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Medicine

मानव रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का एक रंजित जाल उपकला सेल आधारित मॉडल basolateral साइड से जीवाणु संक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Published: May 6, 2016 doi: 10.3791/54061
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

Introduction

रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा (BCSFB) रक्त और मस्तिष्क 1 के बीच तीन बाधा साइटों में से एक है। इसके रूपात्मक सहसंबंधी रंजित जाल (सीपी) 2,3 के उपकला कोशिकाओं रहे हैं, एक endothelial उपकला convolute, जो दृढ़ता से vascularized और मस्तिष्क के निलय में स्थित है। सीपी मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के उत्पादन के साथ ही रक्त से उत्तरार्द्ध को अलग करने के लिए कार्य करता है। आदेश में बाधा समारोह को प्राप्त करने के लिए, सीपी उपकला कोशिकाओं, एक कम pinocytotic सक्रियता दिखाई विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों एक्सप्रेस, और घनी तंग जंक्शनों (TJS) 2,3 की एक सतत नेटवर्क से जुड़े हुए हैं।

मानव पैपिलोमा रंजित जाल (HIBCPP) कोशिकाओं, एक जापानी महिला 4 के एक घातक रंजित जाल पैपिलोमा से निकाली गई, BCSFB के इन विट्रो मॉडल में एक कार्यात्मक निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। HIBCPP कोशिकाओं टी जे के गठन के रूप में एक कार्यात्मक BCSFB की विशेषताओं में से एक जोड़े को दिखानेकिस्में, एक उच्च transepithelial झिल्ली क्षमता है कि transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) के रूप में निर्धारित किया जा सकता का विकास, और बड़े अणुओं के लिए नाबालिग permeabilities। इसके अलावा, HIBCPP कोशिकाओं विशेषता ट्रांसपोर्टरों, जो आयनिक microenvironment विनियमित करने के लिए सेवा कर सकते हैं, और शिखर / basolateral polarity 5,6,7 दिखाने व्यक्त करते हैं।

BCSFB केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 8 में लिए रोगजनकों (बैक्टीरिया, वायरस, और कवक) एक प्रवेश स्थल के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है। नेइसेरिया meningitidis (एन मेनिन्जाइटिडिस), एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु, सहित रोगजनकों, दिमागी बुखार के आक्रमण की तरह गंभीर रोगों का कारण बन सकता है। सबूत है कि यह सी.पी. की सुरक्षात्मक उपकला बाधा पर काबू पा मेनिंगोकोक्सल रोग वाहिकाओं और सी.पी. उपकला कोशिकाओं 9,10 में meningococci की मात्रा में वृद्धि का प्रदर्शन के साथ रोगियों में histopathological टिप्पणियों के द्वारा समर्थित है। मेजबान कोशिकाओं बीए में प्रवेश पाने के लिएcteria अक्सर endocytotic तंत्र है, जो मध्यस्थता या विशिष्ट सतह मेजबान कोशिकाओं पर स्थित रिसेप्टर्स से शुरू हो रहे अपहरण। चूंकि इन रिसेप्टर्स के साथ रोगाणुओं की बातचीत प्रजातियों हो सकता है विशेष 11, पशु मॉडल केवल एक सीमित हद तक विचार-विमर्श किया जा सकता है। HIBCPP सेल लाइन आक्रमण प्रक्रिया के साथ ही एक मानव मॉडल प्रणाली में अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। सेल संस्कृति सम्मिलित रोजगार हमें दो अलग सेल पक्षों से मेजबान कोशिकाओं के साथ रोगाणुओं की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है। कई बैक्टीरिया, एन सहित मेनिन्जाइटिडिस, दृढ़ता से संक्रमण assays के दौरान गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव के अधीन हैं। assays के दौरान HIBCPP कोशिकाओं के साथ रोगाणुओं की इष्टतम बातचीत के लिए, बैक्टीरिया शुरू में सेल संस्कृति फिल्टर डालने प्रणाली के ऊपरी डिब्बे में जुड़ जाते हैं। शिखर या basolateral सेल की ओर, एस्टा क्रमश: इन विट्रो प्रणाली के दो रूपों गया है से संक्रमण सक्षम करने के लिएblished: मानक प्रणाली में HIBCPP कोशिकाओं फिल्टर डालने के ऊपरी डिब्बे में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, स्थिति नकल उतार जब सूक्ष्मजीवों सीएसएफ साइड पर स्थित है और कोशिकाओं (चित्रा 1 ए, सी) के शिखर पक्ष के साथ संपर्क में प्राप्त कर रहे हैं। इसके विपरीत, एक औंधा सेल संस्कृति फिल्टर डालने सिस्टम में HIBCPP कोशिकाओं का उपयोग की स्थिति जब बैक्टीरिया रक्त प्रवाह में प्रवेश किया है दर्शाता है। सूक्ष्मजीवों रक्त और मुठभेड़ सी.पी. basolateral पक्ष (चित्रा 1 बी, डी) से उपकला कोशिकाओं में प्रसार। उल्लेखनीय है, इस मॉडल प्रणाली में यह दिखाया गया है कि बैक्टीरिया basolateral सेल की ओर 5.7 से विशेष रूप से एक ध्रुवीय फैशन में HIBCPP कोशिकाओं पर आक्रमण।

