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Biology

PgR ब्लू प्लाज्मिड और गोल्डन गेट विधानसभा का उपयोग Terminators का तेजी से सत्यापन

Published: April 25, 2016 doi: 10.3791/54064
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

Protocol

1. डिजाइनिंग और उचित चिपचिपा समाप्त होता है के साथ आदेश ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स

  1. प्रोग्राम है कि ऑनलाइन आसानी से उपलब्ध हैं का उपयोग कर जीनोमिक विश्लेषण के माध्यम से संभावित रो-स्वतंत्र Terminators को पहचानें। 7
  2. जब डबल असहाय डीएनए के साथ काम कर रहा है, का निर्धारण। टर्मिनेटर के उन्मुखीकरण का परीक्षण किया जा करने के लिए 7 PgR ब्लू प्लाज्मिड केवल शीर्ष (आगे किनारा) पर दिशा '3' के लिए 5 में ligated Terminators की पुष्टि।
    1. अनुक्रम, जैसे, PgR-ब्लू में परीक्षण नि: शुल्क ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के लिए नई दिशा बंदर इसकी उलट पूरक करने के लिए एक नीचे (रिवर्स) कतरा टर्मिनेटर कन्वर्ट।
  3. उन्मुखीकरण के बाद सही होने के लिए निर्धारित किया जाता है, चिपचिपा अंत "5'-CGAC-3 '' के लिए 5 'शीर्ष कतरा के अंत में जोड़ें। नीचे कतरा के अंत 'करने के लिए 5 चिपचिपा अंत "5'-CCGC -3"' जोड़ें। 8 इससे यह सुनिश्चित होगा कि ligated डालने उचित में डाला जाएगाउन्मुखीकरण GGA का उपयोग कर।
  4. एक बार जब दृश्यों निर्धारित कर रहे हैं, एकल असहाय oligonucleotides व्यावसायिक रूप आदेश।

2. एनीलिंग oligonucleotides (केवल लागू रुक-सूखे डीएनए के लिए)

  1. 100 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए nuclease मुफ्त पानी में अलग-अलग ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स फिर से निलंबित।
  2. 1 एम NaCl और 100 मिमी Tris एचसीएल 7.4 पीएच: 10x annealing बफर बनाओ। एनीलिंग बफर कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक बार annealing बफर बना है और ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स फिर से निलंबित कर, annealing 8 शुरू करते हैं।
  3. प्रत्येक टर्मिनेटर का परीक्षण किया जा करने के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब अति शुद्ध पानी के 16 μl जोड़ें।
  4. प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब 10x annealing बफर के 2 μl जोड़ें।
  5. वांछित टर्मिनेटर से शीर्ष किनारा oligonucleotide के 1 μl (100 माइक्रोन) के जोड़ें।
  6. वांछित टर्मिनेटर से नीचे किनारा oligonucleotide के 1 μl (100 माइक्रोन) के जोड़ें।
  7. एक उबलते पानी बीए बनाएंएक 1000 मिलीलीटर एक गर्म थाली पर नल का पानी और जगह के लगभग 400 मिलीलीटर युक्त बीकर का उपयोग कर वें।
  8. एक नाव में 2.6 कदम से microcentrifuge ट्यूबों की जगह और 4 मिनट के लिए उबाल लें। 4 मिनट के बाद, गर्मी प्लेट बंद कर देते हैं लेकिन ट्यूब छोड़ दें और पानी से स्नान करने के लिए धीरे-धीरे शांत हे / एन (18 घंटा) 8 में तैरने लगते हैं। दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर annealed Terminators।

3. गोल्डन गेट सभा (मानक मिश्रण - लागत कुशल)

