Protocol
1. Design og Bestilling Oligonukleotider med de relevante Sticky Ends
- Identificer potentielle rho-uafhængige terminatorer gennem genomisk analyse ved hjælp af programmer, der er frit tilgængelige online. 7
- Når man arbejder med dobbeltstrenget DNA, bestemme retningen af terminatoren, der skal testes. 7 PGR-Blå plasmid kun kontrollerer terminatorer ligeret i 5 'til 3' retningen på toppen (fremad streng).
- Konverter en bund (omvendt) streng terminator til sin vendt supplement til omlægge sekvens for test i PGR-blå ved hjælp af gratis online software, fx abe.
- Efter orienteringen er bestemt til at være korrekte, tilsæt klæbrig ende "5'-CGAC-3 '" til 5'-enden af den øverste streng. Tilsæt klæbrig ende "5'-CCGC-3 '" til 5'-enden af den nederste streng. 8 Dette vil sikre, at ligerede insert indsættes i en passendeorientering ved hjælp GGA.
- Når sekvenser bestemmes, bestille som enkeltstrengede oligonukleotider kommercielt.
2. Annealing Oligonukleotider (gælder kun for Frysetørret DNA)
- Resuspender individuelle oligonukleotider i nukleasefrit vand til en koncentration på 100 uM.
- Gør 10x annealing buffer: 1 M NaCI og 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Annealing buffer kan opbevares ved 4 ° C i adskillige uger. Når annealing buffer er lavet og oligonukleotider resuspenderes, begynde annealing 8.
- For hver terminator, der skal testes, tilsættes 16 pi ultrarent vand til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 2 pi 10x annealing buffer til hver mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 1 pi af den øverste streng oligonukleotid (100 um) fra det ønskede terminator.
- Tilsæt 1 pi af nederste streng oligonukleotid (100 um) fra det ønskede terminator.
- Opret et kogende bath anvendelse af en 1.000 ml bægerglas indeholdende ca. 400 ml ledningsvand og sted på en varm plade.
- Placer mikrocentrifugerør fra trin 2.6 i en float og koges i 4 min. Efter 4 min, slukke for varmen pladen men lad røret og flyde i vandbadet langsomt afkøle O / N (18 timer) 8. Opbevar udglødet terminatorer ved -20 ° C.
3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - omkostningseffektiv)
- Lav en 40 nM fortynding af udglødet terminatorer. Tilføj 124 pi nuclease frit vand til 1 pi annealet terminatorer mix (100 uM).
- Centrifuger prøver til 30 sekunder ved 10.000 xg og butik på is.
- Til et nyt rør passende for thermocycler anvendes, tilsættes 6 pi nuclease frit vand.
- Tilsæt 1 pi kommerciel DNA Ligase Buffer [300 mM Tris-HCI (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT og 10 mM ATP]. Udfør alle efterfølgende trin på is.
- Tilføje1 pi PgR-Blå (35-50 ng / pl) destination plasmid til mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 1 pi af de 40 nM annealede terminatorer til mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 0,5 pi kommerciel high-fidelity Bsal restriktionsendonuklease til mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 0,5 pi kommerciel DNA-ligase til mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres reaktionsblandingen ved 10.000 xg i 120 sek. Derefter placere røret direkte ind i thermocycler.
- Kør thermocycler program: 20 cykler af 1 min ved 37 ° C efterfulgt af 1 min ved 16 ° C efterfulgt af 1 cyklus af 15 minutter ved 37 ° C. Brug prøver straks eller fryse og opbevares ved -20 ° C. 8
4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - Time Effektiv)
- Tilføj 124 pi nuclease frit vand til 1 pi 100 pM annealede terminatorer oprettet i trin 2. Dette udvander terminator DNA-koncentration til 40 nM.Udfør dette trin i en ny, mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Til et nyt rør passende for thermocycler, tilsættes 14 pi nuclease frit vand. Sørg for, at nye rør er mærket i overensstemmelse hermed.
- Tilsæt 2 pi Commercial Master Mix Buffer til mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 1 pi PgR-Blå plasmid (35-50 ng / pi) til mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 2 pi af de 40 nM annealede terminatorer til mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 1 pi Commercial Master Mix til mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres 40 nM røret ved 10.000 xg i 120 sek. Derefter placere røret direkte ind i thermocycler.
- Kør thermocycler program: 1 cyklus på 60 min ved 37 ° C efterfulgt af 1 cyklus af 15 minutter ved 55 ° C. Brug prøver straks eller fryse og opbevares ved -20 ° C.
