесса бактериальной капсулы играет важную роль: Капсула-отсутствие мутантов показывают увеличение вторжения в HIBCPP клетки 5. В дальнейшем мы сравнили базолатеральных нашествие MC58 штамма 17, его изогенных мутанта MC58siaD - дефицитных для производства 17 капсул и неинкапсулированной носителя изолировать α14 19,20. Клетки HIBCPP инфицировали штаммы , упом нутые выше в течение времени течение 4 ч при MOI 10 раз иммунофлуоресцентного анализа показали значительное вторжение для двух патогенных штаммов МС58 и MC58siaD -, в то время как наблюдались лишь незначительные темпы инвазии для штамма апатогенными α14 ( Рисунок 5А). Представитель изображения двойного immunofluценции микроскопия клеток , инфицированных HIBCPP соответствующего штамма показан на рисунке 5А, В и С.
Рисунок 1:. Стандартные и перевернутый Cell System Культура В стандартной системе клеточной культуры (А, С) взаимодействие бактерий с CP эпителиальных клеток могут быть исследованы на апикальной стороне клетки, которая обозначена микроворсинок. Перевернутая система клеточной культуры (B, D) позволяет изучать взаимодействие бактерий с базолатеральной клеточной мембраны, которая участвует в процессе проникновения бактерий через кровоток в ЦНС. Для перевернутой культуры клеток (Е) HIBCPP клетки высевают на нижней стороне фильтровальной вставок. Чем ниже лунку, включая внутренний отсек вставки фильтра залиты среды. Subsequмому, излишняя среду отсасывают таким образом, чтобы внутренний отсек вставки фильтра остается заполненной. В первый день после посева, культивирования клеток фильтр вставки перевернули и заполнена средой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: HIBCPP Клетки текущее изображение Пряди Сомони The TJ белки ZO-1 (А), Occludin (B) и Claudin-1 (С) были обнаружены в клетках HIBCPP. Панели переменного тока показывают Apotome изображения. Центр каждой панели: ХУ ен вид спереди клеток; верхняя и правая сторона: поперечные сечения нескольких оптических срезов через г - плоскости. Масштабные полоски указывают на 10 мкм. Структура TJ клеток HIBCPP анализировали с помощью transmisSion электронная микроскопия. Клетки взаимосвязаны посредством TJs, которые обозначены стрелками (D). Шкалы показывает 1 мкм. Замораживание исследования электронно - микроскопические трещины визуализировать тесно зацеплении нити TJ (Е). Бар Scale = 0,5 мкм. Изображения на этом рисунке были первоначально опубликованы в Schwerk и др, PLoS One 7: e30069, DOI:. 10,1371 / journal.pone.0030069 (2012); Повторная печать с разрешением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Экспрессия рецепторных белков , участвующих во время вторжения бактерий в HIBCPP Клетки отображает анализ Иммунофлуоресценции экспрессии ECAD (А) и Met (B) на базолатеральной стороне клеток.. КАРТИНКАэс показать Apotome изображения. Центр каждой панели: ХУ ен вид спереди клеток; верхняя и правая сторона: поперечное сечение нескольких оптических срезов через г - плоскости. Апикальной мембране клеток HIBCPP (показано стрелками) расположен в направлении верхней части верхней части, а также в направлении справа от правой стороны, соответственно, каждого кадра. Шкала бар = 10 мкм. Данные , приведенные в этой фигуре также были опубликованы ранее в Grundler и др, Микробы Заражайте 15: 291-301, DOI:.. 10,1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); Повторная печать с разрешением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Влияние ДМСО и Цитохалазин D на барьерной функции HIBCPP клеток Влияние на барьерном FUNC.ции определяются путем измерения значений Тир и FITC-Инулин потока. Результаты приведены для одного репрезентативного эксперимента, выполненного в трех повторах. Клетки HIBCPP обрабатывали ДМСО, а также Cytochlalasin D в указанных количествах в течение 2 часов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
При применении в концентрации до 0,2% по объему, ДМСО не влияет на мембранный потенциал (рис 4а). Концентрации от 0,1% по объему до 0,5% по объему ДМСО также не влияют на парацеллюлярного проницаемость клеток (рис 4б). В отличие от этого , 1 мкг / мл Цитохалазин D приводит к уменьшению Teer сопутствует увеличению FITC-Инулин потока через слой клеток (рис 4А, В).