  1. annealed Terminators की एक 40 एनएम कमजोर पड़ने बनाओ। annealed Terminators मिश्रण (100 सुक्ष्ममापी) के 1 μl के लिए nuclease मुफ्त पानी के 124 μl जोड़ें।
    1. बर्फ पर 10,000 XG पर 30 सेकंड और दुकान के लिए नमूने अपकेंद्रित्र।
  2. में thermocycler के लिए एक नया ट्यूब उचित इस्तेमाल किया जा रहा है, nuclease मुफ्त पानी के 6 μl जोड़ें।
  3. वाणिज्यिक डीएनए Ligase बफर के 1 μl [300 मिमी Tris एचसीएल (7.7-7.8 पीएच), 100 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी डीटीटी, और 10 मिमी एटीपी] जोड़ें। बर्फ पर बाद के सभी चरणों का प्रदर्शन।
  4. जोड़नाPgR-ब्लू (35-50 एनजी / μl) microcentrifuge ट्यूब गंतव्य प्लाज्मिड की 1 μl।
  5. microcentrifuge ट्यूब 40 एनएम annealed Terminators की 1 μl जोड़ें।
  6. microcentrifuge ट्यूब 0.5 μl वाणिज्यिक उच्च निष्ठा BsaI प्रतिबंध endonuclease जोड़ें।
  7. microcentrifuge ट्यूब वाणिज्यिक डीएनए ligase के 0.5 μl जोड़ें।
  8. 120 सेकंड के लिए 10,000 XG पर प्रतिक्रिया मिश्रण अपकेंद्रित्र। तब thermocycler में सीधे ट्यूब जगह।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के 20 चक्र 16 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के 1 चक्र के बाद: thermocycler प्रोग्राम चलाएँ। नमूने तुरंत या -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और दुकान का प्रयोग करें। 8

4. गोल्डन गेट सभा (वाणिज्यिक मास्टर मिक्स - समय कुशल)

  1. 100 माइक्रोन के annealed चरण 2 में बनाई गई इस 40 एनएम के लिए टर्मिनेटर डीएनए एकाग्रता dilutes Terminators के 1 μl के लिए nuclease मुफ्त पानी के 124 μl जोड़ें।एक नया में इस कदम प्रदर्शन, लेबल 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
  2. thermocycler के लिए एक नया ट्यूब उपयुक्त में, nuclease मुफ्त पानी के 14 μl जोड़ें। सुनिश्चित करें कि नया ट्यूब तदनुसार लेबल है सुनिश्चित करें।
  3. microcentrifuge ट्यूब वाणिज्यिक मास्टर मिक्स बफर के 2 μl जोड़ें।
  4. microcentrifuge ट्यूब PgR ब्लू प्लाज्मिड के 1 μl (35-50 एनजी / μl) जोड़ें।
  5. microcentrifuge ट्यूब 40 एनएम annealed Terminators के 2 μl जोड़ें।
  6. microcentrifuge ट्यूब वाणिज्यिक मास्टर मिक्स के 1 μl जोड़ें।
  7. 120 सेकंड के लिए 10,000 XG पर 40 एनएम ट्यूब अपकेंद्रित्र। तब thermocycler में सीधे ट्यूब जगह।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के 1 चक्र 55 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के 1 चक्र के बाद: thermocycler प्रोग्राम चलाएँ। उपयोग के नमूने तुरंत या -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और दुकान।

5. परिवर्तन और कॉलोनी चयन

  1. तैयार Luria बेस (पौंड) 1 मिमी concentrat युक्त पेट्री प्लेटों अगरएम्पीसिलीन के आयन (एएमपी) और arabinose (एआरबी) की एक 10 मिमी एकाग्रता। क्योंकि इस शेयर समाधान बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जाएगा 1 एम एल -arabinose स्टॉक समाधान के कम से कम 10 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. किसी भी उच्च कुशल उपयोग (10 8 - 10 9 transformants / माइक्रोग्राम) रासायनिक सक्षम ई कोली (JM109) परिवर्तन के लिए कोशिकाओं। 9 सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सक्षम कोशिकाओं के 50 μl को बंधाव प्रतिक्रिया के 3-5 μl जोड़ें। रासायनिक सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए विशिष्ट परिवर्तन प्रोटोकॉल का पालन करें।
  3. एक बाँझ एल के आकार का "हॉकी स्टिक" का उपयोग प्लेटों अगर पूर्व गर्म पौंड (amp / एआरबी) पर बदल कोशिकाओं के आधे (25 μl) बिखरा हुआ है और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन। अपघटन के एम्पीसिलीन की तीव्र दर के कारण, 24 घंटा से अधिक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते नहीं है।
  4. दृश्य निरीक्षण द्वारा रंग के आधार पर कॉलोनी चयन प्रदर्शन करना। एक सफल बंधाव सफेद / दृश्य प्रकाश में पीले और हरे रंग की हो unde प्रतिदीप्ति चाहिएआर ब्लू (450 एनएम) या पराबैंगनी प्रकाश। 20 घंटा - एक असफल बंधाव एक कॉलोनी है कि 18 के बाद दिखाई रोशनी के नीचे नीले रंग में है का उत्पादन होगा।

