Introduction
La barriera sangue fluido cerebrospinale (BCSFB) è uno dei tre siti barriera tra il sangue e il cervello 1. La correlazione morfologica sono le cellule epiteliali del plesso coroide (CP) 2,3, un convoluto endoteliale-epiteliale, che è fortemente vascolarizzato e situato nei ventricoli del cervello. Il CP serve per produrre il liquido cerebrospinale (CSF), nonché a separare quest'ultima dal sangue. Al fine di realizzare la funzione di barriera, le cellule epiteliali CP mostrano una bassa attività pinocitotiche, esprimono trasportatori specifici, e sono densamente collegati da una rete continua di giunzioni strette (TJS) 2,3.
Umana coroide plesso papilloma (HIBCPP), le cellule, derivate da una maligna coroide plesso papilloma di una donna giapponese a 4, sono stati usati per costruire un funzionale modello in vitro del BCSFB. cellule HIBCPP mostrano un paio di caratteristiche di un BCSFB funzionale come la formazione di TJfili, lo sviluppo di un alto potenziale di membrana transepiteliale che può essere determinato come la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e permeabilità minori per macromolecole. Inoltre, le cellule HIBCPP esprimono trasportatori caratteristici, che possono servire a regolare il microambiente ionico, e mostrare apicale / basolaterale 5,6,7 polarità.
Il BCSFB ha dimostrato di funzionare come un sito di ingresso per agenti patogeni (batteri, virus e funghi) nel sistema nervoso centrale (CNS) 8. L'invasione di patogeni, tra cui Neisseria meningitidis (N. meningitidis), un batterio Gram-negativo, può causare malattie gravi come la meningite. La prova che supera la barriera epiteliale protettiva del CP è supportata da osservazioni istopatologici nei pazienti con malattia meningococcica esibendo una maggiore quantità di meningococchi nei vasi e le cellule epiteliali CP 9,10. Per ottenere l'ingresso nelle cellule ospiti bacteria spesso dirottare meccanismi di endocitosi, che sono mediati o attivati da specifici recettori di superficie situati sulle cellule ospiti. Poiché interazioni di patogeni con questi recettori possono essere specie modelli 11, animali specifici possono essere consultati solo in misura limitata. La linea cellulare HIBCPP offre l'opportunità di studiare il processo di invasione nonché i meccanismi molecolari alla base in un sistema modello umano. Impiegando inserti di coltura cellulare ci permette di analizzare le interazioni di agenti patogeni con cellule ospiti da due lati delle cellule distinte. Molti batteri, tra cui N. meningitidis, sono fortemente soggetta all'impatto di gravità durante saggi di infezione. Per l'interazione ottimale dei patogeni con cellule HIBCPP durante i saggi, i batteri sono inizialmente aggiunti nel vano superiore del sistema di cartuccia del filtro di coltura cellulare. Per attivare infezione apicale o il lato della cella basolaterale rispettivamente, due varianti del sistema in vitro sono stati estafissare dei: Nel sistema standard cellule HIBCPP vengono seminate nel vano superiore dell'inserto filtrante, imitando la situazione quando i microrganismi si trovano sul CSF-lato ed entrare in contatto con il lato apicale delle cellule (Figura 1A, C). Al contrario, utilizzando le cellule HIBCPP in un sistema di cartuccia del filtro di coltura cellulare invertito riflette le condizioni quando i batteri sono entrati nel flusso sanguigno. Microrganismi diffondere nel sangue e di incontro CP cellule epiteliali dal lato basolaterale (Figura 1B, D). Degno di nota, in questo sistema modello è stato dimostrato che i batteri invadono le cellule HIBCPP in modo polare specificamente dal basolaterale 5,7 lato della cella.