इसके बाद सीपी के संक्रमण के लिए, पर आक्रमण रोगजनकों सहज प्रतिरक्षा पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स करने के लिए बंधाव के माध्यम से व्यवस्था (PRRS) द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। PRRS की अच्छी तरह से वर्णित सदस्यों टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) परिवार के हैं। TLRs कर सकते हैं बिनसंक्रामक सूक्ष्मजीवों की विशेषता संरचनाओं, जो करार दिया रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) कर रहे हैं करने के लिए डी। रिसेप्टर्स की बंधाव मेजबान सेल की सक्रियता के cascades संकेत है कि साइटोकिन्स और chemokines 12 है, जो बारी में BCSFB 13,14 भर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानांतरगमन को प्रोत्साहित की अभिव्यक्ति को गति प्रदान करने के लिए ले जाता है। यह दिखाया गया है कि HIBCPP कोशिकाओं mRNA स्तर पर कई TLRs और एन के साथ कि संक्रमण का इजहार मेनिन्जाइटिडिस कई साइटोकिन्स और chemokines, CXCL1-3, IL6, IL8 और TNFα 15,16 सहित के स्राव में यह परिणाम है।

यहाँ, हम एक औंधा सेल संस्कृति डालने प्रणाली है कि BCSFB mimics में खेती और मानव कोशिका लाइन HIBCPP के संक्रमण का वर्णन है। इस मॉडल प्रणाली में विवो प्रासंगिक basolateral सेल पक्ष के रूप में अच्छी तरह से बाद में सेलुलर प्रतिक्रिया के साथ रोगाणुओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है।

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Protocol

1. एक औंधा मॉडल प्रणाली में सीडिंग HIBCPP कोशिकाओं के लिए सेल संस्कृति फिल्टर आवेषण तैयार

  1. पूर्व गर्म DMEM / F12 (HAM) 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस)।
  2. बाँझ संदंश का प्रयोग करें उल्टा एक 12 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 1E) में नीचे 3 माइक्रोन का एक छेद के आकार के साथ 0.33 सेमी ² विकास क्षेत्र सेल संस्कृति फिल्टर सम्मिलित करने के लिए जगह।
  3. सेल संस्कृति फिल्टर डालने के निचले डिब्बे (लगभग 3 एमएल) और फिल्टर डालने के शीर्ष पर 100 μl में मध्यम भरें। प्लेट के साथ ही मध्यम से कम डिब्बे बाढ़। इस तरह है कि फिल्टर डालने के निचले डिब्बे भरा रहता है (चित्रा 1E) में अत्यधिक मध्यम aspirate।
    नोट: यह इस कदम के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की है।
  4. कवर ढक्कन के साथ 12 अच्छी तरह से थाली और इनक्यूबेटर करने के लिए तैयार सेल संस्कृति फिल्टर आवेषण हस्तांतरण, 37 डिग्री सेल्सियस,5% कोशिकाओं के अलावा जब तक सीओ 2।

2. खेती और HIBCPP प्रकोष्ठों के Passaging

  1. DMEM / F12 (HAM) 5 माइक्रोग्राम / एमएल, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% एफसीएस के साथ पूरक तैयार करें।
  2. पूर्व गर्म मध्यम और पीबीएस एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में। कुप्पी से महाप्राण मध्यम। फ्लास्क और चक्कर आने के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें। यह कदम एक बार दोहराएँ।
  3. फ्लास्क और चक्कर आने के लिए 3 मिलीलीटर 0.25% trypsin EDTA जोड़ें। इनक्यूबेटर में रखें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2।
  4. लगभग 20 मिनट के बाद इनक्यूबेटर से फ्लास्क को हटा दें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं कुप्पी के नीचे से अलग कर रहे हैं और जब माइक्रोस्कोप के साथ सर्वेक्षण में एक गोल आकार प्रदर्शित करते हैं।
    नोट: कोशिकाओं को एक दूसरे से पूरी तरह से अलग नहीं है और अक्सर agglomerates में पाए जाते हैं। यह पारित होने के 38 अप करने के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।
  5. 17 मिलीलीटर मध्यम जोड़ने trypsinization रोकने के लिए। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend और निलंबन हस्तांतरणएक 50 मिलीलीटर ट्यूब में। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 50 XG पर अपकेंद्रित्र।
  6. मध्यम का एक उचित मात्रा में कोशिकाओं resuspend और एक hemocytometer का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती।
    नोट: resuspended HIBCPP कोशिकाओं की एकाग्रता 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए। HIBCPP कोशिकाओं के रखरखाव के लिए यह एक T75-कुप्पी के लिए 10 मिलीलीटर माध्यम में 1-6 x 10 6 कोशिकाओं की राशि हस्तांतरण करने के लिए सुझाव दिया है। हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।

HIBCPP कोशिकाओं के साथ 3. सीडिंग उल्टे सेल संस्कृति फिल्टर आवेषण

  1. प्रत्येक उल्टे फिल्टर डालने (फिल्टर के नीचे की ओर यानी) के शीर्ष पर सेल निलंबन (यानी। 8 x 10 4 कोशिकाओं) (चित्रा 1E) के 80 μl जोड़ें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से बोने से पहले inverting ट्यूब द्वारा निलंबन में वितरित कर रहे हैं।
  2. कवर 12 अच्छी तरह से थाली और इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण के ढक्कन, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सी के साथ वरीयता प्राप्त सेल संस्कृति फिल्टर आवेषणहे 2।
  3. पहले दिन, 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 1 मिलीलीटर मध्यम भरें। 12 अच्छी तरह से थाली से बाहर संदंश का उपयोग करके सेल संस्कृति फिल्टर सम्मिलित करता है लिफ्ट, अंदर मध्यम त्यागें, फिल्टर सम्मिलित कर देते हैं और तैयार 24 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 1E) में मानक उन्मुखीकरण में उन्हें जगह है।
  4. ताजा माध्यम में हर दूसरे दिन कोशिकाओं रखें। ताजा माध्यम के साथ 24 कुओं को तैयार है और इसे करने के लिए फिल्टर आवेषण हस्तांतरण। 0.5 मिलीलीटर ताजा माध्यम के साथ सम्मिलित भरें। धारा 4 में वर्णित के रूप में Teer हर दिन की जाँच करें।
  5. सेल संस्कृति सम्मिलित करता है पर HIBCPP वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के तीर मूल्यों से अधिक है जब 70 Ω x सेमी ² (लगभग 4 दिनों बोने के बाद), तो युक्त 1% एफसीएस और 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन माध्यम में सेल संस्कृति जारी है। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 मिलीलीटर माध्यम के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें। ऊपरी डिब्बे में तैयार कुओं और विनिमय मध्यम करने के लिए फिल्टर सम्मिलित स्थानांतरण।
    नोट: confluency के बाद यह सीरम वापसी के गठन के लिए सुरागएक उच्च झिल्ली क्षमता।
  6. फिल्टर डिब्बे से महाप्राण मध्यम, अच्छी तरह से तैयार करने के लिए हस्तांतरण और 500 μl मध्यम के साथ भरें। यह कदम एक बार दोहराएँ। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रातोंरात कोशिकाओं, रखो।