6. सत्यापन और टर्मिनेटर की मात्रा

  1. 1 मिमी और 10 मिमी एम्पीसिलीन arabinose के साथ 5 मिलीलीटर बाँझ लेग शोरबा ट्यूबों तैयार। जरूरत ट्यूबों की संख्या Terminators परीक्षण किया जा रहा प्लस नियंत्रण (कोशिकाओं एम्पीसिलीन प्रतिरोध के साथ कि प्रतिदीप्ति नहीं है और काटा हुआ PgR ब्लू प्लाज्मिड युक्त कोशिकाओं) की संख्या पर निर्भर है।
  2. दृश्य प्रकाश के तहत 2-3 सफेद / पीले रंग की कालोनियों (कदम 5.4) एक बाँझ पाश का उपयोग कर लेने। नमूने 37 डिग्री सेल्सियस और 16-18 घंटे के लिए 160 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर बतख में सेते दें। अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए इन नमूनों को सेते हैं मत करो।
    1. वैकल्पिक रूप से, 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग पर्याप्त सेल के विकास को सुनिश्चित करने के लिए। आम तौर पर, 0.8-1.0 की ~ एक आयुध डिपो के 600 विकास के 16-18 घंटे के बाद मनाया जाता है।
  3. उपयोगबचे हुए चरणों के लिए एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली। एक सड़न रोकनेवाला वातावरण में और तीन प्रतियों में इन चरणों का संचालन। बाँझ लेग + amp / arabinose शोरबा (1 मिमी एम्पीसिलीन / 10 मिमी arabinose) प्रत्येक के 199 μl अच्छी तरह से जोड़ें। तीन अलग-अलग नियंत्रण के लिए थाली पर कमरे शामिल हैं।
    1. निम्नलिखित तीन नियंत्रण का प्रयोग करें: केवल एक अच्छी तरह से (1) युक्त पौंड + amp / arabinose शोरबा और एक अच्छी तरह से (2) untransformed सक्षम कोशिकाओं (खाली) एक खाली के रूप में काम करने के लिए। मात्रा का ठहराव के लिए (3) टर्मिनेटर ताकत का, काटा हुआ मूल PgR या युक्त PgR ब्लू एक गैर समाप्त अनुक्रम के साथ ligated युक्त कोशिकाओं (मात्रा का ठहराव के लिए संदर्भ नियंत्रण) शामिल किया जाना चाहिए। प्लेट पाठक लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें।
  4. Pipet हे से सेल के समाधान के 1 μl / 96 अच्छी तरह से थाली की अलग-अलग कुओं में एन बतख।
  5. एक सांस कवर के साथ सील प्लेटें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 18-20 घंटा और 160 आरपीएम के लिए हिला।
  6. एक प्लेट रीडर का उपयोग, आयुध डिपो के 600 निर्धारित पढ़ने के द्वारा600 एनएम पर absorbance। GFP प्रतिदीप्ति उपाय इस प्रकार है: उत्तेजना 395 और उत्सर्जन 509 उपाय आरएफपी प्रतिदीप्ति इस प्रकार है: उत्तेजना 575 और उत्सर्जन 605. 18-20 घंटे के बाद, 600 आयुध डिपो लगभग 0.5 होना चाहिए।
  7. विकास दर में बदलाव के लिए सामान्य करने के लिए, समीकरण का उपयोग करें: 1 समीकरण दोनों GFP और आरएफपी के लिए।
  8. सामान्य बनाने के बाद, समीकरण का उपयोग रिश्तेदार टर्मिनेटर ताकत का निर्धारण 2 समीकरण