In seguito alle infezioni del CP, gli agenti patogeni invasi possono essere riconosciuti dal sistema immunitario innato attraverso la legatura ai recettori pattern-recognition (PRR). i membri ben descritto dei PRRs appartengono alla famiglia dei recettori Toll-like (TLR). può TLR bind per strutture caratteristiche di microrganismi infettivi, che sono modelli patogeni associati definito molecolari (PAMPs). Legatura dei recettori porta all'attivazione della cellula ospite cascate di segnalazione che attivano l'espressione di citochine e chemochine 12, che a loro volta stimolano trasmigrazione delle cellule del sistema immunitario in tutto il BCSFB 13,14. E 'stato dimostrato che le cellule HIBCPP esprimono diversi TLR a livello di mRNA e che l'infezione con N. meningitidis si traduce in secrezione di diverse citochine e chemochine, tra cui CXCL1-3, IL-6, TNF IL8 e 15,16.
Qui, descriviamo coltivazione e infezione della linea cellulare umana HIBCPP in un sistema di inserto di coltura cellulare invertita che imita il BCSFB. Questo sistema modello consente di studiare le interazioni di agenti patogeni con il lato in vivo corrispondente cella basolaterale nonché la successiva risposta cellulare.
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Protocol
1. Preparare cultura cellulare di filtro Inserti per celle semina HIBCPP in un sistema invertito modello
- Pre-caldo DMEM / F12 (Ham) supplementato con 5 mg / ml di insulina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 10% di siero fetale bovino (FCS).
- Utilizzare pinza sterile per posizionare 0,33 cm² area di crescita inserti del filtro coltura cellulare con una dimensione dei pori di 3 micron a testa in giù in un 12-pozzetti (Figura 1E).
- Riempire media nel vano inferiore dell'inserto filtro di coltura cellulare (circa 3 ml) e 100 ml sulla parte superiore del dispositivo di filtrazione. Inondare la piastra e il vano inferiore con il mezzo. Aspirare il mezzo eccessivo in modo tale che il vano inferiore dell'inserto filtrante rimane riempito (Figura 1E).
Nota: Si consiglia di utilizzare una pipetta sierologica per questo passo. - Coprire 12-pozzetti con il coperchio e trasferire gli inserti preparati filtri coltura cellulare per l'incubatore, 37 ° C,5% di CO 2 fino aggiunta di cellule.
2. La coltivazione e Passaging di celle HIBCPP
- Preparare DMEM / F12 (prosciutto) integrato con 5 mg / ml, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 10% FCS.
- Pre-caldo medio e PBS a bagnomaria C 37 °. medio Aspirare dalla boccetta. Aggiungere 10 ml di PBS al pallone e turbolenza. Ripetere questa operazione una sola volta.
- Aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina-EDTA al pallone e turbolenza. Mettere in incubatrice, 37 ° C, 5% di CO 2.
- Dopo circa 20 minuti togliere il pallone dal termostato. Assicurarsi che le cellule vengono staccate dal fondo del pallone e mostrano una forma rotonda quando esaminato con il microscopio.
Nota: Le cellule non staccano completamente l'uno dall'altro e si trovano spesso in agglomerati. Si consiglia di utilizzare le cellule fino a passaggio 38. - Per interrompere tripsinizzazione aggiungere 17 ml di mezzo. Risospendere le cellule pipettando su e giù e trasferire la sospensionein un tubo da 50 ml. Centrifugare a 50 xg per 10 min a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule in un volume adeguato di medie e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Nota: La concentrazione di cellule risospese HIBCPP dovrebbe essere di 1 x 10 6 cellule / ml. Per la manutenzione di cellule HIBCPP si suggerisce di trasferire una quantità di 1-6 x 10 6 cellule in 10 ml di mezzo di un T75 in pallone. Modificare media ogni due giorni.
3. Semina filtro Cell Culture invertito inserti con le cellule HIBCPP
- Sulla parte superiore di ogni elemento filtrante invertita (cioè il lato inferiore del filtro) aggiungere 80 ml di sospensione cellulare (cioè. 8 x 10 4 cellule) (Figura 1E).
Nota: Assicurarsi che le cellule sono uniformemente distribuiti in sospensione invertendo il tubo prima della semina. - Coprire le cartucce filtranti coltura seminato cellule con il coperchio della piastra 12 pozzetti e trasferimento in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2.
- Il primo giorno, riempire 1 ml di mezzo nei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Sollevare gli inserti del filtro di coltura cellulare utilizzando una pinza fuori dal 12-pozzetti, scartare il medium all'interno, girare gli inserti del filtro e metterli in orientamento standard nel preparato 24-pozzetti (Figura 1E).