4. Transepithelial विद्युत प्रतिरोध का मापन (तीर)

  1. 80% इथेनॉल में 15 मिनट के लिए उपकला ऊतक voltohmmeter के इलेक्ट्रोड सुझावों को विसर्जित कर दिया। हुड के तहत voltohmmeter स्थानांतरण और एक पल के लिए इलेक्ट्रोड सूखी। इलेक्ट्रोड संबंधित संस्कृति एक और 15 मिनट के संतुलित करने के लिए कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया माध्यम में रखें।
  2. इलेक्ट्रोड की लंबी बांह स्थिति तो यह है कि यह कम डिब्बे के नीचे हर बार छू लेती द्वारा मापन प्रदर्शन, फिल्टर डालने के डिब्बे में कम बांह जगह है।
    नोट: सेल संस्कृति फिल्टर आवेषण के मूल्यों के प्रतिरोध के माध्यम में कोशिकाओं के बिना के रूप में खाली मूल्यों इस्तेमाल किया जाना चाहिए ((मापा मूल्य (Ω) - खाली मूल्य (Ω)) x फिल्टरसतह (यानी 0.33 सेमी ²))।
  3. 15 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में जगह मापने इलेक्ट्रोड के बाद वापस। एक सूखी ट्यूब में स्टोर।

5. Paracellular पारगम्यता के निर्धारण

  1. 200 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन 1% एफसीएस के साथ पूरक में 1 ग्राम FITC-Inulin भंग। कोशिकाओं के संक्रमण से पहले ऊपरी फिल्टर डिब्बे में समाधान के 50 माइक्रोग्राम / एमएल लागू करें।
  2. संक्रमण के बाद निर्धारित करने के लिए बहुत Inulin सेल परत के माध्यम से फिल्टर डिब्बे से पारित कर दिया है कि कैसे कम अच्छी तरह से मध्यम नमूने एकत्र।
  3. एक FITC-Inulin मानक समाधान तैयार है और 1 प्रदर्शन: 2 dilutions, 10 बार (100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13%, 1.56%, 0.78%, 0.39%, 0.2% और 0%) । microplate रीडर में सभी नमूनों की माप से प्रतिदीप्ति निर्धारित करते हैं।

सेल संस्कृति फिल्टर आवेषण पर HIBCPP कोशिकाओं के संक्रमण के लिए बैक्टीरिया की तैयारी 6.

  1. प्रयोग करने के लिए एक दिन पहले, परिमार्जन टीवह जमे हुए एन मेनिन्जाइटिडिस बंद एक ग्लिसरॉल स्टॉक और लकीर Vitox के साथ चॉकलेट अग्रवाल पर बाहर से उपभेदों। इनक्यूबेटर में रात भर के लिए आगे बढ़ें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के साथ।
  2. रातोंरात संस्कृति से 20-30 कालोनियों को निकालें और एक ट्यूब युक्त 8 मिलीलीटर Proteose Peptone माध्यम 0.042% 3 NaHCO, 0.01 एम 2 MgCl और 1% Polyvitex के साथ पूरक में स्थानांतरित।
  3. 220 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.25 घंटे के लिए बैक्टीरिया हिला। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2684 जी पर centrifugation द्वारा बैक्टीरिया गोली। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 8 मिलीलीटर सीरम मुक्त माध्यम के साथ बैक्टीरिया गोली resuspend। भंवर एक भी निलंबन सुनिश्चित करने के लिए।
  4. संस्कृति घनत्व का निर्धारण करने के लिए, 600 एनएम के एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) पर 1:10 के कमजोर पड़ने के उपाय। एक आयुध डिपो के 600 0.1 करने के लिए जीवाणु निलंबन को समायोजित करें।
    नोट: इस निलंबन के लगभग होता है। 1 एक्स 10 8 CFU / एमएल।
  5. बैक्टीरिया कोशिका एकाग्रता पुष्टि करने के लिए, निलंबन stepwise (1:10) एक पतला करने के लिए ऊपर10 -5 के कमजोर पड़ने और चॉकलेट अगर प्लेट पर थाली।
    नोट: इसी तरह के धारावाहिक dilutions बैक्टीरिया विकास घटता की गणना करने के लिए किया जा करने के लिए की जरूरत है।

सेल संस्कृति फिल्टर आवेषण और डबल immunofluorescence द्वारा जीवाणु आक्रमण के निर्धारण पर HIBCPP प्रकोष्ठों के 7. संक्रमण