Рисунок 5: Вторжение N. в HIBCPP менингита клеток. Двойной иммунофлюоресценции микроскопии показывает захвачена (зеленый) и прилипшие (желтые) бактерии. Белые коробки внутри изображений представляют собой увеличенное изображение детали на правой стороне. Базолатеральных вторжение наблюдалось для N. штаммы МС58 менингита (А) и MC58siaD -, дефицитные по производству капсул (В), в то время как только незначительная скорость вторжения была определена для α14 (C). Диаграмма показывает , что темпы вторжения в МС58 и MC58siaD - весьма значимы по сравнению с α14 (**, р <0,01). Экстремальное значение отображается , когда MC58 или MC58siaD -, соответственно, по сравнению с α14 (***, р <0,001) и MC58siaD - сравнивали с МС58 (###, р <0,001). Шкала баров Indicaт.е 10 мкм. . Диаграмма в D была впервые опубликована в Борковский и др, J нейровоспаления 11: 163, DOI: 10,1186 / s12974-014-0163-х (2014); Повторная печать с разрешением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эпителиальные клетки CP образуют BCSFB, отделяющую CSF от 2,3 крови. Недавно мы установили клеточную линию HIBCPP в качестве функциональной человеческой модели BCSFB. Клетки отображения важных барьерные функции BCSFB в пробирке, в том числе развития высокого мембранного потенциала, низкой проницаемостью для макромолекул, а также наличие непрерывных нитей TJs 5. Белки TJ способствуют верхушечного / базолатеральная полярности клеток. Полярность имеет большое значение для направленной локализации поверхностных рецепторов, а также специфических белков-переносчиков. Мы показали полярную локализацию рецепторов ECAD и Met, а также члены АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеров семейства , которая поддерживает высокую управляемую микросреду в ЦНС 6,7.
Есть несколько микроорганизмов, которые способны проникнуть в ЦНС путем преодоления BCSFB, leadinг до тяжелой болезни , включая менингит 8. Одним из патогенных микроорганизмов, которые способны вторжения в эпителиальные клетки CP является человеческий специфических грамотрицательная бактерия Н. 9,10 менингита, которое было показано , входить в клетки HIBCPP в полярном моды конкретно от базолатеральной стороне клеток 5. Это физиологически релевантного для инфекции головного мозга через BCSFB когда бактерии распространения и столкновение СР эпителиальные клетки из крови в течение менингита. Для того, чтобы отразить эту ситуацию в пробирке, HIBCPP клетки выращивают на нижней стороне фильтра. В отличие от стандартной модели фильтра, где клетки высевают в верхний отсек, этот комплект из перевернутой системы культуры позволяет заражать эпителиальные клетки специфически от базолатеральной стороне клеток 5,21.
Базолатеральных вторжения в клетки HIBCPP наблюдается для двух патогенных N. менингита -, тогда как непатогенные носитель изолировать α14 отображается лишь незначительное вторжение 15. Это показывает, что модель HIBCPP клеток дает возможность сканировать доступные мутантные библиотеки для новых вирулентных факторов, участвующих в процессе вторжения. Стоит отметить, что это было показано , что другие патогены , включая L. моноцитогенес и Streptococcus суис (S. суис) вторгнуться клетки HIBCPP в полярном моды 5,7.