- Mettere le cellule in terreno fresco ogni due giorni. Preparare 24 pozzi con terreno fresco e trasferire gli inserti del filtro ad esso. Riempire inserti con 0,5 ml di terreno fresco. Controllare TEER ogni giorno come descritto nel paragrafo 4.
- Quando i valori di Teer HIBCPP seminate cellule su inserti colture cellulari supera il 70 Ω x cm² (circa 4 giorni dopo la semina), per poi proseguire coltura cellulare in mezzo contenente 1% FCS e 5 mg / ml di insulina. Preparare piastre da 24 pozzetti con 1 ml di mezzo per ciascun pozzetto. Trasferire elementi filtranti ai pozzetti preparate e mezzo di scambio nel compartimento superiore.
Nota: Questo ritiro siero dopo confluenza porta alla formazione diun potenziale di membrana superiore. - Aspirare media dal vano del filtro, il trasferimento al preparato bene e riempire con 500 microlitri di media. Ripetere questa operazione una sola volta. Mettere le cellule durante la notte in incubatrice, 37 ° C, 5% di CO 2.
4. Misura della Transepithelial Resistenza elettrica (TEER)
- Immergere le punte degli elettrodi di voltohmmeter tessuto epiteliale per 15 minuti in 80% di etanolo. Trasferire voltohmmeter sotto il cofano e lasciare asciugare l'elettrodo per un momento. Mettere elettrodo nel rispettivo terreno di coltura usato per le celle per altri 15 minuti per equilibrare.
- Eseguire misurazioni posizionando il braccio più lungo dell'elettrodo modo che tocchi il fondo del vano inferiore ogni volta, posizionare il braccio più corto nel vano di alloggiamento del filtro.
Nota: Valori di resistenza delle cartucce filtranti di coltura cellulare senza cellule in terreno dovrebbero essere utilizzati come valori vuoti ((valore misurato (Ω) - valore del bianco (Ω)) x Filtrodi superficie (cioè 0,33 cm²)). - Dopo aver misurato posto l'elettrodo resta in 80% di etanolo per 15 min. Conservare in un tubo secca.
5. Determinazione della permeabilità paracellular
- Sciogliere 1 g FITC-inulina in 200 ml di mezzo la cultura integrata con 5 mg / ml di insulina 1% FCS. Applicare 50 ug / ml della soluzione nel vano filtro superiore prima infezione delle cellule.
- Dopo l'infezione raccogliere campioni di media dal basso bene per determinare la quantità di inulina passata dal vano filtro attraverso lo strato di cellule.
- Preparare una soluzione standard FITC-inulina ed eseguire 1: 2 diluizioni, 10 volte (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% e 0%) . Determinare la fluorescenza con la misurazione di tutti i campioni di lettore di micropiastre.
6. Preparazione di batteri per l'infezione delle cellule HIBCPP sulla cultura delle cellule filtro Inserti
- Un giorno prima dell'esperimento, raschiare tegli N. congelato meningitidis ceppi fuori una glicerolo magazzino e strisciare su agar cioccolato con Vitox. Crescere durante la notte in incubatrice, a 37 ° C, con il 5% di CO 2.
- Estratto 20-30 colonie dalla cultura durante la notte e trasferire in una provetta contenente 8 ml proteoso peptonata medio integrato con 0,042% NaHCO 3, 0,01 M MgCl 2 e 1% Polyvitex.
- Agitare i batteri per 1,25 ore a 220 rpm, 37 ° C. Pellet i batteri da centrifugazione a 2.684 g per 10 min a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e risospendere il pellet batterico con 8 ml di terreno privo di siero. Vortex per assicurare una sospensione.
- Per determinare la densità cultura, misurare una diluizione di 1:10 ad una densità ottica (OD) a 600 nm. Regolare la sospensione batterica ad un OD 600 di 0,1.
Nota: Questa sospensione contiene circa. 1 x 10 8 UFC / ml. - Per confermare la concentrazione cellulare batterica, diluire la sospensione graduale (1,10) fino ad undiluizione del 10 -5 e la piastra su piastre di agar cioccolato.