  1. जिसमें 1% एफसीएस और 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन माध्यम में सेल संस्कृति को जारी रखने के बाद, कोशिकाओं को हर दिन एक उपकला ऊतक voltohmmeter का उपयोग को मापने। कोशिकाओं के चारों ओर 500 Ω x सेमी ² का एक तीर तक पहुँच चुके हैं, तो संक्रमण बाहर ले।
  2. समय का संकेत अवधि के लिए 5% सीओ 2 के साथ संक्रमण से 10 स्टोर इनक्यूबेटर में संक्रमित कोशिकाओं के (MOI) की बहुलता पर तैयार जीवाणु निलंबन के साथ कोशिकाओं को संक्रमित, 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: MOI खाते में संगम (1.21 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी) पर सेल संस्कृति फिल्टर डालने के प्रति कोशिकाओं की संख्या में लेने से गणना की जा सकती है।
  3. संक्रमित बंद करोआयन तीन (SFM) युक्त 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 500 μl सीरम मुक्त माध्यम के साथ कई बार धोने से कम डिब्बे को फिल्टर डिब्बे के लिए आवेदन किया, 1 मिलीलीटर।
  4. 500 μl SFM फिल्टर डिब्बे में 1% BSA बफर युक्त और 1 unspecific बाध्यकारी साइटों के लिए एंटीबॉडी का पालन रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कम डिब्बे में मिलीलीटर के साथ ब्लॉक।
  5. 100 μl प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी एन के साथ सेते meningtidis α-OMP (1: 200) फिल्टर डिब्बे में और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कम डिब्बे में 500 μl।
    नोट: यदि आवश्यक हो, एंटीबॉडी एकाग्रता titrated किया जाना चाहिए।
  6. फिल्टर डिब्बे से मध्यम aspirating द्वारा कोशिकाओं को धो लें, एक अच्छी तरह से तैयार के साथ 1 मिलीलीटर 1% BSA युक्त SFM करने के लिए फिल्टर डालने के हस्तांतरण और 500 μl 1% BSA युक्त SFM के साथ खाली कर दिया फिल्टर डिब्बे भरें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  7. फिल्टर कंपनियों में 500 μl 4% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करेंrtment, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कम डिब्बे में 1 मिलीलीटर।
  8. फिल्टर डिब्बे से मध्यम aspirating द्वारा कोशिकाओं को धो लें, 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ करने के लिए एक अच्छी तरह से फिल्टर तैयार डालने के हस्तांतरण और 500 μl पीबीएस के साथ खाली कर दिया फिल्टर डिब्बे भरें। यह कदम एक बार दोहराएँ।
    नोट: नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रात भर रखा जा सकता है।
  9. कट तय सेल संस्कृति आवेषण के बाहर फिल्टर और 250 μl पीबीएस 1% BSA युक्त से धो लें। बाह्य बैक्टीरिया दाग: 250 μl फ्लोरोसेंट लेबल (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 594 एनएम) माध्यमिक एंटीबॉडी चिकन विरोधी खरगोश (500 1) के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: यदि आवश्यक हो, एंटीबॉडी एकाग्रता titrated किया जाना चाहिए।
  10. 250 μl पीबीएस कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% BSA और 0.5% ट्राइटन X-100 युक्त कोशिकाओं Permeabilize। कोशिकाओं 250 μl पीबीएस 1% BSA युक्त के साथ तीन बार धोएं।
  11. 250 μl प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी एन के साथ सेते मेनिन्जाइटिडिस
  12. , फ्लोरोसेंट लेबल (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 660 एनएम) Phalloidin (1: 250) और 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (: फ्लोरोसेंट लेबल (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 488 एनएम) माध्यमिक एंटीबॉडी (500 1) के 250 μl लागू करें 1: 50,000) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अतिरिक्त और intracellular बैक्टीरिया, actin cytoskeleton और नाभिक दाग।
    नोट: यदि आवश्यक हो, एंटीबॉडी एकाग्रता titrated किया जाना चाहिए।
  13. कोशिकाओं 250 μl पीबीएस 1% BSA युक्त के साथ तीन बार धोएं। माइक्रोस्कोप के माध्यम से परीक्षा तक 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम और दुकान बढ़ते में कोशिकाओं को शामिल करें।
  14. पूर्वनिर्धारित क्षेत्र पर आक्रमण प्रति जीवाणुओं की संख्या निर्धारित करते हैं। फिल्टर झिल्ली प्रति 20 क्षेत्रों की गिनती से यह मत करो। आक्रमण बैक्टीरिया के प्रतिशत की गणना।
    नोट: एक क्षेत्र कोएफ़्रीक के साथ 20 सूक्ष्म क्षेत्रों का मतलब बैक्टीरियल गिनती गुणाient। परिणाम एक 0.33 सेमी ² सेल संस्कृति फिल्टर डालने में मौजूद कुल बैक्टीरिया की मात्रा व्यक्त करता है। संक्रमण की अवधि के दौरान मीडिया में उगाई बैक्टीरिया की राशि से इस मूल्य फूट डालो।

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Representative Results

यहाँ हम एक औंधा सेल संस्कृति डालने प्रणाली में संवर्धन और HIBCPP कोशिकाओं के संक्रमण का वर्णन है। यह मॉडल हमें basolateral सेल की ओर से आक्रमण तंत्र और अंतर्निहित आणविक संकेत दे रास्ते अध्ययन करने के लिए, प्रसार और चित्रा (1) रक्त प्रवाह के माध्यम से उपकला कोशिकाओं में प्रवेश बैक्टीरिया की एक शारीरिक स्थिति reproducing अनुमति देता है।