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल एक टर्मिनेटर GFP और आरएफपी गोल्डन गेट सभा (चित्रा 2) का उपयोग कर के बीच ligated साथ PgR ब्लू युक्त कोशिकाओं का उत्पादन होगा। सकारात्मक ligated डालने युक्त कालोनियों रंग के आधार पर चुना जा सकता है। दृश्य प्रकाश में सकारात्मक कालोनियों सफेद / पीले हो जाएगा और झूठी सकारात्मक 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3) में ऊष्मायन के 18-20 घंटे के बाद नीले कालोनियों का उत्पादन होगा।

कॉलोनी के चयन के बाद, एक प्लेट पाठक टर्मिनेटर शक्ति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अवधारणा के सबूत के रूप में, छह ख्यात Terminators (T1-6) bioinformatically mycobacteriophage Bernal13 में पहचान की गई। चित्रा 4 में परिणाम काटा हुआ / असंशोधित PgR एक नियंत्रण के रूप में व्यक्त कोशिकाओं के साथ रिश्तेदार टर्मिनेटर ताकत दिखा। एक भविष्यवाणी टर्मिनेटर एक GFP / आरएफपी अनुपात PgR के समान (~ 0.0) या 0.1 से नीचे है, तो अनुक्रम एक टर्मिनेटर नहीं होना करने के लिए निर्धारित किया गया था(T5 और T6)। हालांकि, संख्यानुसार प्रत्येक दसवां वृद्धि टर्मिनेटर शक्ति में वृद्धि गुना नियंत्रण के सापेक्ष प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, T3 GFP अभिव्यक्ति आरएफपी के सापेक्ष के एक उच्च अनुपात था और टर्मिनेटर शक्ति में 5 गुना वृद्धि (0.5 ग्राफ पर) से पता चला नियंत्रण की तुलना में और एक मजबूत टर्मिनेटर (चित्रा 4) के रूप में माना जाता था। डेटा तीन प्रतियों में एकत्र की है और दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए औसत था।

टर्मिनेटर ताकत quantitating के लिए सबसे अच्छा संदर्भ नियंत्रण का निर्धारण करने के लिए, हम कोई टर्मिनेटर और PgR ब्लू एक दृश्य एक टर्मिनेटर नहीं हो जाना के साथ क्लोन युक्त मूल PgR प्लाज्मिड का उपयोग कच्चे डेटा की तुलना में। दोनों नियंत्रण GFP और आरएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 5) और, के समान स्तर से पता चला है अधिक महत्वपूर्ण है, इसी तरह GFP / आरएफपी अनुपातों का उत्पादन किया।