Nota: diluizioni seriali simili devono essere eseguite per calcolare curve di crescita batterica.
7. l'infezione delle cellule HIBCPP sulla cultura cellulare di filtro Inserti e la determinazione del batterica Invasion con un doppio immunofluorescenza
- Dopo continuando coltura cellulare in terreno contenente 1% FCS e 5 ug / ml di insulina, misurare cellule ogni giorno utilizzando un voltohmmeter tessuto epiteliale. Se le cellule hanno raggiunto un TEER di circa 500 Ω x cm², effettuare l'infezione.
- Infettare le cellule con la sospensione batterica preparata ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10. Conservare le cellule infettate nell'incubatore, a 37 ° C, con 5% di CO 2 per il periodo di tempo indicato.
Nota: La MOI può essere calcolato tenendo conto del numero di cellule per inserto filtro coltura cellulare a confluenza (1,21 x 10 6 cellule / cm 2). - Arrestare il infettareion mediante lavaggio tre volte con 500 microlitri terreno privo di siero (SFM) contenente albumina di 1% di siero bovino (BSA) applicata al compartimento filtro, 1 ml al vano inferiore.
- Blocco con 500 microlitri SFM contenente tampone BSA 1% nel vano del filtro e 1 ml nel vano inferiore per 20 minuti a temperatura ambiente per prevenire l'aderenza di anticorpi siti di legame non specifici.
- Incubare con 100 microlitri anticorpo primario anti- N. meningtidis α-OMP (1: 200) nel vano filtro e 500 microlitri nel vano inferiore per 20 min a temperatura ambiente.
Nota: Se necessario, la concentrazione di anticorpi deve essere titolato. - Lavare le cellule aspirando il medium dal vano del filtro, trasferire l'inserto del filtro di un preparato SFM bene con 1 ml contenente 1% di BSA e riempire il vano del filtro svuotato con SFM 500 microlitri contenente 1% di BSA. Ripetere questa operazione due volte.
- Fissare le cellule con 500 microlitri 4% formaldeide nel compa filtrortment, 1 ml nel vano inferiore per 10 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule aspirando il medium dal vano del filtro, trasferire l'inserto del filtro ad una ben preparata con 1 ml di PBS e riempire il vano del filtro svuotato con 500 microlitri di PBS. Ripetere questa operazione una sola volta.
Nota: I campioni possono essere conservati durante la notte in PBS a 4 ° C. - coltura cellulare fisso Cut filtra degli inserti e lavare con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA. Incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente con 250 microlitri fluorescente etichettati (lunghezza d'onda di eccitazione 594 nm) anticorpo secondario di coniglio anti pollo (1: 500) per colorare batteri extracellulari.
Nota: Se necessario, la concentrazione di anticorpi deve essere titolato. - Permeabilize cellule con 250 microlitri di PBS contenente 1% di BSA e 0,5% Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le cellule tre volte con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA.
- Incubare con 250 microlitri anticorpo primario anti- N. meningitidis
- Applicare 250 ml di fluorescenza etichettati (eccitazione lunghezza d'onda di 488 nm) anticorpo secondario (1: 500), fluorescente marcato (eccitazione lunghezza d'onda di 660 nm) falloidina (1: 250) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI) ( 1: 50.000) per 1 ora a temperatura ambiente per colorare batteri extra ed intracellulari, citoscheletro actina e nuclei.
Nota: Se necessario, la concentrazione di anticorpi deve essere titolato. - Lavare le cellule tre volte con 250 microlitri di PBS contenente 1% BSA. Incorporare le cellule in terreno e conservare a 4 ° C di montaggio fino a esame tramite microscopio.
- Determinare il numero di batteri invaso per campo predefinito. A tale scopo, contando 20 campi per filtro a membrana. Calcolare la percentuale di batteri invaso.
Nota: Moltiplicare il numero di batteri media dei 20 campi microscopici con una Coëffic zonaiente. Il risultato esprime la quantità di batteri totali presenti in un inserto filtro coltura cellulare 0,33 cmq. Dividere questo valore per la quantità di batteri cresciuti in media durante la durata dell'infezione.