HIBCPP कोशिकाओं कुछ बाधा कार्य है, जो उन्हें एक न्यूनतम स्तर पर आणविक विनिमय प्रतिबंधित करने के लिए सक्षम प्रदर्शित करते हैं। इस adherens जंक्शन (ए जे) और तंग जंक्शन (टीजे) प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा हासिल की है। टी जे जुड़े प्रोटीन Occludin, Claudin और ZO -1 के immunofluorescence विश्लेषण सेल सेल संपर्क के स्थलों पर निर्बाध संकेत का पता चला, प्रदर्शन है कि कोशिकाओं TJS के निरंतर किस्में (चित्रा 2A, बी, सी) से जुड़े रहते हैं। टी की एक विस्तृत छापवह टी जे आकृति विज्ञान संचरण (चित्रा 2 डी) के द्वारा प्राप्त की और फ्रीज फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 ई) है, जो पता चलता है कि TJS कोशिकाओं के बीच स्थित हैं और फार्म व्यापक, meshed केबल संरचनाओं की तरह किया गया है।

उपकला कोशिकाओं के TJS इसके अलावा, एक बाड़ शिखर और basolateral झिल्ली डोमेन को अलग करने के रूप में कार्य इसलिए सेलुलर polarity में योगदान दे। प्रोटीन है, जो HIBCPP कोशिकाओं की basolateral सेल की ओर पर विशेष रूप से व्यक्त कर रहे हैं के अलावा, ए जे प्रोटीन ई cadherin (ECAD) और hepatocyte वृद्धि कारक रिसेप्टर (HGF ​​/ मेट) के रूप में चित्रा 3 में immunofluorescence विश्लेषण से दिखाया गया है, एक की ओर इशारा करते हैं polarity के निश्चित स्तर।

जब उचित शर्तों के तहत सुसंस्कृत HIBCPP कोशिकाओं को भी एक झिल्ली क्षमता के गठन की तरह BCSFB के विशिष्ट बाधा कार्यों के साथ ही macromole के लिए एक कम पारगम्यता का प्रदर्शनcules। झिल्ली क्षमता का निर्धारण एक voltohmmeter के उपयोग के साथ Teer की माप के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। सेल परत की पारगम्यता FITC लेबल inulin, एक चीनी कि एक paracellular फैशन में परत गुजरता के आवेदन के द्वारा मात्रा निर्धारित है। यहाँ, हम एक प्रतिनिधि प्रयोग, यह दर्शाता है जो कि इन कार्यों बाधा स्थिर रहने और डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO), सेल उत्तेजक रसायनों के लिए एक आम विलायक के मानक सांद्रता से कोई स्नेह दिखाने के परिणाम बताते हैं। जैसा कि चित्र -4 ए में देखा जा सकता है, तीर मूल्यों से पहले और DMSO के लिए HIBCPP कोशिकाओं के प्रदर्शन के बाद दर्ज किए गए।

कोशिकाओं को एक उच्च झिल्ली क्षमता है कि सभी स्थितियों के लिए प्रयोग की शुरुआत में लगभग 500 Ω x सेमी ² तक पहुँच का प्रदर्शन किया। मापा Teer 0.2 खंड% DMSO के लिए ऊपर के साथ इलाज किया कोशिकाओं के लिए 2 घंटे के बाद भी नहीं बदला। इसके विपरीत, तीर मानों एक खुराक पर निर्भर ढंग क में कमी आई हैएन अधिक मात्रा लागू किया गया (चित्रा 4 क)। झिल्ली क्षमता में यह कमी अणुओं के लिए एक वृद्धि की पारगम्यता के साथ सहवर्ती था। HIBCPP कोशिकाओं अप करने के लिए 0.5% खंड inulin के लिए एक पारगम्यता वृद्धि का परिणाम नहीं था DMSO के अलावा जबकि, 1 खंड% और 2% खंड एक सीमित हद तक (चित्रा 4 बी) के लिए हालांकि, एक प्रभाव का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, हम झिल्ली क्षमता और HIBCPP कोशिकाओं की पारगम्यता पर cytochalasin डी, actin polymerization के एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला, के प्रभाव की जाँच की। 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cytochalasin डी के साथ कोशिकाओं के उपचार Teer मूल्यों का एक महत्वपूर्ण गिरावट के साथ ही FITC-Inulin प्रवाह में वृद्धि का कारण बनता है (चित्रा -4 ए, बी)। इस आशय cytochalasin डी की वजह से TJS के उद्घाटन के द्वारा समझाया जा सकता है