आकृति 1
एफigure 1. एस chematic का ब्यौरा प्लेट रीडर लेआउट। कमरे में तीन अलग नियंत्रण (हरा) के लिए प्लेट रीडर पर शामिल किया जाना चाहिए। एक अच्छी तरह से (1) युक्त पौंड + amp / arabinose शोरबा ही है और एक अच्छी तरह से (2) untransformed सक्षम कोशिकाओं (रिक्त) के लिए एक खाली के रूप में काम करने के लिए। मात्रा का ठहराव के लिए (3) टर्मिनेटर ताकत का, काटा हुआ मूल PgR या युक्त PgR ब्लू एक गैर समाप्त अनुक्रम के साथ ligated युक्त कोशिकाओं (मात्रा का ठहराव के लिए संदर्भ नियंत्रण) शामिल किया जाना चाहिए। प्लेट (पीला) के शेष के ख्यात Terminators परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सभी कोशिकाओं को तीन प्रतियों में हो गई है और विश्लेषण से पहले औसतन किया जा सुझाव दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. क्लोनिंग साइट अभिविन्यास और की अभिव्यक्तिPgR नीला। AmilCP के विधान अभिव्यक्ति (ब्लू Chromo प्रोटीन) GFP और आरएफपी के विपरीत (नीचे किनारा) दिशा में प्रेरित है। जब BsaI, AmilCP और BsaI मान्यता साइटों के साथ पचा हटा रहे हैं और टर्मिनेटर का परीक्षण किया जा करने के लिए स्थायी रूप से प्लाज्मिड में ligated है। शीर्ष किनारा और उचित चिपचिपा समाप्त होता है के साथ एक टर्मिनेटर के नीचे किनारा दिखाए जाते हैं। Arac नियामक और एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन प्लाज्मिड में हैं, लेकिन नहीं दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. के बाद कॉलोनी चयन क्लोनिंग। (ए) PgR-ब्लू / टर्मिनेटर बंधाव (मानक मिश्रण) और सेल परिवर्तन के बाद प्रतिनिधि थाली। ब्लू कालोनियों असफल ligations और सफेद / पीले कर्नल का प्रतिनिधित्वonies (तीर द्वारा संकेत) सफल ligations हैं। (बी) एक ही थाली परिवर्तन के बाद प्रतिनिधि कालोनियों दिखा की छवि में तेजी से बढ़ी है। पृष्ठभूमि रंग डिजिटल आगे उजागर कॉलोनी रंग मतभेद को बदल दिया गया था। बदल कोशिकाओं (कोलाई -JM109) लेग अगर एम्पीसिलीन और arabinose युक्त Plats पर चढ़ाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. PgR नीला। छह ख्यात Terminators में छह अलग Terminators की मात्रा (T1-6) bioinformatically mycobacteriophage Bernal13 में पहचान की गई। परिणाम रिश्तेदार प्रतिदीप्ति दिखा। सभी परिणाम एक नियंत्रण के रूप में काटा हुआ / असंशोधित PgR युक्त कोशिकाओं का उपयोग सामान्यीकृत थे। T3 एक मजबूत होना पाया गयाटर्मिनेटर। सभी परिणाम अलग-अलग तीन प्रतियों में उगाया कालोनियों का प्रतिनिधित्व करते हैं और दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए औसत। त्रुटि सलाखों के औसत डेटा बिंदुओं के बीच विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. GFP और नियंत्रण में आरएफपी अभिव्यक्ति। काटा हुआ / असंशोधित PgR और दो ​​अलग अलग गैर-टर्मिनेटर दृश्यों PgR ब्लू में डाला में GFP और आरएफपी की अभिव्यक्ति। सभी परिणाम अलग-अलग तीन प्रतियों में उगाया कालोनियों का प्रतिनिधित्व करते हैं और दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए औसत। त्रुटि सलाखों के औसत डेटा बिंदुओं के बीच विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम उचित oligonucleotide डिजाइन आदेश देने से पहले है। ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स उचित चिपचिपा समाप्त होता है दोनों ऊपर और नीचे किस्में के 5 'सिरों को जोड़ा सुनिश्चित करने के लिए कि GGA समावेश संभव है होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह सही सामना करना पड़ रहा है कि करने के लिए छोड़ दिया सामना करना पड़ रहा Terminators (terminators कि नीचे किनारा पर प्रतिलेखन रोक) के उन्मुखीकरण के लिए स्विच करने के लिए महत्वपूर्ण है (ऊपर किनारा पर प्रतिलेखन समाप्त हो जाता है) Terminators क्योंकि GFP और आरएफपी अभिव्यक्ति के अधिकार में है का सामना करना पड़ (ऊपर किनारा ) दिशा।

दो अलग GGA प्रोटोकॉल और बफर घोला जा सकता है PgR-ब्लू में Terminators परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मानक अर्थव्यवस्था मिश्रण सामग्री की खरीद को व्यक्तिगत रूप से और फिर लैब 8 में मिश्रित होते हैं। दूसरा प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक पूर्व बनाया GGA मास्टर मिश्रण का उपयोग करता है। जबकि दोनों अच्छी तरह से काम करते हैं; वाणिज्यिक मास्टर मिश्रण अधिक समय कुशल है, लेकिन मानक मिश्रण की तुलना में अपेक्षाकृत महंगा है।एक शिक्षा की स्थापना में, यह पहले से मानक GGA मिश्रण बनाने के लिए और व्यक्तिगत छात्र के उपयोग के लिए aliquots फ्रीज करने के लिए और अधिक किफायती हो सकता है।