Для того , чтобы распознавать и реагировать на вторжения микроорганизмов в ЦНС, эпителиальные клетки CP выразить PRRs 22,23. TLRs представляют собой важную семью в пределах PRRS. Качественный RT-PCR анализ показал , что HIBCPP клетки экспрессируют несколько TLRs, а также связанные с ними сопутствующие рецепторы и молекулы адаптера MyD88 15. Было установлено, что рецепторы TLR2 и TLR4 участвуют в реакции клеточной защиты на N. меницitidis капсульные полисахариды 24. Дальнейшие результаты микрочипов подхода показали , что HIBCPP клетки , инфицированные N. отображать менингита индукцию путей сигнальной трансдукции, среди других факторов , а также с участием регулятора транскрипции IκBζ 15, обязательным для экспрессии определенных генов - мишеней , в том числе IL6 25,26, провоспалительного цитокина.
Чтобы подтвердить эти данные, HIBCPP клетки , инфицированные N. в менингита перевернутой системе культуры были использованы для исследования высвобождения цитокинов и хемокинов. Известно , что этот процесс направлен на провоцируют воспалительную реакцию путем активации врожденной системы иммунитета 13,14. клетки HIBCPP продуцируют и секретируют цитокины и хемокины, в том числе CXCL1-3, IL6, IL8 и TNF & alpha ; 15,16, которые были описаны для привлечения нейтрофилы и моноциты 27. Используя нашу модель системы, которую мыОбнаружено , что polymorphnuclear нейтрофилы, моноциты , а также Т - лимфоциты мигрируют через клетки HIBCPP 16,28, подчеркивая , что HIBCPP клетки пригодны для расшифровки механизмов трансэпителиальной миграции иммунных клеток.
В настоящем документе представлена модель системы также дает возможность для модификаций. Клетки HIBCPP могут быть предварительно обработаны с использованием антител или химических ингибиторов для идентификации рецепторов и сигнальной трансдукции путей, вовлеченных во время инфекции. ДМСО, общий растворитель для клеточным стимулирующим реагентов могут быть применены в соответствующих объемах к клеткам HIBCPP, которые показывают стабильные барьерные функции, которые не пострадали от химического вещества на протяжении исследуемого временного хода. Это свойство также имеет отношение к использованию модели в фармацевтических исследованиях.
Хотя мы показали , что HIBCPP клетки демонстрируют определенный уровень полярности, они не будут естественным образом отражать каждую деталь модели в естественных условиях. <EM> Например , локализация членов семьи Транспортер ABC лишь частично соответствует ожидаемому модели 6, почему фармацевтические приложения , вероятно , может быть применен только к ограниченной степени. Кроме того, клетки HIBCPP, похоже, не производят CSF (данные не показаны). Тем не менее, мы обнаружили , что HIBCPP клетки экспрессируют белки Транстиретин, инсулиноподобный фактор роста 2 (Igf2) и Forkhead коробки J1 (FOXJ1) на уровне РНК 5, которые являются характерными для белков - маркеров CP эпителиальных клеток 29,30,31,32 , Это наблюдение подтверждают, что HIBCPP клетки сохранили характерные свойства CP эпителиальных клеток. Важно то, что следует отметить, что HIBCPP клетки не настоящее контактное торможение. Поэтому крайне важно, чтобы использовать клетки для экспериментов, когда соответствующие значения Teer достигаются. Кроме того, клетки HIBCPP не должны использоваться за пределами прохода 38, поскольку потенциал для развития барьерную функцию, кажется, падение с более высокими проходами. И, наконец, изучить импакт межклеточных взаимодействий при инфекциях на BCSFB со-культуры модель, состоящая из СР-эпителиальные и эндотелиальные будет представлять большой интерес, но такая модель все еще должна быть разработана.
В заключение отметим, что модель клеточной культуры HIBCPP может быть использована для выявления ключевых путей вторжения и основные пути передачи сигнала, в частности патогенов человека специфических на BCSFB. Как известно , что эпителиальные клетки СР также участвуют в неврологических дегенеративных расстройств , включая болезнь Альцгеймера, а также при рассеянном склерозе 2, а также в мозге метастаз опухолевых клеток 33, система предлагает в общем большое разнообразие возможностей для исследования механизмов развития заболеваний, связанных с, что обеспечивает потенциал, чтобы найти новые терапевтические мишени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