BCSFB की एक मॉडल के रूप में HIBCPP सेल लाइन बाधा के गठन उपकला कोशिकाओं रोगाणुओं की बातचीत और अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। सबूत हैकि जीवाणु एन मेनिन्जाइटिडिस लाभ सीएनएस में प्रवेश BCSFB पार करके। यह दिखाया गया है कि नेइसेरिया HIBCPP कोशिकाओं विशेष basolateral सेल की ओर है, जो इन विवो में प्रासंगिक है से आक्रमण। इस प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरियल कैप्सूल एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: कैप्सूल कमी म्यूटेंट HIBCPP कोशिकाओं 5 में आक्रमण में वृद्धि हुई दिखा। निम्नलिखित में हम MC58 तनाव 17 की basolateral आक्रमण की तुलना में, अपने isogenic उत्परिवर्ती MC58siaD - कैप्सूल उत्पादन 17 और unencapsulated वाहक के लिए कमी α14 19,20 अलग। है, जबकि केवल मामूली आक्रमण दर (apathogenic α14 तनाव के लिए मनाया गया - HIBCPP कोशिकाओं उपभेदों 4 घंटा के एक समय के पाठ्यक्रम से 10 immunofluorescence विश्लेषण के MOI पर पर ऊपर उल्लेख से संक्रमित थे दो रोगजनक उपभेदों MC58 और MC58siaD के लिए महत्वपूर्ण आक्रमण का पता चला चित्रा 5 ए)। डबल immunoflu के एक प्रतिनिधि छविसंबंधित तनाव से संक्रमित कोशिकाओं के HIBCPP orescence माइक्रोस्कोपी चित्रा 5 ए, बी और सी में दिखाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1:। स्टैंडर्ड और उल्टे सेल संस्कृति प्रणाली मानक सेल संस्कृति प्रणाली में (ए, सी) सी.पी. उपकला कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया की बातचीत शिखर सेल की ओर है, जो microvilli ने संकेत दिया है पर जांच की जा सकती है। उल्टे सेल संस्कृति प्रणाली (बी, डी) हमें basolateral कोशिका झिल्ली, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में खून के माध्यम से जीवाणु आक्रमण के दौरान शामिल है के साथ बैक्टीरियल बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। उल्टे सेल संस्कृति के लिए (ई) HIBCPP कोशिकाओं फिल्टर आवेषण के नीचे की ओर पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। फिल्टर डालने के भीतरी डिब्बे सहित कम अच्छी तरह से मध्यम के साथ पानी भर रहे हैं। Subsequently, अत्यधिक मध्यम इस तरह है कि फिल्टर डालने के भीतरी डिब्बे भरा रहता में aspirated है। बोने के बाद पहले दिन पर, सेल संस्कृति फिल्टर सम्मिलित रूप से फ़्लिप और मध्यम से भर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। HIBCPP प्रकोष्ठों TJS की सतत किस्में प्रदर्शित टी जे प्रोटीन ZO-1 (ए), Occludin (बी) और Claudin-1 (सी) HIBCPP कोशिकाओं में पाया गया। पैनलों एसी Apotome छवियों को दिखाने के। प्रत्येक पैनल के केंद्र: कोशिकाओं के चेहरे दृश्य एन XY; ऊपर और सही पक्ष: Z विमान के माध्यम से कई ऑप्टिकल स्लाइस के पार वर्गों। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन से संकेत मिलता है। HIBCPP कोशिकाओं की संरचना टी जे transmis द्वारा विश्लेषण किया गया थासायन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। प्रकोष्ठों आपस में जुड़े हैं TJS, जो तीर (डी) द्वारा संकेत कर रहे हैं। पैमाने पर पट्टी 1 माइक्रोन इंगित करता है। रुक फ्रैक्चर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन बारीकी कल्पना टी जे किस्में meshed (ई)। स्केल बार = 0.5 माइक्रोन। । इस आंकड़े में छवियों मूल Schwerk एट अल, एक PLoS में प्रकाशित किए गए थे 7: e30069, doi: 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); फिर से प्रिंट अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। रिसेप्टर प्रोटीन basolateral सेल पक्ष में ECAD (ए) और मेट (बी) के HIBCPP प्रकोष्ठों अभिव्यक्ति immunofluorescence विश्लेषण दिखाता में बैक्टीरिया के आक्रमण के दौरान शामिल की अभिव्यक्ति। चित्रोंतों Apotome छवियों को दिखाने के। प्रत्येक पैनल के केंद्र: कोशिकाओं के चेहरे दृश्य एन XY; ऊपर और सही पक्ष: Z विमान के माध्यम से कई ऑप्टिकल स्लाइस के पार अनुभाग। HIBCPP कोशिकाओं के शिखर झिल्ली (तीर द्वारा संकेत) शीर्ष भाग के ऊपर की ओर के साथ ही सही पक्ष की सही, क्रमशः, प्रत्येक फ्रेम की ओर तैनात है। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े में डेटा भी Gründler एट अल में पहले से प्रकाशित किए गए थे, रोगाणुओं को संक्रमित 15: 291-301, डोई:।। 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); फिर से प्रिंट अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: HIBCPP प्रकोष्ठों की बाधा समारोह पर DMSO और cytochalasin डी का प्रभाव बाधा समारोह पर प्रभाव।tion Teer मूल्यों और FITC-Inulin-प्रवाह की माप से निर्धारित होते हैं। परिणाम एक प्रतिनिधि प्रयोग है, जो triplicates में प्रदर्शन किया गया था के लिए दिखाए जाते हैं। HIBCPP कोशिकाओं 2 घंटे के लिए संकेत दिया मात्रा में DMSO के साथ ही Cytochlalasin डी के साथ इलाज किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जब 0.2 खंड% तक सांद्रता में आवेदन किया है, DMSO झिल्ली क्षमता (चित्रा 4 ए) को प्रभावित नहीं करता। 0.1 खंड% ऊपर से DMSO के 0.5% से लेकर खंड सांद्रता भी कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) के paracellular पारगम्यता को प्रभावित नहीं करते। इसके विपरीत, 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cytochalasin डी सेल परत के माध्यम से FITC-Inulin-प्रवाह में वृद्धि के साथ Teer सहवर्ती में कमी का कारण बनता है (चित्रा -4 ए, बी)।