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Representative Results
Qui si descrive la coltura e l'infezione delle cellule HIBCPP in un sistema di coltura cellulare inserto invertita. Questo modello permette di studiare i meccanismi di invasione e le vie di segnalazione molecolari alla base dal lato delle cellule basolaterale, riproducendo una situazione fisiologica di batteri diffusione e che entrano cellule epiteliali attraverso il flusso sanguigno (Figura 1).
Le cellule HIBCPP mostrano alcune funzioni di barriera, che consentano di limitare lo scambio molecolare ad un livello minimo. Ciò si ottiene mediante l'espressione di adherens giunzione (AJ) e le proteine di giunzione a tenuta (TJ). Immunofluorescenza delle proteine TJ-associati Occludin, Claudin e ZO-1 ha rivelato un segnale continuo nei siti di contatto cellula-cellula, dimostrando che le cellule sono interconnessi da fili continui di TJs (Figura 2A, B, C). Una impressione dettagliata di tegli TJ morfologia è stato ottenuto dalla trasmissione (Figura 2D) e congelare la microscopia elettronica frattura (Figura 2E), che dimostra che TJs si trovano tra le cellule e formano ampie strutture di cavi simili, maglie.
TJs delle cellule epiteliali anche agire come un recinto per separare i domini membrana apicale e basolaterale, contribuendo così alla polarità cellulare. Tra le proteine, che sono espressi esclusivamente sul lato della cella basolaterale delle cellule HIBCPP, sono la proteina AJ E-caderina (Ecad) e il fattore di crescita degli epatociti recettore (HGF / Met) come dimostrato da analisi di immunofluorescenza in figura 3, indicando un certo livello di polarità.
Quando coltivate in condizioni appropriate cellule HIBCPP mostrano anche funzioni di barriera tipiche del BCSFB come formazione di un potenziale di membrana, nonché una bassa permeabilità per macromolemolecole. Determinazione del potenziale di membrana può essere ottenuto mediante misurazione della TEER con l'uso di un voltohmmeter. La permeabilità dello strato di cellule è quantificato mediante applicazione di FITC-marcato Inulina, uno zucchero che passa lo strato in modo paracellular. Qui mostriamo i risultati di un esperimento rappresentativo, il che dimostra che queste funzioni di barriera rimangono stabili e non mostrano affetto da concentrazioni standard di dimetilsolfossido (DMSO), un solvente comune per cellulari stimolanti chimici. Come si vede nella figura 4A, valori Teer stati registrati prima e dopo esposizione delle cellule HIBCPP al DMSO.
Le cellule mostravano un alto potenziale di membrana che raggiunge fino a circa 500 Ω x cm² all'inizio dell'esperimento per tutte le condizioni. Il misurata TEER non è cambiato dopo 2 ore di cellule trattate con un massimo di 0,2% vol DMSO. Al contrario, i valori Teer diminuito in modo dose-dipendente wh manieraen stati applicati volumi (Figura 4A). Questa riduzione di potenziale di membrana è concomitante con un aumento della permeabilità per macromolecole. Mentre l'aggiunta di DMSO a cellule HIBCPP fino a 0,5% in volume non ha comportato un aumento di permeabilità per inulina, 1 vol% e il 2% vol visualizzate un effetto, anche se in misura limitata (Figura 4B). Inoltre, abbiamo verificato l'influenza di Citocalasina D, un potente inibitore di polimerizzazione, il potenziale di membrana e la permeabilità delle cellule HIBCPP. Il trattamento delle cellule con 1 mg / ml Citocalasina D determina una diminuzione significativa dei valori teer nonché un aumento del flusso FITC-inulina (Figura 4A, B). Questo effetto può essere spiegato con l'apertura di TJs causata da Citocalasina D.