5. Transformation og Colony Selection
- Forbered Luria Base (LB) agar petriskåle indeholdende 1 mM koncentration ampicillin (Amp) og en 10 mM koncentration af arabinose (ARB). Fremstilles mindst 10 ml 1 M L -arabinose stamopløsning fordi denne stamopløsning skal bruges i senere trin.
- Brug en høj-effektive (10 8 - 10 9 transformanter / ug) kemisk kompetent E. coli (JM109) celler til transformation. 9 For de bedste resultater, tilsættes 3-5 pi af ligeringsreaktionen til 50 pi kompetente celler. Ved brug af kemiske kompetente celler, følg transformationsprotokol specifikt til cellerne, der anvendes.
- Spred halvdelen (25 pi) af de transformerede celler på forvarmet LB (Amp / ARB) agarplader under anvendelse af en steril L-formet "hockey stick" og inkuber O / N ved 37 ° C. På grund af ampicillin hurtige hastighed for spaltning, ikke inkuberes ved 37 ° C i løbet af 24 timer.
- Udfør koloni valg baseret på farve ved visuel inspektion. En vellykket ligation bør være hvid / gul i synligt lys og fluorescerer grønt under blå (450 nm) eller UV-lys. En mislykket ligation vil producere en koloni, der er blå i farve under synligt lys efter 18-20 timer.
6. Verifikation og Kvantificering af Terminator
- Forbered 5 ml sterilt LB-bouillon rør med 1 mM ampicillin og 10 mM arabinose. Antallet af rør, der er nødvendige, afhænger af antallet af terminatorer, der testes plus kontroller (celler med ampicillinresistens, som ikke fluorescerer og celler indeholdende uncut PGR-Blå plasmid).
- Under synligt lys bryde 2-3 hvid / gule kolonier (trin 5.4) ved hjælp af en steril løkke. Tillad prøverne inkuberes i bouillon på et rysteapparat ved 37 ° C og 160 rpm i 16-18 timer. Må ikke inkuberes disse prøver i mere end 24 timer.
- Eventuelt bruge et spektrofotometer til bestemmelse optiske celle densitet ved 600 nm (OD 600) for at sikre tilstrækkelig cellevækst. Generelt en OD 600 på ~ 0,8-1,0 ses efter 16-18 timers vækst.
- Brugen steril 96-brønds plade til de resterende trin. Gennemføre disse trin i et aseptisk miljø og i tre eksemplarer. Tilføj 199 pi sterilt LB + Amp / arabinose bouillon (1 mM ampicillin / 10 mM arabinose) til hver brønd. Medtag plads på pladen tre separate kontroller.
- Brug de følgende tre knapper: En godt (1), der indeholder LB + Amp / arabinose bouillon kun og en brønd (2) for ikke-transformerede kompetente celler (tomme) at tjene som en tom. Til kvantificering (3) af terminatoren styrke, celler indeholdende uslebne oprindelige PGR eller indeholder PGR-Blå ligeret med en ikke-terminerende sekvens bør medtages (anmodning kontrol for kvantificering). Se figur 1 for pladelæser layout.
- Pipetter 1 ml af celleopløsningen fra O / N bouillon i individuelle brønde i 96-brønds plade.
- Seal plader med en åndbar låg og ryst for 18-20 timer ved 37 ° C og 160 rpm.
- Anvendelse af en pladelæser, bestemme OD600 ved at læseabsorbans ved 600 nm. Mål GFP-fluorescens som følger: excitation 395 og emission 509. Mål RFP fluorescens som følger: excitation 575 og emission 605. Efter 18-20 timer, bør OD 600 være ca. 0,5.
- For at normalisere for variation i vækst, bruge ligningen:
for både GFP og RFP. - Efter normalisering, bestemme relative terminator styrke ved hjælp af ligningen
for både GFP og RFP. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol vil producere celler, der indeholder PGR-Blå med en terminator ligeret mellem GFP og RFP hjælp Golden Gate Assembly (figur 2). Positive kolonier indeholdende ligeret insertet kan vælges baseret på farve. I synligt lys vil positive kolonier være hvid / gul og falske positive vil producere blå kolonier efter 18-20 timers inkubation ved 37 ° C (figur 3).