चित्रा 5 चित्रा 5: एन के आक्रमण HIBCPP कोशिकाओं में मेनिन्जाइटिडिस। डबल immunofluorescence माइक्रोस्कोपी शो पर आक्रमण (हरा) और पालन (पीला) बैक्टीरिया। छवियों के भीतर सफेद बक्से सही पक्ष पर बढ़ाया तस्वीर विस्तार प्रतिनिधित्व करते हैं। Basolateral आक्रमण एन के लिए मनाया गया मेनिन्जाइटिडिस उपभेदों MC58 (ए) और MC58siaD -, कैप्सूल उत्पादन (बी) के लिए की कमी है, जबकि केवल एक छोटी सी आक्रमण दर α14 (सी) के लिए निर्धारित किया गया था। आरेख यह दर्शाता है कि MC58 और MC58siaD के आक्रमण दरों - अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं जब α14 की तुलना में (**, पी <0.01)। जब MC58 या MC58siaD चरम महत्व प्रदर्शित किया जाता है -, क्रमशः, α14 की तुलना में थे (***, पी <0.001) और MC58siaD - MC58 की तुलना में था (###, पी <0.001)। स्केल इंडिका सलाखोंते 10 माइक्रोन। । एट अल, जम्मू neuroinflammation 11 डी में आरेख मूल Borkowski में प्रकाशित किया गया था: 163, डोई: 10.1186 / s12974-014-0163 एक्स (2014); फिर से प्रिंट अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सीपी की उपकला कोशिकाओं BCSFB कि रक्त 2,3 से सीएसएफ को अलग रूप में। हमने हाल ही में BCSFB के एक कार्यात्मक मानव मॉडल के रूप में HIBCPP सेल लाइन की स्थापना की। कोशिकाओं इन विट्रो में BCSFB के महत्वपूर्ण बाधा काम करता है, एक उच्च झिल्ली क्षमता के विकास, बड़े अणुओं के लिए एक कम पारगम्यता, साथ ही TJS 5 की सतत किस्में की उपस्थिति सहित प्रदर्शित करते हैं। टी जे प्रोटीन कोशिकाओं के एक शिखर / basolateral polarity के लिए योगदान करते हैं। polarity सतह रिसेप्टर्स की एक निर्देशित स्थानीयकरण के लिए उच्च महत्व के साथ ही विशिष्ट ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की है। हम रिसेप्टर्स ECAD और मेट के साथ ही एटीपी बाध्यकारी कैसेट के सदस्यों (एबीसी) ट्रांसपोर्टर परिवार के ध्रुवीय स्थानीयकरण कि सीएनएस 6.7 के भीतर एक अत्यधिक नियंत्रित microenvironment रखता दिखाया है।

leadin कई सूक्ष्मजीवों कि BCSFB से पार पाते हुए सीएनएस में प्रवेश पाने में सक्षम हो रहे हैं,दिमागी बुखार 8 सहित गंभीर बीमारी के लिए जी। रोगज़नक़ों कि सी.पी. उपकला कोशिकाओं में हमलावर करने में सक्षम हैं में से एक मानव विशिष्ट ग्राम नकारात्मक जीवाणु एन है मेनिन्जाइटिडिस 9,10, जो basolateral सेल की ओर 5 से विशेष रूप से एक ध्रुवीय फैशन में HIBCPP कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए दिखाया गया है। इस BCSFB भर में मस्तिष्क के संक्रमण के लिए physiologically प्रासंगिक दिशा जब बैक्टीरिया दिमागी बुखार के दौरान प्रसार और खून से मुठभेड़ सी.पी. उपकला कोशिकाओं है। इन विट्रो में इस स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए, HIBCPP कोशिकाओं फिल्टर के निचले पक्ष पर हो रहे हैं। मानक फिल्टर डालने मॉडल है, जहां कोशिकाओं ऊपरी डिब्बे में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं के विपरीत, एक औंधा संस्कृति प्रणाली के इस सेट अप basolateral सेल की ओर से 5,21 विशेष उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करने की अनुमति देता है।

HIBCPP कोशिकाओं में basolateral आक्रमण दो रोगजनक एन लिए रखा गया है मेनिन्जाइटिडिस -, जबकि गैर रोगजनक वाहक को अलग α14 केवल सीमांत आक्रमण 15 का प्रदर्शन किया। यह दिखाता है कि HIBCPP सेल मॉडल उपन्यास डाह आक्रमण की प्रक्रिया के दौरान शामिल घटकों के लिए उपलब्ध उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को स्कैन करने की संभावना प्रदान करता है। उल्लेखनीय है, यह प्रदर्शन किया गया है एल सहित अन्य रोगाणुओं monocytogenes और स्ट्रेप्टोकोकस सुईस (एस सुईस) एक ध्रुवीय फैशन 5.7 में HIBCPP कोशिकाओं पर आक्रमण।

आदेश को समझते हैं और सीएनएस में सूक्ष्मजीवों पर हमला करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए, सीपी की उपकला कोशिकाओं PRRS 22,23 व्यक्त करते हैं। TLRs PRRS के भीतर एक महत्वपूर्ण परिवार प्रतिनिधित्व करते हैं। गुणात्मक आरटी पीसीआर प्रदर्शन विश्लेषण करती है कि HIBCPP कोशिकाओं कई TLRs के साथ ही संबंधित सह रिसेप्टर्स और अनुकूलक अणु MyD88 15 व्यक्त करते हैं। यह देखा गया है कि रिसेप्टर्स TLR2 और TLR4 एन करने के लिए सेलुलर रक्षा प्रतिक्रिया में शामिल हैं Meningitidis सम्पुटी polysaccharides 24। एक माइक्रोएरे दृष्टिकोण के आगे परिणाम है कि HIBCPP कोशिकाओं एन से संक्रमित का पता चला मेनिन्जाइटिडिस, संकेत पारगमन मार्ग की एक प्रेरण प्रदर्शित बीच अन्य कारकों को भी प्रतिलेखन नियामक से जुड़े 15, अनिवार्य IκBζ 25,26, एक समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन il6 सहित कुछ लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के लिए।

इन निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए, HIBCPP कोशिकाओं एन से संक्रमित एक औंधा संस्कृति प्रणाली में मेनिन्जाइटिडिस साइटोकिन्स और chemokines की रिहाई की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह ज्ञात है कि इस प्रक्रिया को सहज प्रतिरक्षा प्रणाली 13,14 के सक्रियण द्वारा एक भड़काऊ प्रतिक्रिया भड़काने के लिए करना है। HIBCPP कोशिकाओं उत्पादन और साइटोकिन्स और chemokines, CXCL1-3, IL6, IL8 और TNFα 15,16, जो न्यूट्रोफिल और monocytes 27 को आकर्षित करने के लिए वर्णित किया गया है सहित छिपाना। हमारे मॉडल प्रणाली हम काम करकेपाया गया कि polymorphnuclear न्यूट्रोफिल, monocytes और भी टी lymphocytes HIBCPP कोशिकाओं 16,28 के माध्यम से विस्थापित, बल है कि HIBCPP कोशिकाओं प्रतिरक्षा कोशिकाओं के transepithelial प्रवास के तंत्र का गूढ़ रहस्य के लिए उपयुक्त हैं।