GGA के लिए PgR को संशोधित करने और रंग चयन के लिए रिवर्स अभिविन्यास में amilCP जोड़ने का एक परिणाम के रूप में, GFP की अभिव्यक्ति और आरएफपी काटा हुआ PgR ब्लू प्लाज्मिड में सीमित है और जब रिश्तेदार टर्मिनेटर ताकत का निर्धारण करने के संदर्भ नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। हालांकि, सभी संशोधनों क्लोनिंग की प्रक्रिया रिश्तेदार टर्मिनेटर ताकत की उचित मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति दौरान हटा रहे हैं। हालांकि यह सबसे अच्छा है मूल असंशोधित PgR प्लाज्मिड इसी तरह के परिणाम का उपयोग करने के लिए एक दृश्य PgR-नीले रंग में एक टर्मिनेटर होने के लिए नहीं जाना जाता क्लोनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। दोनों नियंत्रण अधिक महत्वपूर्ण बात GFP के बराबर के स्तर और आरएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 5) और, पता चला है, इसी तरह GFP / आरएफपी अनुपातों था।

जीन अभिव्यक्ति की तंग विनियमन के लिए, PgR ब्लू प्लाज्मिड अनिवार्यता से Arac नियामक व्यक्तpBAD (arabinose inducible) प्रमोटर। 10,11 सेल लाइन पर निर्भर करता है के लिए प्रयोग किया जाता है एक उच्च arabinose एकाग्रता GFP और आरएफपी की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हो सकता है। अच्छे परिणाम ई में 10 मिमी arabinose की एकाग्रता का उपयोग कर प्राप्त किया गया कोलाई सेल लाइन JM109। बदल कोशिकाओं या तो सफेद / पीले या नीले प्रकाश दिखाई तहत होना चाहिए। पराबैंगनी प्रकाश या नीली बत्ती (450 एनएम) के तहत, यह केवल करने के लिए हरे रंग की रोशनी देख सकते हैं लेकिन सकारात्मक बदल कोशिकाओं में लाल नहीं आम है। हालांकि, आरएफपी प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग पाया गया।

इस प्रोटोकॉल के लिए अवधारणा के सबूत के रूप में इस्तेमाल Terminators mycobacteriophage Bernal13 में पहचान की गई। हालांकि, PgR ब्लू केवल ई में काम करता है कोलाई और यह एक शटल वेक्टर कि बैक्टीरिया की अन्य प्रजातियों में व्यक्त किया जा सकता है नहीं है। नतीजा यह है कि हम नहीं जानते कि वास्तव में कैसे पहचान Terminators अपने मेजबान वातावरण में कार्य करेगा और एक संभावित सीमा है। अभिव्यक्ति कैसेट सहयोगीPgR-ब्लू के साथ डी पारंपरिक क्लोनिंग साइटों से घिरे हुए है और एक उचित शटल वेक्टर के लिए ले जाया जा सकता है। यह व्यक्तिगत शोधकर्ताओं, उनकी विशिष्ट बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए PgR ब्लू दर्जी को यदि ऐसा है तो वांछित अनुमति होगी।