Efter koloniselektion, kan en pladelæser anvendes til at bestemme terminator styrke. Som proof of concept, blev seks formodede terminatorer (T1-6) bioinformatically identificeret i mycobacteriofag Bernal13. Resultaterne i figur 4 viser relative terminator styrke med celler, der udtrykker uncut / umodificeret PGR som kontrol. Hvis en forudsagt terminator har en GFP / RFP-forhold svarende til PgR (~ 0.0) eller under 0,1, så sekvensen blev bestemt til ikke at være en terminator(T5 og T6). Men numerisk hver tiendedel stigning betegner en fold stigning i terminator styrke i forhold til kontrollen. For eksempel T3 havde et højt forhold mellem GFP-ekspression i forhold til RFP og viste en 5 gange stigning (0,5 på grafen) i terminator styrke i forhold til kontrol og blev betragtet som en stærk terminator (figur 4). Der blev indsamlet i tre eksemplarer og midlet for visuel repræsentation.
For at bestemme den bedste reference kontrol til kvantificering terminator styrke, sammenlignede vi rådata ved anvendelse originalen PGR plasmid indeholdende ingen terminator og PgR-Blå klonet med en sekvens, der kendes ikke være en terminator. Begge kontroller viste lignende niveauer af GFP og RFP udtryk (figur 5), og, endnu vigtigere, produceret lignende GFP / RFP nøgletal.
Figur 1. S chematic Detailing Plate Reader Layout. Room bør medtages på pladen læser til tre separate kontroller (grøn). En brønd (1) indeholdende LB + Amp / arabinose bouillon kun og en brønd (2) for ikke-transformerede kompetente celler (blank) at tjene som en blank. Til kvantificering (3) af terminatoren styrke, celler indeholdende uslebne oprindelige PGR eller indeholder PGR-Blå ligeret med en ikke-terminerende sekvens bør medtages (anmodning kontrol for kvantificering). Den resterende del af pladen (gul) kan anvendes til at teste formodede terminatorer. Det foreslås alle celler dyrkes i tre eksemplarer og gennemsnit før analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kloning site Orientation og ekspression afPGR-Blå. Konstitutiv ekspression af AmilCP (blå Chromo Protein) drives i den modsatte (nederste streng) retning af GFP og RFP. Når fordøjet med Bsal, AmilCP og Bsal genkendelsesstederne fjernes og terminatoren, der skal testes permanent ligeret ind i plasmidet. Den øverste streng og nederste streng af en terminator med de passende klæbrige ender er vist. De AraC regulator og ampicillin resistensgener er i plasmidet, men ikke vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Colony Valg efter Kloning. (A) Repræsentant plade efter PGR-Blå / terminator ligatur (standard mix) og celletransformation. Blå kolonier repræsenterer mislykkede ligeringer og hvid / gul colonies (angivet med pil) er succesfulde ligeringer. (B) En zoomet i billedet af den samme plade, som viser repræsentative kolonier efter transformation. Baggrundsfarven blev digitalt ændret til yderligere highlight koloni farveforskelle. Transformerede celler (E.coli -JM109) blev udpladet på LB agar plats indeholder ampicillin og arabinose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af seks forskellige Terminators i PGR-blå. Seks formodede terminatorer (T1-6) blev bioinformatically identificeret i mycobacteriofag Bernal13. Resultater viser relativ fluorescens. Alle resultater blev normaliseret ved anvendelse af celler indeholdende uncut / umodificeret PGR som kontrol. T3 viste sig at være en stærkterminator. Alle resultater repræsenterer individuelle kolonier dyrket i tre eksemplarer og midlet for visuel repræsentation. Fejl søjler repræsenterer afvigelser mellem gennemsnit datapunkter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. GFP og RFP Expression i Controls. Ekspression af GFP og RFP i uklippet / umodificeret PgR og to forskellige ikke-terminatorsekvenser indsat i PGR-Blå. Alle resultater repræsenterer individuelle kolonier dyrket i tre eksemplarer og midlet for visuel repræsentation. Fejl søjler repræsenterer afvigelser mellem gennemsnit datapunkter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vigtigste skridt i denne protokol er korrekt oligonukleotid design forud for bestilling. Oligonukleotiderne skal have de relevante klæbrige ender tilsat til 5 'enderne af både de øverste og nederste strenge til at sikre, at GGA inkorporering er mulig. Desuden er det vigtigt at skifte orienteringen af venstre står terminatorer (terminatorer, der stopper transkription på nederste streng) til den i korrekt vendende (terminerer transkription på øverste streng) terminatorer fordi GFP og RFP udtryk er i korrekt vendende (øverste streng ) retning.