इस के साथ साथ प्रस्तुत मॉडल प्रणाली को भी संशोधन के लिए अवसर प्रदान करता है। HIBCPP कोशिकाओं एंटीबॉडी या रासायनिक अवरोधकों रिसेप्टर्स की पहचान करने और पारगमन संक्रमण के दौरान शामिल रास्ते संकेत करने के साथ pretreated जा सकता है। DMSO, सेल उत्तेजक अभिकर्मकों के लिए एक आम विलायक HIBCPP कोशिकाओं है, जो स्थिर बाधा कार्य करता है कि जांच की समय पाठ्यक्रम में रासायनिक से प्रभावित नहीं हैं प्रदर्शित करने के लिए उचित मात्रा में लागू किया जा सकता है। यह संपत्ति भी दवा अध्ययन में मॉडल के उपयोग के लिए प्रासंगिक है।

हालांकि हम दिखा दिया है कि HIBCPP कोशिकाओं polarity के एक निश्चित स्तर दिखाने के लिए, वे स्वाभाविक रूप से एक विवो मॉडल की हर एक विस्तार को प्रतिबिंबित नहीं करेगा। <उन्हें> उदाहरण के लिए एबीसी ट्रांसपोर्टर परिवार के सदस्यों के स्थानीयकरण केवल आंशिक रूप से उम्मीद पैटर्न 6, क्यों दवा अनुप्रयोगों शायद ही एक सीमित हद तक लागू किया जा सकता मेल खाता है। इसके अलावा, HIBCPP कोशिकाओं सीएसएफ के उत्पादन के लिए (डेटा) नहीं दिखाया नहीं लगती। फिर भी, हमने पाया है कि HIBCPP कोशिकाओं आरएनए 5 स्तर पर प्रोटीन Transthyretin, इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक 2 (IGF2) और forkhead बॉक्स J1 (FOXJ1), जो सी.पी. उपकला कोशिकाओं 29,30,31,32 के लिए विशेषता मार्कर प्रोटीन होते हैं अभिव्यक्त । इस अवलोकन का समर्थन करता है कि HIBCPP कोशिकाओं सी.पी. उपकला कोशिकाओं के विशिष्ट गुण को बनाए रखा है। महत्वपूर्ण बात है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि HIBCPP कोशिकाओं नहीं उपस्थित संपर्क निषेध नहीं है। यह इसलिए जब उचित तीर मूल्यों पर पहुँच रहे हैं प्रयोग के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, HIBCPP कोशिकाओं नहीं पारित होने के 38 से परे, उच्च मार्ग के साथ ड्रॉप करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए संभावित बाद से एक बाधा समारोह को विकसित करने लगता है। अंत में, छोटा सा भूत अध्ययन करने के लिएBCSFB में संक्रमण के एक सह संस्कृति मॉडल सी.पी. उपकला और endothelial से मिलकर दौरान सेल सेल बातचीत का कार्य उच्च ब्याज की हो जाएगा, लेकिन इस तरह के एक मॉडल अभी भी विकसित किए जाने की जरूरत है।

अंत में, HIBCPP सेल संस्कृति मॉडल कुंजी आक्रमण रास्ते और अंतर्निहित संकेत पारगमन मार्ग, विशेष रूप से BCSFB पर मानव विशिष्ट रोगाणुओं की प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह जाना जाता है कि सीपी की उपकला कोशिकाओं के रूप में भी अच्छी तरह से अल्जाइमर रोग सहित तंत्रिका संबंधी विकारों अपक्षयी मल्टीपल स्केलेरोसिस 2 में शामिल कर रहे हैं, और यह भी ट्यूमर कोशिकाओं को 33 के मस्तिष्क मेटास्टेसिस में, सिस्टम सामान्य अवसरों की एक महान विविधता में प्रदान करता है रोग से संबंधित तंत्र की जांच के लिए, संभावित उपन्यास चिकित्सात्मक लक्ष्य लगाने के लिए प्रदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) Life Technologies D1306
12-well plates Starlab CC7682-7512
24-well plates Starlab CC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMP This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) Invitrogen A21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) Invitrogen A21442
Alexa Fluor 660 Phalloidin Invitrogen A22285
Bovine serum albumine (BSA) Calbiochem 12659
Chocolate agar plates Biomerieux 43109
Cytochalasin D Sigma C8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES Gibco 31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred Gibco 11039-047
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies 10270106
FITC-Inulin Sigma F3272
Insulin Sigma 19278
MgCl2 Sigma 2393
NaHCO3 Sigma 55761
PBS + Mg + Ca Gibco 14040-174
Penicillin/Streptomycin MP Biomedicals 1670049
Polyvitex Biomerieux 55651
Proteose peptone BD 211684
Serum-free medium Gibco 10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm Greiner 662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile Greiner 658175
Triton X-100 Sigma T8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode Millipore MERSSTX00

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References

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चिकित्सा अंक 111 रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा सेल संस्कृति फिल्टर डालने सेल लाइन रंजित जाल HIBCPP मेजबान रोगज़नक़ बातचीत मानव,
मानव रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा का एक रंजित जाल उपकला सेल आधारित मॉडल basolateral साइड से जीवाणु संक्रमण का अध्ययन करने के लिए
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