La linea cellulare HIBCPP come modello del BCSFB può essere impiegato per studiare le interazioni di patogeni e le cellule epiteliali di barriera formatura. Vi sono proveche il batterio N. meningitidis guadagna l'ingresso nel sistema nervoso centrale attraversando il BCSFB. E 'stato dimostrato che Neisseria invadere le cellule HIBCPP precisamente dal lato della cella basolaterale, rilevante in vivo. Durante questo processo la capsula batterica gioca un ruolo importante: i mutanti della capsula-carenti mostrano un aumento invasione nelle cellule HIBCPP 5. Di seguito abbiamo confrontato l'invasione basolaterale della MC58 ceppo 17, il suo mutante isogenico MC58siaD - carente per la produzione di capsule 17 e il vettore non incapsulata isolare α14 19,20. Cellule HIBCPP sono stati infettati con ceppi di cui sopra nel corso di un corso di tempo di 4 ore ad una MOI di 10 analisi di immunofluorescenza ha rivelato invasione significativi per le due ceppi patogeni MC58 e MC58siaD -, mentre i tassi di invasione solo lievi sono stati osservati per il ceppo apatogeno α14 ( Figura 5A). Una immagine rappresentativa del doppio immunofluorescence microscopia cellule HIBCPP infettate con il rispettivo ceppo è mostrato in Figura 5A, B e C.
Figura 1:. Standard e inversi coltura cellulare Sistema Nel sistema di coltura cellulare standard (A, C) interazione dei batteri con le cellule epiteliali CP può essere indagato sul lato apicale delle cellule, che è indicato da microvilli. Il sistema di coltura cellulare invertita (B, D) ci permette di studiare l'interazione batterica con la membrana cellulare basolaterale, che è coinvolto durante l'invasione batterica attraverso il flusso sanguigno nel sistema nervoso centrale. Per la coltura cellulare invertita cellule (E) HIBCPP sono seminati sul lato inferiore delle cartucce filtranti. Il pozzo inferiori, compreso il vano interno del l'inserto del filtro sono inondate di media. Subsequtemente, il mezzo eccessivo viene aspirato in modo tale che il vano interno della cartuccia filtrante rimane riempito. Il primo giorno dopo la semina, gli inserti del filtro colture cellulari vengono capovolte e riempito con il mezzo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Cells HIBCPP visualizzazione fili continui di TJs Le proteine TJ ZO-1 (A), sono stati individuati Occludin (B) e Claudin-1 (C) nelle cellule HIBCPP. Pannelli AC mostrano immagini apotome. Centro di ogni pannello: xy en faccia vista delle cellule; lato superiore e sinistro: sezioni di parecchie fette ottico attraverso la z -Plane. Barre di scala indicano 10 micron. La struttura TJ delle cellule HIBCPP è stato analizzato da trasmismicroscopia elettronica sione. Le cellule sono interconnesse da TJs, che sono indicati dalle frecce (D). La barra della scala indica 1 micron. Congelare studi di microscopia frattura di elettroni visualizzare strettamente ingranamento filoni TJ (E). La barra di scala = 0,5 micron. Le immagini di questa figura sono stati originariamente pubblicati in Schwerk et al, PLoS ONE 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); ristampa con il permesso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione dei recettori proteine coinvolte durante l'invasione di batteri nel HIBCPP cellule immunofluorescenza mostra espressione di Ecad (A) e Met (B) sul lato delle cellule basolaterale.. il pictures mostrano immagini apotome. Centro di ogni pannello: xy en faccia vista delle cellule; superiore e laterale destra: sezione trasversale di qualche fetta ottici attraverso la z -Plane. La membrana apicale delle cellule HIBCPP (indicato dalle frecce) è posizionata verso la parte superiore della parte superiore così come verso destra del lato destro, rispettivamente, di ogni frame. Barre di scala = 10 micron. I dati contenuti in questa figura sono stati pubblicati anche in precedenza in Gründler et al, microbi infettare 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); ristampa con il permesso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Influenza della DMSO e Citocalasina D sulla barriera funzione delle cellule HIBCPP Effetti sulla barriera func.zione sono determinati dalla misurazione dei valori teer e FITC-inulina-Flux. I risultati sono mostrati per un esperimento rappresentativo, che è stata eseguita in triplicato. Cellule HIBCPP sono stati trattati con DMSO e Cytochlalasin D nelle quantità indicate per 2 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Quando viene applicato in concentrazioni fino a 0,2% in volume, DMSO non influenza potenziale di membrana (Figura 4A). Le concentrazioni che vanno da 0,1 vol% fino a 0,5% in volume di DMSO, inoltre, non influenzano la permeabilità paracellular delle cellule (Figura 4B). Al contrario, 1 mg / ml Citocalasina D determina una diminuzione TEER concomitante con un aumento di FITC-inulina-Flux attraverso lo strato di cellule (Figura 4A, B).