To separate GGA protokoller og buffer blandinger kan anvendes til at teste terminatorer i PgR-blå. Standarden-økonomi blanding består af materiale køb individuelt og derefter blandes i laboratoriet 8. Den anden protokol bruger en kommerciel foruddefineret GGA mester mix. Mens begge fungerer godt; den kommercielle mester mix er mere tidsbesparende, men er relativt dyre i forhold til den standard mix.I en uddannelse indstilling, kan det være mere økonomisk at gøre standard GGA mix i forvejen og fryse portioner til enkelte studerende brug.
Som et resultat af at modificere PGR for GGA og tilføje amilCP i den modsatte retning for farvevalg, er udtryk for GFP og RFP begrænset i uslebne PGR-Blå plasmid og bør ikke bruges som reference kontrol, når bestemmelse af relativ terminator styrke. Men alle modifikationer fjernes under kloningsprocessen muliggør korrekt kvantificering af relative terminator styrke. Mens det er bedst at anvende de oprindelige umodificerede PgR plasmid lignende resultater kan opnås ved at klone en sekvens vides ikke at være en terminator i PGR-Blå. Begge kontroller viste lige niveauer af GFP og RFP udtryk (figur 5), og, endnu vigtigere, havde lignende GFP / RFP-forhold.
For stram regulering af genekspression, PGR-Blå plasmid konstitutivt udtrykker AraC regulatoraf pBAD (arabinose inducerbar) promotor. 10,11 Afhængigt af den anvendte cellelinie kan kræves en høj arabinose koncentration til ekspression af GFP og RFP. Gode resultater blev opnået under anvendelse af en koncentration på 10 mM arabinose i E. coli cellelinie JM109. Transformerede celler bør være enten hvid / gul eller blå under synligt lys. I UV-lys eller blåt lys (450 nm), er det almindeligt at kun se grøn fluorescens, men ikke rød i positivt transformerede celler. Imidlertid blev RFP fluorescens detekteret ved anvendelse pladelæseren.
De terminatorer anvendes som proof of concept for denne protokol blev identificeret i mycobacteriofag Bernal13. Imidlertid PGR-Blå fungerer kun i E. coli og det er ikke en shuttle-vektor, der kan udtrykkes i andre arter af bakterier. Resultatet er, at vi ikke ved præcis, hvordan de identificerede terminatorer ville fungere i deres vært miljø og er en potentiel begrænsning. Ekspressionskassetten associated med GB-blå er flankeret af traditionelle kloningssteder og kunne flyttes til en egnet shuttle vektor. Dette vil give de enkelte forskere at skræddersy PGR-blå til deres specifikke bakteriearter, hvis det ønskes.
Mens der er andre high-throughput sekvensanalyse procedurer tilgængelige, de fleste bruger en fremadrettet genetik tilgang. Disse fremgangsmåder anvender mutagenese eller oligo-syntese til at generere hundrede til tusindvis af potentielle sekvenskombinationer. 12,13 Når skabt, er virkningen af hver sekvens modifikation derefter katalogiseret. Imidlertid er PGR-Blå designet til en mere rettet revers genetik ansøgning. Ved analyse af en roman genom simulation, er det almindeligt at observere flere potentielle terminatorer i et givet område. PGR-Blå er designet til at hjælpe forskerne hurtigt forfine deres i silico forudsigelser ved at lade dem teste formodede sekvenser in vivo. Det skal bemærkes, PGR terminator test plasmid blev anvendt til at kvantificere terminator styrke i 582 sekvenser 4 imidlertid PGR bruger en restriktion-enzym samling standard (f.eks basisk bio-mursten samling (BBA)), en relativt tidskrævende kloning proces i forhold til GGA. 7 PGR-Blå plasmid designet til at fungere på samme måde som PgR men anvender en hurtigere kloningsprocedure og koloni farvevalg. Disse ændringer, sammen med vores forenklet protokol, gør PGR-Blå tilpasses både uddannelse og forskning orienterede laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfattere vil gerne anerkende Malcom Campbell og Todd Eckdahl med Genome Consortium for aktiv Undervisning (GCAT) og HHMI-Science Education Alliance - Fag Hunters Advancing Genomforskning og Evolutionary Science (SEA-fager) program.
Dette projekt blev støttet af tilskud fra National Center for Research Resources (P20RR016460) og Statens Institut for General Medical Sciences (P20GM103429) fra National Institutes of Health. Denne forskning blev delvist understøttet af National Science Foundation under tilskud # IIA-1.457.888. Derudover institutionelle (Ouachita Baptist University) midler blev tilvejebragt gennem JD Patterson Summer Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