जबकि वहाँ अन्य उच्च throughput अनुक्रम विश्लेषण प्रक्रियाओं उपलब्ध हैं, सबसे आगे एक आनुवंशिकी दृष्टिकोण का उपयोग करें। इन तरीकों का इस्तेमाल साइट निर्देशित mutagenesis या oligo-संश्लेषण संभावित अनुक्रम संयोजन के हजारों। 12,13 एक बार बनाया करने के लिए सैकड़ों उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक दृश्य के संशोधन का असर तो सूचीबद्ध है। हालांकि, PgR-ब्लू एक अधिक निर्देशित रिवर्स आनुवंशिकी आवेदन के लिए बनाया गया है। जब सिलिको में एक उपन्यास जीनोम का विश्लेषण, यह एक दिए गए क्षेत्र में कई संभावित Terminators निरीक्षण करने के लिए आम बात है। PgR ब्लू मदद करने के लिए शोधकर्ताओं ने जल्दी से उन्हें विवो में ख्यात दृश्यों का परीक्षण करने की अनुमति देकर सिलिको भविष्यवाणियों में अपने को परिष्कृत डिजाइन किया गया था। यह PgR टर्मिनेटर परीक्षण plasmi ध्यान दिया जाना चाहिए(जैसे, बुनियादी जैव ईंट विधानसभा (बीबीए)), एक अपेक्षाकृत समय लेने वाली प्रक्रिया क्लोनिंग GGA की तुलना में डी 582 दृश्यों 4 में टर्मिनेटर ताकत quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, हालांकि PgR एक प्रतिबंध एंजाइम विधानसभा मानक का उपयोग करता है। 7 PgR ब्लू प्लाज्मिड PgR की तरह ही काम करने के लिए तैयार है लेकिन एक और अधिक तेजी क्लोनिंग प्रक्रिया और कॉलोनी रंग चयन का उपयोग करता था। इन संशोधनों, हमारे सरलीकृत प्रोटोकॉल के साथ साथ, PgR ब्लू दोनों शिक्षा और अनुसंधान उन्मुख प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूल हैं।

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Acknowledgments

फेज जीनोमिक्स और विकासवादी विज्ञान में आगे बढ़ने के शिकारी (सागर-फगेस) कार्यक्रम - लेखक सक्रिय शिक्षण के लिए जीनोम कंसोर्टियम (GCAT) और HHMI-विज्ञान शिक्षा एलायंस के साथ Malcom कैम्पबेल और टोड Eckdahl स्वीकार करना चाहते हैं।

इस परियोजना अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केंद्र (P20RR016460) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (P20GM103429) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। इस शोध अनुदान # आईआईए-1457888 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त संस्थागत (Ouachita बैपटिस्ट विश्वविद्यालय) धन जद पैटरसन ग्रीष्मकालीन रिसर्च फैलोशिप के माध्यम से प्रदान किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGR-Blue Plasmid Addgene 68374
pGR-Plasmid Addgene 46002
AeraSeal-(Sterile Sheets) Excel Scientific BS-25 Sterile Sheets only
10x T4 DNA ligase Buffer NEB
BsaI-HF NEB R3535S The non-HF enzyme will work but is less heat stable. 
NEB Golden Gate Assembly Mix NEB E1600S Commerial Master Mix refered to in the protocol.
T4 DNA ligase NEB M0202S
Round Microcentrifuge Floating Rack Nova Tech International F18875-6401
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A-3256 D-Arabinose will not induce the pBAD promoter
Luria Base (LB) - Broth, Miller Sigma Aldrich L1900
Luria Base (LB) - Agar, Miller Sigma Aldrich L2025
Tecan-Infinite M200 Plate Reader Tecan
Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 Zymo Research T3005 Use company recommended transformation protocol
ApE: A plasmid editor-software http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Molecular Grade Promega H5121
Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) Fisher Chemical S671
Comercial Oligonucleotide synthesis Integrated DNA Technologies (IDT) http://www.idtdna.com/site
Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) Falcon 35-3072
mycobacteriophage "Bernal13" Genebank KJ510413
Nuclease Free Water Integrated DNA Technologies (IDT) IDT004
Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell Life Science Products 6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific 2000c
ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. http://rna.igmors.u-psud.fr/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 110 टर्मिनेटर नियामक तत्व गोल्डन गेट विधानसभा हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन सिंथेटिक जीव विज्ञान शिक्षा PgR-ब्लू जैव सूचना विज्ञान ई कोलाई Mycobacteriophage पाठ्यक्रम आधारित अनुसंधान अनुभव
PgR ब्लू प्लाज्मिड और गोल्डन गेट विधानसभा का उपयोग Terminators का तेजी से सत्यापन
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Bradshaw, J. C., Gongola, A. B.,… More

Bradshaw, J. C., Gongola, A. B., Reyna, N. S. Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly. J. Vis. Exp. (110), e54064, doi:10.3791/54064 (2016).

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