Figura 5: Invasione di N. meningitidis in cellule HIBCPP. Doppia immunofluorescenza microscopia spettacoli invaso (verde) e aderito batteri (giallo). White boxes all'interno delle immagini rappresentano dettaglio immagine ingrandita sul lato destro. Invasione basolaterale è stata osservata per la N. meningitidis ceppi MC58 (A) e MC58siaD -, carente per la produzione di capsule (B), mentre solo una percentuale minore invasione è stata determinata per α14 (C). Il diagramma mostra che i tassi di invasione della MC58 e MC58siaD - sono molto significativi rispetto alle α14 (**, p <0,01). Importanza estrema viene visualizzato quando MC58 o MC58siaD - rispettivamente, sono stati confrontati con α14 (***, p <0,001) e MC58siaD - è stato paragonato a MC58 (###, p <0.001). Scala barre indicate 10 micron. . Il diagramma in D è stato originariamente pubblicato in Borkowski et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10,1186 / s12974-014-0163-x (2014); ristampa con il permesso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le cellule epiteliali del CP formano il BCSFB che separa il CSF dal 2,3 sangue. Recentemente abbiamo stabilito la linea cellulare HIBCPP come un modello umano funzionale del BCSFB. Le cellule mostrano importanti funzioni di barriera della BCSFB in vitro, compreso lo sviluppo di un elevato potenziale di membrana, una bassa permeabilità per le macromolecole, così come la presenza di filamenti continui di TJs 5. Le proteine TJ contribuiscono ad una polarità apicale / basolaterale delle cellule. La polarità è di grande importanza per una localizzazione diretta di recettori di superficie, nonché proteine di trasporto specifiche. Abbiamo dimostrato la localizzazione polare dei recettori ECAD e soddisfatte così come i membri della ATP-binding cassette (ABC) trasportatore famiglia che mantiene un microambiente altamente controllato all'interno del sistema nervoso centrale 6,7.
Ci sono diversi microrganismi che sono in grado di entrare nel SNC, superando la BCSFB, leading di malattia grave inclusi la meningite 8. Uno dei patogeni che sono in grado di invadere in cellule epiteliali CP è il batterio Gram-negativi N. specifici umana meningitidis 9,10, che ha dimostrato di entrare nelle cellule HIBCPP in modo polare precisamente dal lato della cella basolaterale 5. Questa è la direzione fisiologicamente rilevanti per infezione del cervello attraverso la BCSFB quando i batteri diffondere e cellule epiteliali incontro CP dal sangue durante il corso di meningite. Per riflettere questa situazione in vitro, le cellule sono coltivate HIBCPP sul lato inferiore del filtro. In contrasto con il modello inserto filtro standard, in cui le cellule vengono seminate nel compartimento superiore, questo set up di un sistema di coltura invertito permette di infettare le cellule epiteliali precisamente dal lato della cella basolaterale 5,21.
L'invasione basolaterale in cellule HIBCPP è stato osservato per i due N. patogeno meningitidis -, mentre il vettore non patogeno isolare α14 visualizzati solo invasione marginale 15. Questo dimostra che il modello cellulare HIBCPP offre la possibilità di eseguire la scansione disponibili librerie di mutanti per fattori di virulenza nuovi coinvolti durante il processo di invasione. Degno di nota, è stato dimostrato che altri agenti patogeni, tra cui L. monocytogenes e Streptococcus suis (S. suis) invadono le cellule HIBCPP in modo polare 5,7.
Per riconoscere e rispondere ad invadere microrganismi nel SNC, le cellule epiteliali del CP esprimono PRRs 22,23. TLR rappresentano una importante famiglia all'interno dei PRRs. RT-PCR qualitativa analisi ha dimostrato che le cellule HIBCPP esprimono diversi TLR e relativi co-recettori e la molecola adattatrice MyD88 15. E 'stato osservato che i recettori TLR2 e TLR4 sono coinvolti nella reazione di difesa cellulare a N. meningitidis polisaccaridi capsulari 24. Ulteriori risultati di un approccio microarray hanno rivelato che le cellule infettate HIBCPP con N. meningitidis visualizzare una induzione di vie di trasduzione del segnale, tra gli altri fattori che coinvolgono anche il regolatore di trascrizione IκBζ 15, obbligatorio per l'espressione di alcuni geni bersaglio tra cui IL6 25,26, una citochina pro-infiammatoria.
Per confermare questi risultati, le cellule infettate HIBCPP con N. meningitidis in un sistema di coltura invertita sono stati utilizzati per studiare il rilascio di citochine e chemochine. È noto che questo processo si propone di avviare una risposta infiammatoria dall'attivazione del innato 13,14 sistema immunitario. cellule HIBCPP produrre e secernere citochine e chemochine, tra cui CXCL1-3, IL-6, TNF IL8 e 15,16, che sono stati descritti per attirare i neutrofili e monociti 27. Utilizzando il nostro ci modello di sistemahanno scoperto che i neutrofili polymorphnuclear, monociti e anche i linfociti T migrano attraverso le cellule HIBCPP 16,28, sottolineando che le cellule HIBCPP sono adatti per decifrare i meccanismi della migrazione transepiteliale di cellule immunitarie.
Il sistema modello qui presentato offre anche la possibilità per le modifiche. cellule HIBCPP possono essere pretrattati con anticorpi o inibitori chimici per identificare i recettori e il segnale vie di trasduzione coinvolte durante l'infezione. DMSO, un solvente comune per cellulari stimolare reagenti può essere applicato in volumi adeguati alle cellule HIBCPP, che mostrano funzioni di barriera stabili che non sono interessati dalla chimica durante il corso di tempo indagato. Questa proprietà è rilevante per l'utilizzo del modello in studi farmaceutiche.
Sebbene abbiamo dimostrato che le cellule HIBCPP mostrano un certo livello di polarità, essi non riflettono naturalmente ogni singolo dettaglio di un modello in vivo. <em> Ad esempio, la localizzazione dei familiari trasportatore ABC corrisponde solo in parte i modelli attesi 6, per cui le applicazioni farmaceutiche possono probabilmente essere applicate solo in misura limitata. Inoltre, le cellule HIBCPP non sembrano produrre CSF (dati non mostrati). Tuttavia, abbiamo trovato che le cellule HIBCPP esprimono le proteine Transthyretin, il fattore di crescita insulino-simile 2 (IGF2) e scatola di forkhead J1 (FOXJ1) a livello di RNA 5, che sono proteine marker caratteristici per le cellule epiteliali CP 29,30,31,32 . Questa osservazione sostiene che le cellule HIBCPP hanno mantenuto proprietà tipiche delle cellule epiteliali CP. Importante, va osservato che le cellule HIBCPP non presentano inibizione da contatto. E 'quindi fondamentale utilizzare le cellule per la sperimentazione quando vengono raggiunti i valori appropriati teer. Inoltre, le cellule HIBCPP non devono essere usati al di là di passaggio 38, dal momento che il potenziale per sviluppare una funzione di barriera sembra cadere con passaggi più alti. Infine, per studiare l'impatto di interazioni cellula-cellula durante le infezioni al BCSFB un modello di co-coltura, comprensivi di CP epiteliale e endoteliale sarebbe di grande interesse, ma un tale modello deve ancora essere sviluppato.
In conclusione, il modello di coltura cellulare HIBCPP può essere utilizzato per rivelare percorsi invasione chiave e vie di trasduzione sottostanti, in particolare di agenti patogeni specifici umani al BCSFB. Come è noto che le cellule epiteliali del CP sono coinvolti nelle patologie degenerative neurologiche compreso la malattia di Alzheimer e la sclerosi multipla 2, e anche in metastasi cerebrale di cellule tumorali 33, il sistema consente in generale una grande varietà di opportunità per l'indagine dei meccanismi correlati alla malattia, fornendo la possibilità di trovare nuovi bersagli terapeutici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
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